JPH03133399A - バクテリオファージの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は発酵工業、発酵食品工業の製造に大打撃を与え
るバクテリオファージの検出方法に関し、また人間また
は動植物にとって有用または有害な淡水性または海洋性
細菌に作用するバクテリオファージの探索に適用できる
バクテリオファージの検出方法に関する。

〔従来の技術〕

細菌を用いる発酵工業、発酵食品の製造分野におけるバ
クテリオファージ（以下ファージという）の汚染は、発
酵製品の製造を妨げ、その損害も致命的となるため大き
な問題である。実際多くの発酵製品でファージ汚染が知
られている。例えば、チーズ、ヨーグルト製造分野では
サツカロマイセス・タレモリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｃｒｅｍｏｒｉｓ）　、サツカロマイセス・ラク
ティス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｓ　１ａｃｔｉｓ）
等、清酒の分野ではラクトバチルス・プレビス（Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅ−ｖｉｓ）、レウコノス
トック・メセンテロイデス（Ｌａｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　
ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）等、糸引納豆の分野では
バチルス・ナラトウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｎａｔｔｏ）
、Ｌ−グルタミン酸発酵の分野ではマイクロバタテリウ
ム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）等、抗生物質製造の分
野ではストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ）等の宿主菌を溶菌させる
ファージによる汚染がある。

これに対し、これまでのファージ汚染対策はもっばら予
防的なもので、積極的にファージを不活性化する方法や
薬剤は未だ開発されていない。ファージに感染したもの
を途中でその溶菌を止めることは不可能であるし、宿主
菌の増殖と共にファージも増殖するので、培養条件など
を変えてファージの増殖のみを押えることは不可能であ
る。結局工場全体あるいは製造現場を熱湯により清浄に
し、器具や容器の殺菌を完全にするきいった雑菌対策が
ファージ対策の中心である。

ファージ汚染を回避する最も実用的な方法はいわゆるロ
ーテーション法である。即ち、ファージに抵抗性を有す
る菌株をあらかじめ選んでおき、ファージ汚染が起きた
ら直ちにそのファージに抵抗性を有する菌株に変えてい
く方法である。しかしこの方法はファージに抵抗性を有
する菌株のない細菌（例えば納豆菌の場合）では、ファ
ージはその種の全ての菌株を侵すのでこの方法を用いる
ことはできない。

このような細菌の場合は如何に早くファージ汚染を検知
するかというファージ予察と、どの工程で感染が起きた
かをつきとめるいわゆる感染源の探索によって迅速にフ
ァージ汚染防止対策を請じることがローテーション法同
様重要である。

従来、平板培養法によるファージの検出可能な下限濃度
は１／−である。ところが、ファージ汚染をいち早く検
知し、感染源の量的指標を把渥するためにはできるだけ
低いファージ濃度を検知することが望ましい。そこで、
半定量的ではあるが１０−’／ｍ１．水準のファージ濃
度を定量する簡易定量法（加菌法）が提案されている。

この方法は概ね次のとおりである。

宿主菌濃度１０７／−以上の菌液に少なくともファージ
を１個含むように試料水を加えて適当時間培養する。次
に、菌液を混和した寒天培地を固めた平板表面上に上記
培養液を画線し、適当時間培養後、画線に沿った溶菌斑
の有無を確認する。

この方法では、上記のように、少なくとも１個のファー
ジ粒子が含まれた試料水を混合できる量は、高々ｉ　ｏ
　ｏ　０ｍ１２であり、このためファージ濃度の定量下
限は１０−’／ｒｄに過ぎない。

〔発明が解決しようとする課題〕

通常、食品または発酵工場で使用される用水又は発生す
る排水は製造規模によって異なるが一日数ｍ′〜数百ｍ
’になる。通常、用水は機器洗浄に用いられる前には十
分な殺菌操作を経るためファージ汚染の原因となること
は稀れである。

一方排水には常時発酵に用いられる菌が機器の洗浄に伴
って流入するためファージの存在する不可避性が高い。

排水からのファージの定量は、感染源となるファージの
探索と共に、その工場におけるファージ汚染の指標とな
るものであるから、実際のファージ汚染の有無にかかわ
らず定期的に精度よ〈実施することが重要である。

