JPS59166083A - セルラ−ゼの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アクレモニウム属菌によるセルラーゼの製造
方法に関するものである。

セルラーげはセルロースをグルコースまたはレロビΔ−
スやＬ？［」オリゴ糖にまで分解する酵素反応系を触媒
する酵素群の総称であり、その作用様式により、Ｃ１酵
索、Ｃ×酵索とβ−グルコシダーＵあるいはエキソ−β
−グルカナーゼ、エンド−β−グルカナーセとヒロビア
ーゼなど種々の名称で呼ばれる酵素で椙成されているが
、いまだその実体は明らかでない。それは、セルラーゼ
を生産する微生物起源により、結晶性セルロース、カル
ボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）　、セロデキスｉ〜
リン、セロオリゴ糖、セロビオース等に対Ｊる作用様式
の異なる酵素が多種多様に存在することと、天然セルロ
ースの構造上の複雑さに起因している。しかし、セルラ
ーゼは、これら複数の酵素が調和のとれた相互作用を°
リ−ることによりセルロースをその構成糖に分解する複
合酵素である。

近年、セルラーゼはバイオマス賀源の有効利用を図ると
いう観点から注目を集め、盛んに研究されるようになっ
たが。しかし、従来、よく知られているトリコデルマ属
やアスペルギルス属等の微生物の生産するセルラーゼは
、天然セルロースに対づる分解力が充分でなく、またセ
ルロースを完全にグルコースに分解できないでセロビオ
ースや、それ以上のセロオリゴ糖を多量に生成するなど
の問題があっ１ζ。更にまた、従来、知られているセル
ラーゼは、通常、熱安定性に劣っているため、長時間の
糖化反応では４５〜５０℃程度での反応しか行なえない
ため、糖化中しばしば雑菌に汚染されるという危険があ
った。

本発明者らは、結晶性セルロースに対する分解力が優れ
、且つグルコースへの糖化力の優れたセルラーゼ生産菌
を求めて、広く自然界より微生物の検索を行ってきた結
果、土壌中より分離し、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏ
ｎｉｕｍ　）属と同定した糸状菌を分離した。そしてこ
の菌の生産するセルラーゼを工業的に使用Ｊべく、生産
力価の向上について、鋭意、研究を続けてぎた結果、セ
ルラーゼを生産するアクレモニウム属菌をポリエチレン
グリコールの存在下で培養−するとセルラーゼの生産但
が顕著に増加することを認めた。本発明はこの知見にも
とづいてなされたものである。

ずなわら、本発明はセルラーゼを生産井るアクレモニウ
ム属菌を培養してセルラーゼ生産するに際し、ポリエチ
レングリコールの存在下で培養することを特徴どするセ
ルラーゼの生産方法に関するものである。

以下に、本発明の詳細な説明する、。

本発明において使用される、ポリエチレングリコールと
して（ま例えば、ポリエチレングリコール１０００、ポ
リエチレングリコール２０００゜ポリエチレングリコー
ル４０００など、車合度の異なる種々なものが知られて
おり、これらは、いずれも本発明に対し、有効に適用り
−ることができるが、なかんずくポリエチレングリコー
ル１０００程合度のものがより効果的であった。

ポリエチレングリコールは、培地に対して、通常、０．
０１〜５％稈度、望ましくは、０．０５〜０．５％程度
添加される。そして、このようなポリエチレングリコー
ルを添加した培地で、）７クレモニウム属菌を培養りる
と、セルラーゼの生産品が、無添加の場合に比べ顕著に
増加する。例えば、セルラーゼのうらアビレラーゼ話性
は１．１〜１．５倍、カルボキシメチルセルラーゼは１
．５〜２．９倍、β−グルコシダーゼは１．３〜２倍に
増加する。

