JP3433300B2 - 酵母細胞壁溶解酵素高生産菌及びこれを用いる酵母細胞壁の溶解方法 - Google Patents

酵母細胞壁溶解酵素高生産菌及びこれを用いる酵母細胞壁の溶解方法

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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、オエルスコフィア(Oe
rskovia) に属する酵母細胞壁溶解酵素(YLase)を著量
生産する能力を有するE24株(菌寄第13692 号)の生産
する酵素または培養液を用いて酵母細胞壁を溶解する方
法、さらにはこの酵素または培養液を用いて酵母細胞壁
を溶解することを特徴とする酵母エキスを製造する方法
に関する。
【0002】
【従来の技術】酵母エキスの製造は、主に自己溶解させ
る方法で行われているが、最近は、呈味性の高い酵母エ
キス製造方法として、市販の酵母溶解酵素(YLase)剤を
用いた酵素溶解法もよく用いられるようになっている。
この酵母溶解酵素(YLase) を生産する微生物は、これま
でにアルスロバクター(Arthrobacter) 属 (特公昭47-3
2674、特公昭48-2790)、オエルスコフィア(Oerskovia)
属(特公昭52-46308、特公昭63-51676) 、ストレプトミ
セス(Streptomyces) 属(特公昭52-31427、特公昭60-2
2916) など多くの菌種が報告されており、すでに酵素剤
として数種市販されている(工業用酵素として、YL-15
(天野製薬株式会社) 、ツニカーゼ(大和化成株式会
社)等。研究用試薬として、ザイモリエイス(生化学工
業株式会社)、キタラーゼ(和光純薬工業株式会社)
等)。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】しかし、工業用として
市販されている酵素は活性が不充分であり、酵母の溶解
に多量(酵母乾燥重量に対して酵素剤1〜数%)の酵素
剤を必要とする。このため、酵母エキスの製造コストに
占める酵素剤の費用が多くなる。一方、研究用試薬とし
て販売されている酵素は、活性が高いが高価である。
【0004】また、前記の微生物による酵母溶解酵素(Y
Lase) 生産においては、培地成分による酵素生産の抑制
が報告されており(Andrews, B. A. and Asenjo J. A.:
Biotechnol. Bioeng., 30, 628-637 (1987)) 、通常の
バッチ培養では菌体増殖が進んだ増殖後期において培地
成分が少なくなってから酵素を生産する(Kitamura,K.,
Kaneko, T. and Yamamoto, Y. : J. Gen. Appl. Micro
biol., 18, 57-71 (1972)) 。従って、培養液の酵素活
性が高くならず、酵素の効率的な生産に不利であり、酵
素活性を高めるために、炭素源を制限した連続培養など
の方法がとられることがある。
【0005】かかる問題を解決するために、本発明者ら
は酵母溶解能を有する微生物を広く天然界より検索し、
排水処理場近傍の土壌より分離したE24が酵母細胞壁を
強力に溶解し、また炭素源及び窒素源を多く含有する培
地でも酵素生産が抑制されることがなく、菌の増殖に伴
って酵母細胞壁溶解酵素を生産することを見出し、本発
明を完成した。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明は、酵母細胞壁溶
解酵素を著量生産する能力を有するオエルスコフィア
Oerskovia sp.) E24 (工業技術院生命工学工業研究
所菌寄託番号第13692 号)である。また、本発明は、前
記菌または該菌が生産する酵母細胞壁溶解酵素を使用す
ることを特徴とする酵母細胞壁の溶解方法である。さら
に本発明は、前記の菌または該菌が生産する酵母細胞壁
溶解酵素を使用することを特徴とする酵母エキスの製造
方法である。
【0007】本発明のオエルスコフィア(Oerskovia s
p.) E24は、寄託番号第13692 号にて工業技術院生命工
学工業研究所に寄託されている。本菌の特性を列挙すれ
ば次の通りである。 I.形態及び培養的性質(肉汁寒天培地 30℃) 1.形態:培養初期は、長桿菌であり一部分枝した形態
が見られる。培養後期に至ると単桿菌から球菌に近い形
態を示す。 2.内生胞子:形成しない。 3.運動性:認められない。 4.鞭毛:認められない。 5.グラム染色:陽性。 6.コロニー:***している。 7.色素:培養後期に黄色色素を産生する。
【0008】II.生理的性質 1.生育条件:20〜37℃の温度範囲で生育でき、42℃で
は生育しない。また、嫌気条件下でも生育する。 2.硫化水素生成:陰性。 3.インドール生成:陰性。 4.カタラーゼ:陽性。 5.オキシダーゼ:陰性。 6.硝酸塩還元性:陽性であるがN2までは還元しな
い。 7.ゼラチン液化:陽性。
