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Die
vorliegende Erfindung betrifft Xylanasen, im Besonderen mesophile
Xylanasen, abgeleitet vom Schimmelpilz Acremonium cellulolyticus,
FERM BP-685.
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Xylan
ist eines der in der Natur weit verbreiteten Polysaccharide und
wird unter den Polysacchariden als Hemicellulose klassifiziert;
diese sind Hauptbestandteile der Zellwand und der peripheren Gewebe
von höheren
Pflanzen, wie zum Beispiel Cellulose, Lignin, Hemicellulosen und
Pektine. Die Struktur ist ein Polysaccarid mit hohem Molekulargewicht,
das eine Hauptkette besitzt, die durch β-1,4-Xylosid-Bindungen polymerisiert
ist, bei der die Einheiten Xylose sind. In der Natur kommt Xylan nicht
nur als Homoxylan vor, dessen Zuckerbestandteil nur Xylose ist,
sondern auch als Heteroxylan wie zum Beispiel als Arabinoxylan,
in welchem Arabinose die Verzweigungen bildet und an die Hauptkette
gebunden ist.
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Xylanase
ist der übliche
Name für
Enzyme, die die Hydrolyse von Xylan über Xylosaccharide und Xylobiose
und schließlich
zu Xylose katalysieren, und wird, abhängig von der Wirkungsweise,
grob in Endoxylanase, Exoxylanase und β-Xylosidase eingeteilt. Durch
einen genauen Vergleich dieser Wirkungsweisen kommt es zur Festlegung
einer großen Anzahl
von Enzymarten. Es wurde daher angenommen, dass Xylan in Planzengeweben
durch eine synergistische Wirkung von Xylanasen, die eine große Vielfalt
an Wirkungsweisen haben, abgebaut wird.
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Xylanase
wird für
die Herstellung von Xylooligosacchariden oder Xylose aus Xylan oder
der Aufbereitung von Biomasse benutzt. Außerdem macht die Anwendung
von Xylanase seit kurzem Fortschritte im Gebiet der Enzyme für Futter
und Nahrungsmittelaufbereitung und verschiedene Arten von Xylanasen
werden untersucht und entwickelt.
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Der
Schimmelpilz Acremonium cellulolyticus hat die Eigenschaft eine
Cellulase zu produzieren, die eine starke Verzuckerung aufweist
und die Nützlichkeit
für Futter
und Silo-Futter
wurde beschrieben (vgl. z.B.: offengelegte Japanische Patentveröffentlichung
Nr. Hei 4-117244 und Hei 7-236431). Die darin enthaltene Cellulase-Komponente
wird auch beschrieben (vgl. z.B.: Agric. Biol. Chem. 52, 2493-2501
(1988); ibid. 53, 3359-3360 (1989); ibid. 54, 309-317 (1990)). Außerdem erzeugt
das von dem Schimmelpilz hergestellte Rohenzym Xylanase zusammen
mit Cellulase und einige Komponenten der Xylanase wurden beschrieben
(vgl. z.B.: Agric. Biol. Chem. 51, 65-74 (1987); ibid. 51, 3207-3213
(1987); Report of National Institute of Bioscience and Human Technology,
1, 37-44 (1993), Japanische Patentveröffentlichung Nr. Hei 1-21957;
und offengelegte Japanische Patentveröffentlichungs Nr. Hei 1-171484 und
Hei 1-171485).
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Diese
Beschreibungen betreffen hitzebeständige Xylanasen und Xylooligosyl-Transferasen, eine
mesophile Xylanase war im Detail nicht bekannt.
