JP7195568B2

JP7195568B2 - 複合体

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Publication number: JP7195568B2
Application number: JP2018054389A
Authority: JP
Inventors: 豊展臼杵
Original assignee: Sophia School Corp
Current assignee: Sophia School Corp
Priority date: 2018-03-22
Filing date: 2018-03-22
Publication date: 2022-12-26
Anticipated expiration: 2038-03-22
Also published as: JP2019167301A

Description

本発明は、複合体に関する。

慢性閉塞性肺疾患（Chronic Obstructive Pulmonary Disease：ＣＯＰＤ）は、肺気腫と慢性気管支炎が合併した症状の総称であり、気流閉塞を特徴とする疾患である。この気流閉塞は末梢気道病変と気腫性病変（肺胞壁の破壊）が様々な割合で複合的に作用することで起こる。

ＣＯＰＤ患者の痰・血液・尿を加水分解処理し、高速液体クロマトグラフ－タンデム質量分析計（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry：ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）で分析すると、肺胞の伸縮を司る弾性線維エラスチンの架橋アミノ酸であり下記式に示されるデスモシンおよびその異性体であり下記式に示されるイソデスモシンが観測される。健常者と比べて、ＣＯＰＤ患者におけるそれらの存在量が異なることから、デスモシン類はＣＯＰＤのバイオマーカーとして有望視されている。

一方、デスモシン類の定量法として、ＨＰＬＣを用いた定量法の他に、酵素免疫測定法等の免疫化学的な手法が考えられるが、デスモシン類は、ハプテンであり、それ自体は免疫原性を有さない。そこで、非特許文献１において、デスモシン類とキャリアタンパク質との結合が検討されている。

Verplanke, A. J W.他４名、「Experience with an Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay for the Quantitation of Urinary Desmosine」, Tokai J. Exp. Clin. Med., 1988年, 13, p.159-163

ところが、非特許文献１においては、デスモシンとタンパク質を結合しようとした際に、デスモシンが４個のアミノ基とカルボキシ基を有しているため、デスモシンがタンパク質に多点で結合した種々の結合体が生じてしまい、抗体を安定的に作製できなかった。

そこで、本発明は、デスモシン類の簡便な定量法に用いることができる物質を提供する。

本発明によれば、
デスモシンが、前記デスモシンのピリジン環の４位の側鎖末端において、直接または連結基を介してタンパク質に結合している、複合体が提供される。

本発明によれば、デスモシン類の簡便な定量法に用いることができる物質を提供することができる。

以下、本発明の実施形態を具体例に基づいて説明する。複数の実施形態に記載の態様を組み合わせて用いることもできる。

本実施形態において、複合体は、デスモシンが直接または連結基を介してタンパク質に結合した構造を有する。具体的には、本実施形態における複合体は、デスモシンが、デスモシンのピリジン環の４位の側鎖において、たとえばピリジン環の４位の側鎖末端において、直接または連結基を介してタンパク質に結合しているものである。

本実施形態の複合体は、デスモシンが、デスモシンのピリジン環の４位の側鎖末端においてタンパク質に結合した構造であるため、デスモシン類がタンパク質に安定的に固定化されており、デスモシン類の簡便な定量法に用いることができる。たとえば、本実施形態における複合体を用いることにより、酵素免疫測定法等の免疫化学的な方法によるデスモシン類の検出または定量が可能となる。また、本実施形態における複合体を用いることにより、たとえば、抗デスモシン抗体を得ることも可能となる。
複合体を用いた抗体の製造および抗体を用いるデスモシン類の分析を安定的におこなう観点から、デスモシン１分子中のタンパク質との結合部位の数は、好ましくは１つである。

複合体において、デスモシンのタンパク質との結合部位として、たとえばアミノ基およびカルボキシル基からなる群から選択される１種が挙げられる。
好ましくは、デスモシンは、デスモシンのピリジン環の４位の側鎖末端のアミノ基においてタンパク質に結合している。

