JP3338706B2 - 固定化乳酸菌を用いるバイオリアクター及びその使用方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固定化乳酸菌を用いるバイオリアクター及
びその使用に関する。

発酵プロセスは、長い間、遊離して生育する細菌培養
で行なわれてきた。固定化された細菌の使用が有利であ
ることがわかったのは、ほんの近年になってからであ
る。固定化細菌は、遊離細菌とは違って、バイオリアク
ター内に保持されており、連続的プロセスにおいて使用
することを可能にする。固定化細菌を用いるプロセスは
高い細菌濃度を可能にし、従って、遊離して生育する細
菌に比べてさらに速い反応速度が達成され、従ってより
小規模の工場で可能となり、又プロセスの持続時間を著
しく短縮できるようになる。

乳酸菌及びそれから産生された生産物は食品製造にお
いて広く用いられている。さまざまな乳酸菌の固定化も
同様に知られている。発酵プロセスにおいて固定化乳酸
産生菌の使用については、詳細な報告が、Marc R.Smifh
及びJan A.M.DuPont（農業大学、食品科学部門、工業微
生物学研究所、PO.Box 8129,6700EVWageningen）によっ
て、その論文「発酵プロセスにおける固定化乳酸菌の応
用」の中で記されている。

この中で、固定化はさまざまなトラッピング又は被包
技術を用いて行なわれている。例えば、ゲル化プロセス
で細菌を用いるためには、寒天、ゼラチン又はアルギン
酸塩が用いられる。溶剤沈澱法により細菌のトラッピン
グを達成するためには、酢酸セルロース又はポリスチレ
ンが使用される。さらに、重縮合又は重合によってトラ
ッピングを達成するため、エポキシ樹脂及びポリウレタ
ン又はポリアクリルアミドが使用される。しかしなが
ら、上述の担体材料は、工業的規模でのその加工におい
て多大な欠点を結果としてもたらす。

かくして、例えば、上述の担体材料は軟らかく、高流
量でのパックベッド型反応器において又は大型ユニット
の使用において不必要な圧力損失を生む。さらに、細菌
を担体材料内に固定する場合、固定化は別々に行なわれ
なくてはならない。すなわち後に乳酸産生が続く反応器
の中で、固定段階自体を行なうことはできないのであ
る。最後に、担体が汚染した場合又はその他の理由で反
応器内でのプロセスが中断した場合、担体材料の再使用
は不可能である。同様に、マトリクス内で細菌を固定す
る方法によって乳酸を生産するには、反応速度が拡散プ
ロセスにより制限されるということも大きな欠点であ
る。

本発明の目的は、上述の欠点を克服することができ、
しかも技術的にも経済的にも工業的規模で行なうことの
できるプロセスを実現することを可能にする、固定化乳
酸菌を用いるバイオリアクターを提供することにある。

上述の目的は、固定化された乳酸菌を用いるバイオリ
アクターにおいて、該細菌が連続した多孔性のマトリク
ス又はくぼみ状もしくは網状多孔体粒子からなる実質的
に非圧縮性の担体表面に固定されており、該マトリクス
又は粒子が、個々の微粒子又は微小繊維間の少なくとも
いくつかの接点において、化学的に、接着により又は機
械的に結合された緩く結びついた複数の微粒子又は微小
繊維の構造を有することを特徴とするバイオリアクター
を用いて解決される。好ましくは微粒子又は微小繊維が
陰イオン交換能力をもつ材料、好ましくは樹脂を含むか
又はそれらにより構成されている。

好ましい一実施態様においては、担体はセルロース又
はレーヨン又はそれらの誘導体を含む。これらの誘導体
は、陰イオン交換特性を与えるために化学的に修飾され
る。好ましくは、微粒子又は微小繊維は、例えば接着の
機能を果たす疎水性重合体を用いて、互いに凝集させら
れる。

特に有利な実施態様に従うと、担体の樹脂材料は、米
国特許第4355117号に従ったジエチルアミノエチレンで
修飾されたセルロース（DEAE−セルロース）であり、微
粒子又は微小繊維は、好ましくはポリスチレンと凝集さ
せられている。

上述の好ましい担体を製造するには、好ましくは最初
に疎水性重合体を用いてセルロースの集塊を製造し、次
にこれは、陰イオン交換特性を形成するアルカリ条件の
下で、集塊の水性懸濁液中で誘導化される。この場合、
集塊は、可塑条件まで加熱された疎水性重合体とセルロ
ースを混ぜ合わせることによって製造できる。もう１つ
の可能性としては、有機溶剤中で疎水性重合体の溶液を
生成させ、この中にセルロースを取り込むことによって
凝集させることができる。