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Andere
Beschreibungen offenbaren die Herstellung von Rohenymlösungen von
Acremonium cellulolyticus FERM BP-685, der Xylanase-Aktivität besitzt
(
JP 61162181 ), die
Herstellung von Xylanase durch Acremonium cellulolyticus Y-94 (Grassland Science
42(4), 343-347 (1997)) und ein Verfahren für die Verzuckerung einer Cellulosesubstanz
unter Verwendung einer Xylanase von Acremonium cellulolyticus FERM
BP-685 mit einem Temperatur-Optimum von etwa 80°C und einer Themperaturstabilität bei 70°C oder niedriger
(US-Patent Nr. 4,742,005). Eine Vielzahl and Xylanasen von diversen
Microorganismen, deren Funktionen und Anwendungen sind beschrieben,
ohne dass jedoch eine Offenbarung bezüglich Acremonium cellulolyticus
oder des individuellen Molekulargewichts der Xylanasen der vorliegenden
Erfindung angedeutet wird (Microbiological Reviews 52(3), 305-317 (1998)). Xylan
hydrolysierende Enzyme von thermophilen und mesophilen Pilzen werden
beschrieben, Acremonium cellulolyticus ist jedoch nicht eingeschlossen
(World Journal of Microbiology and Biotechnology 7, 475-484 (1991)).
Ein Vergleich von generell aus Pilzen stammeden Xylanasen mit Xylanasen
bakterieller Herkunft wird bereitgestellt. Die Xylanasen der vorliegenden
Erfindung haben eine pH-Stabilität
und ein Temperatur-Optimum, das sich von den uns bekannten unterscheidet,
und demnach besitzen sie vorteilhafte Eigenschaften über bekannte
aus Pilzen stammende Xylanasen (EP-A-0 463 706).
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Vorzugsweise
ist eine mesophile Xylanase zu verwenden, die eine Aktivität im neutralen
bis sauren Bereich aufweist, im mesophilen Bereich ist die optimale
Temperatur bei Anwendung für
Essen und Futter bis zu etwa 60°C.
Eine solche mesophile Xylanase war jedoch bis jetzt noch nicht bekannt.
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Die
Erfinder haben eine erschöpfende
Fraktionierung/Reinigung verschiedener Enzyme durchgeführt, die
das Xylanase-System, abgeleitet von Acremonium cellulolyticus FERM-BP-685,
ausmachen, sodass sie neue aktive Komponenten gefunden haben, die
optimale Aktivitäten
im mesophilen Bereich der Enzyme hatten. Basierend auf diesem Ergebnis
wurde die vorliegende Erfindung abgeschlossen. Der Gegenstand der
vorliegenden Erfindung ist, eine neue mesophile Xylanase bereitzustellen,
die für
Nahrungsmittelaufbereitung, Futter, Silo-Futter und andere Zwecke
wirkungsvoll ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt, wie in Anspruch 1 beansprucht, eine
mesophile Xylanase I, abgeleitet vom Schimmelpilz Acremonium cellulolyticus
FERM-BP-685, mit den folgenden Eigenschaften bereit:
- (a) Aktivität:
hydrolysiert Xylan unspezifisch hauptsächlich zu Xylose, Xylobiose,
Xylotriose und so weiter;
- (b) Substratspezifität:
das Enzym wirkt auf Xylan
- (c) pH-Optimum und pH-Stabilitätsbereich: das pH-Optimum ist
3,5 und es ist bei einem pH-Wert von
3,5-9,5 stabil (25°C,
2 Stunden), bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität unter
Verwendung von löslichem
Xylan als Substrat;
- (d) optimale Wirktemperatur: 55°C, bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität unter
Verwendung von löslichem
Xylan als Substrat;
- (e) Temperaturstabilität:
stabil bei 55°C
oder darunter (pH 3,5, 10 Minuten);
- (f) Molekulargewicht: 30.000, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese,
und
69.500, bestimmt durch Gelfiltrationschromatographie;
- (g) Spezifische Aktivität:
112,1 U/mg Protein, bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität für lösliches
Xylan, 76,6 U/mg Protein, bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität für nicht-lösliches
Xylan;
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin, wie in Anspruch 2 beansprucht,
eine mesophile Xylanase II, abgeleitet vom Schimmelpilz Acremonium cellulolyticus
FERM-BP-685, mit
den folgenden Eigenschaften bereit:
- (a) Aktivität: hydrolysiert
Xylan unspezifisch hauptsächlich
zu Xylose, Xylobiose, Xylotriose und so weiter;
- (b) Substratspezifität:
das Enzym wirkt auf Xylan;
- (c) pH-Optimum und pH-Stabilitätsbereich: das pH-Optimum ist
3,8 und es ist bei einem pH-Wert von
3,0-9,5 stabil (25°C,
2 Stunden), bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität unter
Verwendung von löslichem
Xylan als Substrat;