また、複合体中のタンパク質（以下、「キャリアタンパク質」ともよぶ。）の具体例として、牛血清アルブミン（Bovine Serum Albumin：ＢＳＡ）、スカシガイヘモシアニン（Keyhole Limpet Hemocyanin：ＫＬＨ）、オブアルブミン（Ovalbumin：ＯＶＡ）、チログロブリン、フィブリノーゲンからなる群から選択される１種が挙げられる。複合体を安定的に形成する観点から、キャリアタンパク質は、好ましくはＢＳＡ、ＫＬＨおよびＯＶＡからなる群から選択される１種であり、より好ましくはＢＳＡおよびＫＬＨからからなる群から選択される１種である。

本実施形態における複合体は、好ましくはデスモシンとキャリアタンパク質Ｐ１とが直接または連結基を介して結合してなる。このとき、複合体は、たとえば下記一般式（１）または（２）に示される。

上記一般式（１）および（２）中、Ｐ１－は、キャリアタンパク質であるＰ１由来の１価の基であり、ｎは平均値であり、０より大きく１００以下の数である。
また、上記一般式（１）中、Ｌ１は単結合または連結基である。上記一般式（２）中、Ｌ２は単結合または連結基である。

一般式（１）において、Ｌ１が連結基であるとき、連結基Ｌ１は、具体的には２価の基である。また、連結基Ｌ１の具体例として、－ＣＯ（ＣＨ₂）_x－Ｌ２－、－ＣＯ（ＣＨ₂）_x－、－（－ＣＨ₂－ＣＨ₂－Ｏ－）_z－、または、下記式に示される基が挙げられる。上記連結基の具体例において、ｘは１以上の整数である。デスモシンとタンパク質との間に適度な空間を得る観点から、ｘは好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは１０以下であり、より好ましくは８以下、さらに好ましくは６以下、さらにより好ましくは５以下である。また、上記連結基の具体例において、ｚは１以上３０以下の数である。

（上記式中、＊は結合手を示す。）

連結基Ｌ１は、縮合剤由来の構造を含んでいてもよい。縮合剤の例として、下記式４０および４１に記載の化合物が挙げられ、これらのいずれかを用いることができる。

また、他の縮合剤の具体例として、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルフォリニウムクロリドｎ－ハイドレート（ＤＭＴ－ＭＭ）等のトリアジン系の縮合剤；ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等のカルボジイミド系の縮合剤が挙げられる。

また、連結基Ｌ１は、スペーサーとして機能する構造を含んでいてもよい。スペーサーの具体例として、アルキル鎖、エチレングリコール鎖が挙げられる。

また、一般式（２）において、Ｌ２が連結基であるとき、連結基Ｌ２は、具体的には２価の基である。また、連結基Ｌ２の具体例として、ペプチド鎖が挙げられる。

一般式（１）および（２）において、Ｐ１－は、キャリアタンパク質であるＰ１由来の１価の基である。Ｐ１－の具体例として、Ｐ１中のアミノ基由来の基、Ｐ１中のカルボキシル基由来の基が挙げられる。複合体の製造容易性を高める観点から、Ｐ１－は、好ましくはＰ１中のアミノ基由来の基、または、Ｐ１中のカルボキシル基由来の基であり、より好ましくはＰ１中のアミノ基由来の基である。

一般式（１）および（２）において、ｎは、１つの複合体中に導入されているデスモシンの数を示し、平均値である。複合体中のデスモシンの固定化密度を高める観点から、ｎは０より大きい数であり、好ましくは１以上、より好ましくは２以上、さらに好ましくは３以上、さらにより好ましくは４以上である。
また、複合体の製造安定性を高める観点から、ｎは、たとえば１００以下であり、好ましくは５０以下、より好ましくは３０以下、さらに好ましくは２０以下、さらにより好ましくは１０以下である。

また、本実施形態における複合体は、デスモシン類の側鎖末端のアミノ基と、キャリアタンパク質中のアミノ基とが結合する構造であってもよい。このとき、複合体は、たとえば下記一般式（３）に示される。

（上記一般式（３）中、Ｐ２－ＮＨ－は、キャリアタンパク質であるＰ２－ＮＨ₂由来の１価の基であり、ｍは平均値であり、０より大きく１００以下の数であり、ｙは２以上１５以下の整数である。）