凝集物質として適しているものとしては、好ましい重
合体としてのポリスチレンに加えて、メラミンホルムア
ルデヒド樹脂又はエポキシ樹脂がある。

凝集した繊維性イオン交換セルロース複合体の製造に
ついての詳細な記述は、ドイツ特許第3130178C2の中に
見られる。

担体材料のさらなる実施態様には、多孔性の焼結ガラ
ス又はセラミクス材料が含まれる。

本明細書中で用いられる「乳酸菌」という語は、Aero
coccus,Carnobacterium,Enterococcus,Erysipelothrix,
Gemella,Globicatella,Lactobacillus,Lactococcus,Leu
conostoc,Pediococcus,Streptococcus,Tetragenococcus
及びVagococcus属を包含する。これらの属は一般に、そ
れに属する細菌が、乳酸及びその他の特定の産物を産生
する能力を有しているか又はその野生型形態において有
していることを特徴とする。

乳酸の大規模生産のためには、Lactobacillus delbr
ckii,Lactobacillus bulagaricus又はLactobacillus
leichmaniiといったホモ発酵性細菌を使用することがで
きる。乳酸によるビールの酸性化には、Lactobacillus
amylovirus,Lactobacillus plantarum及びLactobacillu
s helveticusを使用することができる。乳酸を含む食品
の生産のためには、Lactobacillus brevis,Lactobacill
us buchneri又はLactobacillus mesenteroidesといった
ヘテロ発酵性細菌が使用される。

上述の細菌が発酵により乳酸を発酵する基質には、ヘ
キソースから成る化合物又は容易にヘキソースに分解さ
れうる化合物が含まれる。これらの原料は、バイオリア
クターの中で処理すべき基質中に存在し、例えば糖蜜、
サトウキビ汁、米澱粉、乳清、亜硫酸パルプ廃液、ジャ
ガイモ澱粉を含む。

バイオリアクターの好ましい一実施態様に従うと、担
持能力すなわち乾燥担体１グラムあたりの細胞数は10⁸
〜10¹²である。ここで、それぞれ意図された用途のため
に充分な量の乳酸が生産されるように担持能力が設定さ
れるよう注意を払わなくてはならない。生産される乳酸
の量を左右するさらなる要因は、反応器に通す流速及び
温度でもある。さらに、バイオリアクター内での基質の
処理においては、酸化プロセスひいては収量損失を防ぐ
ため、好ましくは、空気に触れさせないように保つ。バ
イオリアクター内のプロセス条件は、あらゆるケースに
おいて、乳酸菌が乾燥し切ってしまわないような条件が
得られるように調整される。

本発明の好ましい実施態様に従うと、バイオリアクタ
ーは、担持された担体が反応させるべき流体と接触でき
るようにする装置を含んでいる。有利には、この装置
は、攪拌槽型反応器、バスケット型反応器、流動床式反
応器、パックベッド式反応器及びフィルター式反応器の
中から選定される。バイオリアクターは同様に、１本の
カラム又は有利には平行な複数のカラムである装置で構
成されていてもよい。カラムの中で、処理されるべき基
質は好ましくは重力方向に流れる。

バイオリアクターのもう１つの有利な実施態様は、装
置に加えて、バイオリアクター内のポンプの前方の乾燥
担体材料を水和するためのコンテナ、バイオリアクター
内で担体を殺菌するための殺菌用液体が入ったコンテ
ナ、殺菌後に担体を中和するための中和用液体の入った
コンテナ、バイオリアクター内に圧送して担体表面に固
定させるための細菌懸濁液の入ったコンテナ、処理すべ
き基質の入ったコンテナ、任意にはバイオリアクターか
らの流出物が後反応を受ける後処理コンテナ、及び生成
物の貯蔵用のコンテナをも含んでいる。