本発明において使用されるセルラーげ生産菌の菌学的性
質は下記の通りである。

生育二麦芽エキス寒天上では生育は速く、３０℃７日で
直径７０１１０１に達する。集落は最初白色で後にやや
黄色味を４５ひる。気生菌糸はゆるく盛り上がり羊毛状
を呈し、時に細状の菌糸束を形成覆る。

培養後期には集落裏面は桃褐邑ないし赤褐色を呈する。

ツアペック寒天上でもほぼ同様の生育を承りが気生菌糸
の盛り上がりはより少い。生育１）Ｈ範囲は３．５へ−
６．０で最適ｐＨは４イ」近、生育温度範囲は　１５℃
〜４３℃　で、最適作用温度は３０℃（ｑ近である。

形態：菌糸の直径は０．５〜２．５　　μｍ、無色で菌
糸には隔壁が認められる。また、菌糸表面は滑面である
。

分生子、分生子形成能は非常に不安定でツアペック寒天
および麦芽エキス寒天培地による継代培釡により容易に
消失した。分離時におりる観察では、分生子柄は気生国
糸側面より突出し、無色である。

分住子は亜球形（２．５〜５×２〜４．５μｍ　）で滑
面、無色で連鎖は非常にゆるく分散しやすい。

以上の菌学的性質について、Ｗ，Ｑａｍｓのｒ　Ｃｅｐ
ｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍａｒｔｉｇｅ　　３ｃｈｉｍｍ
ｅｌｐｉ１ｇｃｊ　Ｐ８４、Ｇ．　Ｆｉｓｌ＋ｅｒ　　
（１９７１年）及びＣ，　ｌ−１，　ＤｉＣｋｉｌｌＳ
Ｏｎ，　Ｍｙｃｏｌ、Ｐａｐｅｒｓ　’１１５　　Ｐ　
１　０　（１９６８年）を参照した結果、水筒はアクレ
モニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　）属に近縁の糸状菌
と考えるのが妥当であると考えた。なお、アクレモニウ
ム属に゛は、従来、強力なセルラーゼ生産性が知られて
いなかったこと、及び、本発明の菌株が強力、カリ特徴
的なセルラーゼを生産することから、水筒をアクレモニ
ウム・ヒルロリテイノＪス（ＡＣｒｅｎｌＯｎｉＵｍｃ
ｅｌ　１ｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）と命名した。なお、水
筒は、Ｆｌ＝ＲＩＶＩ　　Ｐ−６８６７として、工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

アクレモニウム属は　Ｑ　ａｍｓにより詳細な検Ｎがな
され、以前にセファロスポリウム属どして記載されてい
た属の再検討を行うことにより、近年採用された局名で
ある。従って、アクレモニウム属の局名を用いたセルラ
ーゼ生産菌の記載はまだない。更に、本発明の示すよう
な結晶性セルロースに作用覆ることのできる強力な真の
セルラーゼ、すなわちアビセラーげやｌ−Ｐアーゼを生
産するセファロスポリウム属菌は、本発明以前には全く
知られ一Ｃいない。

水筒の生産するセルラーゼは、作用特性から結晶性の高
いセルロースであるアビヒルに作用する解水、′？Ｊな
わちアビセラーＬ’ｕ：たはＦＰアーゼで代表されるＣ
１酵素、カルボキシメチルセルラーゼ（ＣＭＣ）に作用
する、いわゆるＣＭＣアーゼで代表されるＣｘｔＷ素と
、セロビオースなどセロオリゴ糖に作用づるβーグルコ
シダーＬの主とじ１３種類の酵素群からなる複合酵素系
である。そして、これら酵素群の調和のとれた相互作用
により、天然のけルロースを゛完全にグルコースにまで
分解づることができるのである。以下（ここれら酵素の
性質を記載する。

（Ａ）アビセラーゼの酵素的性質 （１）　作用 セルロース末、アビヒル、脱脂綿など結晶性の高い不溶
性セルロースに対し作用してグルコース、セロビオース
等の還元糖を生成する。