一般式（３）において、キャリアタンパク質Ｐ２－ＮＨ₂は、リシン残基またはＮ末端に存在するアミノ基において、デスモシンと結合している。

一般式（３）において、ｍは、１つの複合体中に導入されているデスモシンの数を示し、平均値である。複合体中のデスモシンの固定化密度を高める観点から、ｍは０より大きい数であり、好ましくは１以上、より好ましくは２以上、さらに好ましくは３以上、さらにより好ましくは４以上である。
また、複合体の製造安定性を高める観点から、ｍは、たとえば１００以下であり、好ましくは５０以下、より好ましくは３０以下、さらに好ましくは２０以下、さらにより好ましくは１０以下である。

また、一般式（３）において、ｙは、キャリアタンパク質とデスモシンとの間に適度な空間を得る観点から、たとえば２以上であり、好ましくは３以上、より好ましくは４以上であり、また、たとえば１５以下であり、好ましくは１２以下、より好ましくは１０以下、さらに好ましくは８以下、さらにより好ましくは６以下である。

次に、本実施形態における複合体の製造方法を説明する。
本実施形態において、複合体の製造方法は、たとえば、デスモシン類の側鎖末端のアミノ基とタンパク質とを直接または連結基を介して結合させて、複合体を得る工程を含む。
さらに具体的には、複合体の製造方法は、以下の工程を含む。
（工程１）デスモシンの４位の側鎖に、反応性基が選択的に導入されたデスモシン類誘導体を準備する工程
（工程２）デスモシン類誘導体とタンパク質またはその誘導体とを接触させて、複合体を形成する工程

工程１においては、デスモシン類誘導体を準備する。デスモシン類誘導体を合成する場合、たとえば、特開２０１５－１７８９５７号公報に記載の方法を用いて得ることができる。
ここで、デスモシンの４位の側鎖においてタンパク質と選択的に結合させる観点から、デスモシン類誘導体は、好ましくは、デスモシンの４位の側鎖に、反応性基が選択的に導入された化合物である。
反応性基の具体例として、マレイミド基が挙げられる。複合体を安定的に得る観点から、反応性基は、好ましくはマレイミド基である。
たとえば、デスモシンの４位側鎖のアミノ基に反応性基が選択的に導入されたデスモシン誘導体の例として、下記一般式（４）に示される化合物が挙げられる。

（上記一般式（４）中、ｙは、前述した一般式（３）におけるｙと同じである。）
一般式（４）において、ｙの好ましい範囲は、一般式（３）において前述した範囲と同じである。

また、デスモシンの４位の側鎖に反応性基が選択的に導入されたデスモシン類誘導体は、たとえば、デスモシンの４位の側鎖の所定の基を前述した縮合剤と反応させることにより得ることもできる。また、デスモシンの４位の側鎖に、前述したスペーサーを介して反応性基が結合していてもよい。

工程２においては、デスモシン類とタンパク質またはその誘導体とを接触させて、タンパク質にデスモシン類を導入することにより、複合体を得る。
タンパク質誘導体の例として、たとえば、タンパク質に、工程１で得られるデスモシン類誘導体における反応性基と反応する基が導入されたものが挙げられる。
たとえば、デスモシン類誘導体における反応性基がマレイミド基である場合、タンパク質中の１級アミノ基をチオール化し、このチオール基とマレイミド基とを反応させて複合体を形成してもよい。１級アミノ基のチオール化の例として、タンパク質と、２－イミノチオラン塩酸塩（Traut's試薬）との反応が挙げられる。

なお、固定化の際には、必要に応じて、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ｐ－ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール等の活性エステル類を併用してもよい。

以上の手順により、複合体が得られる。得られた複合体においては、デスモシン類がタンパク質に、デスモシンのピリジン環の４位の側鎖末端において選択的に固定化されているため、デスモシン類の検出や定量に好ましく用いることができる。

