JPH0239900A - バクテリオフアージの検出方法 - Google Patents
バクテリオフアージの検出方法Info
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- JPH0239900A JPH0239900A JP18679688A JP18679688A JPH0239900A JP H0239900 A JPH0239900 A JP H0239900A JP 18679688 A JP18679688 A JP 18679688A JP 18679688 A JP18679688 A JP 18679688A JP H0239900 A JPH0239900 A JP H0239900A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は発酵工業、発酵食品工業の製造に大打撃を与え
るバクテリオファージの検出方法に関し、また人間また
は動植物にとって有用または有害な淡水性または海洋性
細菌に作用するーくクテリオファージの探索に適用でき
るバクテリオファージの検出方法に関する。
るバクテリオファージの検出方法に関し、また人間また
は動植物にとって有用または有害な淡水性または海洋性
細菌に作用するーくクテリオファージの探索に適用でき
るバクテリオファージの検出方法に関する。
細菌を用いる発酵工業、発酵食品の製造分野におけるバ
クテリオファージ(以下ファージという)の汚染は、発
酵製品の製造を妨げ、その損害も致命的となるため大き
な問題である。実際多くの発酵製品でファージ汚染が知
られている。列えば、チーズ、ヨーグルト[造分野では
サツカロマイセス・クレモリス(8accharomy
−css cremoria ) 、サツカロマイセス
・ラクテイス(Saccharomycss 1act
ia ) 等、清酒の分野ではラクトバチルス・プレ
ビス(Lactobaci −11us brevia
’) % レウコノストック・メセンテロイデス(L
auconostoc masenteroides
)等、糸引納豆の分野ではバチルス・ナットク(Bac
illus natto )、 −−グルタミン酸発酵
の分野ではマイクロバクテリウム・アンモニアフィルム
(Micro’bactarium ammoni−a
philum )等、抗生物質製造の分野ではストレプ
トマイセス−グリセウス(Streptomyces
griseus ) 等の宿主菌を溶菌させるファー
ジによる汚染がある。
クテリオファージ(以下ファージという)の汚染は、発
酵製品の製造を妨げ、その損害も致命的となるため大き
な問題である。実際多くの発酵製品でファージ汚染が知
られている。列えば、チーズ、ヨーグルト[造分野では
サツカロマイセス・クレモリス(8accharomy
−css cremoria ) 、サツカロマイセス
・ラクテイス(Saccharomycss 1act
ia ) 等、清酒の分野ではラクトバチルス・プレ
ビス(Lactobaci −11us brevia
’) % レウコノストック・メセンテロイデス(L
auconostoc masenteroides
)等、糸引納豆の分野ではバチルス・ナットク(Bac
illus natto )、 −−グルタミン酸発酵
の分野ではマイクロバクテリウム・アンモニアフィルム
(Micro’bactarium ammoni−a
philum )等、抗生物質製造の分野ではストレプ
トマイセス−グリセウス(Streptomyces
griseus ) 等の宿主菌を溶菌させるファー
ジによる汚染がある。
これに対し、これまでのファージ汚染対策はもっばら予
防的なもので、積極的にファージを不活性化する方法や
薬剤は未だ開発されていない。ファージに感染したもの
を途中でその溶菌?止めることは不可能であるし、宿主
菌の増殖と共にファージも増殖するので、培養条件など
を変えてファージの増殖のみを押えることは不可能であ
る。結局工場全体あるいは製造現場を熱湯によシ清浄に
し、器具や容器の殺菌を完全にするといった雑菌対策が
ファージ対策の中心である。
防的なもので、積極的にファージを不活性化する方法や
薬剤は未だ開発されていない。ファージに感染したもの
を途中でその溶菌?止めることは不可能であるし、宿主
