JPH01157373A - バクテリオフアージの検出装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、発酵工業、発酵食品工業に大打撃を与えるバ
クテリオファージの検出装置に関し、また人間または動
植物にとって有用または有害な淡水性または海洋性細菌
に作用するバクテリオファージの探索に適用できるバク
テリオファージの検出装置に関する。

〔従来の技術〕

細菌を用いる発酵工業、発酵食品の製造分野におけるバ
クテリオファージ（以下ファージという）の汚染は、発
酵製品の製造を妨げ、その損害も致命的なものとなるた
め大きな問題である。実際多くの発酵製品でファージ汚
染が知られている。例えば、チーズヨーグルト製造分野
ではサツカロマイセス・クレモリス（Ｓａｃｃｈａｒ。

ｍｙｃｅｓ　Ｃｒｅｍｏｒｉｓ）　、サツカロマイセス
・ラクテイス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔ
ｉｓ）、サツカロマイセス・サーモフィリウス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｒｎ−ｏｐｈ　ｉ　ｌ
　ｉ　ｕＳ　）　ｅ　　ラクトバチルス争アシドフィル
ス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌ
ｕｓ）等、清酒の分野ではラクトバチルス・プレビス（
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ−ｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）等、糸
引納豆の分野ではバチルス・ナラトウ（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｎａｔｔｏ）、Ｌ−グルタミン酸発酵の分野ではミ
クロバクテリウム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）等、
抗生物質製造の分野ではストレプトマイセス・グリセウ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）等の
宿主菌を溶菌させるファージによる汚染がある。

これに対し、これまでのファージ汚染対策はもっばら予
防的なもので、積極的にファージを不活性化する方法や
薬剤は末だ開発されていない。ファージに感染した後、
途中でその溶菌を止めることは不可能であるし、宿主細
菌の増殖と共にファージも増殖するので、培養条件など
を変えてファージの増殖のみを押えることは不可能であ
る。結局、工場全体あるいは製造現場を熱湯により清浄
にし、器具や容器の殺菌を完全にするといった雑菌対策
がファージ対策の中心である。′ ファージ汚染を回避する最も実用的な方法はいわゆるロ
ーテーション法である。即ち、ファージに抵抗性を有す
る菌株をあらかじめ選んで置き、ファージ汚染が起きた
ら直ちにその７アージに抵抗性を有する菌株に変えてい
く方法である。しかしこの方法はファージに抵抗性を有
する菌株のない細菌（例えば納豆菌の場合）では、ファ
ージはその種の全ての菌株を侵すのマこの方法を用いる
ことはできない。このような細菌の場合は、如何に早く
ファージ汚染を探知するかというファージ予察と、どの
工程で感染が起きたかをつきとめるいわゆる感染源の探
索によって迅速にファージ汚染防止対策を講じることが
ローテーション法同様重要である。

従来、平板培養法によるファージの検出可能な下限濃度
は１／−である。ところがファージ汚染をいち早く察知
し、感染源の量的指標を把握するためにはできるだけ低
いファージ濃度を検知することが望ましい。そこで半定
量的ではあるが１０−３／−水準のファージ濃度を定量
する簡易定量法（加菌法）が提案されている。この方法
は概ね次のとおシである。

宿主菌濃度１０１／−以上の菌液に少なくともファージ
を１個含むように試料水を加えて適当時間培養する。つ
いで菌液を混和した寒天培地を固めた平板表面上に上記
培養液を画線し、適当時間培養後、画線に沿った溶菌斑
の有無を確認する。

この方法では、上記のように少なくとも１個のファージ
粒子が含まれた試料を混合できる量は高々１０００−で
あり、このためファージ濃度の定量下限は１　ｏ−７艷
にすぎない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

通常食品工場で使用される用水又は発生する排水は製造
規模によって異なるが一日数ｍ３〜数αｍ３になる。通
常、用水は食品衛生上、機器洗浄に用いられる前には十
分な殺菌操作を経るためファージ汚染の原因となること
は稀れである。

一方排水には常時発酵に用いられる菌が機器の洗浄に伴
って流入するためファージの存在する不可避性が高い。

排水からのファージの定量は、感染源となるファージの
探索と共に、その工場におけるファージ汚染の指標とな
るものであるから、実際のファージ汚染の有無にかかわ
らず定期的に精度よ〈実施することが重要である。