しかし、従来の方法によるファージ下限濃度の１０−３
／ｍｌ！水準の精度でも必ずしも十分でない。例えば１
０−’／ｄの７７一ジ濃度の場合、１ｍｌ中には１００
個のファージが含まれることになるため、排水の管理を
怠れば排水の飛沫、従業者の衣服、くっ、手足等への排
水の付着からファージによる汚染が起り得るからである
。

また−日数ｍ゛〜〜数百の排水から高々１０００証程度
の採取であるためファージの検出可能な水準は高くない
。

そこで本発明者は大量の試料水から微量のファージを失
活させることなく捕捉・ａ縮させる方法を先に提案した
（特願昭６２〜２１８０２７、同６２〜２１８０２８．
同６３〜１８６７９６、同６３〜２０２，７３４及び同
６３〜２６１．５６１） 本発明は、これらの方法に代わる経済的な方法を継続し
て鋭意研究し本発明を完成するに至ったものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は大量の試料水から微量のファージを失活させる
ことなく捕捉・濃縮する吸着剤としてクリップチオライ
トまたはセピオイトを使用する点を新規とするものであ
って、本発明はバタテリオファージを検出すべき試料水
とクリップチオライトまたはセピオライトとを接触させ
てバクテリオファージを該化合物に吸着させてバクテリ
オファージを検出することを特徴とするバクテリオファ
ージの検出方法である。

クリノプチロライトはＮａ５ＡＩｓＳＩｉｏＯｔ２・２
４Ｈ２［］の組成からなる天然鉱石（一種のゼオライト
）であり、セピオライトは（ＯＨ２）−・（０）１）、
・Ｍｇ６ＳＩ＋２０３０　　・６〜８Ｈ２０の組成から
なる天然鉱石である。

〔作用〕

試料水中の微量のファージを失活させることなく吸着材
に吸着担持させて、イオン強度を変えることにより、そ
のファージを溶出させるか、ファージを吸着材に担持さ
せたま＼宿主菌とともに培饗し、ファージの溶菌斑を形
成させてファージを検出する。

この点を更に詳述すると、ファージは核酸とタンパク質
のみからなり、それ自体では増殖せず、特定の細菌（宿
主菌）に寄生・増殖し、最終的にはその細菌を溶菌する
特性を有する。ファージの外殻構成物質はタンパク質で
あり、上記のクリノプチロライトまたはセピオライトは
このようなタンパク質をよく吸着する。特に、ファージ
の頭部は細菌に吸着作用を有する吸着部位に比べて比較
的大きいため、大部分のファージはその頭部が上記吸着
材に吸着される。即ち、ファージは細菌を溶菌させる活
性を有したままで上記吸着材に吸着されていることにな
る。

これら吸着材に吸着したファージは宿主菌に作用し、遊
離した子ファージを放出し、さらにその近傍の宿主菌に
感染し溶解させる。この反応は寒天内で菌が固定された
状態で生じるため、上記吸着材または液中に遊離したフ
ァージが存在する箇所を中心に溶菌された透明な斑点が
肉眼で観察されることになる。

特に、吸着材を寒天平板上にスポットしたり、培地に浸
漬することにより、吸着材廻りのイオン強度が変り、吸
着材の溶解度の変化によって吸着されていたファージが
一部遊離し、吸着されたファージとともに、その近傍の
宿主菌に感染し溶菌させる作用もある。

糸引き納豆工場の排水を例にとって、本発明の実施例を
以下に説明する。糸引き納豆工場で使用されている納豆
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｎａｔｔｏ）とその工場排水を
用いてあらかじめ納豆菌ファージを分離精製し以下の試
験に供した。

なお、このファージは既に知られているＢａｃｉｌｌｕ
ｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｎｆファージ（Ｃ型）の外観と
頌似していた。〔保坂康弘、用瀬茂実、松井千秋編：ウ
イルス図鑑（第４版）、講談社すイエンテイフィク　（
１，９８４＞］ 〔実施例１〕 無菌水１００ｒｎｌにあらかじめ納豆菌ファージを１０
”／ｍｆ！、となるように注加し試料水を調製した。こ
の試料水と、あらかじめオートクレーブ滅菌した粒径１
００メツシユのクリノプチロライトとセピオライトをそ
れぞれ約０．５ｇ（乾慢重量として）を２５℃、２４時
間混合し、接触させた後、この粉末を無菌的にろ過し上
澄液を得た。この上澄液を適当倍希釈した液と、納豆菌
をあらかじめＬＢ培地（バタトトリプトン１０ｇ、酵母
エキス５　ｇＳＮａＣｌ　　５　ｇ−蒸留水１１、ｐｔ
１７．０〜７．５）で３０℃、３２時間培養した菌液（
前培養液）　　１ｍｌ！をあらかじめ溶解して４８℃に
保った１、５％寒天を含むＬＢ培地にともに注加してプ
レートを作成し、上澄液中のファージ粒子数を測定した
。試料水と上澄液中のファージ粒子数の差から上記吸着
材のファージ吸着量を求めた。その結果を第１表に示す
。

