JPH02110000A - バクテリオフアージの検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は発酵工業、発酵食品工業の製造に大打撃を与え
るバクテリオファージの検出方法に関し、また人間また
は動植物にとって有用または有害な淡水性または海洋性
細菌に作用するバクテリオファージの探索に適用できる
バクテリオファージの検出方法に関する。

〔従来の技術〕

細蔚を用いる発酵工業、発酵食品の製造分野におけるバ
クテリオファージ（以下ファージという）の汚染は、発
酵製品の製造を妨げ、その損害も致命的となるため大き
な問題である。実際多くの発酵製品でファージ汚染が知
られている。例えば、チーズ・ヨーグルト製造分野では
サツカロマイセス・クレセリス（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅａＣｒｅｍｏｒｉｓ　）、サツカロマイセス・ラク
ティス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ　
）等、清酒の分野では、ラクトバチルス・プレビス（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ　）％レウコノ
ストック・メセンテロイデ７　（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏ
ｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　）等、糸引納豆の分
野ではバチルス・ナラトウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｎａｔｔ
ｏ　）　、Ｌ−グルタミン酸発酵の分野ではマイクロバ
クテリウム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　）等、抗生
物質製造の分野ではストレプトマイセス・グリセウス（
８ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅａ　ｇｒｉａｅｕｓ　）等の宿
主菌を溶菌させるファージによる汚染がある。

これに対し、これまでの７アージ汚染対策はもっばら予
防的なもので、積極的にファージを不活性化する方法や
薬剤は未だ開発されていない。ファージに感染したもの
を途中でその溶菌を止めることは不可能であるし、宿主
菌の増殖と共にファージも増殖するので、培養条件など
を変えてファージの増殖のみを押えることは不可能であ
る。結局工場全体あるいは製造現場を熱湯によル清浄に
し、器具や容器の殺菌を完全にするといった雑菌対策が
ファージ対策の中心である。

ファージ汚染を回避する最も実用的な方法はいわゆるロ
ーテーション法である。即ち、ファージに抵抗性を有す
る菌株をあらかじめ選んでおき、ファージ汚染が起きた
ら直ちにそのファージに抵抗性を有する菌株に変えてい
く方法である。しかしこの方法はファージに抵抗性を有
する菌株のない細菌（例えば納豆菌の場合）では、ファ
ージはその種の全ての菌株を侵すのでこの方法を用いる
ことはできない。

このような細菌の場合は如何に早くアアージ汚染を検知
するかというファージ予察と、どの工程で感染が起きた
かをつきとめるいわゆる感染源の探索によって迅速にフ
ァージ汚染防止対策を講じることがローテーション法同
様重要である。

従来、平板培養法によるファージの検出可能な下限濃度
は１／−である。ところが、ファージ汚染をいち早く検
知し、感染源の量的指標を把握する丸めにはできるだけ
低いファージ濃度を検知することが望ましい。そこで半
定量的ではあるが１ｏ−”　／−水準のファージ濃度を
定量する簡易定量法（加菌法）が提案されている。

この方法は概ね次のとおりである。

宿主菌濃度１０１／−以上の請液に少なくともファージ
を１個含むように試料水を加えて適当時間培養する。つ
ぎに、菌液を混和した寒天培地を固めた平板表面上に上
記培養液を画線し、適当時間培養後、Ｓ線に沿った溶菌
斑の有無を確′認する。

この方法では、上記のように、少なくとも１個のファー
ジ粒子が含まれた試料水を混合できる量は、高々１００
０−であル、このためファージ濃度の定量下限は１ｏ−
”／１ａｇにすぎない。

〔発明が解決しようとする課題〕

通常、食品または発酵工場で使用される用水又は発生す
る排水は製造規模によって異なるが一日数ｍｍ〜数百ｍ
３になる。通常、用水は機器洗浄に用いられる前には十
分な殺菌操作を経るためファージ汚染の原因となること
は稀れである。

一方排水には常時発酵に用いられる菌が機器の洗浄に伴
って流入するためファージの存在する不可避性が高い。

排水からのファージの定量は、感染源となるファージの
探索と共に、その工場におけるファージ汚染の指標とな
るものであるから、実際のファージ汚染の有無にかかわ
らず定期的に精度よく実施することか重要である。

しかし、従来の方法によるファージ下限濃度の１０１／
−水準の精度でも必ずしも十分でない。例えば１０　　
／−の７７一ジ濃度の場合、１　ｍ”中には１００個の
ファージが含まれることになるため、排水の管理を怠れ
ば排水の飛沫、従業者の衣服、くっ１手足等への排水の
付着からファージによる汚染が起り得るからである。

また−日数ｍｓ〜数頁ｍ３の排水から高々１００〇−程
度の採取である丸めファージの検出可能な水準は高くな
い。

そこで本発明者らは大量の試料水から微量のファージを
失活させることなく捕捉・濃縮する方法を先に提案した
（特願昭６２−２１８０２７、同！２−２１８０２８、
同６３−７９，５２８及び同６３−２０２７４３）。

