SE431469B - Harts, hartskombination samt forfarande for selektiv avskiljning av bakterieinhibitorer, sasom antibiotika, ur bakteriellt infekterade kroppsvetskor - Google Patents

Description

10 15 20 25 3D 35 7812264-5 2 ett odlingsmedium med 5 ml helblod, urin eller ryggmärgs- vätska och vänta på uppträdande av turbidítet, som visar bakterietillväxt. Patienter, som har genomgått antibiotika terapi, har alltjämt antibiotiket i blodet, urinen eller ryggmärgsvätskan, när odlingen sätts i gång. Antibiotiket hämmar bakterietillväxten och kan fördröja isoleringen av den skadliga organismen så länge som 14 dagar och ibland längre. ç Det är möjligt att upptäcka bakterier i blodet snšbbare genom att använda radioaktiv koldioxid i kulturen Eftersom bakterier metaboliserar koldioxid, tyder försvin- nandet av den märkta koldioxiden på närvaro av bakterier.

Denna metod gör det möjligt att snabbt fastställa närvaro av“bakterier i blodkulturer i frånvaro av antibiotika och andra inhibitorer, men den är ineffektiv när bakteriostas inträffar som följd av närvaro av antibiotika eller andra inhibitorer i blodkulturerna.

Metoder för separering av antibiotika från bakterier genom membrankromatografi har nyligen rapporterats, men dessa metoder är för närvarande inte praktiskt användbara, *enär de kräver många handgrepp och enär risken för föro- rening av provkulturerna med exogena organismer är hög.

Det är således inte möjligt att snabbt isolera och identi- fiera bakterier i kroppsvätskeprov med konventionella meto- der, när proven innehåller bakterieinhibitorer.

Det är känt, att jonbytarhartser och adsorbent- hartser tar upp laddade antibiotika ur vätskor, men de har inte visat sig vara tillfredsställande medel för avskilj- ning av antibiotika ur bakteriellt infekterade prov, när 'snabb isolering och identifiering av en infekterande bakte- *rie åsyftas. Anledningen är, att när ett prov innehållande ett anjoniskt antibiotikum3och_en infekterande_organism leds genom ett' * anjonbytarharts,¿det utgående fil- tratet blir icke blott väsehtligen befriät¿från_antibiotià, ket, utan även i stor utsträckning befriat från de infek- terande bakterierna. K Uppfinningen syftar till att åstadkomma ett medel m 15 20 25 30 7812264-5 3 för snabb isolering och identifiering av en infekterande organism i ett kroppsvätskeprov. Uppfinningen syftar också till att åstadkomma ett medel för selektiv avskiljning av ett antibiotikum från ett bakteriellt infekterat kroppsvätske- prov utan avsevärd minskning av provets bakteriepopulation.

Uppfinningen syftar vidare till att tillhandahålla ett harts, som adsorberar laddade antibiotika från kropps- vätskeprov, men visar ringa adsorption av bakterier ur provet.

Uppfinningen syftar ävenledes till att få fram ett harts för avskiljning av bakterier inhiberande material från kroppsvätskeprov under kvarlämnande av ett betydligt antal bakterier.

Uppfinningen avser mikroporösa jonbytar- och adsorbenthartser och deras användning vid selektivt bort- skaffande av laddade antibiotika och andra bakterieinhi- bitorer från bakteriellt infekterade kroppsvätskeprov.

Hartserna enligt uppfinningen är mikroporösa jonbytar- och adsorbenthartser, som kännetecknas av förmåga att adsorbera antibiotika och som har belagts med nonjonisk tensid, särskilt den under varumärket "Triton X-100" sålda tensiden.

När ett biologiskt vätskeprov innehållande bakte- rier och ett laddat antibiotikum sammanförs med hartset, adsorberas antibiotiket, varvid antalet livskraftiga bak- terier, som passerar hartset och inte häftar vid eller adsorberas av hartset, ökar. En kombination av ett sådant tensidbehandlat ofunktionellt polymert adsorbentharts med ett katjonbytarharts avskiljer selektivt andra bakterie- inhibitorer jämte antibiotika från bakterieinfekterade kroppsvätskeprov. Således erbjuder de tensidbelagda hartser- na enligt uppfinningen ett medel för selektivt avlägsnande av laddade antibiotika och andra antimikrobiella substanser under kvarlämnande av ett väsentligt antal bakterier i huvudsak intakta i filtratet. Snabb odling och analys av bakterierna i provet blir därför möjliga. 10 15 20 25 30 35 7812234-s 4 Enligt uppfinningen belägger man ett mikroporöst harts, som.har förmåga att adsorbera ett antibiotikum, med en nonjonisk tensid. Det sålunda erhållna hartset ad- sorberar antibiotiket från prov av kroppsvätskor, såsom blod eller urin, men skonar bakterier i proven. 7 Hartser, som kan användas enligt uppfinningen; är mikroporösa hartser och hartskombinationer, som adsorberar laddade antibiotika. Dessa mikroporösa hartser beläggs med en nonjonisk tensid för bildning av hartserna enligt uppfinningen genom att hartserna fluidiseras med tensiden.