バイオリアクターは同様に、圧力放出弁及び二酸化炭
素分離用手段も含んでいてもよい。

本発明の枠内では、乳酸菌の代謝の結果得られる生産
物を製造するため及び原料流の組成を修正するために、
バイオリアクターを使用することができる。

特定の一実施態様に従うと、バイオリアクターは、乳
酸、好ましくはＬ（＋）乳酸の生産において応用され
る。

特定の乳酸菌を選定することにより、本発明に係るバ
イオリアクターは、乳酸に加えて又は乳酸の代替として
さらなる化合物を生産するのに使用することができる。
かくして、食品保存にとって有用なナイシンのようなバ
クテリオシンの生産に言及することができる。同様に、
ジアセチル、エタノール、プロパノール、イソブタノー
ル、ペンタノール及びヘキサノールのような特定の香料
化合物を生産することも可能である。本発明に係るバイ
オリアクターは同様に、リパーゼのような細胞外酵素、
デキストランのような重合体、又は乳酸に加えてその他
の有機酸を生産するのに使用することもできる。さらに
同様に、反応器内で特定の細胞結合ウレアーゼ酵素を使
用することにより原料流から尿素を除去することも可能
である。

バイオリアクターのもう１つの好ましい利用分野は、
牛乳又はフルーツジュースのような流動、圧送可能な食
品における乳酸の産生に見られる。

最後に、本発明に係るバイオリアクターは、同様に、
有利に、例えばジュース、レモネード、ビール、ワイン
のような飲料を酸性化するためにも使用できる。

本発明に係るバイオリアクターの利点は、まず第１
に、実質的に非圧縮性の担体を用いてバイオリアクター
自体の中の過度に高い圧力を防ぐことができるというこ
とである。さらに、本発明のバイオリアクターは、細菌
がマトリクス内部ではなく特定的に使用される担体の表
面において固定されるという点で、先行技術のものと異
なっている。従って、いかなる拡散バリアも発生せず、
表面の細菌濃度が高いことから、認知できるほどにより
高い反応速度ひいてはより短い反応時間、そして基質の
より優れた利用を達成することができる。表面における
細菌の固定は、さらに担体を再生し再利用できるという
効果をもたらす。

本発明に従ったバイオリアクターは、乳酸菌の代謝の
結果得られる生産物、特に乳酸の製造に関して高い融通
性及び高い能力を内含する。このバイオリアクターは数
週間にわたり待機状態に保つことができ、又きわめて容
易に始動させることができる。バイオリアクター内のプ
ロセスは完全に自動的にかつ閉鎖されたシステム内で行
なうことができ、そのため全く汚染が無く優れた生物学
的条件が得られる。本発明に係るバイオリアクターは、
コンパクトな設備そしてエネルギー及びコストの節減を
可能にする。

以下では、制限的な意味をもたないものとして理解さ
れるべき例を用いて、さらに詳細に本発明について記述
する。

例1:担体の製造 米国特許第4,355,117号に従って以下のとおり、粒状
誘導体化セルロースを製造した。

25部の繊維質セルロースを25部の二酸化チタンと混合
し、混合物を２軸押出し機を用いて食品等級の高衝撃ポ
リスチレン50部と混ぜ合わせた。押出し物を水中で冷却
し、0.35〜0.85mmの粒度になるようふるいにかけた。

ふるいにかけた粒状凝集セルロース粒子を誘導体化し
て、前述の米国特許に記載されているとおり、DEAEセル
ロースを形成した。

例2:担体の水和、殺菌、担持及び担体上での細菌の固定
化 例１で製造した粒状DEAE−セルロース10gを精製水中
でスラリーになるまで溶き、随時攪拌しながら５時間ソ
ーキングした。水和した担体を次に精製水で傾瀉し、内
径15mmのガラス製カラム内に移した。ここで担体は、高
さ145mmのベッドを形成した。

乳酸産生菌（Lactobacillus amylovorus,NRRL Ｂ−4
540）を30℃で48時間、培地（DIFCO 0881−01−３）中
で培養した。細胞懸濁液50mlを担体ベッドに通して25ml
/時の流速で圧送した。ひきつづきこの中にさらに50ml
の精製水を圧送した。カラムの流出物を、それが透明と
なって合計75mlの体積になるまで収集した。使用後、バ
イオリアクターを以下のとおり殺菌し再担持することに
よって、再利用に備えて準備した。

バイオリアクターを、流出物に色がなくなるまで73℃
で約５ベッド分の体積の２％NaOHを通過させることによ
って殺菌した。流出物のpHが10.8となるまで１時間につ
き約２ベッド分の体積の流量で73℃で無菌水を通過させ
ることによって、バイオリアクターを洗浄した。洗浄用
水を22℃の0.5％クエン酸溶液で置換し、これを、流出
物のpHが4.2となるまで１時間あたり２ベッド分の体積
でバイオリアクター内に通過させた。酸溶液を30℃の無
菌水で置換し、これを２ベッド分体積／時でカラム内を
通過させた。