- (d) optimale Wirktemperatur: 55°C, bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität unter
Verwendung von löslichem
Xylan als Substrat;
- (e) Temperaturstabilität:
stabil bei 55°C
oder darunter (pH 3,5, 10 Minuten);
- (f) Molekulargewicht: 25.500, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese,
und
58.000, bestimmt durch Gelfiltrationschromatographie;
- (g) Spezifische Aktivität:
86,1 U/mg Protein, bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität für lösliches
Xylan, 87,6 U/mg Protein, bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität für nicht-lösliches
Xylan;
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Die
vorliegende Erfindung stellt, wie in Anspruch 3 beansprucht, eine
mesophile Xylanase III, abgeleitet vom Schimmelpilz Acremonium cellulolyticus
FERM-BP-685, mit den folgenden Eigenschaften bereit:
- (a) Aktivität:
hydrolysiert Xylan unspezifisch hauptsächlich zu Xylose, Xylobiose,
Xylotriose und so weiter;
- (b) Substratspezifität:
das Enzym wirkt auf Xylan;
- (c) pH-Optimum und pH-Stabilitätsbereich: das pH-Optimum ist
3,5 und es ist bei einem pH-Wert von
2,5-9,5 stabil (25°C,
2 Stunden), bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität unter
Verwendung von löslichem
Xylan als Substrat;
- (d) optimale Wirktemperatur: 50°C, bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität unter
Verwendung von löslichem
Xylan als Substrat;
- (e) Temperaturstabilität:
stabil bei 50°C
oder darunter (pH 3,5, 10 Minuten);
- (f) Molekulargewicht: 33.500, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese,
und
23.000, bestimmt durch Gelfiltrationschromatographie;
- (g) Spezifische Aktivität:
74,8 U/mg Protein, bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität für lösliches
Xylan, 101,5 U/mg Protein, bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität für nicht-lösliches
Xylan;
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1 stellt das pH-Optimum der Enzyme dar.
Buchstaben a, b und c zeigen das pH-Optimum der mesophilen Xylanasen
I, II bzw. III an.
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2 stellt die pH-Stabilität der Enzyme
dar. Buchstaben a, b und c zeigen die stabilen pH-Bereiche der Xylanasen
I, II bzw. III an.
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3 stellt das Temperaturoptimum der Enzyme
dar. Buchstaben a, b und c zeigen das Temperaturoptimum der mesophilen
Xylanasen I, II bzw. III an.
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4 stellt die Temperaturstabilität der Enzyme
dar. Buchstaben a, b und c zeigen Temperaturstabilitätsbereiche
der Xylanasen I, II bzw. III an.
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5 stellt
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Bestimmung des Molekulargewichts
der Enzyme dar.
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Entsprechend
der vorliegenden Erfindung sind die mesophilen Xylanasen I-III aktive
Komponenten, die im Xylanasesystem enthalten sind, das von Acremonium
cellulolyticus hergestellt wird. Die vorliegende Erfindung wird
nachstehend im Detail beschrieben.
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Der
Mikroorganismus, der das Xylanasesystem herstellt, das die mesophile
Xylanase entsprechend der vorliegenden Erfindung enthält, ist
der Stamm Acremonium cellulolyticus TN.
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Der
Mikroorganismus Acremonium cellulolyticus TN wurde im Fermentation
Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology,
Ministry of International Trade and Industry von 1-3, Higashi 1-chome,
Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken, Japan (obwohl derzeit wohnhaft
am selben Ort, wurde die Adresse jedoch zu: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, Japan geändert;
und der Name wurde zu National Institute of Bioscience and Human-Technology,
Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International
Trade and Industry geändert)
gemäß dem internationalen Abkommen
mit der Hinterlegungsnummer FERM-BP-685 hinterlegt (am 20. Dezember
1984 von der ursprünglichen
Hinterlegung übertragen).
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Diese
ursprüngliche
Hinterlegung wurde am 13. Oktober 1984 mit der Hinterlegungsnummer FERM
7894 bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science
and Technology, Ministry of International Trade and Industry durchgeführt.