以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
以下、参考形態の例を付記する。
１．デスモシンが、前記デスモシンのピリジン環の４位の側鎖末端において、直接または連結基を介してタンパク質に結合している、複合体。
２．前記デスモシンが、前記４位の側鎖末端のアミノ基において前記タンパク質に結合している、１．に記載の複合体。
３．前記タンパク質が、牛血清アルブミン、スカシガイヘモシアニン、オブアルブミン、チログロブリン、フィブリノーゲンからなる群から選択される１種である、１．または２．に記載の複合体。
４．当該複合体が下記一般式（１）に示される、１．乃至３．いずれか１つに記載の複合体。

（上記一般式（１）中、Ｌ１は単結合または連結基であり、Ｐ１－は、キャリアタンパク質であるＰ１由来の１価の基であり、ｎは平均値であり、０より大きく１００以下の数である。）
５．当該複合体が下記一般式（２）に示される、４．に記載の複合体。

（上記一般式（２）中、Ｐ１－およびｎは、ぞれぞれ、前記一般式（１）におけるＰ１－およびｎと同じであり、Ｌ２は単結合または連結基である。）
６．当該複合体が下記一般式（３）に示される、１．乃至５．いずれか１つに記載の複合体。

（上記一般式（３）中、Ｐ２－ＮＨ－は、キャリアタンパク質であるＰ２－ＮＨ₂由来の１価の基であり、ｍは平均値であり、０より大きく１００以下の数であり、ｙは２以上１５以下の整数である。）
７．前記キャリアタンパク質が、牛血清アルブミン、スカシガイヘモシアニンおよびオブアルブミンからなる群から選択される１種である、４．乃至６．いずれか１つに記載の複合体。

以下において、非水系反応は、とくに記載のない場合、いずれも、窒素雰囲気下、マグネチックスターラーで撹拌しながらおこなった。ｔ－ブタノール（ｔＢｕＯＨ）は、ＣａＨ₂を用いた蒸留により乾燥し、活性モレキュラーシーブ上に保存した。ＤＭＦはＭｇＳＯ₄を用いた蒸留により乾燥し、活性モレキュラーシーブ上に保存した。トリエチルアミン（Ｅｔ₃Ｎ）、ジイソプロピルエチルアミン（ｉＰｒ₂ＮＥｔ）およびＢＦ₃・ＯＥｔ₂は、ＣａＨ₂上で乾燥した。ジクロロメタン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）、メタノール（ＭｅＯＨ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、ジエチルエーテル（Ｅｔ₂Ｏ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、エタノール（ＥｔＯＨ）等の他の溶媒については、市販品を用い、活性モレキュラーシーブ上に保存した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）は、ＰＢＳタブレットを２００ｍＬの２回蒸留水に溶解して調製した。ＰＢＳ（ｐＨ８．４）は、４６ｍｇのＮａＨ₂ＰＯ₄２Ｈ₂Ｏおよび６７４ｍｇのＮａ₂ＨＰＯ₄を１００ｍＬの２回蒸留水に溶解して調製した。ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）は、８７ｍｇのＢ（ＯＨ）₃および５７ｍｇのＮａ₂Ｂ₄Ｏ₇１０Ｈ₂Ｏを１０ｍＬの２回蒸留水に溶解して調製した。すべての試薬は、とくに記載のない場合、市販品をさらに精製することなく用いた。Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン（ＤＭＡＰ）およびトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ₃）はトルエンを用いて再結晶化した。高光学純度（＞９９．５％）のアミノ酸保護体、出発物質であるヨードアミノ酸（化合物９および化合物３２）ならびにアルキン（化合物８）は渡辺化学工業社より購入した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析は、Ｍｅｒｃｋ社製、シリカゲル６０Ｆ₂₅₄プレートを用いておこなった。カラムクロマトグラフィーは、関東化学製、酸性のシリカゲル６０（球状、４０～５０μｍ）または中性のシリカゲル６０Ｎ（球状、４０～５０μｍ）を用いておこなった。脱塩には、Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（Thermo Fisher Scientific社製、７ＫＭＷＣＯ、１０ｍＬ）またはNAP 5 columns（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。インキュベーションおよび濃縮は、バイオクロマト社製のSmart Evaporatorを用いておこなった。

