JPH0121957B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、アクレモニウム属菌による耐熱性キ
シラナーゼの製造法に関するものである。

〔従来技術〕

キシラナーゼは、植物細胞壁を構成するヘミセ
ルロースのうちキシランに作用し、これを構成単
糖であるキシロース、またはキシロースの重合物
であるキシロオリゴ糖に、分解する作用を持つも
ので、この作用をもとにした用途に利用できる。
すなわち、植物性バイオマス中のキシランに作用
させることにより、飼料では可食性の改良、コー
ヒー豆ではコーヒーエキスの抽出性の改善等に利
用出来る。また近年、石油代替資源としてバイオ
マスのエネルギー化あるいは化学原料化法の開発
が進められ、セルラーゼによるバイオマスの酵素
糖化法が検討されているが、ここでもセルラーゼ
にキシラナーゼを併用することで、バイオマス中
のグルコースばかりではなくキシロースもまた資
源化することができる。更に、セルロースをとり
まくヘミセルロースのマトリクスをキシラナーゼ
で分解することにより、セルラーゼがセルロース
に接近しやすくなり、セルロースの分解性を高め
る効果も期待できる。

一方、こうしたキシラナーゼの利用に際して、
キシラナーゼには次のような二つの性質が求めら
れる。すなわち、分解反応中に雑菌による汚染を
防ぐ点からなるべく高温に作用最適温度をもつこ
と、またキシランの糖化能力に優れていることで
ある。

従来、高温域に最適作用温度をもつキシラナー
ゼとしてはフミコラ・ラヌギノザ（J.Ferm.
Technol.、62巻 p63−69、1984）チエラビラ・
テレストリス（Enzyme Microb.Technol.、６
巻、p175−180、1984）などが知られている。し
かし、これらのキシラナーゼの短時間反応におけ
る最適作用温度は65℃付近であり、長時間反応で
の安定作用温度はもつと低いものと推定されるこ
と、また反応生成物は、キシロースよりもキシロ
オリゴ糖が多く糖化が不完全であるなどの問題を
残している。

〔目的〕

そこで本発明者らは、広く自然界より植物バイ
オマスを分解する微生物を求めて検索したところ
中温性糸状菌の一種アクレモニウム属菌の一菌株
が、80℃に最適作用温度をもつキシラナーゼを培
養物中に生産蓄積する事実を見出し、中温性糸状
菌で初めて高度に耐熱性のキシラナーゼを生産す
ることを知り、かつこのキシラナーゼが高温域に
おいて極めて糖化力に優れたキシロース生成力の
強い新規キシラナーゼであることを認め、本発明
を完成したものである。

〔構成〕

すなはち、本発明は、耐熱性キシラナーゼを生
産するアクレモニウム属菌を培養し、培養物より
耐熱性キシラナーゼを採取することを特徴とする
耐熱性キシラナーゼの製造法に関するものであ
る。

以下に本発明の内容を更に具体的に説明する。
本発明においては、その例示菌株としてアクレモ
ニウム・セルロリテイカス（Acremonium
cellulolyticus）が有効に利用される。本菌は耐
熱性キシラナーゼと同時に著量のβ−グルコシダ
ーゼを含むことによつて、強力なセルロース糖化
能力を持つことを特徴としたセルラーゼ複合物を
も生産する菌である。

次に、本発明において使用される耐熱性キシラ
ナーゼ生産菌の菌学的性質を示すと、下記の通り
である。

生育、麦芽エキス寒天上では生育は速く30℃７
日間で直径70mmに達する。集落は最初白色で後に
やや黄色味をおびる。気性菌糸はゆるく盛り上が
り羊毛状を呈し、時に縄状の菌糸束を形成する。
培養後期には集落裏面は桃褐色ないし赤褐色を呈
する。ツアペツク寒天上でもほぼ同様の生育を示
すが気性菌糸の盛り上がりはより少ない。生育PH
範囲は3.5〜6.0で最適PH４付近、生育温度範囲は
15℃〜43℃で、最適生育温度は30℃である。