（２）　作用ｐｌ−１及び最適作用ｐ１−１本酵素の作
用ｐＨ１Ｊ囲は２〜８、＠適作用ｐｌ−１は約４．５に
認められノこ。　　（第１　図　（ａ　）　）（３）　
安定ｐＨ クエン酸−リン酸塩緩＠液の下で４５℃で２０時間放同
じたときの安定ｐＨｌ値間は約３．５〜約６であった。

（第１図（Ｃ））（４）　作用温度範囲及び最適作用温
度本酵素は約９０°Ｃまでの高温に作用づるが、１％ア
ビセル、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐ１〜（／１．５）の
下で１０分間反応さ氾たときの最適作用温度は約６５℃
に認められた。（第１図（ｂ〉）（５）　熱安定性 本酵素を０．０５　Ｍ耐酸緩衝液（ｐｌ−１　４．５）
の下で、各温度で１０分間加熱処理した結果、本酵素は
約６０℃までの渇１腿ではほとんど失活せず、６５℃、
１０分間の加熱で約５０％、そして７０’Ｃ。

１０分間の加熱で約８０％失活した。（第１図（ｄ））
（６）　　１ｉＩＩ害剤 各種小金属イオンのうらで１ｍＭ以上の水銀イオンＪ５
　にび銅イオンにより強く阻害される。また、５ＨＩＩ
害ｉ１ｊ　ｃ、あるパラクロルマーキュリ−ベンゾエイ
１〜によっても１ｍＭで約と）′１％の１ｔｌＪ害を受
（プる。

（７）　精製法 本酵素は培Ｍ　濾ｉｉ１から小口ファイバー（アミコン
１刊−Ｐ５）ににり脱塩濃縮してのら、ＤＥ八［−レフ
ァーース（ＣＬ−６Ｂ＞によるカラムクロマトグラフィ
ー（Ｎａｃｌ　　Ｏ→１Ｍグラジエン１〜）と同カラム
による再クロマトグラフィー（ＮａＣＩ　　Ｏ→０．６
〜１）により、より精製Ｊることが−ｃきる。

（８）　分子Ｍ Ｂｉｏ−ｇｅｌ　　（Ａ　０．５ｍ　）ノＪラムによる
ゲル’ａＧ過払により測定した分子量は約１４０，００
０であった。

（９）　活性測定法 ０．１Ｍｌ！ｉｔ酸緩衝液に０．５％濶１哀のアビセル
恕澗物（ｉ）ｌ−１４，５）０．５ｍｌに適量の酵素液
を加え、蒸溜水で全量１．０　−ｍｌとし、５０”Ｃで
反応を行った。そして生成覆る還元糖はソモギー・ネル
ソン法により測定した。

この条件で、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当す
る還元ツノを生成する酵素南を１単位とした。

（Ｂ）ＣＭＣアーゼの酵素的性質 （１）　　ＣＩＶＩＣアーゼの多成分法ＣＭＣアーＬは
ディスク電気泳動的に少くとも４成分に分離され、それ
ぞれは分子量と等電点により区別される。ＣＭＣアーゼ
Ｉは分子量約１６０，０００で等電点５，０８　、以下
同様に■は約１６０，０００．４．９５．１１１ｔｃｌ
：約１２０，０００．４，６０　、ＩＶハ約１２０，０
００．　４．４８テあり、これらアイソザイムの複合物
よりＣＭＣアーゼは成っている。

（２）　カッ囲ζキシメチルセルロース（ＣＭＣ）　等
の可溶性セル１］−ス誘導体に作用し、これをグルコー
ス及びセロビオース等に分解する成分（ＣＭＣアーゼ■
および■）とグルコースを極わずがしか生成けずセロビ
オース以上のセロオリゴ糖に分解する作用を持゛っ成分
（ＣｔｖｌＣアーゼ■、ＩＶ）が存在する。