När biologiska vätskeprov innehållande anjoniska eller kat- joniska antibiotika och bakterier sammanförs med passande hartser enligt uppfinningen, adsorberas antibiotika på hartset och förblir bakterierna i filtratet. Det patogen- haltiga filtratet kan sedan lätt odlas och/eller analyseras med konventionella metoder.

När ett bakterieinfekterat kroppsvätskeprov inne- hållande andra bakterieinhibitorer jämte antibiotika samman- förs med ett tensidbelagt ofunktionellt polymert adsorbent harts i kombination med ett katjoniskt harts, adsorberas bakterieinhibitorerna jämte antibiotika, medan ett väsent- ligt antal bakterier bevaras. Hartserna och förfarandet enligt uppfinningen avskiljer således selektivt antibio- tika och andra antimikrobiella substanser, som normalt häm- mar eller hindrar tillväxt av bakterier i kroppsvätskeprov innehållande sådana inhibitorer. Detta möjliggör en snabb identifiering och bestämning av en infekterande organisms känslighet. i I föreliggande beskrivning syftar uttrycket "selek- tiv adsorption" i samband_med hartserna enligt uppfinningen genomgående på hartsernas förmåga att adsorbera bakterie- inhibitorer under ringa adsorption av bakterier. Uttrycket används utan avseende på hartsernas eventuella inverkan på andra material, som kan förekomma i provet jämte bakterier och bakterieinhibitorer.

Hartser, som kan användas enligt uppfinningen, är anjon- och katjonbytarhartser och ofunktionella 10 15 20 25 w 35 7812264-5 5 polymera hartsadsorbenter, som kan i det närmaste full- ständigt avlägsna anjoniska och katjoniska antibiotika från kroppsvätskeprov och inte fullständigt adsorberar bakterier efter behandling med en tensid enligt uppfin- ningen. Graden av avskiljning av ett material med ett harts beror naturligtvis på sådana faktorer som hartsets totala jonbytarkapacitet, pordiameter och ytarea. Dessa faktorer måste alltså beaktas vid val av ett lämpligt harts för användning enligt uppfinningen.

Hartser, som kan användas enligt uppfinningen, är syntetiska jonbytarhartser och ofunktionella adsorbenthart- ser med grundmassor bildade av kondensations- och additiona- polymerer. Särskilt kan man använda polystyrenhartser för- nätade med divinylbensen. Det enligt uppfinningen använda hartset kan ha formen av granuknfeller sfäriska pärlor.

Generellt har hartserna inte så stora porer¿ att bakterier kan tränga in i hartsets inre. Vissa hartser har emellertid makroporösa strukturer med stora inre ytor, som tillåter stora molekyler att tränga in i dem. Sådana makro- porösa hartser bör undvikas vid tillämpning av uppfinning- en, enär bakterier synes bli infångade i sådana hartser.

Hartser med relativt små porer, där adsorptionen sker i första hand på hartsernas yttre ytor, dvs. mikroporösa hartser, rekommenderas därför till skillnad från makro- porösa hartser. I föreliggande fall avser uttrycket "mikro- porös" sådana submakroporösa hartser.

De användbara mikroporösa jonbytarhartserna kan vara starkt eller svagt basiska anjonbytarhartser med kvaternära ammoniumgrupper eller polyalkylamingrupper som funktionella grupper. I sådana anjonbytarhartser kan den rörliga jonen vara en godtycklig anjonisk grupp, som kan utbytas mot ett antibiotikum. Kloridmättade anjonbytar- hartser har generellt befunnits lämpliga.

Närmare bestämt har de kloridjonmättade anjonbytar- hartser och adsorbenthartser, som säljs under följande varumärken, befunnits användbara för uppfinningens syften efter behandling med nonjoniska tensider: "Dowex 1-X8" 10 15 20 25 30 350 7812264-5 6 (Dow Chemical Company), "Duolite A-109" (Diamond Shamrock Company) och "Amberlite IRA H00" (ROHM & Haas), vilka är starkt basiska hartser med kvaternära ammoniumgrupper på polystyren; "Dulolite A-7" (Diamond Shamrock Company) och "Amberlite IR 45" (Rohm & Haas), vilka är svagt basiska och har tertiära aminogrupper som funktionella grupper; samt "XAD-4" (Rohm & Haas), som är en ofunktionell sampoly- mer av styren och divinylbensen och har makroretikulär struktur med 0,3 - 0,8 mm, en densitet av 1,20 g/ml och en pordiameter av 80 Ä. 7 Enligt uppfinningen beläggs de mikroporösa hartser- na med tensider, som minskar hartsernas adsorption av bakte rier. De tensider, som har befunnits verksamma vid till- lämpning av uppfinningen, är nonjoniska tensider. Katjo- niska tensider kan generellt inte användas, enär de har desinfekterande egenskaper. Dessutom har det visat sig, att åtminstone vissa anjoniska tenäde?nædför ännu större ned- sättning_av bakterieantalet än vid användning av hartser som inte har behandlats med tensid. Exempelvis iakttogs en sådan minskning av bakterieantalet, när ett prov innehållan de Staphylococcus aureus eluerades genom "XAD-H" behand- lat med den anjoniska tensiden natriumlaurylsulfat.