本発明はこれらの方法に代わる経済的な方法を提供しよ
うとするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は大量の試料水から微量の７７−ジを失活させる
ことなく捕捉・濃縮する手段として、難水溶性の力ＩＷ
Ｖウム化合物、鉄塩、活性炭などから１種を選んでファ
ージ吸着材に使用する点を新規とするもので、本発明は
バクテリオファージを検出すべき試料水と、難水溶性の
カルシウム化合物、鉄塩および活性炭から選ばれた１種
以上の化合物を接触させ、バクテリオファージを当該化
合物に吸着してバクテリオファージを検出することを特
徴とするバクテリオファージの検出法である。

難水溶性の力μシウム化合物としては次の化合物が使用
できる。

■炭酸カルシウム・・・沈降性炭酸カルシウム、天然物
では石灰石、大理石、貝殻粉末、 ■硫酸塩、フッ化物他・・・石膏、フッ化カルシウム、
フッ石、ホタル石、高炉滓、 ■リン酸塩・・・リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタ
イト、天然物ではリン鉱石、骨炭 鉄塩としては水酸化第二鉄が使用できる。

〔作用〕

試料水中の微量のファージを失活させずに吸着材に吸着
担持させて、イオン強度を変えることによシ、そのファ
ージを溶出させるか、ファージを吸着材に担持させたま
ま宿主菌とともに培養し、ファージの溶菌斑を形成させ
てファージを検出する。

この点を更に詳述すると、ファージは核酸とタンパク質
のみからなシ、それ自体では増殖せず、特定の細菌（宿
主菌、）に寄生、増殖し最終的にはその細菌を溶菌する
特性を有する。ファージの外殻構成物質はタンパク質で
あシ、上記の力ＩＷＶウム化合物、鉄塩、活性炭などは
、とのタンパク質をよく吸着する。特に、ファージの頭
部は細菌に吸着作用を有する吸着器官に比べて比較的大
きいため、大部分のファージはその頭部が上記吸着材に
吸着される。即ち、ファージは細菌を溶菌させる活性を
有したままで当該吸着材に吸着されていることになる。

この上記吸着材に吸着したファージは宿主菌に作用し、
遊離した子ファージを放出し、さらにその近傍の宿主菌
に感染し溶菌させる。この反応は寒天内に菌が固定され
た状態で生じるため、上記吸着材又は液中に遊離したフ
ァージが存在する箇所を中心に溶菌され九透明な斑点が
肉眼で観察されることＫなる。

特に、吸着材を寒天平板上にスポットしたシ、培地に浸
漬することによシ、吸着材廻シのイオン強度が変シ、吸
着材の溶解度の変化によって吸着されていたファージが
一部遊離し、吸着されたファージとともに、その近傍の
宿主菌に感染し溶菌させる作用もある。

糸引き納豆工場の排水を例にとって、本発明の実施例を
以下に説明する。糸引き納豆工場で使用されている納豆
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｎａｔｔｏ　）　　とその工場
排水を用いてあらかじめ納豆菌ファージを分離精製し以
下の試験に供した。

なお、このファージは、既に知られているＢａ−ｃｉｌ
ｌｕｓ　ａｕｂｔｉｌｉｓ　Ｎｆファージ（Ｃ型）の外
観と類似していた。（保坂康弘、用顕茂美、松井千秋編
：ウイｌｖス図鑑（第４版）講談社すインテイフイク（
１９８４）） 〔実施例１〕 無菌水１１００ｆｉにあらかじめ納豆菌ファージを１０
”　／　ｄとなるように注加し試料水を調製した。この
試料水とあらかじめオートクレープ滅菌した沈降性炭酸
力μシウム（ＣａＣＯｓ）　％石灰石粉末（粒径α１〜
α２−）、大理石粉末（粒径α１〜α２■）、内容物を
取シ除いたイガイ殻粉末（粒径（ｌＬ１〜１２　ｗ＋　
）、含水石膏（ＣａＳＯａ’２Ｈ，０：　粒ｉ　１１１
■以下、）、フッ化カルシウム（ＣａＦｌ　：粒径１ｆ
ｆ１１１以下）、ホタル石粉末（ＣａＦに粒径１ｍ以下
、）、高炉滓（成分Ｃａ０３５％、５ｉＯｓ３０％、Ａ
ＴＯｓ　１２％、その他２３％）粉末（粒径１ｌＬ１〜
α２■）、リン酸カルシウム〔Ｃａｓ　（ＰＯ４）！　
）、ヒドロキシアパタイト（Ｃａｇ　（ＰＯ４）１・（
ＯＨ）　）、リン鉱石〔ナウー〜産、Ｃａｇ　（Ｐｏ４
）ｓ　（ＯＨ）３４．３％〕、骨炭〔主成分Ｃａｓ（Ｐ
Ｏ４）ｗｅ　Ｃａ　　１０％〕、水酸化第二鉄（Ｆｅｚ
ＯＢａｘＨｌｏ又はＦｅ０（ＯＨ）、）（以上の粉末は
（ＬＯ２−以下）および活性炭（＝菱化成ダイアホープ
００８粒径α１〜１２日）をそれぞれ約（Ｌ５ｆづつ（
乾燥重量として）、２５℃、２４時間混合し、接触させ
た後、これらの粉末を無菌的にｐ過し上澄液を得た。

