JPH0239900A - バクテリオフアージの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は発酵工業、発酵食品工業の製造に大打撃を与え
るバクテリオファージの検出方法に関し、また人間また
は動植物にとって有用または有害な淡水性または海洋性
細菌に作用するーくクテリオファージの探索に適用でき
るバクテリオファージの検出方法に関する。

〔従来の技術〕

細菌を用いる発酵工業、発酵食品の製造分野におけるバ
クテリオファージ（以下ファージという）の汚染は、発
酵製品の製造を妨げ、その損害も致命的となるため大き
な問題である。実際多くの発酵製品でファージ汚染が知
られている。列えば、チーズ、ヨーグルト［造分野では
サツカロマイセス・クレモリス（８ａｃｃｈａｒｏｍｙ
−ｃｓｓ　ｃｒｅｍｏｒｉａ　）　、サツカロマイセス
・ラクテイス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｓｓ　１ａｃｔ
ｉａ　）　　等、清酒の分野ではラクトバチルス・プレ
ビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ　−１１ｕｓ　ｂｒｅｖｉａ
　’）　％　レウコノストック・メセンテロイデス（Ｌ
ａｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍａｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　
）等、糸引納豆の分野ではバチルス・ナットク（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｎａｔｔｏ　）、　−−グルタミン酸発酵
の分野ではマイクロバクテリウム・アンモニアフィルム
（Ｍｉｃｒｏ’ｂａｃｔａｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉ−ａ
ｐｈｉｌｕｍ　）等、抗生物質製造の分野ではストレプ
トマイセス−グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　
ｇｒｉｓｅｕｓ　）　　等の宿主菌を溶菌させるファー
ジによる汚染がある。

これに対し、これまでのファージ汚染対策はもっばら予
防的なもので、積極的にファージを不活性化する方法や
薬剤は未だ開発されていない。ファージに感染したもの
を途中でその溶菌？止めることは不可能であるし、宿主
菌の増殖と共にファージも増殖するので、培養条件など
を変えてファージの増殖のみを押えることは不可能であ
る。結局工場全体あるいは製造現場を熱湯によシ清浄に
し、器具や容器の殺菌を完全にするといった雑菌対策が
ファージ対策の中心である。

ファージ汚染を回避する最も実用的な方法はいわゆるロ
ーテーション法である。即ち、ファージに抵抗性を有す
る菌株をあらかじめ選んでおき、ファージ汚染が起きた
ら直ちにそのファージに抵抗性？有する菌株に変えてい
く方法である。しかしこの方法はファージに抵抗性を有
する菌株のない細菌（例えば納豆菌の場合）では、ファ
ージはその種の全ての菌株を侵すのでこの方法を用いる
ことはできない。

このような細菌の場合は如何に早くファージ汚染？検知
するかというファージ予察と、どの工程で感染が起きた
かをつきとめるいわゆる感染源の探索によって迅速にフ
ァージ汚染防止対策を講じることがローテーション法同
様重要である。

従来、平板培養法によるファージの検出可能な下限濃度
は１／ｄである。ところが、ファージ汚染？いち早く検
知し、感染源の量的指標を把握するためにはできるだけ
低いファージ濃度を検知することが望ましい。そこで、
半定量的ではあるが１０−’／Ｗｔ水準のファージ濃度
を定量する簡易定量法（別画法）が提案されている。

この方法は概ね次のとおυである。

宿主菌濃度１０７／−以上の菌液に少なくとも７アージ
を１個含むように試料水を加えて適当時間培養する。つ
ぎに、菌液を混和した寒天培地を固めた平板表面上に上
記培養液２画線し、適当時間培養後、画線に浴った溶菌
斑の有無を確認する。

この方法では、上記のように、少なくとも１個のファー
ジ粒子が含まれた試料水分混合できる１ｌ（ｆｌ、高々
１０００＋ｎｔであ）、このためファー２４度の定量下
限は１ｏ−”　／−にすぎない。