Föredragna nonjoniska tensider för användning enligt uppfinningen är polyetylenglykolalkylaryleterten- sider. Särskilt har den tensid av denna typ, som säljs under varumärket "Triton X-100", befunnits vara synner- ligen verksam i förfarandet enligt uppfinningen. Nonjoniska sorbitanmonokarboxylatpolyoxialkylentensider, t.ex. de som säljs under varumärkena "Tween 20" (sorbitanmonolauratpoly- oxialkylen). "Tween 40" (sorbitanmonopalmitatpolyokialky- -len), "Tween 60" (sorbitanmonostearatpolyoxialkylen) och "Tween 80" (sorbitanmonooleatpolyoxialkylen), är visser- 'ligen användbara, men hindrar inte bakterieadsorption i samma grad som "Triton X-100". I de flesta fall minskar "Tween"Éprodukterna bakterieadsorption på "XAD-4"-adsorbent med 3 - 5 %.

Hartserna enligt uppfinningen beläggs med tensid 10 15 20 25 30 så 7812264-5 7 genom fluidisering av hartserna med en nonjonisk tensid och avlägsnande av tensid i överskott över den för belägg- ning erforderliga mängden. Naturen av den kemiska och fysikaliska samverkan mellan tensiden och hartset vid till- lämpning av uppfinningen är inte till fullo klarlagd. Ten~ siden torde emellertid föreligga som en rymdbeläggning på hartset.

Beläggningen av hartset med en nonjonisk tensid för uppbyggnad av ett harts enligt uppfinningen kan utföras genom att en hartspelare perkoleras med ett prov av ten- siden löst i sterilt destillerat vatten tills pelaren är fluidiserad med tensiden. Således förkastas dmiutmïömmuüe vätskan tills tensiden är upptagen i hartsbädden och inte befinnrsig över bädden. överskott av tensid i hartset efter det att hartset har fluidiserats kan bortskaffas genom avsugning av vätskefasen från hartsbädden sedan tensiden och hartset har varit i kontakt ca 15 minuter eller mera. En lämplig mängd sålunda framställt harts kan placeras i en flaska, som kan slutas med en lämplig propp och steriliseras.

Enligt uppfinningen används ett på ovan beskrivet sätt med tensid behandlat jonbytarharts för avskiljning av antibiotika från kroppsvätskeprov genom sammanföring av provet med det behandlade hartset. Om det finns andra bakte- rieinhibitorer än antibiotika i kroppsvätskeprovet, kan man använda ett tensidbehandlat harts enligt uppfinningen i kombination med ett katjonbytarharts för att avskilja dessa inhibitorer från provet. En synnerligen lämplig kombination består av ett tensidbehandlat-ofunktionellt polymert adsor- bentharts, såsom "XAG-4", och ett katjonbytarharts. Denna kombination adsorberar såväl antibiotika som andra bakterie inhibitorer under kvarlämnande av ett väsentligt antal bakterier i ett kroppsvätskeprov.

Alla hartser har inte lika stor kapacitet för ad- sorption av ett antibiotikum. Exempelvis avskiljer "1-X8", "IRA H00", "A.-7", "IR 45" kalíumpenicillin G från blodprov innehållande 5 ml helblod och "XADr4" effektivt 2 pg/ml 7s122ä4+š 10 15 20 25 30 jss 8 i 5 ml vatten, vilka bringats i kontakt med 30 g harts be- handlat med "Triton X-100". 12,5 g, kan “XAD-u"-adsørbenten alltjämt avskilja 100 % av antibiotiket, men de andra hartserna avlägsnar inte effektivt penicillinet från blodet När hartsmängden minskas till i denna mängd. På grund av denna större effektivitet föredras "XAD-HÜ för adsorp- tion av anjoniska antibiotika enligt uppfinningen; U 7 Den ovan angivna minskningen av effektiviteten hos anjonbytarhartser observeras icke med katjonbytarhartser.

När det enligt ovan behandlade blodet användes som späd- medel för gentamycinsulfat (2 pg/ml) i stället för kalium- penicillin G, avskilde alla undersökta katjonbytarhartser antibiotiket även vid nivåer av 1 g harts per 10 ml bland- -ning av blod och vatten.

Vid ökningen av hartsmängden uppenbarligen på att blodserum anjonbytarhartserna beror den erforderliga och plasma har anjoniska komponenter, som konkurrerar med antibiotiket om hartsets aktiva centra. Mängden anjoniskt harts måste därför vara tillräcklig för att erbjuda så många centra, att både antibiotiket och de konkurrerande komponenterna_i blodet satisfieras. Däremot innehåller serum, plasma, blod, ryggmärgsvätska och urin endast få organiska katjoniska komponenter, varför behovet av katjn- bytarharts är mindre. Ehuru man i allmänhet behöver endast för ett blodprov av 5 ml, kan man så- 12,5 g av den effektivare'XAD-4"-ad- tillräcklig adsorption av anjoniska 5 g katjonbytarharts ledes behöva använda sorbenten för att få material., .