この上澄液を適当希釈した液と、納豆菌をあらかじめＬ
Ｂ培地（パクトｂリプトン１０ｔ１酵母エキス５　ｆ％
ＮａＣＡ　５　ｆ、蒸留水１ｔ、ｐＨ７．０〜７．５）
で３０℃、３２時間培養し九菌液（前培養液）１−をあ
らかじめ溶解して４８℃に保った。１．５　Ｘ寒天を含
むＬＢ培地に供に注加してプレートを作成し、上澄液中
のファージ粒子数を測定した。試料水と上澄液中のファ
ージ粒子数の差から、上記吸着材のファージ吸着量を求
めた。

その結果を第１表に示す。

つぎに上述の上澄液から炉別された吸着材ｃＬ５ｔをそ
れぞれ濾過ｖＩ４（１μのグラスファイバーフィルター
）上で２５０−の無菌水によって４回洗浄した。そして
あらかじめ溶解して４８℃に保った１、５％寒天を含む
ＬＢ培地に上記前培養液１−を注加して固定した各平板
上に、上記の洗浄した各吸着剤と上記の４回目の洗浄ｐ
液（Ｌｌ−をそれぞれスポットし、液が寒天にしみ込ん
だ後に、５０°Ｃ１１６〜２４時間培養した。

その結果、洗浄Ｆ液をスポットした平板には溶菌斑が発
生せず、各吸着剤粉末周辺には溶菌斑が発生していた。

即ちファージは失活することなく各吸着剤に吸着してい
ることが確認された。

第１表 〔火施例２〕 無菌水１０ＡＫあらかじめ納豆菌ファージを１０−４／
−となるように注加し試料水を調製した。

第１表の吸着材をそれぞれ５０ｆづつ秤量し、オートク
レーブ滅菌した後、上記試料水１０Ｌとそれぞれ２０°
Ｃで２４時間混合し、接触させた後、無菌的に濾過し試
料水を除いた。

ｐ別した各吸着材の適当少量を、実施例１と同様にして
、菌液を含んだ各平板上にスポットし、３０°Ｃで１６
〜２４時間培養して、観察した。

同様にしてこのようなプレート５枚を作成し観察した。

その結果を第２表に示す。

第２表のように、炭酸カルシウム、リン酸力ＩＶＶウム
、骨炭、ヒドロキシアパタイト、水酸化第二鉄および活
性炭をスポットした全平板については、その周辺には溶
菌斑が認められたが、その他の吸着材には、かならずし
も、常に溶菌斑が認められるとは限らなかった。

第２表 注）＋：溶菌斑　発生 一：溶菌斑　発生せず 〔実施例３〕 第１表に示すすべての吸着材について、実施例２と同様
にして、ファージを吸着後無菌的に濾過し試料水を除い
た。

ついで納豆菌の前培養液を菌数が１０−／−以上となる
ように注加し、上記のファージを担持した吸着材を加え
て室温で１５分間静置し、２０℃、１６〜２４時間振と
う培養法その液１−をあらかじめ溶解して４８°Ｃに保
った１、　５　％寒天を含むＬＢ培地に前培養液１−と
共に注加してプレートを作成した。そのプレートを２０
℃、１６〜２４時間培養後、プｖ−）上の溶菌斑の有無
を観察した。

同様にしてこのようなプレートを５枚作成し観察した。

その結果を第３表に示す。すべてのプレートから溶菌斑
が観察された。

〔比較例〕

従来法と同様に、実施例２の試料水を各々１〇−１１０
０−１１０００−づつ分取し、それぞれに納豆菌の前培
養液を菌数が１０’／ｓｇ以上となるように注加した後
、２０℃、１６〜２４時間培養した。その液の１ｄｔ−
＊施例３と同様にしてプレートを作成し溶菌斑の有無を
観察した。

その結果を第３表に併せて示す。

すべてのプレートで溶菌斑の発生が認められなかった。

第３表 〔発明の効果〕 （１）従来の方法ではファージの検出可能な濃度が１０
−”／−であるのに対し、本発明では１０−’／−迄高
めることができる。

（２）　　ファージの検出可能な濃度が向上することに
よシ、工場のファージ汚染をいち早く察知することが可
能となυ迅速な対応策を講することができる。

（３）　　比較的経済的な材料でファージ検出が可能と
なシ、コストも廉価である。

注）＋：溶菌斑　発生 一：溶菌斑　発生せず

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　バクテリオファージを検出すべき試料水と、難水溶性
   のカルシウム化合物、鉄塩および活性炭から選ばれた１
   種以上の化合物を接触させ、バクテリオファージを当該
   化合物に吸着してバクテリオファージを検出することを
   特徴とするバクテリオファージの検出法。