（３）　作用１）Ｈ及び最適作用１）ＨＣＭＣアーゼ複
合体の作用１）Ｈ範囲は、はぼ２〜８にわたり最適作用
１）Ｈは約４．５に認められた。（第１図（ａ）〉（４
）　安定１）ｌ−１ クエン酸−リンＭ塩緩衝液の下で４５℃で２０時間放置
したときのＣＭＣアーゼ複合体の安定ｐ１−１範囲は約
３．５〜約６であった。

く第１区＋　　（Ｃ’　　）　　） （５）　作用温度範囲及び最適作用温度このＣＭ　ＣＬ
ｉ’　−ｆ複合体は約９０℃までの高温に作用Ｊるが、
１％ＣＭＣ，０，０５Ｍｌ酸緩衝液（ｐＨ４，５＞の下
で１０分間反応さぼたときの最適作用）晶磨は約６５℃
にｔ２められた。く第１図（ｂ））（６）　熱安定性 本酵素を０．０５　Ｍ酢酸緩衝液（１）ｌ−１４，５）
の下で、各温度で１０分間加熱処理した結果、本酵素は
約６０℃までの温度ではほとんど失活せず、６５°Ｃ１
１０分間の加熱で約１０％、そして７０℃、１０分間の
加熱で約７０％失活した。（第１図（ｄ））（７）　阻
害剤 各種重金属イオンのうちでｌｎ＋Ｍ以−ヒの水銀イオン
Ｊ３よび銅イオンにより強く阻害される。

（８）　精製法 本酵素は培養濾液からボロファイバー（アミコンＩ」１
−Ｐ５）により脱塩濃縮してのち、ＤＥＡＥ−セファロ
ース（ＣＬ−６Ｂ）によるカラムク［１マドグラフイー
（ＮａＣＩ　　Ｏ→１Ｍグラジエン１へ）と同カラムに
よる再クロマ１〜グラフイー及びクロマトフＡ−カスシ
ングにＪ：り各成分に精製できる。

（９）　活性測定法 ０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解させた１　％ＣＭｃ溶ａ　（
ｐｔ−１４，５＞０．５ｍｌに、適量の酵素液を加え、
蒸溜水で全量１．０ｍｌとし、５０℃で反応を行った。

そして、生成する還元糖はソモギー・ネルソン法により
測定した。

この条件で、１分間に１μｍｏｌ’のグルコースに相当
する還元力を生成する酵素岱を１単位とした。

＜Ｃ）β−グルコシダーげの酵素的性７１（１）　作用 １ナリシン、ゼロビオース、Ｌ’ＤＩ−リＡ−ス、レロ
テトラオース、レロベンタオース、セロテトラオースの
ようなセロオリゴ糖に作用して、これをグルコースに分
解づる。また、本酵素はアビセルのＪ：うな高分子セル
ロースにも作用するがＣＭＣや１−ＩＥＣ（ヒドロギシ
エヂルセルロース）にはほとんど作用しない。ザリシン
、ＬロビＡ−ス、セロトリオース、セロテトラオース、
ＬロペンタＡ−ス及びレロヘキザオースに対するＫｍ値
は、それぞれ３．４０　、　２．２Ｇ、１．１９．０．
８２．０．５２　ソシＴ：　０，５１１１Ｍテアッた。