I Hartserna enligt uppfinningen adsorberar selektivt antibiotika och andra bakterieinhibitorer från bakteriellt infekterade kroppsvätskeprov, t.ex. urin, blod eller rygg- märgsvätska. När det gäller blodprov kan man leda helblod utspätt med fysiologisk saltlösning i förhållandet 1:5 genom ett enligt uppfinningen framställt harts eller samman _föra provet med hartset på annat sätt. Filtratet kan blandas med ett kulturmedium till en slutlig utspädning av blodet av 1:10. Den erhållna blandningen är färdig för överföring 10 15 20 25 30 35 7812264-5 9 till plattor för undersökning av bakterieaktiviteten.

Vid tillämpning av uppfinningen för behandling av blodprov, kan provet erhållas på vanligt sätt genom ven- punktering och upptagning av 5 ml helblod i en spruta.

Blodprovet kan överföras aseptiskt till en flaska inne- hållande hartserna genom perforering av proppen med sprut- ans nål och insprutning av helblodprovet i flaskan. Flas- kan kan placeras i en roterande skakapparat och skakas 15 minuter med sådan hastighet att god kontakt mellan blodet och hartset ernås. I praktiken är det lämpligt att använda en roterande skakapparat vid 250 - 300 r/min.

Andra slags apparater och metoder, som åstadkommer tillräcklig kontakt mellan hartset och provet för säker- ställande av adsorption av antibiotiket på hartset kan också användas. Exempelvis är det synnerligen effektivt att tumla hartset med provet i en vertikalt roterande behål- lare. Genom att låta en sådan behållare rotera långsamt kan man få en mycket hög grad av kollisionsverkan och sam- tidigt minska möjligheten till traumatiska effekter på bakterierna. Denna tumling kan man åstadkomma genom att fästa en sluten flaska innehållande hartserna och provet på en rotationsmekanism på sådant sätt, att flaskan roterar i ett vertikalplan kring en mot dess längdaxel vinkelrät axel.

Efter skakning, tumling eller sammanföring av ett blodprov . med hartset på annat sätt kan man ta ut provet ur flaskan genom att införa en nål genom proppen och suga upp minst 5 ml av blandningen av vatten och blod ur flaskan medelst en spruta. Provet kan sedan inympas i ett blod- kulturmedium på vanligt sätt. Med användning av konven- tionella metoder inkuberas kulturerna, vanligen vid 35 - 3600, tills turbiditet uppträder i kulturen. I så fall anses provet vara positivt och erforderliga åtgärder för behandling av patienten kan vidtas. När ett antibiotikum innehållande prov har behandlats med ett harts enligt upp- finningen, är den tid som förflyter innan turbiditet upp- träder väsentligt kortare än när ett sådant prov inte har 7s12264+s 10 157 20 25 30 35 10 behandlats enligt uppfinningen.

I huvudsak samma åtgärder vidtas när antibiotika skall avskiljas från ryggmärgsvätska, urin eller andra kroppsvätskor. Ibland kan det emellertid vara svårt att få ett 5 ml prov av ryggmärgsvätska. Om man kan få ett 5 ml prov, bör man använda detta. Eljest insprutar man den er- hållna volymen i hartset i flaskan och drar ut så stor mängd vätska som möjligt efter den angivna skakningstiden.

Hartseluaten inympas på angivet sätt i bakteriologiska medier.

Izen specifik utföringsform av uppfinningen an- vänder man en kombination av mikroporös polymer hartsadsor- bent belagd med nonjonisk tensid och ett katjoniskt harts för att avskilja antibiotika och andra bakterieinhibitorer från bakteriellt infekterade kroppsvätskor. En synnerligen effektiv hartskombination kan beredas på följande sätt. 100 g "XAD-4"-harts placeras i en kolonn och tvättas med 200 ml destillerat vatten och med 200 ml 70-procentig etanol för avlägsnande av förorenande substanser. Hartset tvättas sedan med 200 ml destillerat vatten för avlägsnande av alkoholåterstoder. Därpå får 200 ml 0,1-procentig “Triton-100" långsamt perkolera genom kolonnen. Hartskolon- nen befrias från överskott av tensiden genom blåsning med luft. 40 g katjonbytarharts FC-249" (Ionac) eller "IRC 50" (Rohm and Haas) placeras i en kolonn, och kolonnen be- handlas med 200 ml destillerat vatten och 200 ml 70-procent- ig etanol samt tvättas fri från etanol med 200 ml destiller- at vatten. Hartset mättes med natriumjon genom att 400 ml 1M natriumklorid leds långsamt genom kolonnen. Kolonnen tvättas fri från saltrester med H00 ml destillerat vatten och lufttorkas sedan med övertryck, 7 p 100 g sålunda behandlat "xAD-Iwwadsorbenf óch nu g sålunda behandlat "C-2H9"-harts eller annat acceptabelt katjonbytarharts sammanförs i ett lämpligt kärl, såsom en bägare, och 2% ml destillerat vatten tillsätts, så att upp- slamning erhålls. Uppslamningen omblandas kraftigt med en 10 15 20 25 30 35 7812264-5 11 omrörare, så att hartserna suspenderas. Sedan tas 20,5 ml alikvoter av blandningen ut och placeras i 50 ml flaskor.