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Das
Xylanasesystem kann zum Beispiel gemäß dem in der Japanischen Patentveröffentlichung Nr.
Hei 1-21957 und der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. Hei 1-171484
beschriebenen Verfahren durch den vorstehend erwähnten Mikroorganismus hergestellt
werden.
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Üblicherweise
wird flüssiges
Medium, das pflanzliche Biomasse wie zum Beispiel Xylan, Xyloglucan,
Cellulose, Avicel, Weizenkleie, Stroh von Reispflanzen, und/oder
Bagasse als Kohlenstoffquelle(n), organische und/oder anorganische
Stickstoffquelle(n) wie Pepton, Hefeextrakt, Nitrat, und/oder Ammonium-Salz;
und kleine Mengen an Metallsalzen enthält, verwendet. Die Züchtung wird
aerob bei 20-40°C
für 2-15
Tage durchgeführt.
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Nachdem
der Mikroorganismus gezüchtet ist,
wird z.B. durch Zentrifugation unlösliche Substanz von der resultierenden
Kultur getrennt, der erhaltene Überstand
(rohe Enzymflüssigkeit)
wird z.B. durch Ultrafiltration konzentriert und ein Konservierungsmittel
und andere Zusatzstoffe werden zur konzentrierten Enzymlösung zugegeben,
oder die konzentrierte Enzymflüssigkeit
wird mittels des Trockensprühverfahrens
zu Pulver getrocknet.
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Mesophile
Xylanasen I-III gemäß der vorliegenden
Erfindung können
durch Reinigung der konzentrierten Enzymflüssigkeit oder des Enzympulvers gewonnen
werden.
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Als
Reinigungsverfahren können
herkömmliche
Verfahren wie das Aussalzverfahren durch Ammoniumsulfat oder ähnliches,
Ausfällung
unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln wie zum Beispiel
Alkohol, Membran-Trennungverfahren, Chromatographie unter Verwendung
von Ionenaustauscher, Träger
für hydrophobe
Chromatographie, Träger
für Gelfiltration
usw. allein oder in Kombination verwendet werden.
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Die
Eigenschaften von hochgereinigten mesophilen Xylanasen gemäß der vorliegenden
Erfindung werden nachstehend beschrieben. Sie sind neue Enzyme,
die bis jetzt nicht in irgendeiner Veröffentlichung bekannt gemacht
wurden.
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Mesophile Xylanase I
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- (a) Aktivität:
hydrolysiert Xylan unspezifisch hauptsächlich zu Xylose, Xylobiose,
Xylotriose und so weiter;
- (b) Substratspezifität:
dieses Enzym wirkt auf Xylan
- (c) pH-Optimum und pH-Stabilitätsbereich: das pH-Optimum ist
3,5 (1a) und es ist bei einem pH-Wert von 3,5-9,5 stabil
(25°C, 2 Stunden)(2a),
bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität unter Verwendung von löslichem Xylan
als Substrat;
- (d) optimale Wirktemperatur: 55°C (3a), bestimmt
durch die Zuckerbildungs-Aktivität
unter Verwendung von löslichem
Xylan als Substrat;
- (e) Temperaturstabilität:
stabil bei 55°C
oder darunter (pH 3,5, 10 Minuten)(4a);
- (f) Molekulargewicht: 30.000, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese
(5) und 69.500, bestimmt durch Gelfiltrationschromatographie;
- (g) Spezifische Aktivität:
112,1 U/mg Protein, bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität für lösliches
Xylan, 76,6 U/mg Protein, bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität für nicht-lösliches
Xylan.