〔発明が解決しようとする課題〕

通常、食品または発酵工場で使用される用水又は発生す
る排水は製造規模によって異なるが一日数ｍ３〜数百ｒ
ｎ３になる。通常、用水は機器洗浄に用いられる前には
十分な殺菌操作を経るためファージ汚染の原因となるこ
とは稀れである。一方排水には常時発酵に用いられる菌
が機器の洗浄に伴って流入するためファージの存在する
不可避性が高い。排水からのファージの定量は、感染源
となるファージの探索と共に、その工場におけるファー
ジ汚染の指標となるものであるから、実際のファージ汚
染の有無にかかわらず定期的に、濃度よ〈実施すること
が重要である。

しかし、従来の方法によるファージ下限濃度の１ｏ−３
７，ｚ水準の濃度でも必ずしも十分でない。例えば１ｏ
　４／−のファージ１度の場合、１ｍ３中には１００個
のファージが含まれることになるため、排水の管理を怠
れば排水の飛沫、従業者の衣服、くっ、手足等への排水
の付漕からファージによる汚染が起シ得るからである。

また−日数ｍ１〜数百ｍ３の排水から高々１０００−程
度の採取であるためファージの検出可能な水準は高くな
い。

そこで本発明者らは大量の試料水から微量のファージを
失活させることなく捕捉・濃縮させる方法を先に提案し
た（特願昭６２〜２１８゜２７および特願昭６２〜２１
８０２８）。

本発明は、これらの方法に代わる１経済的な方法を継続
して鋭意研究し本発明を完成するに至ったものである。

〔開題点を解決するだめの手段］ 本発明は大量の試料水から微量のファージを失活させる
ことなく捕捉・濃縮する手段として、キチンをファージ
吸着剤に使用する点を新規とするものであって、本発明
はバクテリオファージを検出すべき試料水とキチンを接
触させてバクテリオファージを該物質に吸着させた後増
殖させ、バタテリオファージを検出することを特徴とす
るバタテリオファージの検出方法である。

キチンはカニ・エビなどの甲殻類の殻の主成分のＮ−ア
セチルキトサンであυ、本発明において一般的にはカニ
・エビの殻を乾燥し、５０〜１００メツシユのフレーク
状に調製したもの？キチンとして用い得る。

〔作用〕

試料水中の微量のファージを失活させることなく吸着剤
に吸着担持させたまま宿主菌とともに培養し、ファージ
の溶菌斑を形成させて、ファージを検出する。この点を
更に詳述すると、ファージは核酸とタンパク質のみから
なシ、それ自体では増殖せず、特定の細菌（宿主菌）に
寄生・増殖し、最終的にはその細菌を溶菌する特性を有
する。ファージの外殻構成物質はタンパク質であシ、キ
チンはこのようなタンパク質をよく吸着する。特に、フ
ァージの頭部は、細菌に吸着作用を有する吸着部位に比
べて比較的大きいため、大部分の７アージはその頭部が
キチンに吸着される。即ちファージはその活性を有した
ままキチンに吸着されていることになる。

このキチンに吸着したファージは宿主菌に作用し、遊離
した子７アージを放出し、さらにその近傍の宿主菌に感
染し溶解させる。この反応は寒天内で菌が固定された状
態で生じるため、キチンを中心に溶菌された透明な斑点
が肉眼で観察されることになる。

糸引き納豆工場の排水に例にとって、本発明の実施列を
以下に説明する。糸引き納豆工場で使用されている納豆
菌（Ｂａｃｉｌｕｓ　ｎａｔｔｏ　）　　とその工場排
水を用いてあらかじめ納豆菌７アージを分雅精裂し以下
の試験に供した。

〔実施例１］ 無菌水１００−にあらかじめ納豆菌ファージを１０ａ／
＠ｔとなるように江別し試料水を調製した。この試料水
と、あらかじめオートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分
間）したキチン粉末（カニの甲らを粉砕し５０〜１００
メツシユの７レーク状に調製したもの）１１（乾燥重量
として）６２ｏ℃、２４時間混合し、接触させた後、こ
の粉末を無菌的に戸遇し上せ液を得た。

この上澄液を適当倍希釈した液と、納豆菌をあらかじめ
ＬＢ培地（バクトドリブトン１０Ｆ、酵母エキス５２、
Ｎａ０Ｚ　５　ｔ　％蒸留水１ｔ％ｐＨ７，０〜７．５
　）で３０℃、３２時間培養した菌液（前培養液）１−
をあらかじめ溶解して４８℃に保った１、５％寒天を含
むＤＢ培地に共に江別してプレートを作成し、上澄液中
のファージ粒子数を測定した。その結果キチンには９．
４×１０”／ｒ（乾燥キチン）のファージ粒子が吸着さ
れていることが判った。

つぎに、上述の上澄液から戸別されたキチンｌ末１　ｆ
を濾過膜（１μのグラスフィルター）上で５ｔの無菌水
によって洗浄した。そしてあらかじめ溶解して４８℃に
保った１、５％寒天を含むＬＢ培地に上記前培養液１−
を江別して固化したプレート上に、上記の洗浄したキチ
ン粉末を適当少量スポットし、３０℃、１６〜２４時間
培養した。その結果、キチン粉末周辺に溶菌斑が発生し
ていた。即ちファージは失活することなくキチンに吸着
していることが確認嘔れた。

〔実施例２コ 無菌水１０Ａにあらかじめ納豆菌ファージを１ｏ　’／
−となるように江別し試料水を調製した。この試料水と
、あらかじめオートクレーブ滅菌したキチン３５１（乾
燥重量として）を２０℃、２４時間混合し、接触させた
後、キチンを無菌的に濾過し試料水と除いた。この操作
により納豆菌ファージはキチンに吸着された。

ついで納豆菌をあらかじめＬＢ培地で３ｍ℃、５２時間
培養した前培養液を新たなＬＤ培地３００−に菌数が１
０８／＠を以上となるように江別し、上記のファージを
吸着しているキチンを加えて、室温で１５分間静置し、
２０℃、１６〜２４時間振とり培養後、その液１−を、
あらかじめ溶解して４８℃に保った１、５％寒天を含む
ＬＢ培地、前培養１ｗ１ｔと共に江別してプレートを作
成した。そのプレー）ｋ２０℃、１６〜２４時間培養後
にプレート上の溶菌斑の有無？観察した。同様にしてこ
のようなプレートを５枚作成し観察した。その結果を第
１表に示す。

〔比較例〕

従来法と同様に、実施例２の試料水を各々１〇−１１０
０−１１０００−づつ分注し、それぞれに納豆菌の前培
養液を菌数が１０畠／−以上となるように圧加した後、
２０℃、１６〜２４時間培養した。その液の１ｄを用い
て実施列２と同様にしてグレートを作成し溶菌斑の有無
を観察した。その結果を第１表に示す。

第１表 注）＋：溶菌斑１〜１０個発生 升：溶菌斑１０個以上発生 ：溶菌斑発生せず 〔発明の効果〕 （１）従来の方法ではファージの検出可能な濃度が１０
−Ｚ／−であるのに対し、本発明では１ｏ−４７−迄高
めることができる。

（２）　　ファージの検出可能な濃度が向上することに
より、工場のファージ汚染をいち早く察知することが可
能となり迅速な対応策を講することができる。

（３１比較的安価なキチンを用いることにより、経済的
なファージ検知方法？実施することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. バクテリオファージを検出すべき試料水とキチンを接触
   させてバクテリオファージを該物質に吸着させた後増殖
   させ、バクテリオファージを検出することを特徴とする
   バクテリオファージの検出方法。