ＵＶスペクトルは、JASCO V-730BIO紫外／可視分光光度計（日本分光社製）により測定した。旋光度は、JASCO P-2200デジタル旋光計（日本分光社製）を用い、ナトリウムランプ（λ＝５８９ｎｍ）Ｄ線にて測定し、本明細書中以下のように表記する：［α］_D ^T（ｃｇ／１００ｍＬ、溶媒）。スピン脱塩カラムは、Sorvall Legend XTR 遠心分離機（Thermo Fisher Scientific社製）にて使用した。¹Ｈおよび¹³Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは日本電子社製JNM-EXC 300分光計（３００ＭＨｚ）または日本電子社製JNM-ECA 500分光計（５００ＭＨｚ）により測定した。¹H NMRのデータは、本明細書中以下のように表記する：化学シフト（δ、ｐｐｍ）、積分値、***（ｓ：一重線、ｄ：二重線、ｔ：三重線、ｑ：四重線、ｍ：多重線）、カップリング定数Ｊ（Ｈｚ）、帰属。¹³ＣＮＭＲのデータは、本明細書中化学シフト（δ、ｐｐｍ）にて表記する。マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ）スペクトルは、島津製作所社製AXIMA performance装置により測定し、本明細書中、質量電荷比（ｍ／ｚ）で示す。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）スペクトルは、日本分光社製JMS-T100LC装置により測定し、本明細書中、質量電荷比（ｍ／ｚ）で示す。

ピリジニウム化合物のＮＭＲにおける炭素の番号付けは、以下のマレイミド活性化デスモシン（化合物２）に対応する。

（合成例１）
(2S)-2-[(Benzyloxycarbonyl)amino]-3-hydroxypropanoic acid（化合物１２）の合成

クロロギ酸ベンジル（50wt%溶液, トルエン中, 0.42 mL, 2.82 mmol, 1.48 eq)を、飽和ＮａＨＣＯ₃(7.6 mg, 0.25M)水溶液中のＬ－セリン(化合物１１)溶液(200 mg, 1.96 mmol, 1.0 eq)に加えた。混合物を室温にて４時間激しく撹拌し、水層をエーテルで抽出した。水溶液を１ＭＨＣｌにて酸性化して酢酸エチルにて抽出し、有機層をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（CH₂Cl₂/MeOH = 20:1）にて精製することにより、生成物である化合物１２を無色固体（249.6 mg, 1.03 mmol, <69%）として得た; R_f 0.1 (hexane/EtOAc = 2:1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.36 (5H, m, Bn), 5.11 (2H, s, CH₂Ph), 4.28 (1H, t, J = 4.2 Hz, CH), 3.88 (2H, m, CH₂)。

（合成例２）
（S)-tert-Butyl 2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-3-hydroxypropanoate（化合物１３）の合成

Ｚ－Ｌ－セリン（化合物１２）（997.3 mg, 4.18 mmol, 1.0 eq）、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（0.95 mg, 4.18 mmol, 1.0 eq）および炭酸カリウム（3.8 g, 27.2 mmol, 6.5 eq）をＭｅＣＮ（13 mL）中で室温にて５時間激しく撹拌した。これに２－ブロモ－２－メチルプロパン（5.0 mL, 42.6 mmol, 10.2 eq）を加え、反応混合物を５０℃まで加温し、急速に撹拌した。反応混合物は、２～３時間後に非常に高粘度となった。これにさらにＭｅＣＮ（5 mL）を加えて撹拌を促進し、得られた反応混合物を２４時間撹拌した。その後、反応混合物を室温まで冷却し、大部分のＭｅＣＮをロータリーエバポレーターにより除去した。そして、反応混合物をＥｔＯＡｃおよび水の間で分割した。水層をＥｔＯＡｃにて抽出した。ＥｔＯＡｃ層を飽和食塩水にて洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上での乾燥、濾過および濃縮をおこなった。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 40:1）で精製し、生成物である化合物１３を無色固体（926.3 mg, 3.13 mmol, 75%）として得た; R_f 0.51 (hexane/EtOAc = 1:1); [α]_D ²⁰ -16.8 (c 1.1, EtOH); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ7.36 (5H, m, Bn), 5.63 (1H, m, NH), 5.13 (2H, s, CH₂Ph), 4.32 (1H, m, CH), 3.94 (2H, d, J = 3.6 Hz, CH₂), 1.48 (9H, s, tBu)。