しかし、従来の方法によるファージ下限濃度の１０−ｓ
／−水準の精度でも必ずしも十分でない。

例えば１０−’／Ｎｌのファージ濃度の場合、１　ｍ”
中には１００個のファージが含まれることになるため、
排水の管理を怠れば排水の飛沫、従来者の衣服、くっ、
手足等への排水の付着からファージによる汚染が起こシ
得るからである。また−日数ｍ３〜数百ｍ３の排水から
高々１０００−程度しか採取しないためファージの検出
可能な水準は高くない。

そこで本発明者らは大量の試料水から微量のファージを
失活させることなく捕捉・濃縮させる方法を先に提案し
た（特願昭６２〜２１８０２７及び特願昭６２〜２１８
０２Ｂ）。

〔発明の目的〕

本発明は上記発明をよシ具体的に実施する手段上提案す
るものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、 （１）　　大量の試料水から微量のファージを失活させ
ることなく捕捉・濃縮させるために、キトサン成形物ま
たは不溶性ピリジニウム型樹脂を用いる点、 （２）大量の試料水とキトサン成形物または不溶性ピリ
ジニウム型樹脂を効率良く接触せしめる方法として充填
方式接触、１を用いる点、を新規とするもので、本発明
は粒状のキトサン成形物または不溶性ピリジニウム型樹
脂を充填したカフム、バクテリオファージを検出すべき
試料水を当該充填物と繰り返し接触させる手段および当
該バクテリオファージの宿主菌を含む培養液を当該充填
物と繰り返し接触させる手段からなるバクテリオファー
ジの検出装置である。

〔作用〕

本発明は試料水中の微量のファージを失活させることな
くキトサン成形物または不溶性ピリジニウム型樹脂より
なる吸着剤に吸着担持させたまま宿主菌とともに培養し
、ファージの溶菌斑を形成させて、ファージを検出する
ものである。

以下、本発明のキトサン成形物、不溶性ピリジニウム型
樹脂について説明し、更に本発明方法の一態様を作用と
共に説明する。

キトサンはキチンの脱アセチル化物でキチンを濃アルカ
リと加熱して得られる白色無定系粉末である。本発明で
使用されるキトサン成形物は脱アセチル化度２０〜９０
％、平均分子量１０００〜２３（１，０００、粒度Ｑｌ
〜五〇＋ｗの性状を有するものが好ましい。

キトサンを成形物として使用するのは、試料水とキトサ
ンの接触を充填カフム方式で行えるようにするためであ
る。

キトサン成形物は次のようにして得られる。

キトサン（例えば脱アセチル化度８０％、平均分子量４
へ０００）７０２を酢酸５５１を含む水９３０？に溶解
し、粘度２．５００　ｃｐｓのキトサン酸性液を得、こ
れを（Ｌ１５ｍ径のノズｙよシフ％苛性ソーダ、５０％
エタノール１６３％水からなる塩基性溶液中に一定量づ
つ落下させ粒状に凝固再生させた後、水で中性になるま
で充分洗浄するといった方法によって、５０〜１００メ
ツシユのキトサン粒状成形物を湿潤状態で４３０−を得
ることができる。

キトサン成形物はファージを失活させること々く吸着す
ることができ、かつその吸着能力は他の吸着能力のある
吸着材よりも著しく高い性質を有する。例えばＡｔ（Ｏ
Ｈ）、のファージの吸着数は２．０×１０８／１である
に対し、キトサン成形物は＆　ＯＸ　１０１３／りであ
る。この上キトサン成形物は吸着したファージを失活さ
せることはないが、Ａｔ（ＯＨ）ｓに吸着されたファー
ジは失活していることが多い。

不溶性ピリジニウム型樹脂の一例としては下記のものが
あげられる。

四ｘｃａＨｓ この樹脂は、橋かけポリ−４−ビニルピリジンを臭化ベ
ンジルによって四級化したものである。

ＣＨｔＣ６Ｈ暴 〔本発明の一態様とその作用〕 工場の排水を１μｍガラスフィルターで濾過することに
よシ、排水中の夾雑物、懸濁物質を除去する。この際、
ファージは濾過液側、即ち試料水に含まれる。