Varje sålunda iordningsställd flaska innehåller 12,5 g "XAD-4", 5 g "C-249" och 3 ml destillerat vatten.

Flaskor innehållande denna blandning av vatten och hartser steriliseras genom autoklavering vid 0,1 MPa under 15 - 20 min eller sluts med vaccinpropp och steriliseras genom bestrålning med kobolt 60 (ca 500 - 1 000 krad). De sålunda färdigställda enheterna för avskiljning av anti- biotika kan användas genast eller efter en ganska lång lagringstid. Ovan beskrivna kombinationsharts möjliggör- en snabbare bestämning av identiteten och antibiotikakäns- ligheten av en infekterande organism icke blott när vissa antibiotika finns i provet, utan även när ett blodprov innehåller andra material, som ínhiberar tillväxten av bakterier. När sådant inhiberande blod behandlas med ovan beskrivna kombination av ofunktionell polymer hartsadsor- bent och katjonbytarharts, avlägsnar hartsblandningen de inhíberande substanserna från blodet. Sådana substanser bortskaffas emellertid enbart av det blandade hartset, inte av hartserna vart för sig.

När ett prov som skall analyseras innehåller ett identifierat antibiotikum, väljer man ett mikroporöst harta som adsorberar det antibiotiket och belägger det med ten- sid. Om ett prov innehåller ett eller flera oidentifierade antibiotika, kan man avskilja detta eller dessa medelst en kombination av tensidbehandlade hartser, som adsorberar olika antibiotika. Provet sammanförs i följd eller sam- tidigt med de valda hartserna på ovan beskrivet sätt.

Använda hartser kan regenereras i enlighet med tillverkarnas instruktioner. Det är möjligt att ånyo be- handla hartserna med tensid enligt uppfinningen, så att hartsmaterialen kan användas på nytt.

Följande exempel belyser uppfinningen.

Exempel 1 Blodprovsblandningar bereddes genom tillsats av en känd bakterie till blod, som hade lyserats med en lika 10 15 20 25 30 35 7sí2264-5 12 stor volym destillerat vatten. Ett 10 ml prov,av varje K blandning skakades med 12,5 g "XAD-4" hartsadsorbent från Rohm and Haas). I separata 50 ml flaskor (nonjonisk polymer- skakades ett andra 10 ml prov av varje blandning med 12,5 g harts, som hade behandlats med en lösning av 0,1 % “Triton X-100". överskott av “Triton X-100" hade bortskaffats från hartset genom avsugning av vätskefasen från hartsbädden sedan behandlingen hade pågått 15 min. Alla prov av bland- ningarna skakades i en roterande skakapparat under 30 min vid 250 r/min. Ett blindprov bestående av den med bakterier I ympade blandningen av blod och vatten utan harts användes också. En del av supernatet från varje hartsbehandlad portion erhölls (eluat), och varje eluat och varje blindprov blandades med en lika stor mängd näringskoncentrat och överfördes till plattor (O h). Resten av provet inkuberades vid 35°C under 5h och undersöktes därpå för bestämning av bakteriernas tillväxt. Resultaten framgår av tabell I.

Som framgår av tabell I, minskade den "Triton"- behandlade hartsadsorbenten förlusten av bakterier, såsom framgår av värdena för 0 h. När utspädningsmedlet för bakterierna var urin (5 ml urin ympad med bakterier), rygg- märgsvätska (5 ml därav ympad med bakterier) eller destil- lerat vatten (bakterier inympade i vattnet), erhölls väsent- ligen samma resultat. Sålunda iakttas adsorption av bakterier på det obehandlade hartset oberoende av utspädningsmedlet och reduceras adsorptionen när ett harts förbehandlas med -"Triton X-100", såsom exemplifieras av tabell I.

Exempel 2 Med samma förfarande som 1 exempel 1 bestämdes verkan av olika med "Triton X~100“ behandlade hartser på @Staphylococcus aureus. Resultaten anges i tabell II.

Av dessa resultat framgår, att behandling med "Triton X-100" ger en bakterierna skonande verkan oberoende av det använda anjonbytarhartsets typ.

Flera katjonbytarhartser (natriumjonmättade) be- .stâende av svagt sura akrylsyra- eller karboxylsyrastruktu- 'rer eller starkt sura polystyrengrundmassor med kvaternära 10 15 20 25 30 35 7812264-5 13 ammoniumgrupper provades också. Bakterieantalen i blind- proven och hartseluaten var väsentligen desamma vare sig ' hartset var behandlat med "Triton X-100" eller ej. Sålunda synes katjonbytarhartser inte åstadkomma den minskning av bakterieantalet som iakttas vid anjoniska hartser.