（合成例３）
(S)-tert-Butyl 2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-3-iodopropanoate（化合物１４）の合成

トリフェニルホスフィン（1.55 g, 6.26 mmol, 2.0 eq）およびイミダゾール（405.1 mg, 6.26 mmol, 2.0 eq）を、窒素雰囲気下、０℃にて撹拌しながらＣＨ₂Ｃｌ₂（9 mL）中に溶解した。ヨウ素粉末（1.51 g, 6.26 mmol, 2.0 eq）を加えた後、混合物を室温まで温め、10分間撹拌したのち、０℃まで冷却した。冷却した溶液に、(S)-tert-butyl 2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-3-hydroxypropanoate（化合物１３）（878.6 mg, 3.13 mmol, 1.0 eq）のＣＨ₂Ｃｌ₂（8 mL）溶液を加えた。１時間０℃にて撹拌後、反応混合物を減圧濃縮した。残渣を中性シリカゲルのショートカラムにて濾過し、hexane/Et₂O = 1/1にて溶出し、ろ液を濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 10:1）で精製し、化合物１４を黄色固体として得た。これをペンタンから再結晶化して無色結晶（993.3 mg, 2.45 mmol, 78%）を得た; R_f 0.68 (hexane/EtOAc = 2:1); [α]_D ²² -8.1 (c 1.05, EtOH); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ7.36 (5H, m, Bn), 5.60 (1H, m, NH), 5.13 (2H, s, CH₂Ph), 4.41 (1H, m, CH), 3.59 (2H, d, J = 3.6 Hz, CH₂), 1.50 (9H, s, tBu)。

（合成例４）
Bromo(trimethylsilyl)acetylene（化合物１６）の合成

トリメチルシリルアセチレン（化合物１５）（10.8 mL, 75.0 mmol, 1.0 eq）のアセトン（250 mL）溶液にＮ－ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）（14.7g, 82.5 mmol, 1.1 eq）およびＡｇＮＯ₃（1.28 g, 7.5 mmol, 0.1 eq）を室温にて加えた。室温にて２時間撹拌後、反応混合物を氷水で反応停止し、ペンタンで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥、氷浴を用いて濃縮した。これを蒸留して精製し、化合物１６を無色液体（4.77 g, 26.9 mmol, 36%）として得た; ¹HNMR (300 MHz, CDCl₃) δ 0.19 (9H, s, TMS)。

（合成例５）
(S)-tert-Butyl 2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-5-trimethylsilyl-4-pentynoate（化合物１７）の合成

ＣｕＣＮ（492.8 mg, 5.50 mmol, 1.0 eq）およびＬｉＣｌ（466.5 mg, 11.0 mmol, 2.0 eq）を１つのフラスコ中で減圧下１５０℃にて２時間加熱し一緒に乾燥した。ＣｕＣＮおよびＬｉＣｌを乾燥している間に、亜鉛粉末（2.23 g, 34.1 mmol, 6.2 eq）を、ヒートガンを用いて５分間かけて減圧加熱により乾燥した。亜鉛粉末の入ったフラスコにＤＭＦ（2.7 mL）およびＴＭＳＣｌ（216 μL, 0.31 mmol）を室温にて加えた。３０分間室温にて撹拌した後、この分散液にゆっくりとtert-Butyl 16-(S)-((benzyloxycarbonyl)amino)-15-iodopropanoate（化合物１４）（2.23 g, 5.50 mmol, 1.0 eq）のＤＭＦ（2.7 mL, 0.55 mLにて洗浄 × 2）溶液を加えた。ＴＬＣにより化合物１４－Ｚｎの生成を確認した後、ＤＭＦ（10 mL）中にＣｕＣＮおよびＬｉＣｌを含み、－２０℃に冷却した別のフラスコに、化合物１４－Ｚｎの溶液を３０分かけて加えた。－２０℃にて１５分間撹拌後、新たに調製した（２－ブロモエチニル）トリメチルシラン（1.58 mL, 11.0 mmol, 2.0 eq）のＤＭＦ（1.67 mL）溶液を反応混合物に５分かけて滴下した。得られた混合物を室温までゆっくりと温め、１７時間撹拌を続けた。混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮＨ₄Ｃｌ溶液にて反応停止した。そして、水層をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 40:1）で精製して化合物１７を黄色固体（1.00 g, 2.66 mmol, 49%）として得た; R_f 0.57 (hexane/EtOAc = 4:1); [α]_D ²⁵ +183.3 (c 0.10, CHCl₃); IR (ATR, cm^-1) 2962, 1730, 1506, 1456, 1349, 1251, 1530, 1220, 1159, 1049, 846, 759, 698; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.36 (5H, m, Bn), 5.60 (1H, d, J = 8.2 Hz, NH), 5.13 (2H, s, CH₂Ph), 4.41 (1H, m, CH), 2.78 (2H, m, CH₂), 1.50 (9H, s, tBu), 0.13 (9H, s, TMS);¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 169.2, 155.5, 136.3, 128.6, 128.2, 128.1, 100.7, 88.2, 82.5, 67.0, 52.8, 28.0, 24.4, 0.1。