（２）　作用１）ｌ−（及び最適作用１））−１本酵素
の作用ｐＨ範囲は２〜８、最適作用ｐＨは約４．５にル
２められた。（第１図（ａ）） （３〉　安定１）Ｈ クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で４５℃で２０時間放置
したときの安定吐範囲は約３．５〜約５であった。（第
１図（Ｃ））く４）　作用温１良範聞及び１１４適作川
温瓜本酵素は約９０℃までの高温に作用するが、１％１
ノ′リジン、０．０５　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，！ｉ）
の下で１０分間反応さＵたときの最適作用温度は約６５
℃に認められた。（第１図（ｂ））（５〉　熱安定性 ０．０５　Ｍ酢酸緩衝液（ｐｌ−１４，５）の下で、各
温度で１０分間加熱処理した結果、本酵素は約６５°Ｃ
までの高温ではほとんど失活せず、７０℃、１０分間の
加熱で約４０％失活し、そして８０’Ｃ１１０分間の加
熱で９０％以上失話した。（第１図（ｄ））（６）　阻
害剤 各種重金属イオンのうち１１ＩＩＭ以上の水銀イオンｉ
ｌ’ｉ　、Ｉび１４イＡ−ンにより強く阻害される。ま
た、グルコース−δ−ラクトン（ま基？１に対して拮抗
阻害剤とし−Ｃ作用覆る。

（７）　精製法 本酵素は培養ｄ液からポロファイバー（アミコンｌ−１
１−Ｐ５）により脱塩濃縮したのち、ＤＥＡＥ−セファ
０−ス（ＣＬ−６Ｂ）によるカラムクロマトグラフィー
（ＮａＣＩ　　Ｏ→１Ｍグラジエン１〜）とクロマｌ−
フォーカシング（ｐＨ６→４）とＢｉｏ−ｇｅｌ　　（
Ａ　０．５ｍ　）によるゲル濾過により、電気泳動的に
均一まで精製づ−ることができ染 （８）　分子量 Ｂｉｏ−ｇｅｔ　　（Ａ　Ｏ，５ｍ　）を用いるゲル濾
過法により測定した分子ｍは約２４０，０００であった
。

（９）　活性測定法 ０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解させた２％サリシン溶液（１
）Ｈ４，５）０．５ｍｌに適量の酵素液を加え、蒸溜水
で全ｆｉ　１．０ｔｎｌとし、５０℃で反応を行った。

そして生成覆るグルコースをソモギー・ネルソン払によ
り測定した。

この条件で、１分間に１μ１Ｉｌｏｌのグルコースに相
当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。

本発明のβ−グルコシダーゼは、ザリシンやｅロピオー
スのような小さい分子の基ｉｄよりもセロヘキザオ°−
スやけロペンタオースのようなΔリボ糖に対してＪ：り
親和性が大きく、かつ本酵素はアどレルのような高分子
坦の基質に対しても作用する。特にセミビオースを分解
し、かつアヒレルを相当程度分解できる基質特異性を持
った酵素の存在は本発明により初めて明らかになったも
のであり、しかも生成物はりべてグルコースであること
など本閑の生産するβ−グルコシダーゼは、従来知られ
ていない新規なβ−グルコシダーゼであって、源粉に対
するグルコアミラーゼとよく似た作用特性をもっことか
ら本発明賃らはこの酵素をグルコセルラーゼと命名した
。

二のように、本発明のアクレモニウム属菌により生産さ
れるセルラーゼは、新規なβ−グルコシダーゼを含む新
規なセルラーゼ複合酵素剤である。

次に実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１ セルロース４％、　ＫＩＩ２　ＰＯ４１，２％、　バク
１〜ペプトン　１％、Ｚｎ’ＳＯ４・７Ｈ２０ｉｘ　ｉ
Ｑ−：］％、　ＫＮＯ３０，６％、へ４１１８０４　　
・　７１−１２０　１ｘ　　１０−コ　％、　　尿素　
　０．２％、Ｃｕ　８０４　　・５Ｈ２０ｉｘ　１０．
−３％、　ＫＣＱ　Ｏ，１６％、１）ｌ−１４，０、Ｍ
！Ｊ　８０４　・７Ｈ２００，１２％、の組成からなる
培地と、これにポリエチレングリコール１０００を０．
０５〜０．４　　％吊添加した培地、各２０ｍ１を２０
０ｍ１容三角フラスコ１に入れ、常法により殺菌後、ア
クレモニウム・セルロリティカス（ＦＥＲＭ　　Ｐ−６
８６７）を接種し、３０℃で８０間好気的に培養した。