試料水とキトサン成形物または不溶性ピリジニウム型樹
脂（以下、ファージ吸着剤という）が繰り返し接触する
ことによシ試料水中のファージはファージ吸着剤に失活
することなく吸着される。

ファージは核酸とタンパク質のみからなシ、それ自体で
は増殖せず、特定の細菌（宿主菌）に寄生・増殖し、最
終的にはその細菌を溶菌する特性を有する。ファージの
外殻溝成物質はタンパク質であシ、キトサンまたは不溶
性ピリジニウム型樹脂などの吸着剤はこのようなタンバ
り質を極めて良く吸着する。特にファージの頭部は細菌
に吸着作用を有する吸着部位に比べて比較的大きいため
、大部分のファージは上記ファージ吸着剤にその頭部が
吸着される。即ちファージはその活性を維持したまま吸
着剤に吸着されている。

ファージを吸着したファージ吸着剤と培養液が接触する
ことにより、培養液に含まれる１０”／−以上の宿主菌
のいずれかがファージ吸着剤上のファージに吸着される
。ついでファージは宿主菌内にその遺伝子を注入し、菌
内で増殖し、やがては宿主菌を溶菌して培養液中に子の
ファージを放出する。さらにこの子ファージは他の宿主
菌に作用して同じように溶菌させながら、増殖する。

ファージを増殖させた培養液を、別途準備しておいた宿
主菌の前培養液と共＜、ｔＳ％の寒天を含む［Ｂ培地に
注加して、プレートを作成し、２０℃、１６〜２４時間
培養することによシ、培養液中のファージの存否をプレ
ート上で観察できるようになる。

培養液中の宿主菌もファージ吸着剤に吸着される性質が
あるため試料水からファージ吸着剤に吸着されていたフ
ァージと宿主菌とが接触する頻度は高くなる。

〔実施例〕

以下、糸引き納豆工場の排水を例にとって、第１図を参
照しながら本発明の一実施例をあげる。

予め定量しておいた納豆菌ファージを１０−４／−含む
糸引き納豆工場の排水ｉｏｔを１μｍガラスフィルター
で濾過しく図示省略）試料水１ａとして試料水槽１に貯
留する。

まず、弁２および弁６を開け、試料水槽１から試料水１
ａをポンプ３によってカラム４の下部に流入させる。カ
ラム４にはあらかじめオートクレーブ滅菌（１２１°Ｃ
２１５分間）又はアルコール滅ｍＣ７０％エタノール溶
液）したファージ吸着剤５を充填している。ファージ吸
着剤５としては、キトサン粒状成形物又は不溶性ピリジ
ニウム型樹脂が用いられる。

キトサン粒状成形物の場合、次のようにして成形する。

即ち脱アセチル化度８ｏｚ、平均分子量４６０００のキ
トサン７０ｆを、酢酸３５１を含む水９３０ｆに溶解し
、粘度２５００ｃ’ｐｓのキトサン酸性液を得る。該溶
液を（１１５−径のノズルよ）７％苛性ソーダ、３０％
エタノール、６３に水からなる塩基性溶液中に一定量づ
つ落下させ粒状に凝固再生させた後、水で中性になるま
で充分洗浄して、５０〜１００メツシユのキトサン粒状
成形物を湿潤状態で４３０−得る。このようにして得た
キ）サン粒状成形物３５ｔ（乾燥重量として）をファー
ジ吸着剤５として用いる。このときの充填容量は約４０
０−である。

なお本発明で使用しうるキトサンの性状が、脱アセチル
化度２０〜９０９６、平均分子ｆｋ１０００〜２３０．
０００、粒度（Ｌ　１〜ｌ　Ｏｍであれ・ば任意に使用
できる。

また不溶性ピリジニウム型樹脂の場合は、橋かけポリ−
４−ビニルピリジンを臭化ベンジルによって四級化した
橋かけ−Ｎ−ベンジｆｖ−４−ビニルピリジニウムプロ
ミドが使用できる。