菌の増殖と共にファージも増殖するので、培養条件など
を変えてファージの増殖のみを押えることは不可能であ
る。結局工場全体あるいは製造現場を熱湯によシ清浄に
し、器具や容器の殺菌を完全にするといった雑菌対策が
ファージ対策の中心である。
ファージ汚染を回避する最も実用的な方法はいわゆるロ
ーテーション法である。即ち、ファージに抵抗性を有す
る菌株をあらかじめ選んでおき、ファージ汚染が起きた
ら直ちにそのファージに抵抗性?有する菌株に変えてい
く方法である。しかしこの方法はファージに抵抗性を有
する菌株のない細菌(例えば納豆菌の場合)では、ファ
ージはその種の全ての菌株を侵すのでこの方法を用いる
ことはできない。
ーテーション法である。即ち、ファージに抵抗性を有す
る菌株をあらかじめ選んでおき、ファージ汚染が起きた
ら直ちにそのファージに抵抗性?有する菌株に変えてい
く方法である。しかしこの方法はファージに抵抗性を有
する菌株のない細菌(例えば納豆菌の場合)では、ファ
ージはその種の全ての菌株を侵すのでこの方法を用いる
ことはできない。
このような細菌の場合は如何に早くファージ汚染?検知
するかというファージ予察と、どの工程で感染が起きた
かをつきとめるいわゆる感染源の探索によって迅速にフ
ァージ汚染防止対策を講じることがローテーション法同
様重要である。
するかというファージ予察と、どの工程で感染が起きた
かをつきとめるいわゆる感染源の探索によって迅速にフ
ァージ汚染防止対策を講じることがローテーション法同
様重要である。
従来、平板培養法によるファージの検出可能な下限濃度
は1/dである。ところが、ファージ汚染?いち早く検
知し、感染源の量的指標を把握するためにはできるだけ
低いファージ濃度を検知することが望ましい。そこで、
半定量的ではあるが10−’/Wt水準のファージ濃度
を定量する簡易定量法(別画法)が提案されている。
は1/dである。ところが、ファージ汚染?いち早く検
知し、感染源の量的指標を把握するためにはできるだけ
低いファージ濃度を検知することが望ましい。そこで、
半定量的ではあるが10−’/Wt水準のファージ濃度
を定量する簡易定量法(別画法)が提案されている。
この方法は概ね次のとおυである。
宿主菌濃度107/−以上の菌液に少なくとも7アージ
を1個含むように試料水を加えて適当時間培養する。つ
ぎに、菌液を混和した寒天培地を固めた平板表面上に上
記培養液2画線し、適当時間培養後、画線に浴った溶菌
斑の有無を確認する。
を1個含むように試料水を加えて適当時間培養する。つ
ぎに、菌液を混和した寒天培地を固めた平板表面上に上
記培養液2画線し、適当時間培養後、画線に浴った溶菌
斑の有無を確認する。
この方法では、上記のように、少なくとも1個のファー
ジ粒子が含まれた試料水分混合できる1l(fl、高々
1000+ntであ)、このためファー24度の定量下
限は1o−” /−にすぎない。
ジ粒子が含まれた試料水分混合できる1l(fl、高々
1000+ntであ)、このためファー24度の定量下
限は1o−” /−にすぎない。
通常、食品または発酵工場で使用される用水又は発生す
る排水は製造規模によって異なるが一日数m3〜数百r
n3になる。通常、用水は機器洗浄に用いられる前には
十分な殺菌操作を経るためファージ汚染の原因となるこ
とは稀れである。一方排水には常時発酵に用いられる菌
が機器の洗浄に伴って流入するためファージの存在する
不可避性が高い。排水からのファージの定量は、感染源
となるファージの探索と共に、その工場におけるファー
ジ汚染の指標となるものであるから、実際のファージ汚
染の有無にかかわらず定期的に、濃度よ〈実施すること
が重要である。
る排水は製造規模によって異なるが一日数m3〜数百r
n3になる。通常、用水は機器洗浄に用いられる前には
十分な殺菌操作を経るためファージ汚染の原因となるこ
とは稀れである。一方排水には常時発酵に用いられる菌
が機器の洗浄に伴って流入するためファージの存在する
不可避性が高い。排水からのファージの定量は、感染源
となるファージの探索と共に、その工場におけるファー
ジ汚染の指標となるものであるから、実際のファージ汚
染の有無にかかわらず定期的に、濃度よ〈実施すること
が重要である。
しかし、従来の方法によるファージ下限濃度の1o−3
7,z水準の濃度でも必ずしも十分でない。例えば1o