Exempel 3 Med tillämpning av de i exempel 1 beskrivna metod- erna användes 5 g katjonbytarharts "C-249", 12,5 g tensid- behandlat "XAD-H" och blandningar av 5 g "C-249" och _ 12,5 g "XAD-4". 5 ml helblod från frivilliga med blod inne- hållande inhiberande faktorer lyserades med 5 ml vatten och isattes till hartserna. Resultaten anges i tabell III. Som framgår därav, avlägsnar behandlingen med en blandning av "XAD-4" och "C-249" effektivt det inhiberande materialet, vilket möjliggör snabbare identifiering av en infekterande organism. V Exempel H En hartsblandning innehållande 12,5 g "XAD-H"-ad- sorbent, vari "Triton X-100" hade fluidiserats, 5 g katjon- bytarharts "C-209" och 3 ml destillerat vatten framställ- des i en flaska. 20 ml helblod togs från en person genom venpunktering. Härtill sattes kaliumpenicillin G till en koncentration av 2 ug/ml och 0,1 ml Staphylococcus aureus till ett slutligt antal av ca 25 per milliliter. Omedel- bart därefter sattes 5 ml av det behandlade blodet till en flask med hartsblandning. Till en konventionell 50 ml flaska innehållande blodkulturmedium sattes 5 ml behandlat blod.

Hartsprovet omskakades i en roterande skakapparat under 15 min vid 250 r/min, och därpå uttogs 5 ml harts- eluat och överfördes till en 50 ml flaska innehållande blodkulturmedium. Både hartseluatprovet och det icke harts- behandlade provet inkuberades lä dygn vid 36°C.

Efter 6h visade den med hartseluat ympade kulturen turbiditet, vilket tydde på bakterietillväxt, såsom be- kräftades genom odling av ett prov på agarmedium. Det med blandningen av blod, bakterier och antibiotikum ympade 781226211-051 10 15 20 25 30 35 14 - kulturmediet visade ingen turbiditet under hela inkubations- tiden av 14 dygn.

Exempel 5 Ett 20 ml prov av urin erhölls från en person, och härtill sattes kaliumpenicillin G till en slutlig koncen- tration av 2 ng/ml och 0,1 ml Staphylococcus-aureus till ett slutligt bakterieantal av ca 25 per milhiliter. Omedel- bart därefter sattes 5 ml av den behandlade hrinen till en flaska innehållande en hartsblandning enligt exempel 4.

En annan 5 ml portion av behandlad urin infördes i en 50 ml flaska innehållande kulturmedium. Både hartseluatprovet och blindprovet inkuberades vid 3600 under IH dygn.

Efter 6h visade den med hartseluatet ympade kulturen turbiditet. Detta tydde på bakterietillväxt, vilken be- kräftades genom odling av ett prov på agarmedium. Det_ kulturmedium, som hade ympats med en blandning av urin, bakterier och antibiotikum visade ingen turbiditet under hela den 14 dygnnlånga inkuberingstiden. _ Exempel 6 - , _ Ett 20 ml prov av ryggmärgsvätska erhölls. Härtill sattes kaliumpenicillin G tillen slutlig koncentration av 2 um/ml och 0,1 ml Staphylococcus aureus till en slutlig bakterieräkning av 25 per milliliter. Omedelbart därefter infördes 5 ml behandlad ryggmärgsvätska i em flaska med hartsblandning enligt exempel 4. En annan 5 ml portion av behandlad ryggmärgsvätska sattes till en 50 ml flaska med kulturmedium. Hartsprovet skakades 15 min vid 250 r/min i en roterande skakapparat, och sedan togs 5 ml hartseluat ut och infördes i en likadan 50 ml flaska med kulturmedium.

Båda proven inkuberades vid SSOC under 14 dygn. 7 Den med hartseluatet ympade kulturen'visade turbie ditet efter 6 h. Att bakterietillväxt hade förekommit be- kräftades genom odling av ett prov på agarmedium. Den med blandningen av ryggmärgsvätska, bakterier och antibiotikum ympade kulturen var fri från turbiditet under hela den 1H dygn långa inkubationstiden. 10 15 20 25 30 35 7812264-5 15 Exempel 7 Penicillin G och bakterier sattes till 20 ml hel- blod, såsom beskrivs i exempel 4. Av blodprovet infördes 5 ml i ett kulturmedium såsom blindprov, 5 ml i en flaska innehållande enbart 12,5 g "XAD-H"-adsorbentharts, 5 ml i aïflaska innehållande enbart 5 g katjonbytarharts "C~2Å9" och 5 ml i en flaska med hartsblandningen. Sedan de tre flaskorna hade skakats vid 250 r/min under 15 min, togs 5 ml hartseluat blodkulturmedium, såsom beskrivs för blindprovet. ut ur varje flaska och överfördes till Blodkulturblindprovet visade ingen turbiditet efter lä dygns inkubering vid 3800, eftersom antibiotikum fanns i kulturen. Den med eluat från hartsblandningsflaskan ympade kulturen visade turbiditet efter 6,5 h. Den med eluat från "XAD-4" ympade blodkulturen visade också tur- biditet efter 6,5 h, eftersom detta harts är adsorbent för anjoniska föreningar och penicillin är anjoniskt. Den med eluat från katjonbytarhartset "C-249" ympade kulturen avisade ingen turbiditet efter 1% dygns inkubation, vilket tyder på att katjonhartset inte kunde avlägsna läkemedlet.