ホップやホップ抽出物が全く無い麦汁の中で48時間30
℃で培養したPediococcus pentosaceus（VTTE−88317）
を次に、バイオリアクター内で固定化させた。25ml/時
の流速で50mlの細胞懸濁液を圧送して担体ベッドに通し
て、ひきつづき、さらに50mlの精製水をその中に圧送し
た。カラムの流出物が透明となり、合計体積が75mlとな
るまで収集した。バイオリアクター内の細胞の担持は、
乾燥担体1gあたり3.96×10⁹CFUであった。

例3:麦汁の処理 通常の方法で生産されたがホップやホップ抽出物を含
んでいない麦汁を、例２で作ったバイオリアクターの中
に入れた。この場合、麦汁の糖含有量は、ブリックス屈
折測定計で15.1％となり、pH値は約5.50であった。麦汁
を48℃、圧力１バール、反応器全体を通しての接触時間
10分で供給した。流出物のpH値は約3.5であった。

例4:L（＋）乳酸の生産 ｉ）ジャケットを備えた内径1.5cmのガラス反応器に、3
0℃の精製水中で基本的に例１に従って製造した市販の
製品であるSpezyme GDC220の10gを担持した。ベッドの
担持体積は約25〜30mlであった。MRS肉汁（Difco）内で
生育させたLactobacillus casei亜種Casei（ATCC393、
ジアセチルの生成者として既知である、培養CFU:62×10
⁹ml）の培養物50mlを15ml/時（約0.5ベッド分体積／
時）の流量で、上から下へと反応器内へ圧送し、細菌を
GDCベッド中に一度に通すことによって固定化させた。
反応器内で固定化された細胞の数を適当な希釈及び未結
合細胞のMRS寒天平板上のCFU計数によって数量化した。
反応器内のバイオマス担持は2.7×10¹¹CFUであり、パッ
クベッドの8.9×10⁹CFU/mlと同等であった。次に、グル
コース 20g/l;MgSO₄・7H₂O 0.1g/l;MnSO₄・H₂O 0.05
g/l;Na₂HPO₄ 2g/l及び酵母エキス（Difco）、（1g/l）
pH6.5からなる無菌原料液を、同じ流量でカラム内に通
過させた。生成物放出液の試料を毎日、生成物分析のた
め収集した。生育及び／又はこすことによりカラムから
連続的に取り出された少数の生菌によりひき起こされる
収集期間中のあらゆる反応を避けるため、試料を氷上で
収集した。反応器内の酸の生産は、原料流のものよりも
標準的に約2pH単位下である流出物のpHを測定すること
によって、適切に監視された。

６日間反応器を作動状態に維持し、この間流出物内の
Ｌ（＋）乳酸の濃度（酵素テストキット−Boehringer M
annheim Cal.No.139084で測定）は、１日目の0.36g/l
（流量15.6ml/時）から６日目の0.43g/l（流量12.4ml/
時）まで上昇した。Ｄ（−）乳酸は、全体を通して方法
の検出限界（0.02g/l）以下であった。

Ｌ（＋）乳酸の生成速度はかくして１日目に187mg/l
・時（2.08mg/時/10¹¹CFU）そして６日目に178mg/l・時
（1.97mg/時/10¹¹CFU）であった。

その他の点では同じであるものの4.1×10¹⁰CFUという
より少く担持した反応器は、同様の空間−時間収量（26
4mg/l・時）で、ただし著しく高いバイオマスに基づく
収量（19.4mg/時/10¹¹CFU）で、Ｌ（＋）乳酸を生成し
た。

ii）Ｌ（＋）乳酸を産生する既知のホモ発酵性乳酸菌で
あるLactococcus lactis亜種・lactis（LMG6890）を利
用した反応器をセットし、例4i）に記述した通り9.2×1
0¹⁰CFUの担持で作動させた。７日間の作動期間全体にわ
たり、流出物中のＬ（＋）乳酸の濃度は、1.3〜1.5g/l
であった;D（−）乳酸は検出レベル以下であった。空間
−時間生産性は、667mg/l・時であり、バイマスに基づ
いた生産性は21.8mg/時/10¹¹CFUであった。当業者にと
っては明らかであるように、本書に記されているとおり
の固定化された反応器内で用いるためのこの微生物菌株
の重要な特徴は、流出物中に存在する細胞の数が少ない
ことである（50〜500CFU/ml）。