（合成例６）
(S)-tert-Butyl 2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-4-pentynoate（化合物８）の合成

化合物１７（1.37 g, 3.70 mmol, 1.0 eq）のＴＨＦ（46.2 mL）およびＥｔＯＨ（1.08 mL, 18.5 mmol, 5.0 eq）溶液を０℃に冷却し、これにテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）（THF中1.0 M溶液; 1.85 mL, 1.85 mmol, 0.5 eq）を加えた。０℃にて１．５時間撹拌後、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮＨ₄Ｃｌ溶液にて反応停止した。そして、水層をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 10:1）により精製し、化合物８を黄色固体（1.06 g, 3.49 mmol, 96%）として得た; R_f 0.42 (hexane/EtOAc = 4/1); [α]_D ²⁵ +78.7 (c 0.10, CHCl₃); IR (ATR, cm^-1) 3355, 3299, 1722, 1691, 1533, 1342, 1292, 1264, 1158, 1059, 996, 647; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.36 (5H, m, Bn), 5.60 (1H, d, J = 7.6 Hz, NH), 5.13 (2H, s, CH₂Ph), 4.41 (1H, m, CH), 2.74 (2H, m, CH₂), 2.00 (1H, t, J = 2.7 Hz, CH) 1.50 (9H, s, tBu);¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ169.4, 165.4, 155.5, 136.1, 128.6, 128.0, 100.7, 82.7, 71.5, 67.0, 52.6, 28.0, 22.9; ESI-HRMS (m/z) calcd for C₁₇H₂₁N₁NaO₄ [M+Na]⁺ 326.1368, found 326.1343。

（合成例７）
4-Methyl L-aspartate hydrochloride（化合物１９）の合成

Ｌ－アスパラギン酸（化合物１８）（4.95 g, 37.55 mmol, 1.0 eq）をメタノール（24.5 mL, 16.05 eq）に加え、－１０℃に冷却した。塩化チオニル（3.66 mL, 1.34 eq）を混合物に滴下し、冷却槽を除去して溶液をゆっくりと室温まで加温した。２５分間置いた後、冷却したジエチルエーテルを混合物に冷却および振とうしながら加え、生成物を白色固体として沈澱させた。この白色固体を直ちに濾過し、氷冷したジエチルエーテルで洗浄し、収集した。L-aspartic acid methyl ester hydrochloride（化合物１９）を無色固体（6.60 g, 35.95 mmol, 97%）として得た; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4.32 (1H, t, J = 5.1 Hz, CH), 3.76 (3H, s, Me), 3.07-3.01 (2H, m, CH₂)。

（合成例８）
(S)-20-((tert-Butoxycarbonyl)amino)-18-methoxy-21-oxobutanoic acid（化合物２０）の合成

L-aspartic acid methyl ester hydrochloride（化合物１９）（1.90 g, 10.4 mmol, 1.0 eq）のジオキサン（38.3 mL）溶液を撹拌し、０℃にて、これにