JP3468626B2 - β−グルコシダーゼおよびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規なβ−グルコシ
ダーゼ、その製造方法およびそのβ−グルコシダーゼを
生産する微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】モノテルペン類はブドウやワインの香り
に重要な働きをしており、ブドウでは、これらの化合物
の多くは、香りのない配糖体として存在している。また
テルペン類と糖とのβ−グルコシド結合は、β−グルコ
シダーゼにより加水分解され、テルペン類が遊離してく
ることが知られている。従ってワインの芳香成分の増加
にβ−グルコシダーゼが適用可能かどうか多くの関心が
もたれているが、β−グルコシダーゼを利用するにあた
りその基質特異性やグルコース阻害などの問題がある。
特に植物、酵母、かび由来のβ−グルコシダーゼはグル
コースによる阻害を受けることが知られている。この中
で唯一グルコース耐性を示すのがサッカロマイセス・セ
ラビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）のペリプラズムより単離されたβ−グルコシ
ダーゼで、グルコース濃度が５％（２８０ｍＭ）でもま
ったく阻害を受けないことが報告されている（Ｖｉｇｎ
ｅＶｉｎ．１９８８，２２，１８９）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、グ
ルコース耐性およびエタノール耐性を具えた新規なβ−
グルコシダーゼ、その製造方法およびそのβ−グルコシ
ダーゼを生産する微生物を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、グルコー
ス耐性およびエタノール耐性を具えたβ−グルコシダー
ゼを産生し得る微生物を求めてスクリーニングを行なっ
た結果、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅ
ｓ）に属する一菌株が新規なβ−グルコシダーゼを生産
することを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００５】本発明の酵素を産生する菌株は以下に述べ
るとおり、菌学的性質からデバリオマイセス（Ｄｅｂａ
ｒｙｏｍｙｃｅｓ）属に属する一菌株と判断され、他の
公知菌株との比較によりデバリオマイセス・ハンセニイ
（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｈａｎｓｅｎｉｉ）に属す
る新規な菌株と同定された。本発明者らは本菌株をデバ
リオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ
ｈａｎｓｅｎｉｉ）Ｙ−４４と命名して、通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年９月１１
日付で受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１６８として寄託し
ている。

【０００６】デバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａ
ｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）Ｙ−４４株の菌
学的性質は以下のとおりである。 （１）形態的性質 麦芽エキス液体培地での増殖形式は多極性出芽増殖であ
り、細胞は球形または短卵形でその大きさは２〜７×
２．４〜８．５μｍである。沈殿物や皮膜を形成する。
麦芽エキス寒天培地で黄色がかった灰白色のコロニーを
形成する。有性生殖は、異形接合で母細胞と娘細胞との
間に起こる。子嚢内に１個ないしは非常に希に２個形成
する。子嚢形成後のコロニーの色調は茶色になる。

【０００７】（２）生理的性質 （２−１）発酵性 グルコース −または非常に弱い ガラクトース −または非常に弱い ラクトース − マルトース −または非常に弱い シュクロース −または非常に弱い （２−２）資化性 ガラクトース ＋ エリスリトール ＋ マルトース ＋ リビトール ＋ シュクロース ＋ マンニトール ＋ セロビオース ＋ イノシトール − トレハロース ＋ 可溶性澱粉 ＋ ラフィノース ＋ コハク酸 ＋ キシロース ＋ 硝酸塩 − アラビノース ＋ （＋：資化する， −：資化しな
い） （２−３）ビタミン要求性 ビオチンおよびチアミン要求性である。

【０００８】以上の性質をもとにＴｈｅ ｙｅａｓｔｓ
／ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ（ｔｈｉｒｄ
ｒｅｖｉｓｅｄ ａｎｄ ｅｎｌａｒｇｅｄ ｅｄｉｔ
ｉｏｎ；ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｎ．Ｊ．Ｗ．Ｋｒｅｇａ
ｒ−Ｖａｎ Ｒｉｊ）で検索し、Ｙ−４４株をデバリオ
マイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｈａ
ｎｓｅｎｉｉ）に同定した。

【０００９】Ｙ−４４株を用いて本発明のβ−グルコシ
ダーゼを得るためには、この菌株を適当な培地に接種
し、常法に従って培養すればよい。なお、本発明の酵素
を取得するために用いる微生物は、上記Ｙ−４４株に限
られず、後記する特性を有する本発明のβ−グルコシダ
ーゼを生産するものであればいかなる菌株を使用しても
よい。