即ち、その製法は次式で表わされる。

」 ＣＨ，ＣｓＨ。

この樹脂の（Ｌ２〜α３ｆ１粒状物１０ｔ（乾燥重量と
して）をファージ吸着剤５として用いる。

このときの充填容量は約１５０−である。

試料水１ａの供給流量は、ファージ吸着剤５と試料水１
ａとの接触時間が１０〜１５分間となるようにポンプ３
の流量を設定する。

ファージ吸着剤５と接触した試料水１ａはカラム４の上
部から弁６を通じて試料水槽１に戻る。このようにして
試料水１ａとファージ吸着剤５の接触は４〜５時間継続
して行なう。このときの液温は２０℃以下とする。２０
″Ｃ以下で接触させるのは雑菌の増殖を抑制するためで
ある。

ついでカラム４内の試料水１ａを除いた後、弁２および
弁６を閉じ、弁８および弁９を開ける。

培養液槽７には培養液７ａがあらかじめ満たされており
、弁８、ポンプ３を通じてファージ吸着剤５と接触し、
弁９を介して培養液槽７に戻す。この操作を２０°Ｃで
１６〜２４時間継続する。ポンプ３の設定流量は上記と
同様、７ア一ジ吸着剤５と培養液７ａの接触時間が１０
〜１５分となるようにする。培養液７ａは、納豆菌（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｎａｔｔｏ）　　をあらかじめＬＢ培
地（バクトドリプトン１０ｆ１酵母エキス５ｆ。

ＮａＣｔ５Ｆ、蒸留水１１％ｐＨ７，０〜７．５　）で
３０℃、３２時間培養した後その菌液（前培養液）を添
加した新たなＬＢ培地５００−である。

なお前培養液の添加量は培養液７ａの菌数が１０ａ／−
以上となるようＫする。通常５〜１゜−程度である。

ついで培養液７ａの１Ｗｔを採取しあらかじめ溶解して
４８℃に保ったｔ５Ｘ寒天を含むＬＢ培地に、別途準備
しておいた納豆菌の前培養液と共に注加してプＶ−）を
作成し、２０″Ｃ１１６〜２４時間培養した。同様にし
て合計５枚プレートを作成・培養した。それによってプ
レート上の溶菌斑の有無を観察しファージの存否を検索
した。

〔比較例〕

実施例で用いた試料水から１０．ｊｏｏ、１０００−づ
つ分取し、それぞれに納豆菌の前培養液を菌数が１０１
１／ｆｌＩｔ以上となるように注加した後、２０℃、１
６〜２４時間培養した。その液の１−を実施例と同様に
してあらかじめ溶解して４８℃に保った１、５％寒天を
含むＬＢ培地に、別途準備しておいた納豆菌の前培養液
と共に注加してプレートを作成し、２０℃、１６〜２４
時間培養した。同様にして合計５枚プレートを作成培養
した。

それによってプレート上の溶菌斑の有無を観察しファー
ジの存否を検索した。

その結果を実施例とともに第１表に示す。

第１表 〔発明の効果〕 （１）従来の方法ではファージの検出可能な濃度が１０
−”　／−であるのに対し、本発明では、１０−’　／
−迄高めることができる。

（２）　　粒状のファージ吸着剤をカラムに充填するこ
とによシ、試料水とファージ吸着剤を確実に接触させら
れ、ファージ吸着剤へのファージの吸着も迅速かつ簡便
に行える。また、その接触操作が終了すれば直ちに試料
水とファージ吸着剤を分離することができる。

（３）　　ファージを吸着した後、吸着剤の移し替えな
どの操作をすること表＜、前培養液と直ちに接触でき、
排水以外に由来する雑菌の混入を防止できる。

（４）　　ファージ吸着剤にファージを吸着固定してい
ることおよび前培養液を押し出し流れでファージ吸着剤
と接触させるため、吸着したファージと宿主菌の接触頻
度が高くなる。

以上の効果とあいまって、 （５）　　ファージの検出可能な濃度が向上することに
より、工場のファージ汚染をいち早く察知することが可
能となシ、迅速な対策を講することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例を説明するための図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 粒状のキトサン成形物または不溶性ピリジニウム型樹脂
   を充填したカラム、バクテリオファージを検出すべき試
   料水を当該充填物と繰り返し接触させる手段および当該
   バクテリオファージの宿主菌を含む培養液を当該充填物
   と繰り返し接触させる手段からなるバクテリオファージ
   の検出装置。