Exempel 8 Med samma metod som i exempel 7 gjordes försök med blod innehållande bakterieinhibitorer. Följande resultat erhölls.

Blindprovskulturen var negativ för turbiditet. Den med hartsblandningseluatet ympade kulturen var positiv efter 6,5 h. Den med eluat från "XAD-H" ympade blodkultur- en visade ingen turbiditet. Den med eluat från katjonbytar- 4 hartset ympade kulturen visade ej heller turbiditet. Resul- tatet visar, att man behöver en hartsblandning för att effektivt avlägsna både inhibitorsubstanser i blodet och antibiotika.

Exempel 9 Verkan av en hartsblandningsflaska enligt exempel 4 vid avskiljning av olika antibiotika undersöktes. De an- givna medlen infördes i ett 20 ml prov av helblod erhållet genom venipunktur till en slutlig koncentration av 2 pg/ml. i 10 7812264-5 16 Blodproven ympades med de i tabell IV angivna bakterierna till ett slutligt bakterieantal av ca 25 per milliliter. I några fall användes antibiotika, som var bakteriostatiska mot försöksorganismerna, för efterliknande av betingelser, som ofta förekommer i naturen, och i övriga fall användes baktericida antibiotika. Av blodproven behandlades Srml _med hartsblandning, såsom beskrivs i exempel 4, och in- pfördes 5 ml i en 50 ml flaska med blodkulturmedium. Efter inkubering av hartseluatproven och blindproven under 1% dygn vid 3600 erhölls de i tabell angivna resultaten.

Resultaten visar, att behandling av proven med hartsblandning enligt uppfinningen ledde till mycket snab- bare upptäckt av bakterierna. 10 15 20 25 30. 35 7812264-5 17 Tabell I Verkan av "Triton"-behandlat "XAD-4" på bakterier Bakterie CPU/Hü 0 h 5 h Staphyløcoccus aureus Blindprov 70 24 500 Hartseluat (obehandlat) 20 8 200 Hartseluat ("Tríton"-beh.) 60 22 000 Streptococcus (grupp A) Blindprov 190 18 000 Hartseluat (obehandlat) 40 3 200 Hartseluat ("Triton"-beh.) 60 4 500 Steptococcus (grupp D) Blindprov 90 20 200 Hartseluat (obehandlat) 25 5 100 Hartseluat ("Triton"-beh.) 60 11 400 E. coli Blindprov 240 140 000 Hartseluat (obehandlat) 140 34 000 Hartseluat ("Triton"-beh.) 150 34 600 Proteus Blindprov 55 31 900 Hartseluat (obehandlat) 10 6 000 Hartseluat ("Triton"-beh.) 45 28 300 Pseudomonas Eïndprov 110 41 400 Hartseluat (obehandlat) 75 33 450 Hartseluat ("Triton"-beh.) 90 37 500 7812264-5 10 15 20 25 30 35 18 Tabell II Harts Prov CPU/ml 0 h s h_ "I-xs" Blindprov 110 37 000 hartseluaf (obehandlat) 50 10 200 hartseluat ("Triton"-beh.) 90 36 500 "IRA 1400" Blindprov 130 39 000 hartseluatvflobehandlat) 70 31 000 hartseluat ("Triton"-beh.) 120 38 200 "A7" Blindprov 100^ 736 800 hartseluat (obehandlat) 30 7 100 hartseluat ("Triton"-beh.) 60 15 100 "IR45" Blindprov 125 40 000 hartseluat (obehandlat) 20 6 200 hartseluat ("Triton"-beh.) 70 18 900 "XADe&" Blindprov 120 ' 39 400 harfseluat (obehandlat) 30 0 6 000 hartseluat ("Triton"-beh.) 105 37 400 Tabell III Bakterie- Utspädnings- Harts- CFU/ml suspension medel behandling 0 h - 5 h E. coli inhiberande blod ingen 30 0 icke inhiberande blod ingen 70 29 400 inhiberande blod XAD-4 25 0 icke inhiberande blod XAD-4 70 30 100 inhiberande blod C-249 35 0 iche inhiberande blod C-249 65 28 200 inhíberande blod XAD-H & 70 '31 000 C-249 icke inhiberande blod XAD-R & 65 30 100 C-249 Endast odlingsmedium ingen 80 32 200 10 15 20 7812264-5 * Ingen turbiditet inom 14 dygn 19 Tabell IV 'Antibiotikum Bakterie Turbiditet Bliädprov Haršseluat Meticillin (Staphcillin) Staph. 3 6 Cefalotin (Keflin) Staph. ingen * 5 Karbenicillin (Pyopen) Staph. ingen 5,5 Tetracyklin ~ Staph. ingen 7 Ampicillin (Polycillin) Staph. ingen 9 Klíndamycin (Cleocin) Staph. 5 8 7 Polymyxin B (Aerosporin) E. coli 7 5 Kolistin (Colymycin) E. coli ingen 6 Kanamycin (Kantrex) E. coli ingen 5,5 Erytromycin (Ilotycin) Staph. ingen 7 Neomycin E. coli ingen 6,5 Linkomycin Staph. ingen 5,25 Dihydrostreptomycinsulfat E. coli H 5,75 Gentamycinsulfat Staph. ingen 6