iii）既知のナイシン生産菌であるLactococcus lactis
亜種・lactis（LMG7930）の異なる菌株を利用する反応
器を、1.25×10¹¹CFUの担持で例4i）に記述されている
とおりにセットした。グルコース 20g/l;クエン酸三ナ
トリウム塩 2g/l;酵母エキス 1g/l;細菌学ペプトン
5g/l;MgSO₄・7H₂O 0.2g/l;K₂HPO₄ 5g/l;Na₂SO₄ 1g/
l;pH6.7を含む無菌原料溶液上で、基本的に記述されて
いる通りに反応器を作動させた。６日間の作動全体にわ
たり、流出物中のＬ（＋）乳酸の濃度は2.9〜3.1g/lで
あった;D（−）乳酸は検出レベル以下であった。空間−
時間生産性は1653.3mg/l・時であり、バイオマスに基づ
く生産性は39.7mg/時/10¹¹CFUであった。

例5:ジアセチルの付加的生産 ｉ）例4i）に記述された反応器は、Ｌ（＋）乳酸に加え
て、乳酸菌に典型的な一連の香料化合物を生成した。A.
Kaipainenが「Journal of High Resolution Chromatogr
aphy（高分解能クロマトグラフィジャーナル）」15、75
1〜755（1992）に記述しているとおり、香料化合物をヘ
ッドスペースGLC−MSにより分析した。この方法は、適
切な低レベルの検出を提供するが、真正標準との比較に
よる数量化は、FID検出を伴うGLCのようなその他の方法
ほど精確ではない。例4i）の中で記述した反応器内で使
用されたLactobacillus casei亜種casei ATCC393は、そ
の作動中の早い時点で約1,000ppmでジアセチルを生成し
たが、Ｌ（＋）乳酸の生産が一定であり続けたのに対
し、ジアセチルの生産は、時間の経過と共に減少した。
作動の早い時点で、反応器の空間−時間生産性は520mg
ジアセチル/l・時であり、バイオマスベースで表わすと
5.8mg/時/10¹¹CFUであった。

例6:ナイシンの付加的生産 ｉ）例4iii）に記述した反応器は、Ｌ（＋）乳酸に加え
てナイシンを生産した。ナイシンは、Nissen−Meyen et
al.Journal of General Microbiology（一般微生物学
ジャーナル）（1993）139,1973〜1978に記述されている
ものに類似したマイクロタイター平板検定においてMicr
ococcus flovus（NCIB8166）の感受性指示菌株を用いた
生育抑制試験によって検出され検定された。MRS肉汁内
の試験用微生物の接種物を伴うマイクロタイター平板ウ
エル内で、反応器からの生成物の段階希釈を行なった。
ウエル内の全体的生育を監視するバイオスクリーン計器
の中で、試験用微生物の生育を追跡調査した。反応器生
成物と同じpH（pH4.5）で同じ乳酸濃度（3g/l）を含む
対照と比較した、50％の生育抑制を与えた反応器生成物
の希釈（Nissen−Meyer et al.によって使用されていた
ように濁度のみではなく、濁度と時間の積分により測定
されたもの）を、1BU（バクテリオシン単位）を含んだ
反応器生成物の量として取り上げた。反応器生成物は、
300BU/mlを含んでいた。バクテリオシンの生産性（産生
微生物及び指示菌株の感受性をベースとしたナイシンと
して取り上げたもの）は、160×10³BU/l・時及び3,840B
U/時/10¹¹CFUであった。