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Mesophile Xylanase II
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- (a) Aktivität:
hydrolysiert Xylan unspezifisch hauptsächlich zu Xylose, Xylobiose,
Xylotriose und so weiter;
- (b) Substratspezifität:
dieses Enzym wirkt auf Xylan;
- (c) pH-Optimum und pH-Stabilitätsbereich: das pH-Optimum ist
3,8 und es ist bei einem pH-Wert von
3,0-9,5 stabil (25°C,
2 Stunden)(2b), bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität unter Verwendung
von löslichem
Xylan als Substrat;
- (d) optimale Wirktemperatur: 55°C (3b), bestimmt
durch die Zuckerbildungs-Aktivität
unter Verwendung von löslichem
Xylan als Substrat;
- (e) Temperaturstabilität:
stabil bei 55°C
oder darunter (pH 3,5, 10 Minuten)(4b);
- (f) Molekulargewicht: 25.500, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese
(5), und 58.000, bestimmt durch Gelfiltrationschromatographie;
- (g) Spezifische Aktivität:
86,1 U/mg Protein, bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität für lösliches
Xylan, 87,6 U/mg Protein, bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität für nicht-lösliches
Xylan;
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Mesophile Xylanase III
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- (a) Aktivität:
hydrolysiert Xylan unspezifisch hauptsächlich zu Xylose, Xylobiose,
Xylotriose und so weiter;
- (b) Substratspezifität:
das Enzym wirkt auf Xylan;
- (c) pH-Optimum und pH-Stabilitätsbereich: das pH-Optimum ist
3,5 (1c) und es ist bei einem pH-Wert von 2,5-9,5 stabil
(25°C, 2 Stunden)(2c),
bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität unter Verwendung von löslichem Xylan
als Substrat;
- (d) optimale Wirktemperatur: 50°C (3c), bestimmt
durch die Zuckerbildungs-Aktivität
unter Verwendung von löslichem
Xylan als Substrat;
- (e) Temperaturstabilität:
stabil bei 50°C
oder darunter (pH 3,5, 10 Minuten)(4c);
- (f) Molekulargewicht: 33.500, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese
(5), und 23.000, bestimmt durch Gelfiltrationschromatographie;
- (g) Spezifische Aktivität:
74,8 U/mg Protein, bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität für lösliches
Xylan, 101,5 U/mg Protein, bestimmt durch die Zuckerbildungs-Aktivität für nicht-lösliches
Xylan.
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Die
Bestimmung der Enzymaktivität
und die Definition einer Einheit (U) werden nachstehend beschrieben.
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Zuckerbildungsaktivität für unlösliches
Xylan
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Ein
Enzym wurde mit einer 2% Lösung
von Xylan (Haferspelzen, Sigma Chem. Co. X-0627) bei einem pH-Wert
von 3,5 und 30°C
inkubiert, und die Menge an Enzym, die ein reduzierendes Zuckeräquivalent
zu 1μMol
Xylose pro Minute gebildet hat, wurde als eine Einheit (U) definiert.
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Zuckerbildungsaktivität für lösliches
X
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Ein
Enzym wurde mit einer 0,25% Lösung von
Xylan (Haferspelzen, Sigma Chem. Co. X-0627)(unlösliche Substanz wurde von einer
gekochten Lösung
von unlöslichem
Xylan entfernt) bei einem pH-Wert von 3,5 und 30°C inkubiert, und die Menge an
Enzym, die ein reduzierendes Zuckeräquivalent zu 1μMol Xylose
pro Minute gebildet hat, wurde als eine Einheit (U) definiert.
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Obwohl
die vorliegende Erfindung nachfolgend im Detail in Beispielen beschrieben
ist, ist die vorliegende Erfindung durch diese Beispiele nicht eingeschränkt.
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Beispiel 1 (Erzeugung
von Rohenzympulver)
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Die
Kultivierung wurde durchgeführt,
um ein aus Mikroorganismen stammendes Xylosepräparat zu erhalten, die zur
Gattung Acremonium gehören, wie
nachstehend beschrieben.
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Alle
Medien für
die Kultivierung wurden durch konventionelle Methoden mit Hitze
sterilisiert.
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Zusammensetzung des Mediums
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4
Gew.-% Cellulose, 1,2 Gew.-% Di-Kaliumhydrogenphosphat, 1 Gew.-%
Bacto Peptone, 0,6 Gew.-% Kaliumnitrat, 0,2 Gew.-% Harnstoff, 0,16 Gew.-%
Kaliumchlorid, 0,12 Gew.-% Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 0,001 Gew.-%
Zinksulfat-Heptahydrat, 0,001 Gew.-% Mangansulfat-Heptahydrat, und 0,001
Gew.-% Kupfer(II)sulfat-Pentahydrat (pH 4.0).