次に、上述の上澄液からろ別された吸着材０．５ｇをそ
れぞれろ過膜（１μのグラスフィルター）上で２５０ｍ
ｆ２の無菌水によって４回洗浄した。

そして、あらかじめ溶解して４８℃に保った１、５％寒
天を含むＬＢ培地に上記前培養液１−を注加して固定し
た各平板上に、上記の洗浄した各吸着材と上記洗浄ろ液
（４回目）０．１−をそれぞれスポットし、液が寒天に
しみ込んだ後に、３０℃、１６〜２４時間培養した。そ
の結果、洗浄ろ液をスポットした平板には溶菌斑が発生
せず、各吸着材粉末周辺には溶菌斑が発生していた。即
ちファージは失活することなく各吸着材に吸着している
ことが確認された。

〔実施例２〕 無菌水１０１にあらかじめ納豆菌ファージを１０−’／
ｍｌ！となるように注加し試料水を調製した。

第１表の吸着材をそれぞれ５０ｇずつ秤量し、オートク
レーブ滅菌した後、上記試料水この試料水と、あらかじ
めオートクレーブ１０１とそれぞれ２０℃で２４時間混
合し、接触させた後、無菌的にろ過し試料水を除いた。

ろ別した各吸着材の適当少量を実施例１と同様にして、
菌液を含んだ各平板上にスポットし、３０℃で１６〜２
４時間培養して観察した。同様にしてこのようなプレー
ト５枚を作成し観察した。その結果を第２表に示す。

第２表のように、クリノプチロライトおよびセピオライ
トをスポットした周辺には溶菌斑が認められた。

〔実施例３〕 第１表に示す吸着材について実施例２と同様にして、フ
ァージを吸着後、無菌的にろ過し試料水を除いた。

次いで納豆菌の前培養液を菌数が１０”／ｄ以上となる
ように注加し、上記のファージを担持した吸着材を加え
て室温で１５分間静置し、２０℃、１６〜２４時間振と
う培養後、その液の液１ｍｌをあらかじめ溶解して４８
℃に保った１、５％寒天を含むＬＢ培地に前培養液１−
と共に注加してプレートを作成した。そのプレートを２
０℃、１６〜２４時間培養後、プレート上の溶菌斑の有
無を観察した。

同様にしてこのようなプレートを５枚作成し観察した。

その結果を第３表に示す。すべてのプレートから溶菌斑
が観察された。

観察した。その結果を第４表に示す。

すべてのプレートで溶菌斑の発生が認められなかった。

〔比較例〕

従来方法と同様に、実施例２の試料水を各々ｌｄ、１０
ｍｆ、１００艷、１０００−づつ分取し、それぞれに納
豆菌の前培養液を菌数が１０’／ｒｎ１以上となるよう
に注加した後、２０℃、１６〜２４時間培養した。その
液の１ｒＩＩ！、を実施例３と同様にしてプレートを作
成し溶菌斑の有無を〔発明の効果〕 （１）従来の方法ではファージの検出可能な濃度が１０
−’／ｍｉ！であると云われているのに対し、本発明で
は１０−’／ｍｆ迄高めることができる。

（２）　　ファージの検出可能な濃度が向上することに
より、工場のファージ汚染をいち早（察知ることが可能
となり迅速な対応策を講することができる。

（３）比較的安価で取扱いも簡便な天然材料でファージ
検出が可能となる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. バクテリオファージを検出すべき試料水とクリノプチロ
   ライトまたはセピオライトとを接触させて、バクテリオ
   ファージを該化合物に吸着させてバクテリオファージを
   検出することを特徴とするバクテリオファージの検出方
   法。