4/−のファージ1度の場合、1m3中には100個
のファージが含まれることになるため、排水の管理を怠
れば排水の飛沫、従業者の衣服、くっ、手足等への排水
の付漕からファージによる汚染が起シ得るからである。
7,z水準の濃度でも必ずしも十分でない。例えば1o
4/−のファージ1度の場合、1m3中には100個
のファージが含まれることになるため、排水の管理を怠
れば排水の飛沫、従業者の衣服、くっ、手足等への排水
の付漕からファージによる汚染が起シ得るからである。
また−日数m1〜数百m3の排水から高々1000−程
度の採取であるためファージの検出可能な水準は高くな
い。
度の採取であるためファージの検出可能な水準は高くな
い。
そこで本発明者らは大量の試料水から微量のファージを
失活させることなく捕捉・濃縮させる方法を先に提案し
た(特願昭62〜218゜27および特願昭62〜21
8028)。
失活させることなく捕捉・濃縮させる方法を先に提案し
た(特願昭62〜218゜27および特願昭62〜21
8028)。
本発明は、これらの方法に代わる1経済的な方法を継続
して鋭意研究し本発明を完成するに至ったものである。
して鋭意研究し本発明を完成するに至ったものである。
〔開題点を解決するだめの手段]
本発明は大量の試料水から微量のファージを失活させる
ことなく捕捉・濃縮する手段として、キチンをファージ
吸着剤に使用する点を新規とするものであって、本発明
はバクテリオファージを検出すべき試料水とキチンを接
触させてバクテリオファージを該物質に吸着させた後増
殖させ、バタテリオファージを検出することを特徴とす
るバタテリオファージの検出方法である。
ことなく捕捉・濃縮する手段として、キチンをファージ
吸着剤に使用する点を新規とするものであって、本発明
はバクテリオファージを検出すべき試料水とキチンを接
触させてバクテリオファージを該物質に吸着させた後増
殖させ、バタテリオファージを検出することを特徴とす
るバタテリオファージの検出方法である。
キチンはカニ・エビなどの甲殻類の殻の主成分のN−ア
セチルキトサンであυ、本発明において一般的にはカニ
・エビの殻を乾燥し、50〜100メツシユのフレーク
状に調製したもの?キチンとして用い得る。
セチルキトサンであυ、本発明において一般的にはカニ
・エビの殻を乾燥し、50〜100メツシユのフレーク
状に調製したもの?キチンとして用い得る。
試料水中の微量のファージを失活させることなく吸着剤
に吸着担持させたまま宿主菌とともに培養し、ファージ
の溶菌斑を形成させて、ファージを検出する。この点を
更に詳述すると、ファージは核酸とタンパク質のみから
なシ、それ自体では増殖せず、特定の細菌(宿主菌)に
寄生・増殖し、最終的にはその細菌を溶菌する特性を有
する。ファージの外殻構成物質はタンパク質であシ、キ
チンはこのようなタンパク質をよく吸着する。特に、フ
ァージの頭部は、細菌に吸着作用を有する吸着部位に比
べて比較的大きいため、大部分の7アージはその頭部が
キチンに吸着される。即ちファージはその活性を有した
ままキチンに吸着されていることになる。
に吸着担持させたまま宿主菌とともに培養し、ファージ
の溶菌斑を形成させて、ファージを検出する。この点を
更に詳述すると、ファージは核酸とタンパク質のみから
なシ、それ自体では増殖せず、特定の細菌(宿主菌)に
寄生・増殖し、最終的にはその細菌を溶菌する特性を有
する。ファージの外殻構成物質はタンパク質であシ、キ
チンはこのようなタンパク質をよく吸着する。特に、フ
ァージの頭部は、細菌に吸着作用を有する吸着部位に比
べて比較的大きいため、大部分の7アージはその頭部が
キチンに吸着される。即ちファージはその活性を有した
ままキチンに吸着されていることになる。
このキチンに吸着したファージは宿主菌に作用し、遊離
した子7アージを放出し、さらにその近傍の宿主菌に感
染し溶解させる。この反応は寒天内で菌が固定された状
態で生じるため、キチンを中心に溶菌された透明な斑点
が肉眼で観察されることになる。
した子7アージを放出し、さらにその近傍の宿主菌に感
染し溶解させる。この反応は寒天内で菌が固定された状
態で生じるため、キチンを中心に溶菌された透明な斑点
が肉眼で観察されることになる。
糸引き納豆工場の排水に例にとって、本発明の実施列を
以下に説明する。糸引き納豆工場で使用されている納豆