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Nachdem
der Stamm Acremonium cellullolyticus TN (FERM BP-685) in das vorstehend
beschriebe Medium überimpft
wurde, wurde die Kultivierung mit Rühren bei 30°C für 48 Stunden durchgeführt. Die erhaltene
Kultur wurde dann als Ansähkultur
zu einem 15 l-Medium
vermehrt, und die Kultivierung fortgesetzt. Die Vermehrungen wurden
wiederholt um schließlich
nach Ablüftung
und Rühren
für 7 Tage eine
300 l-Kultur in einem 600 l-Tank zu erhalten.
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Die
erhaltene Kultur wurde durch eine Filterpresse filtriert, das erhaltene
Filtrat wurde durch Ultrafiltration auf 15 l konzentriert, und,
um ein Pulver zu erzeugen, wurde das erhaltene Kondensat mittels Sprühtrockenverfahren
nach der Zugabe von 2 kg Lactose getrocknet. Mit Hilfe dieses Verfahrens
wurden 5,0 kg Xylanase-Präparat
erhalten.
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Beispiel 2
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Das
in Beispiel 1 erhaltene Rohpulver wurde in Acetat-Puffer (0,02 M,
pH 5,5) aufgelöst
und unlösliche
Substanz wurde unter Verwendung einer gekühlten Hochgeschwindigkeitszentrifuge
entfernt. Der erhaltene Überstand
wurde als Startmaterial (Rohenzym) für die Enzymreinigung laut der
folgenden Verfahren gereinigt.
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(1) Stark basische Anionenaustausch-Chromatographie
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Das
Rohenzym wurde an QAE-TOYOPEARL 550C (Tosoh Co., Ltd.) gebunden,
die schrittweise Eluierung wurde unter Verwendung von Actetat-Puffer
(0,02 M, pH 5,5) entweder ohne NaCl oder mit 0,04, 0,15 bzw. 0,5
M NaCl durchgeführt,
und eine Xylanaseaktive Fraktion wurde gesammelt, die mittels Acetat-Puffer
ohne NaCl eluiert wurde.
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(2) Wöchentliche basische Ionenaustausch-Chromatographie
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Die
in Schritt 1 erhaltene Fraktion wurde in Acetat-Puffer (0,02 M,
pH 6,0) an DEAE-TOYOPEARL
650 S (Tosho Co., Ltd.) gebunden, die schrittweise Eluierung wurde
unter Verwendung von Acetat-Puffer (0,02 M, pH 5,5) entweder ohne
NaCl oder mit 0,2 M NaCl durchgeführt, und eine Xylanase-aktive
Fraktion wurde gesammelt, die mittels Acetat-Puffer ohne NaCl eluiert
wurde.
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(3) Stark saure Anionenaustausch-Chromatographie
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Die
in Schritt 2 erhaltene Fraktion wurde in Acetat-Puffer (0.1 M, pH
3,5) an Mono S (Amersham Pharmacia Biotech Ltd.) gebunden, eine
lineare Gradienten-Eluierung wurde unter Verwendung von Acetat-Puffer
(0,1 M, pH 3,5), der 0 bis 0,05 M NaCl enthielt, durchgeführt und
die Fraktionen, die Xylanaseaktivität aufwiesen, wurden gesammelt.
Zwei Fraktionen (FI, FII), die nur Xylanaseaktivität aufwiesen, wurden
gesammelt.
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(4) Gelfiltrationschromatographie
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Die
in Schritt 3 erhaltene Fraktion (FI) wurde unter Verwendung von
Acetat-Puffer (0,05 M, pH 3,5) und 0,1 M NaCl durch eine Superdex
75 (Amersham Pharmacia Biotech Ltd.) geschickt und die Fraktionen,
die Xylanaseaktivität
zeigten, wurden gesammelt, wobei die so eluierte Fraktion gereinigte
Xylanase I (mesophile Xylanase I) war.
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5) Gelfiltrationschromatographie
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Die
in Schritt 3 erhaltene Fraktion (FII) wurde unter Verwendung von
Acetat-Puffer (0,05 M, pH 3,5) und 0,1 M NaCl durch eine Superdex
75 (Amersham Pharmacia Biotech Ltd.) geschickt und die Fraktionen,
die Xylanaseaktivität
zeigten, wurden gesammelt. Die als Erstes eluierte Xylanasefraktion
war gereinigte Xylanase II (mesophile Xylanase II) und die als Zweites
eluierte Xylanasefraktion war Xylanase III (mesophile Xylanase III).