培養後、遠心分離して得た上澄液について、生産された
ゼルラーゼのアビレラーゼ、カルボキシメチルレルラー
ゼ（ＣＭＣアーゼ）及びβ−グルコシダーゼ活性を測定
した。結果は第１表に示す通りであっＩＣ０ 第１表 表から明らかなように、０，０５％　量のポリエチレン
グリコール１０００の添加にＪ：リアごセラーゼは、無
添加の場合に比べ１．２イ８に増加した。ＣＭＣアーゼ
は、０．４％量のポリエチレングリコール１０００の添
加にｊ、す２．１倍に増加した。そして、β−グルコシ
ダーゼは０．４％用のポリエチレングリコール１０００
の添加により１．７倍に増加した。

実施例２ 実施例１で使用した基本培地にポリエチレングリコール
１ｏｏｏ、２０００ど４０００をそれぞれ０．１％添加
した培地にアクレモニウム・セルロリティカス（ＦＥＲ
Ｍ　　Ｐ−６８６７）を接種し、３０℃で６日間好気的
に培養した。培養後、遠心分離して得た上澄液について
、生産されたセルラーゼのアビセラーゼ、ＣＭＣアーゼ
とβ−グルコシダーゼ活性を測定した。（；１られた結
果は第２表に示８Ｊ−通りであった。

表から明らかなように、試験したポリエチレングリコー
ル１ｏｏｏ　。

２０００及び４０００はいずれもアビセラーゼ、ＣＭＣ
アーゼとβ−グルコシダーゼの生産に対して有効であっ
たが、中で−ｂポリエヂレングリコール１０００はより
効果的であった。

第２表 第１図はアクレモニウム（ＦＦＲＭ　、Ｐ−６８６７＞
の生産するＬルラーゼのアビレラ−１、ＣＭＣアーゼ及
びβ−グルコシダーゼについて、（ａ　）最適作用ｐＨ
１（ｂ）最適作用温度、（ｃ　）　ｐｌ−１安定性そし
て（ｄ　）熱安定性を示している。

官庁出願 手続補正書　く自発） 昭和５９年２月９日 特許庁長官殿 １、　事件の表示　　昭和　５８　年特許願第　３８４
３４　　号２、　発明の名称　　　セルラーゼの生産方
法５、　補正命令Ｑ日イ］　　自　　弁 別　　紙 １、明細書第２頁第４行目の「なったが。しかし」を「
なった。しかし」に訂正する。

２、明細書第２頁第１１行目の「行なえないため」を「
行えないため」に訂正する。

３、間層１山第３頁第３行のＵセルラーゼ生産するＪを
「セルラーゼを生産する」に訂正する。

４、明細書第４頁第１１行目の「分生子、分生子形成能
は」を「分生子：分生子形成能は」に訂正する。

５、明細書第４頁第１２行目の１容易に消滅した。」を
「消滅する。」に訂正する。

６、明細書第５頁第９〜１０行目の「近年採用された・
・・・・・記載はまだない。更に、本発明」を「近年採
用された局名であり、本発明」に訂正する。

７、明細書第５頁第１２行目〜第１３頁第１行目の１セ
フアロスポリウム」を１アクレモニウム」に訂正する。

８、明細書第８頁第４行目の「多成分法」を「多成分性
」に訂正する。

９、明！１１１１第９頁第１８行目の「クロマトフォー
カスシング」を「クロマトフを一カシング」に訂正する
。

１０、明ｆ＠Ｆ５第１２頁第１行目の「均一まで精製す
る」を「均一なまで精製する」に訂正する。

１１、明細書第２頁第４行目の１２％サリシン溶液」を
「１％サリシン溶液」に訂正する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. セルラーゼを生産するアクレモニウム属菌を培養してけ
   ルラーゼを生産するに際し、ポリエチレングリコールの
   存在下で培養することを特徴とするセルラーゼの生産方
   法