【００１０】本発明において使用される培地は、本発明
に係るデバリオマイセス属の菌が増殖し、β−グルコシ
ダーゼを生産し得るものならば任意の培地が用いられ
る。例えば、炭素源としては通常グルコース、キシロー
ス、セロビオース、グリセロール、コハク酸などが用い
られるが、多量のβ−グルコシダーゼを生産する点から
セロビオースが最も適当である。窒素源としてはミート
エキス、ペプトン、脱脂大豆粉、酵母エキス、麦芽エキ
ス、コーンスティープリカーなどが用いられる他、リン
酸塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウムなど
の無機塩が添加される。

【００１１】培養は好気的条件で、例えば通気撹拌法や
振とう培養法で行なう。培養温度は２０〜３５℃の温度
範囲で行なうが、生育の良好な２５〜３２℃が望まし
い。初発ｐＨは４．０〜７．０が望ましく、培養中のｐ
Ｈも４．０〜７．０が望ましい。培養時間は１２〜３０
時間程度であり、β−グルコシダーゼ活性が最高に達し
た時に培養を終了すればよい。

【００１２】培養後、ろ過または遠心分離またはろ過法
によって菌体を集め、溶菌酵素処理あるいは超音波処
理、フレンチプレス、ホモジナイザーなどの機械的破砕
処理により菌体を破砕し、遠心分離して得られた上清を
粗酵素液として用いる。粗酵素液はそのまま使用するこ
ともできるが、一般の酵素の分離精製法に準じて分離精
製することができる。すなわち、分離液に硫酸アンモニ
ウムなどの塩類を添加し蛋白を沈殿させる塩析沈澱法、
あるいはエタノール、アセトンなどの親水性有機溶媒を
添加し蛋白を沈殿させる溶媒沈澱法により沈澱物を得、
乾燥粉末として用いることもできる。また、さらにイオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィ
ーなどの精製法を用いて活性純度の高い酵素標品を調製
することもできる。

【００１３】このようにして得られた本発明の酵素の活
性は以下の方法にて測定する。１００ｍＭクエン酸−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で希釈した酵素サンプル溶液
０．２ｍｌに、同緩衝液に溶解した５ｍＭ ｐ−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド溶液０．２ｍｌを
混合し、３０℃で１０分間反応させる。その後、１Ｍ炭
酸ナトリウム１．６ｍｌを加えて反応を停止させ、４０
０ｎｍにおける吸光度を測定することにより遊離したｐ
−ニトロフェノールを定量する。このとき１．０ｍＭｐ
−ニトロフェノール溶液の４００ｎｍにおける吸光度を
０．０５７として計算した。また酵素活性を示す１酵素
単位（Ｕ）は、３０℃、ｐＨ５．０において、ｐ−ニト
ロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドから１分間に１
μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成させる酵素量と
して定義した。

【００１４】粗酵素液から各種クロマトグラフィー法を
組合わせて精製することにより得られた本発明酵素の性
質は以下のとおりである。 （１）作用：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラ
ノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシ
ド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド
またはｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノピラノシド
を基質として作用させた場合、いずれの基質もｐ−ニト
ロフェノールを遊離する。 （２）至適ｐＨ：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシドを基質とし、緩衝液として１００ｍＭクエン
酸−リン酸緩衝液（ｐＨ２．０〜７．０）、１００ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）、１００ｍＭグリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を用い
る以外は前記酵素活性測定法に従い、相対活性を測定し
た。その結果は図１に示すとおりであり、反応至適ｐＨ
は７．０付近にある。 （３）ｐＨ安定性：１００ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液
（ｐＨ２．０〜７．０）、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０〜９．０）、１００ｍＭグリシン−水酸化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ１０．０）の各緩衝液中で３０℃に
て３０分間保持した後、前記酵素活性測定法に従い、残
存活性を測定した。その結果は図２に示すとおりであ
り、安定ｐＨ範囲は、ｐＨ６．０〜９．０である。