形態、菌糸の直径は0.5〜2.5μｍ、無色で菌糸
には隔壁が認められる。また、菌糸表面は滑面で
ある。

分生子、分生子形成能は非常に不安定でツアペ
ツク寒天および麦芽エキス寒天培地による継代培
養により容易に消失した。分離時における観察で
は、分生子柄は気生菌糸側面より突出し、無色で
ある。分生子は亜球形で滑球形で滑面、無色で連
鎖は非常にゆるく分散しやすい。以上の菌学的性
質について、ガムス（W.Gams）のセフアロスポ
リウムに関する記載〔セフアロスポリウム アル
テイーゲ シンメルピルゲ（Cephalosporium
artige Schimmelpilge、G.Fisher編、）第84ペー
ジ、1971年〕およびデイキンソン（C.H.
Dickinson）の研究〔マイコロジカルペーパー
（Mycological Paper）第115巻、10ページ、1968
年〕を参照した結果、本菌はアクレモニウム
（Acremonium）属に近縁の糸状菌と考えるのが
妥当であると考えた。なお、アクレモニウム属に
は、従来、強力なセルラーゼ生産菌が知られてい
なかつたこと、及び、本発明の菌株が強力かつ特
徴的なセルラーゼをキシラナーゼと同時に生産す
ることから、菌をアクレモニウム・セルロリテイ
カスTN（Acremonium cellulolyticus TN）を
命名した。なお、本菌は、FFRMBP−685とし
て、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている。

本発明のアクレモニウム属菌による耐熱性キシ
ラナーゼを生産するためには、通常、キシラン、
キシログルカン、セルロース、アビセル、フスマ
稲ワラ、バガスなど植物性バイオマスを炭素源と
し、これに窒素源として、硝酸塩、アンモニウム
塩あるいはペプトン、酵母エキスのような有機ま
たは無機の窒素源と少量の金属塩を含む液体また
は固体培地を用い、20〜40℃で、２〜15日間程
度、好気的に培養される。耐熱性キシラナーゼは
菌体外に生産される酵素であるため、液体培地の
場合は、培養後ろ過あるいは遠心分離した上澄液
を、そして固体培養の場合は培養後、水または適
当な無機塩類で抽出した液を、粗酵素液として用
いることができる。粗酵素液は、そのまま使用し
てもよいが、例えば硫安塩析法やアセトン沈殿法
など公知の方法により、粗酵素粉末を得ることが
できる。更に、本酵素が耐熱性であることを利用
してPH4.9、65℃ ２時間の熱処理をすることに
より、キシラナーゼの活性を損なうことなく、不
純蛋白質を変性沈殿させて除くことができ、キシ
ラナーゼ活性のみをもつ酵素液を簡単に調製する
ことができる。このようにして得られた、本発明
の耐熱性キシラナーゼ標品は次のような諸性質を
もつている。

(1) キシラナーゼの多成分性 耐熱性キシラナーゼは、デイスク電気泳動的
に少なくとも３成分に分離され、それぞれ分子
量と等電点により区別される。キシラナーゼＡ
は分子量約51000で等電点5.05、以下同様にＢ
は約46000、4.57、Ｃは約36000、3.55であり、
これら成分の複合物よりキシラナーゼは成つて
いる。

(2) 作用 キシラナーゼ複合物は、植物バイオマスに含
まれる可溶性および不溶性のキシランに作用し
て、キシロースおよびキシロオリゴ糖を生成す
る。また、アラビノースを含むアラビノキシラ
ンからは上記以外にアラビノースとキシロース
からなるオリゴ糖も生成する。本酵素複合物は
キシロビオースにも有効に作用し、これをキシ
ロースに分解する。従つて最終生成物は、主と
してキシロースから成る。

(3) 作用PH及び最適作用PH 本酵素複合物の作用PH範囲は第１図ａに示し
たように、PH３−６であり、最適作用PHは約５
に認められた。

(4) 安定PH範囲 クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で25℃24時間
放置したときの安定PH範囲は、第１図ｃに示し
たように約2.5−8.5であつた。

(5) 作用温度範囲及び最適温度範囲 本酵素複合物のどの成分も、約90℃までの高
温で作用できるが、第１図ｂに示したように、
0.25％キシラン、0.05M酢酸緩衝液（PH4.9）の
下で10分間反応させた時の最適作用温度は約80
℃に認められた。