菌(Bacilus natto ) とその工場排
水を用いてあらかじめ納豆菌7アージを分雅精裂し以下
の試験に供した。
以下に説明する。糸引き納豆工場で使用されている納豆
菌(Bacilus natto ) とその工場排
水を用いてあらかじめ納豆菌7アージを分雅精裂し以下
の試験に供した。
〔実施例1]
無菌水100−にあらかじめ納豆菌ファージを10a/
@tとなるように江別し試料水を調製した。この試料水
と、あらかじめオートクレーブ滅菌(121℃、15分
間)したキチン粉末(カニの甲らを粉砕し50〜100
メツシユの7レーク状に調製したもの)11(乾燥重量
として)62o℃、24時間混合し、接触させた後、こ
の粉末を無菌的に戸遇し上せ液を得た。
@tとなるように江別し試料水を調製した。この試料水
と、あらかじめオートクレーブ滅菌(121℃、15分
間)したキチン粉末(カニの甲らを粉砕し50〜100
メツシユの7レーク状に調製したもの)11(乾燥重量
として)62o℃、24時間混合し、接触させた後、こ
の粉末を無菌的に戸遇し上せ液を得た。
この上澄液を適当倍希釈した液と、納豆菌をあらかじめ
LB培地(バクトドリブトン10F、酵母エキス52、
Na0Z 5 t %蒸留水1t%pH7,0〜7.5
)で30℃、32時間培養した菌液(前培養液)1−
をあらかじめ溶解して48℃に保った1、5%寒天を含
むDB培地に共に江別してプレートを作成し、上澄液中
のファージ粒子数を測定した。その結果キチンには9.
4×10”/r(乾燥キチン)のファージ粒子が吸着さ
れていることが判った。
LB培地(バクトドリブトン10F、酵母エキス52、
Na0Z 5 t %蒸留水1t%pH7,0〜7.5
)で30℃、32時間培養した菌液(前培養液)1−
をあらかじめ溶解して48℃に保った1、5%寒天を含
むDB培地に共に江別してプレートを作成し、上澄液中
のファージ粒子数を測定した。その結果キチンには9.
4×10”/r(乾燥キチン)のファージ粒子が吸着さ
れていることが判った。
つぎに、上述の上澄液から戸別されたキチンl末1 f
を濾過膜(1μのグラスフィルター)上で5tの無菌水
によって洗浄した。そしてあらかじめ溶解して48℃に
保った1、5%寒天を含むLB培地に上記前培養液1−
を江別して固化したプレート上に、上記の洗浄したキチ
ン粉末を適当少量スポットし、30℃、16〜24時間
培養した。その結果、キチン粉末周辺に溶菌斑が発生し
ていた。即ちファージは失活することなくキチンに吸着
していることが確認嘔れた。
を濾過膜(1μのグラスフィルター)上で5tの無菌水
によって洗浄した。そしてあらかじめ溶解して48℃に
保った1、5%寒天を含むLB培地に上記前培養液1−
を江別して固化したプレート上に、上記の洗浄したキチ
ン粉末を適当少量スポットし、30℃、16〜24時間
培養した。その結果、キチン粉末周辺に溶菌斑が発生し
ていた。即ちファージは失活することなくキチンに吸着
していることが確認嘔れた。
〔実施例2コ
無菌水10Aにあらかじめ納豆菌ファージを1o ’/
−となるように江別し試料水を調製した。この試料水と
、あらかじめオートクレーブ滅菌したキチン351(乾
燥重量として)を20℃、24時間混合し、接触させた
後、キチンを無菌的に濾過し試料水と除いた。この操作
により納豆菌ファージはキチンに吸着された。
−となるように江別し試料水を調製した。この試料水と
、あらかじめオートクレーブ滅菌したキチン351(乾
燥重量として)を20℃、24時間混合し、接触させた
後、キチンを無菌的に濾過し試料水と除いた。この操作
により納豆菌ファージはキチンに吸着された。
ついで納豆菌をあらかじめLB培地で3m℃、52時間
培養した前培養液を新たなLD培地300−に菌数が1
08/@を以上となるように江別し、上記のファージを
吸着しているキチンを加えて、室温で15分間静置し、
20℃、16〜24時間振とり培養後、その液1−を、
あらかじめ溶解して48℃に保った1、5%寒天を含む
LB培地、前培養1w1tと共に江別してプレートを作
成した。そのプレー)k20℃、16〜24時間培養後
にプレート上の溶菌斑の有無?観察した。同様にしてこ
のようなプレートを5枚作成し観察した。その結果を第
1表に示す。
培養した前培養液を新たなLD培地300−に菌数が1
08/@を以上となるように江別し、上記のファージを
吸着しているキチンを加えて、室温で15分間静置し、
20℃、16〜24時間振とり培養後、その液1−を、
あらかじめ溶解して48℃に保った1、5%寒天を含む
LB培地、前培養1w1tと共に江別してプレートを作
成した。そのプレー)k20℃、16〜24時間培養後
にプレート上の溶菌斑の有無?観察した。同様にしてこ
のようなプレートを5枚作成し観察した。その結果を第
1表に示す。
従来法と同様に、実施例2の試料水を各々1〇−110
0−11000−づつ分注し、それぞれに納豆菌の前培
養液を菌数が10畠/−以上となるように圧加した後、
20℃、16〜24時間培養した。その液の1dを用い
て実施列2と同様にしてグレートを作成し溶菌斑の有無
を観察した。その結果を第1表に示す。
0−11000−づつ分注し、それぞれに納豆菌の前培
養液を菌数が10畠/−以上となるように圧加した後、
20℃、16〜24時間培養した。その液の1dを用い
て実施列2と同様にしてグレートを作成し溶菌斑の有無
を観察した。その結果を第1表に示す。
第1表
注)+:溶菌斑1〜10個発生
升:溶菌斑10個以上発生
:溶菌斑発生せず
〔発明の効果〕
(1)従来の方法ではファージの検出可能な濃度が10
−Z/−であるのに対し、本発明では1o−47−迄高
めることができる。
−Z/−であるのに対し、本発明では1o−47−迄高
めることができる。
(2) ファージの検出可能な濃度が向上することに
より、工場のファージ汚染をいち早く察知することが可
能となり迅速な対応策を講することができる。
より、工場のファージ汚染をいち早く察知することが可
能となり迅速な対応策を講することができる。
(31比較的安価なキチンを用いることにより、経済的
なファージ検知方法?実施することができる。
なファージ検知方法?実施することができる。
Claims (1)
- バクテリオファージを検出すべき試料水とキチンを接触
させてバクテリオファージを該物質に吸着させた後増殖
させ、バクテリオファージを検出することを特徴とする
バクテリオファージの検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18679688A JPH0239900A (ja) | 1988-07-28 | 1988-07-28 | バクテリオフアージの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18679688A JPH0239900A (ja) | 1988-07-28 | 1988-07-28 | バクテリオフアージの検出方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0239900A true JPH0239900A (ja) | 1990-02-08 |
Family
ID=16194738
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP18679688A Pending JPH0239900A (ja) | 1988-07-28 | 1988-07-28 | バクテリオフアージの検出方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0239900A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110907476A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-03-24 | 云南省地方病防治所 | 一种噬菌体透射电镜标本的制备方法 |
-
1988
- 1988-07-28 JP JP18679688A patent/JPH0239900A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110907476A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-03-24 | 云南省地方病防治所 | 一种噬菌体透射电镜标本的制备方法 |
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