【００１５】（４）至適温度：前記酵素活性測定法に従
い、各種温度において相対活性を測定した。その結果は
図３に示すとおりであり、至適温度は約２５℃である。 （５）温度安定性：１００ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液
（ｐＨ５．０）中で３０分間保持した後、前記酵素活性
測定法に従い、残存活性を測定した。その結果、本酵素
は図４に示すように、３０℃まで安定した酵素活性を示
し、それを超えると急速に失活した。 （６）各種試薬の影響：各種試薬の本酵素に対する影響
を調べた。すなわち、表１に示す各種試薬を１００ｍＭ
クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に１ｍＭとなる
ように溶解し、これに酵素溶液を混合し、３０℃におい
て１０分間保持した後の残存酵素活性を前記酵素活性測
定法に従い測定し表１の結果を得た。

【００１６】

【表１】

【００１７】（７）分子量：精製した本酵素をスラブゲ
ル電気泳動を行なった結果は１バンドであり、マーカー
としてカタラーゼ（分子量２３２，０００ダルトン）、
乳酸デヒドロゲナーゼ（分子量１４０，０００ダルト
ン）および牛血清アルブミン（分子量６７，０００ダル
トン）を用いて測定した分子量は約９５，０００ダルト
ンである。またＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法を行なった結果は１バンドであり、マーカーとして
ｂ型ホスホリラーゼ（分子量９４，０００ダルトン）、
ウシ血清アルブミン（分子量６７，０００ダルトン）、
卵白アルブミン（分子量４３，０００ダルトン）、カル
ボニックアンヒドロラーゼ（分子量３０，０００ダルト
ン）およびダイズトリプシンインヒビター（分子量２
０，１００ダルトン）を用いて測定した分子量は約２
５，０００ダルトンである。 （８）等電点：マーカーとしてレンズ豆レクチン（ｂａ
ｓｉｃ：ｐＩ８．６５）、レンズ豆レクチン（ｍｉｄｄ
ｌｅ：ｐＩ８．４５）、レンズ豆レクチン（ａｃｉｄｉ
ｃ：ｐＩ８．１５）、馬ミオグロビン（ｂａｓｉｃ：ｐ
Ｉ７．３５）、馬ミオグロビン（ａｃｉｄｉｃ：ｐＩ
６．８５）、ヒトカルボニックアンヒドロラーゼＢ（ｐ
Ｉ５．８５）、β−ラクトグロブリンＡ（ｐＩ５．２
０）、大豆トリプシンインヒビター（ｐＩ４．５５）、
アミログルコシダーゼ（ｐＩ３．５０）を用いて測定し
た等電点は、ｐＩ４．９である。

【００１８】（９）グルコース耐性：０〜５００ｍＭ濃
度のグルコースを含む１００ｍＭクエン酸−リン酸緩衝
液（ｐＨ５．０）中で、前記酵素活性測定法に従い、相
対活性を測定した。その結果は図５に示すとおりであ
り、５００ｍＭグルコースにおいても８０％の相対活性
を示す。 （１０）エタノール耐性：０〜２０容量％濃度のエタノ
ールを含む１００ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ
５．０）中で、前記酵素活性測定法に従い、相対活性を
測定した。その結果は図６に示すとおりであり、２０容
量％エタノールにおいても８０％の相対活性を示す。

【００１９】

【発明の効果】本発明の酵素は、その酵素活性がグルコ
ースおよびエタノールに対し耐性を示し、モノテルペン
配糖体に作用してモノテルペン類を遊離させる微生物起
源のβ−グルコシダーゼであり、食品製造、特にワイン
製造の分野においてその香味改善に応用し得る道を開い
たものである。

【００２０】

【実施例】以下に実施例を示し本発明を具体的に説明す
るが本発明はこれらの実施例により何等限定されるもの
ではない。下記の説明中特に記載がない限り表示濃度は
重量％である。

【００２１】実施例１：炭素源の影響 ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス
０．３％からなるＹＭ基本培地に表２に示す炭素源を
２．０％添加し、塩酸でｐＨ４．０に調整した。これを
２５０ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌ仕込み、１２０
℃、１５分間加圧滅菌した。これにあらかじめグルコー
ス２．０％を含むＹＭ基本培地で培養しておいたデバリ
オマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ
ｈａｎｓｅｎｉｉ）Ｙ−４４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１
６８）の種母を１ｍｌ接種し、２８℃、２００ｒｐｍに
て２４時間振盪培養した。得られた各培養液中のβ−グ
ルコシダーゼ活性を表２に示す。デバリオマイセス・ハ
ンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉ
ｉ）Ｙ−４４株のβ−グルコシダーゼ生産には、炭素源
としてセロビオースが適していることがわかる。またグ
ルコースはβ−グルコシダーゼの発現を抑制している。