例7:酵素の付加的生産 固定化したLactococcus lactis亜種lactis（LMG793
0、例4iii））を含む反応器からの作動２日目の流出物
の試料をまず最初に0.2μｍのフィルターを通してろ過
し、あらゆる細菌細胞を除去し、次に、10,000NMWL（Mi
llipore Ultrafree−CL）の限外ろ過膜を通過させるこ
とにより５倍濃縮した。カゼイン基質の加水分解が関与
するpH4での濃縮物の標準的プロテアーゼ検定でも、プ
ロテアーゼ酵素活性の存在を検出することはできなかっ
た。しかしながら、0.01MのNaOHでの滴定により８に維
持されたpHと40℃で、CaCl₂（0.51％w/v（重量／体積
％））を含むアラビアゴム（２％w/v）中の５％w/vエマ
ルジョン中でのオリーブ油の加水分解が関与する標準pH
−スタット検定において、同じ濃縮試料内でリパーゼ活
性を検出することができた。1Uのリパーゼ活性は、これ
らの条件下での１分あたりの１μmoleの脂肪酸の放出速
度（μmole/分単位でのNaOHの滴定速度に等しい）とし
て定義づけされる。リパーゼ活性は、反応器流出物内で
0.022U/mlであり、反応器の生産性は11.9リパーゼU/l・
時又は0.5リパーゼU/時/10¹¹CFUであった。

例8:DL乳酸及びその他の有機酸の生産 ｉ）他の乳酸菌がヘテロ発酵性代謝を有し、Ｌ（＋）及
びＤ（−）乳酸の両方ならびに酢酸のようなその他の有
機酸を産生するのに対して、いくつかの乳酸菌はホモ発
酵性代謝を有し、Ｌ（＋）乳酸を産生することが認めら
れている。さらに、若干の乳酸菌はＬ（＋）及びＤ
（−）乳酸を相互変換することのできるラセマーゼ酵素
を有する。Ｌ（＋）及びＤ（−）乳酸の混合物は、以下
のようにセットし作動させた固定化Leuconostoc mesent
eroides亜種mesenteroides（DSM20187）を含む反応器に
よって生産された。微生物は、MRS肉汁上で振とうフラ
スコ培養内で成育させ、例4i）に記述されているように
固定化させた。当初の反応器内への細胞の担持は3.2×1
0¹⁰CFUであった。反応器は、シュクロース 20g/l;MgSO
₄・7H₂O 0.1g/l;MnSO₄・H₂O 0.05g/l;Na₂HPO₄ 2g/l;
酵母エキス 1g/l:pH6.5を含む原料を用いて、15ml/時
の名目流量で27℃で作動させた。作動６日目の流出物の
pHは3.8であり、反応器を通過したときの原料の酸性化
により酸生成は明白であった。６日目に、流出物内のＤ
（−）乳酸の濃度は0.7g/lであり、Ｌ（＋）乳酸の濃度
は0.1g/lであった。dL乳酸を合わせた生産性は381mg/l
・時（当初適用された細胞に基づき35.8mg/時/10¹¹CF
U）であった。

作動条件下でのこの微生物の１つの特徴は、作動中反
応器内でバイオマスが著しく増大するものの、流出物中
ではバイオマスが受容可能な低レベルに維持されていた
（約３×10⁴CFU/ml）という点にある。Leuconostoc mes
enteroides亜種、mesenteroides（DSM20187）が担持さ
れたこの反応器内では酢酸は検出されなかった。

ii）Lactococcus lactis亜種lactis（LMG7930）が担持
された反応器内で（例4iii））、用いたHPLC検定におい
て0.05g/lの検出限界より上で低濃度の酢酸が検出され
た。この反応器内で生産されたＬ（＋）乳酸及びナイシ
ンに加えて、反応器の作動中早い時点での流出物中に
は、0.06g/lの酢酸が発見された。

例9:デキストランの付加的生産 ｉ）例8i）に記述されている既知のデキストラン生産者
であるLeuconostoc mesenteroides亜種mesenteroidesを
含む反応器は、乳酸及び酢酸に加えてデキストランを生
成した。反応器流出物の中のデキストランの存在は、流
出物の粘度を測定することによっては示すことができな
かったが、アルコールを使ってデキストランを沈降さ
せ、特異的酵素を用いてデキストランを加水分解し、以
下のとおり糖を還元するための標準的DNS検定により放
出されたグルコースを測定することによって示すことが
できた。反応器流出物の30ml又は50mlのいずれかの試料
を、5Mの酢酸ナトリウム（試料10ml中1ml）及びイソプ
ロパノール（最終濃度67％）を室温で添加することによ
って処理し、デキストランを沈降させ、このデキストラ
ンを遠心分離により回収した。上清を捨て、10分間沸騰
水浴中でのインキュベーションにより精製水中で再溶解
させ、上述のとおりアルコールで再沈降させることによ
って、その他の成分特に糖が実質的に含まれない状態で
デキストランペレットを洗浄した。最終的ペレットを煮
沸により1mlの精製水中に溶解させ、0.1Mの酢酸ナトリ
ウム緩衝液pH5.3を1ml加えた。この溶液1mlを50℃で１
時間デキストラナーゼ酵素調製物（Amano）１μｌと共
にインキュベートし、デキストランを加水分解した。4m
lのDNS試薬（１％の3,5−ジニトロサリチル酸、1.6％の
水酸化ナトリウム及び30％のＫ−Na酒石酸塩）を添加す
ることによって反応を終結させ、混合物を６分間沸騰水
浴中に置いた。同じDNS試薬パッチで既知のグルコース
濃度で作成された標準曲線と試料の540nmでの吸収度を
比較することによってグルコース濃度を測定した。DNS
試薬の後にデキストラナーゼが添加された点を除いて、
同じ要領でさらに1mlのデキストラン溶液について行な
われた対照検定の吸収度によって、観察された値を補正
した。反応器流出物中のデキストランの濃度は作動６日
目で0.04g/lであった。反応器の生産性は19.1mgデキス
トラン/l・時及び1.79mgデキストラン／時/10¹¹CFUであ
った。