【0009】8.ウレアーゼ:陰性。 9.アルギニンジヒドロラーゼ:陰性。 10.リジンデカルボキシラーゼ:陰性。 11.オルニチンデカルボキシラーゼ:陰性。 12.トリプトファンデアミナーゼ:陰性。 13.β−ガラクトシダーゼ:陽性。 14.糖類の資化性:グルコース、アラビノース、マンノ
ース、N−アセチル−D−グルコサミン、マルトースを
資化し、マンニトールを資化しない。
【0010】以上の菌学的知見から本菌はオエルスコフ
ィア(Oerskovia)属に属するものであるが、既に報告
されている同属のオエルスコフィア・ツルバータ(Oers
kovia turbata)、オエルスコフィア・キサンチネオリ
チカ(Oerskovia xanthineolytica)、オエルスコフィア
・シトリア(Oerskovia citrea) とは一部の性質、例え
ば鞭毛の有無、運動性などの点が異なっている。
【0011】本発明ではオエルスコフィア(Oerskovi
a)E24株を液体培地または固体培地で培養するが、酵
母細胞壁溶解酵素を取得するには液体培地の方が便利で
ある。培地としては、用いられる菌が資化できる炭素
源、窒素源、無機塩類、その他微量栄養源を適当な濃度
で含むことが望ましい。本菌は炭素源及び窒素源を多く
含有する培地においても酵素生産が抑制されることな
く、菌の増殖に伴って酵母細胞壁溶解酵素を生産するの
で、培地としてビール工場の余剰酵母や酵母エキス製造
における残渣(YCW)をそのまま利用することがで
き、安価に酵素を生産できる。酵素は、通常の酵素の精
製法に従って精製して使用することができるし、培養上
清をそのまま用いても良い。
【0012】本発明に使用する酵母細胞壁溶解酵素は、
45℃まで、またpH5〜9の間で安定である。反応至適温
度は40〜50℃、至適pHは6〜9と広い範囲で有効であ
る。酵母細胞壁分解酵素活性は、キタムラら(Kitamur
a, K., Kaneko, T. and Yamamoto, Y. : J. Gen. Appl.
Microbiol., 18, 57-71 (1972)) が用いた酵母溶解活
性測定方法を一部次のように改変して測定した。基質
は、YCW溶液(吸光度(800nm) 約 1.0、pH 7.5) を用
い、緩衝液は、pH 7.5の1/15Mリン酸緩衝液を用いた。
反応は、YCW溶液3mlに緩衝液1mlを加え、37℃に保
温した後に酵素液1mlを加えて行った。この反応液の吸
光度(800nm)を酵素液添加直後(吸光度B)および30分
または1時間後(吸光度A)に測定し、次式から酵素活
性を算出した。
【0013】
【数1】
【0014】酵素の生産は、得られた変異株(E24株)
及び、対照としてYLase 生産菌オエルスコフィア・キサ
ンチネオリチカ(Oerskovia xanthineolytica JCM3164)
について行った。各菌株の生産する酵素を市販酵素剤と
比較するために、−80℃アセトン沈澱法により各菌株培
養液から粗酵素を調製し、その酵素活性および蛋白質当
たりの比活性を比較した。結果を下表に示し、本菌の優
位性を示す。 培養上清および粗酵素の活性 菌株名または酵素名 YLase 培養液上清〔U/ml〕粗酵素剤〔U/mg〕比活性〔U/mg蛋白〕 E24 1220 440 4630 JCM3164 62 19 380 YL-15 - 18 300 ザイモリエイス - 960 3430
【0015】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例1 本菌の分離は、YCW 1%、グルコース 0.5%、酵母エ
キス 1%、寒天 1.5%、pH7.5 からなる培地上に採取し
た土壌懸濁液を適宜希釈して塗布し、37℃で培養した。
コロニー周辺に大きなハローを形成する菌はグルコース
及び酵母エキスによる酵素生産抑制を受けず、酵素生産
量が多い菌と判断し、ハローの大きなコロニーを分離
し、E24と命名した。
【0016】本菌を用いる酵母細胞壁溶解酵素生産は、
培地にYCWを使用して振盪フラスコまたはジャーファ
ーメンターを用いて実施した。フラスコ培養は、培地と
して1%YCW 100mlを 500ml容振盪フラスコに入れ、
37℃で3日間培養した。培養終了後、遠心分離(10,000
g、15分) にて培養上清を取得し、その酵母溶解活性を
測定したところ、1220U/mlであった。酵素活性の測定は
前述した方法を用いて行った。
【0017】一方、ジャーファーメンターを用いた酵素
生産の条件は以下の通りであった。 項目 設定 使用ジャーファーメンター:丸菱バイオエンジ (株) 製 MDL-500 培地 :5%YCW、pH 7.5、2L 温度 :30℃ 攪拌数 :300rpm 通気量 :0.5 vvm pH調整 :培養中 NaOHで 7.5に調整 図1に培養中の酵素活性の経時変化を示す。得られた培
養液から遠心分離にて菌体を除去し、粗酵素液とした。
【0018】実施例2 実施例1で得られた粗酵素液を用い乾燥酵母スラリーを
原料として酵母エキス製造を実施した。乾燥酵母スラリ