【００２２】

【表２】

【００２３】実施例２：菌株の培養 セロビオース２．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス
０．３％、麦芽エキス０．３％からなる培地を塩酸でｐ
Ｈ４．０に調整し、これを５００ｍｌ容の三角フラスコ
に１００ｍｌ仕込み、１２０℃、１５分間加圧滅菌し
た。これに実施例１と同様に調製したデバリオマイセス
・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｈａｎｓｅｎ
ｉｉ）Ｙ−４４株の種母を２ｍｌ接種し、２８℃、２０
０ｒｐｍにて２４時間振盪培養した。得られた培養液を
遠心分離し、菌体を集め、３０ｍｌの２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した。これを同緩衝
液６０ｍｌに懸濁し、菌体重量の２．５倍量のガラスビ
ーズ（直径０．４５〜０．５５ｍｍ）を加え、菌体を破
砕した。遠心分離により菌体破砕物を除き、細胞抽出液
５０ｍｌを得た。これを超遠心処理（１０００００×
ｇ、６０分）してミクロゾーム分画と上清分画に分離し
た。これらの分画のβ−グルコシダーゼ活性を測定する
と、すべての活性が上清分画に存在していたので上清分
画を以下に述べる精製操作に供した。

【００２４】実施例３：酵素の精製 実施例２で得た上清分画５０ｍｌを、２０ｍＭビス（２
−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチ
ル）メタン緩衝液（Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ緩衝液：ｐＨ６．
０）で平衡化したＤＥＡＥトヨパール（ＤＥＡＥ−Ｔｏ
ｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍカラム（φ２６ｍｍ×８０ｍ
ｍ：東ソー株式会社製）に付し、５００ｍｌの塩化ナト
リウムリニアグラジエント（０〜０．５Ｍ）で溶出し
た。活性分画を集め、１．０Ｍ硫酸アンモニウムを含む
２０ｍＭ Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）で平
衡化したブチルトヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅ
ａｒｌ）６５０Ｓカラム（φ９ｍｍ×６３ｍｍ：東ソー
株式会社製）に付し、吸着した蛋白質を１００ｍｌの硫
酸アンモニウムリニアグラジエント（１．０〜０Ｍ）で
溶出した。活性分画を集め、限外ろ過装置（ＰＭ−１
０：Ａｍｉｃｏｎ社製）を用い、４℃にて濃縮した。こ
れを再度、２０ｍＭ Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ
６．０）で平衡化したＤＥＡＥトヨパール（ＤＥＡＥ−
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍカラム（φ９ｍｍ×５０
ｍｍ）に付し、８０ｍｌの塩化ナトリウムリニアグラジ
エント（０〜０．５Ｍ）で溶出し、精製β−グルコシダ
ーゼを得た。以上の精製工程毎における酵素の活性を表
３に示す。

【００２５】

【表３】

【００２６】実施例４：基質特異性 実施例３で得られた精製酵素を用い、表４に示す各種発
色基質の分解試験を行なった。なお、分解試験は前記酵
素活性測定の方法に準じて行ない、ｐ−ニトロフェノー
ルの生成により活性の有無を調べた。結果を表４に示
す。

【００２７】

【表４】

【００２８】表４より、本酵素はｐ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−グルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−
Ｄ−キシロピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−
アラビノフラノシドおよびｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ
−ラムノピラノシドに作用し、いずれの基質もｐ−ニト
ロフェノールを遊離することがわかる。

【００２９】実施例５：ブドウ果汁由来のグリコシド類
に対する作用 水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整した濃縮ブドウ果
汁（３倍濃縮：マスカット種）１０００ｍｌを合成吸着
樹脂カラム（φ２２ｍｍ×３５０ｍｍ、Ａｍｂｅｒｌｉ
ｔｅ ＸＡＤ−２：ローム・アンド・ハース社製）に通
した。これを蒸留水５００ｍｌで洗浄し、水溶性化合物
を除去した。さらにペンタン−エーテル（１：１）１０
００ｍｌを通し、フリーのテルペン類を除去した後、メ
タノール１０００ｍｌでグリコシド類を溶出させた。こ
の分画を３０℃、減圧下にて濃縮乾固し、グリコシド類
２００ｍｇを得た。実施例３で得られた精製酵素溶液２
０ｍｌ（３．２Ｕ、１００ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液
（ｐＨ５．０））に上記グリコシド類１００ｍｇを溶解
し、２２℃にて３日間反応させた。遊離したテルペン類
を２０ｍｌのペンタン−エーテル（１：１）で２回抽出
し、それを濃縮した後、キャピラリーガスクロマトグラ
フィーを用い下記の条件にて分析した。結果を表５に示
す。