ii）例9i）中に記述されている反応器を、バックベッド
からの廃液が、ベッドを通過した直後の反応器流出物と
して収集されるような形で構成し作動させた。デキスト
ラン合成は、原料中のシュクロースに対する遊離細胞外
酵素デキストランスクラーゼの作用の結果であることが
わかっていることから、デキストランスクラーゼ反応が
反応器内の理想に近い条件下で起こるように、より長い
時間を許容することによってより大きいデキストラン生
産を達成することが可能であった。ガラスジャケットを
備えた反応器の底面に置かれた固定化Leuconostoc mese
nteroides亜種、mesenteroides（DSM20187）の類似のベ
ッドをもったもう１つの反応器を作った。パックベッド
からの流出物が反応器を通過して外の氷上で収集される
前に、約6.4時間ベッドより上の空間内にとどまるよう
に、下から上へ原料を通過させることにより反応器を作
動させた。反応器は基本的に、１×10¹⁰CFUの細胞を担
持して例4i）及び8i）の中で記述されているとおりにセ
ットした。供給は、13ml/時（約0.5ベッド体積／時）の
名目流量で例8i）に記述されたものと同じであった。上
述の分析により測定したとおりの反応器流出物内のデキ
ストラン濃度は、0.09g/lで作動５日目と８日目の間で
一定であった。反応器生産性は39mgデキストラン/l・時
及び11.7mgデキストラン／時/10¹¹CFUであった。

例10:反応器内通過中の尿素の除去／分解 1.12×10¹⁰CFUの担持でLactobacillus fermentum（AT
CC9338）を用いて基本的に例4i）に従って作成した反応
器を、名目でグルコース 20g/l;尿素 4g/l;MgSO₄・7H
₂O 0.1g/l;MnSO₄・H₂O 0.05g/l;Na₂HPO₄ 2g/l;酵母
エキス 1g/l;pH6.5を含む原料を用いて作動させた。原
料を高圧滅菌した後、イソクラティク溶離液としてCa
（NO₃）_２溶液を用いて、85℃でCa²⁺イオン交換カラム
上でのHPLC分析により測定した尿素濃度は2.7％であっ
た。原料を21.0ml/時で反応器内に通過させ、流出物中
の尿素の濃度を上述のとおりHPLCにより測定した。流出
物中の尿素濃度は0.3g/lまで低下した。尿素除去速度は
310ml/l・時及び56mg/時/10¹¹CFUであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 7/56 Ｃ１２Ｐ 7/04 // Ｃ１２Ｐ 7/04 7/54 7/54 19/08 19/08 Ｃ１２Ｒ 1:645 (Ｃ１２Ｎ 9/20 1:245 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:225 (Ｃ１２Ｐ 7/56 Ａ２３Ｌ 2/00 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:245） (Ｃ１２Ｐ 7/56 Ｃ１２Ｒ 1:225） (72)発明者 ヴィルヤバ，ティモ・タピオ フィンランド国、エフアイエヌ―02460 カントヴィク、コルサリンティエ 18 (72)発明者 ハモンド，ロジャー・チャールス フィンランド国、エフアイエヌ―02660 エスポー、ヘメーンキュルエンティエ 15 (56)参考文献 特開 平２−26641（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−94022（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12M 1/00 - 3/06 A23C 9/127 C12N 11/00 - 11/12