Claims (21)

i7s12264+sf 10 15 20 25 30 35 20

1. iHarts för selektiv avskiljning av ett antibiotikum från ett bakteriellt infekterat kroppsvätskeprov, k ä n n e - t e c k n a t av att det utgöres av ett med en nonjonisk tensid belagt mikroporöst harts med förmåga att absorbera ett antibiotikum, vilket harts utgöres av ett anjonbytarharts eller ett ofunktionellt adsorbentharts.

2. Harts enligt patentkravet 1, vari tensiden är en polyetylenglykolalkylaryleter.

3. Harts enligt patentkravet 1, vari hartset är ett anjonbytarharts. 7 7 * 1

4. Harts enligt patentkravet 1, vari hartset är ett ofunk- tionellt adsorbentharts.

5. Harts enligt patentkravet 1, vari hartset är en ofunk- tionell sampolymer av styren och divinylbensen med makroreti- kulär struktur.

6. Harts enligt patentkravet 1, vari kroppsvätskan är helblod.

7. Harts enligt patentkravet 1, vari kroppsvätskan är urin. I _ _

8. Harts enligt patentkravet 1, vari kroppsvätskan är ryggmärgsvätska. "

9. I -Hartskombination för selektiv avskiljning av antibio- ~tika och andra bakterieinhibitorer från bakteriellt infekterade kroppsvätskeprov, k ä n n e t e c kön a t av att det utgöres av ett harts enligt kravet 4 i kombination med ett katjonbytar- harts.

10.' 'i Harts enligt patentkravet 9, vari hartset är en ofunk- tionell sampolymer av styren och divinylbensen med makroretiku- lär struktur.

11. Harts enligt patentkravet 9, vari tensiden är poly- etylenglykolalkylaryleter. A I 7

12. 1 Förfarande för selektiv avskiljning av ett antibioüknm från ett bakteriellt infekterat kroppsvätskeprov, t e c k n a t av att man belägger ett mikroporöst harts, som har förmåga att adsorbera ett antibiotikum och utgöres av ett anjonbytarharts eller ett ofunktionellt adsorbentharts, med k ä n n e - en nonjonisk tensid genom att fluidisera hartset med tensiden och därefter sammanför provet med hartset. 10 15 20 7812264-5 m

13. Förfarande enligt patentkravet 9, vari tensiden är en polyetylenglykolalkylaryleter.

14. Förfarande enligt patentkravet 9, vari hartset är ett ofunktionellt polymert adsorbentharts.

15. Förfarande enligt patentkravet 9, t e c k n a t av att sammanförandet av hartset med provet sker genom tumling av hartset med provet i en vertikalt roterande behållare. k ä n n e -

16. Förfarande enligt patentkravet 12, vari hartset är ett anjonbytarharts.

17. Förfarande enligt patentkravet 12, vari hartset är en ofunktionell sampolymer av styren och divinylbensen med makro- retikulär struktur.

18. Förfarande enligt patentkravet 12, vari kroppsvätskan är blod.

19. Förfarande enligt patentkravet 12, vari kroppsvätskan är urin.

20. Förfarande enligt patentkravet 12, vari kroppsvätskan är rymmmärgsvätska.

21. Förfarande enligt patentkravet 12, t e c k n a t av att man sammanför provet med det tensidbe- handlade hartset i kombination med ett katjonbytarharts. k ä n n e - n 7812264-5 SAMMANDRAG Mikroporösa anjonbytar- och nonjoniska adsorbent- hartser, vilka är i stånd att adsorbera ett antibiotikum och vilka är belagda med en nonjonisk tensid,beskrivs. I kontakt med ett prov av bakteriellt infekterade kropps- vätskor avlägsnar dessa hartser antibiotika från provet, men visar låg bakterieadsorption. En kombination av ett tensidbelagt icke funktionellt adsorbentharts med ett kat- joniskt harts avlägsnar andra bakterieinhibitorer såväl som antibiotika från prov av bakteriellt infekterade kropps- vätskor, men låter bakterierna vara kvar i proven. Genom att avlägsna bakterieinhibitorer och samtidigt lämna kvar bakterierna möjliggör dessa hartser en snafiisoleríng och identifiering av en infekterande organism.