【００３０】

【表５】

【００３１】（分析条件） 装置：Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ５９８０ カラム：ＤＢ−ＷＡＸキャピラリーカラム（φ０．２５
ｍｍ×３０ｍ：Ｊ＆ＷＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） 検出器：ＦＩＤ ヘリウム流速：２．０ｍｌ／分 初期カラム温度：７５℃ カラム昇温速度：４℃／分 最終カラム温度：２２０℃ 試料注入部温度：２３０℃ 検出部温度：２２０℃

【図面の簡単な説明】

【図１】 デバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒ
ｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）Ｙ−４４株の生産
するβ−グルコシダーゼの作用ｐＨと活性の関係を示す
グラフである。

【図２】 デバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒ
ｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）Ｙ−４４株の生産
するβ−グルコシダーゼの安定ｐＨ域を示すグラフであ
る。

【図３】 デバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒ
ｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）Ｙ−４４株の生産
するβ−グルコシダーゼの作用温度と活性の関係を示す
グラフである。

【図４】 デバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒ
ｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）Ｙ−４４株の生産
するβ−グルコシダーゼの作用温度安定性を示すグラフ
である。

【図５】 デバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒ
ｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）Ｙ−４４株の生産
するβ−グルコシダーゼの活性とグルコース濃度の関係
を示すグラフである。

【図６】 デバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒ
ｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）Ｙ−４４株の生産
するβ−グルコシダーゼの活性とエタノール濃度の関係
を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645） (56)参考文献 Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｂａｃｔｅｒｉｏ ｌｏｇｙ，1994年，77 （５），519− 527 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ，1987年，26 （６），552−554 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の性質を有するβ−グルコシダーゼ。 （１）作用：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラ
   ノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシ
   ド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド
   またはｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノピラノシド
   を基質として作用させた場合、いずれの基質もｐ−ニト
   ロフェノールを遊離する。 （２）至適ｐＨ：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコ
   ピラノシドを基質として反応させ、遊離するｐ−ニトロ
   フェノールの量を４００ｎｍの吸光度により測定する方
   法での反応至適ｐＨは７．０付近にある。 （３）ｐＨ安定性：３０℃にて３０分間保持した場合、
   ｐＨ６．０〜９．０で安定した酵素活性を示す。 （４）至適温度：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコ
   ピラノシドを基質として反応させ、遊離するｐ−ニトロ
   フェノールの量を４００ｎｍの吸光度により測定する方
   法での反応至適温度は約２５℃である。 （５）温度安定性：ｐＨ５．０にて３０分間保持し酵素
   活性を測定する方法で、３０℃まで安定した酵素活性を
   示し、それを超えると急速に失活する。 （６）阻害剤：ｐ−クロロ安息香酸水銀、Ｃｕ²⁺、Ａｌ
   ³⁺により阻害を受け、エチレンジアミン四酢酸では殆ど
   阻害されない。 （７）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
   動法により測定した分子量は約２５，０００ダルトンで
   ある。 （８）等電点：ｐＩ４．９である。 （９）グルコース耐性：５００ｍＭグルコース中におい
   て８０％の相対活性を示す。 （１０）エタノール耐性：２０容量％エタノール中にお
   いて８０％の相対活性を示す。
2. 【請求項２】 デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙ
   ｃｅｓ）に属する微生物を培養して得られる培養物から
   請求項１に記載のβ−グルコシダーゼを採取することを
   特徴とするβ−グルコシダーゼの製造方法。
3. 【請求項３】 デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙ
   ｃｅｓ）に属する微生物をセロビオース（ｃｅｌｌｏｂ
   ｉｏｓｅ）を含む培地で培養して得られる培養物から請
   求項１に記載のβ−グルコシダーゼを採取することを特
   徴とするβ−グルコシダーゼの製造方法。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のβ−グルコシダーゼ産
   生能を有するデバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａ
   ｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）Ｙ−４４株（Ｆ
   ＥＲＭ Ｐ−１５１６８）。