Claims (19)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】固定化された乳酸菌を用いるバイオリアク
   ターにおいて、該細菌が連続した若しくは多孔性のマト
   リクス又はくぼみ状もしくは網状多孔体粒子からなる実
   質的に非圧縮性の担体表面に固定されており、該マトリ
   クス又は粒子が、個々の微粒子又は微小繊維間の少なく
   ともいくつかの接点において、化学的に、接着により又
   は機械的に結合された緩く結びついた複数の微粒子又は
   微小繊維の構造を有し、ここで該微粒子又は微小繊維
   が、陰イオン交換能力を有する材料、好ましくは樹脂を
   含むか又はこれらにより構成されていることを特徴とす
   るバイオリアクター。
2. 【請求項２】担体が、セルロース又はレーヨン又はそれ
   らの誘導体を含むことを特徴とする、請求の範囲第１項
   に記載のバイオリアクター。
3. 【請求項３】担体が、ジエチルアミノエチレンで修飾さ
   れたセルロース（DEAEセルロース）であり、微粒子又は
   微小繊維がポリスチレンと凝集されていることを特徴と
   する、請求の範囲第２項に記載のバイオリアクター。
4. 【請求項４】担持能力（乾燥担体1gあたりの細菌細胞
   数）が、10⁸〜10¹²であることを特徴とする、請求の範
   囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載のバイオリアク
   ター。
5. 【請求項５】反応させるべき流体と担持された担体との
   接触を可能にする装置を含んでいることを特徴とする、
   請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載のバイ
   オリアクター。
6. 【請求項６】装置が、攪拌槽型反応器、バスケット型反
   応器、流動床式反応器、パックベッド式反応器及びフィ
   ルター式反応器から成る群の中から選択されることを特
   徴とする、請求の範囲第５項に記載のバイオリアクタ
   ー。
7. 【請求項７】装置が、１本のカラム又は有利には平行な
   複数のカラムで構成されていることを特徴とする、請求
   の範囲第６項に記載のバイオリアクター。
8. 【請求項８】装置に加えて、バイオリアクター内に圧送
   する前に乾燥担体を水和するためのコンテナ、バイオリ
   アクター内で担体を殺菌するための殺菌用液が入ったコ
   ンテナ、殺菌後に担体を中和するための中和用液が入っ
   たコンテナ、バイオリアクター内に細菌を圧送して担体
   表面に細菌を固定させるための細菌懸濁液が入ったコン
   テナ、処理すべき基質が入ったコンテナ、任意にはバイ
   オリアクターからの流出物が後反応を受ける後処理コン
   テナ、及び生成物の貯蔵用のコンテナが存在することを
   特徴とする、請求の範囲第５項〜第７項のいずれか１項
   に記載のバイオリアクター。
9. 【請求項９】圧力放出弁及び／又は二酸化炭素を分離す
   るための手段を含んでいることを特徴とする、請求の範
   囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載のバイオリアク
   ター。
10. 【請求項１０】乳酸菌の代謝の結果得られる生産物を製
    造するため及び原料流の組成を修正するための、請求の
    範囲第１項〜第９項のいずれか１項に記載のバイオリア
    クター。
11. 【請求項１１】乳酸、好ましくはＬ（＋）乳酸を生産す
    るための、請求の範囲第10項に記載のバイオリアクタ
    ー。
12. 【請求項１２】香料化合物を生産するための、請求の範
    囲第10項に記載のバイオリアクター。
13. 【請求項１３】バクテリオシンを生産するための、請求
    の範囲第10項に記載のバイオリアクター。
14. 【請求項１４】乳酸以外の有機酸を生産するための、請
    求の範囲第10項に記載のバイオリアクター。
15. 【請求項１５】細胞外酵素を生産するための、請求の範
    囲第10項に記載のバイオリアクター。
16. 【請求項１６】乳酸菌を用いて得ることのできる重合体
    を生産するための、請求の範囲第10項に記載のバイオリ
    アクター。
17. 【請求項１７】尿素を除去するための、請求の範囲第10
    項に記載のバイオリアクター。
18. 【請求項１８】食料又は飼料製品から成る原料流の中で
    乳酸を生成させるための、請求の範囲第11項に記載のバ
    イオリアクター。
19. 【請求項１９】飲料を酸性化するための、請求の範囲第
    10項又は第18項に記載のバイオリアクター。