ー(乾燥酵母10%)に培養液をスラリー 100ml当たり1
ml添加し、45℃、17時間、緩やかな攪拌条件下で酵母エ
キス製造を行った。比較として酵母エキス製造に用いら
れている市販酵素YL-15(天野製薬株式会社製) を固形物
換算 1.0%(w/w)になるように加えて同じ条件下で
酵母エキス製造を行った。反応終了後、遠心分離(8000
g、10分)にて上清と沈澱に分離し、それぞれの乾燥重
量を測定した。エキス収量は、次のように定義して比較
した。
【0019】
【数2】
【0020】次表にその比較を示す。 酵母エキス収量 菌株又は酵素名 添加量〔%W/W〕 エキス収量〔%〕 E24 0.3 37.6 YL-15 1.0 37.2 上表に示したように、本菌の培養液を用いた場合、活性
が高く、少量の使用でも市販酵素を使用した場合と同様
の酵母エキス収量が得られた。
【0021】実施例3 E24株を用いた酵母エキスの製造を行った。乾燥酵母ス
ラリー(乾燥酵母10%)にE24株培養液を1%接種し、
30℃で振盪することにより酵母エキスを製造し、振盪7
日後のエキス収量を測定した。対照として、E24株を接
種せずに同様に振盪した場合のエキス収量を測定した。
エキス収量の測定方法は、実施例2と同じである。7日
振盪した場合のエキス収量の経時変化を次表に示した。
この結果から、E24株を接種することによっても、酵母
エキスを効率的に製造できることが示された。
【0022】 エキス収量の経時変化 エキス収量〔%〕 日数 E24接種 対照 0 12.0 -- 1 13.0 11.3 2 15.3 12.2 4 20.3 13.3 7 26.5 14.0
【0023】
【発明の効果】本発明によれば、新規な菌オエルスコフ
ィア(Oerskovia sp.) E24は炭素源及び窒素源を多く含
有する培地においても酵素生産が抑制されることなく、
菌の増殖に伴って酵母細胞壁溶解酵素を生産するので、
培地としてビール工場の余剰酵母や酵母エキス製造にお
ける残渣(YCW)をそのまま利用することができ、安
価に酵素を生産できる。酵素は、通常の酵素の精製法に
従って精製して使用することができるし、培養上清をそ
のまま用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 実施例1において、培養中のバッチ中の酵素
活性の経時変化を示すグラフである。図中、○はYLase
〔U/ml〕、△は生菌数〔cells/ml〕を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI (C12N 1/20 C12N 1/20 C12R 1:01) C12R 1:01 (C12N 9/14 C12R 1:01) C12P 1/02 (C12P 1/02 C12R 1:01) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 1/00 BIOSIS/MEDLINE/WPID S(STN)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 酵母細胞壁溶解酵素を著量生産する能力
    を有し、かつ下記の菌学的性質を有するオエルスコフィ
    ア(Oerskovia sp.) E24 (工業技術院生命工学工業研
    究所菌寄託番号第13692 号) 。I.形態及び培養的性質(肉汁寒天培地 30℃) 1.形態:培養初期は、長桿菌であり一部分枝した形態
    が見られる。培養後期に至ると単桿菌から球菌に近い形
    態を示す。 2.内生胞子:形成しない。 3.運動性:認められない。 4.鞭毛:認められない。 5.グラム染色:陽性。 6.コロニー:***している。 7.色素:培養後期に黄色色素を産生する。 II.生理的性質 1.生育条件:20〜37℃の温度範囲で生育でき、42℃で
    は生育しない。また、嫌気条件下でも生育する。 2.硫化水素生成:陰性。 3.インドール生成:陰性。 4.カタラーゼ:陽性。 5.オキシダーゼ:陰性。 6.硝酸塩還元性:陽性であるがN 2 までは還元しな
    い。 7.ゼラチン液化:陽性。 8.ウレアーゼ:陰性。 9.アルギニンジヒドロラーゼ:陰性。 10.リジンデカルボキシラーゼ:陰性。 11.オルニチンデカルボキシラーゼ:陰性。 12.トリプトファンデアミナーゼ:陰性。 13.β−ガラクトシダーゼ:陽性。 14.糖類の資化性:グルコース、アラビノース、マンノ
    ース、N−アセチル−D−グルコサミン、マルトースを
    資化し、マンニトールを資化しない。
  2. 【請求項2】 請求項1記載の菌または該菌が生産する
    酵母細胞壁溶解酵素を使用することを特徴とする酵母細
    胞壁の溶解方法。
  3. 【請求項3】 請求項1記載の菌または該菌が生産する
    酵母細胞壁溶解酵素を使用することを特徴とする酵母エ
    キスの製造方法。
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