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Durch
die vorstehend erwähnten
Verfahren wurden die Enzyme so hoch gereinigt, dass sie, nachgewiesen
durch Proteinfärbung
in nativer- und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, einzelne Banden ergaben.
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Beispiel 3
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Um
das pH-Optimum der in Beispiel 2 erhaltenen, gereinigten Xylanasen
I, II und III bei 30°C
zu bestimmen wurde unter Verwendung von löslichem Xylan als Substrat
die Zuckerbildungs-Aktivität
bestimmt. Das Ergebnis wird in 1a, 1b bzw. 1c gezeigt.
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Wie
in 1 gezeigt wird, zeigten diese Enzyme
(gereinigte Xylanasen I, II und III) eine maximale Aktivität bei pH
3,5, 3,8 bzw. 3,5) wenn McIlvain-Puffer verwendet wurden.
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Die
pH-Stabilität
dieser Enzyme (gereinigte Xylanasen I, II und III) nach der Behandlung
bei 25°C für 2 Stunden
wird in 2a, 2b bzw. 2c gezeigt.
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Wie
in 2 gezeigt wird, waren diese Enzyme
(gereinigte Xylanasen I, II und III) jeweils bei einem pH-Wert von
3,5-9,5, 3,0-9,5 bzw. 2,5-9,5 stabil.
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Beispiel 4
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Um
die optimale Wirktemperatur der gereinigten Xylanasen I, II und
III zu bestimmen wurde unter Verwendung von löslichem Xylan als Substrat
die Zuckerbildungsaktivität
bestimmt. Das Ergebnis wird in 3a, 3b bzw. 3c gezeigt.
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Wie
in 3 gezeigt wird, zeigten diese Enzyme
(gereinigte Xylanase I, II und III) bei 55°C, 55°C bzw. 50°C jeweils bei einem pH-Wert
von 3,5 eine optimal Aktivität.
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Danach
wurde die Temperaturstabilität
dieser Enzyme (gereinigte Xylanasen I, II und III) nach der Behandlung
bei einem pH-Wert von 3,5 für
10 Minuten bestimmt. Das Ergebnis ist in 4a, 4b bzw. 4c gezeigt.
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Wie
in 4 gezeigt wird, waren diese Enzyme
(gereinigte Xylanasen I, II und III) bei ≤ 55°C, ≤ 55°C bzw. ≤ 50°C.
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Beispiel 5
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Um
das Molekulargewicht jeder der gereinigten Xylanasen I, II und III
zu bestimmen wurde unter Verwendung eines 12,5 Gew.-% Gels bei konstanter Stromstärke von
20mA für
80 Minuten bei Raumtemperatur eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt. Das
Ergebnis der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wird in 5 gezeigt.
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Von 5 wurden
die Molekulargewichte der gereinigten Xylanasen I, II und III als
etwa 30.000, etwa 25.500 bzw. etwa 33.500 geschätzt.
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Die
Molekulargewichte der Standardproteine für die Kalibrierung (angezeigt
in
5 durch die Zahlen 1, 2, 3, 4, 5 und 6) sind wie
folgend:
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Die
Enzyme, mesophile Xylanasen gemäß der vorliegenden
Erfindung, sind die Hauptbestandteile im Xylanase-System, das vom
Schimmelpilz Acremonium cellulolyticus abgeleitet ist, und Eigenschaften
der Enzyme wurden zum ersten Mal aufgeklärt.
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Die
Enzyme (mesophile Xylanasen I, II und III) haben optimale Wirktemperaturen
bei 55°C,
55°C bzw.
50°C, das
heißt
bei mesophiler Temperatur bei einem pH-Wert von 3,5, und haben eine
Aktivität
im neutralen bis sauren Bereich.
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Die
Enzyme, mesophile Xylanasen, sind gemäß der vorliegenden Erfindung
für Nahrungsmittelaufbereitung,
Futter, Silo-Futter und andere Zwecke nützlich.