(6) 熱安定性 本酵素複合物を0.1M酢酸緩衝液（PH4.9）の
下で各温度で10分間加熱処理した結果、第１図
ｄに示したように、70℃まではほとんど失活せ
ず、80℃10時間で約60％そして85℃10分間の加
熱で約90％が活性を失つた。

(7) 阻害剤 各種重金属イオンのうちで１ｍＭ以上の水銀
イオン及び銅イオンにより強く阻害された。

(8) 精製法 本酵素複合物は培養ろ液を、65℃ ２時間加
熱処理し、含まれる不純蛋白質を変性させ生じ
た沈殿を遠心分離により除いた後、DEAEセフ
アロース及びクロマトフオーカシングのカラム
クロマトグラフイーにより、デイスク電気泳動
的に均一なまでに各成分を分離精製することが
できた。

(9) 活性測定法 0.1M酢酸緩衝液に稲ワラより調製したキシ
ラン（約９％のアラビノースを含む）0.5％を
懸濁させた基質懸濁液（PH4.9）0.5mlに、適量
の酵素を加え、蒸留水で全量を1.0mlとし、60
℃で反応を行なつた。そして、生成する還元糖
はソモギー・ネルソン法により測定した。

この条件で、１分間に1μｇのキシロースに
相当する還元力を生成する酵素量を１単位とし
た。

〔効果〕

以上のとおり、本発明の耐熱性キシラナーゼは
最適作用温度が80℃付近に存在し、かつキシラン
からの主な生成物がキシロースであるというよう
に、その酵素的性質がこれまで知られている酵素
に比べ非常に優れている。そしてこのような本発
明の酵素の特徴は、キシラナーゼの工業的利用に
おいても著しく技術的進歩をもたらしたものであ
る。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 １ セルロース４％、ペプトン１％、硝酸カリウム
0.6％、塩化カリウム0.16％、塩化ナトリウム0.16
％、硫酸マグネシウム0.12％、リン酸１カリウム
1.20％、及び硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸銅を
それぞれ0.001％含む培地（PH4.0）20mlを200ml
容の三角フラスコにいれ、常法により殺菌後アク
レモニウム・セルロリテイカスTN（FERM BP
−685）を接種し、30℃で６日間通気培養した。
培養後、遠心分離機により除菌し、得られた上澄
液についてキシラナーゼ活性を測定した結果培養
液１ml当り1050単位であつた。

実施例 ２ 実施例１において、セルロースに代えて、キシ
ログルカン（大日本製薬製 グリロイド3S）２
％を添加した培地にアクレモニウムセルロリテイ
カス（FERM Ｐ−6867）を接種し、30℃で８日
間通気培養した。培養後遠心分離した上澄液につ
いて、キシラナーゼ活性を測定した結果培養液１
ml当たり2400単位であつた。

この培養上澄液のPHを4.9に調整して、65℃２
時間加熱処理をした後生じた沈殿を遠心分離によ
り除き、キシラナーゼ活性のみをもつ酵素標品を
得た。キシラナーゼの回収率は、92.4％だつた。

実施例 ３ 実施例２で得たキシラナーゼ酵素標品を終濃度
で、300単位／mlとなるように10％キシラナン懸
濁液に添加し、65℃で48時間糖化した。得られた
糖液の一部について、還元糖量を測定した結果キ
シロースとして60mg／mlであつた。この値を硫酸
により同濃度のキシランを分解した値（68mg／
ml）と比較すると、88.2％の分解率であつた。ま
た、このときの分解産物をペーパークロマトグラ
フイーにより同定した結果主にキシロースからな
り、他に僅かなキシロビオースを含んでいた。

【図面の簡単な説明】

第１図はアクレモニウムTN（FERM BP−
685）の生産する耐熱性キシラナーゼの(a)最適作
用PH、(b)最適作用温度、(c)PH安定性そして(d)熱安
定性を示している。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 耐熱性キシラナーゼを生産するアクレモニウ
   ム属菌を培養し、培養物より耐熱性キシラナーゼ
   を採取することを特徴とする耐熱性キシラナーゼ
   の製造法。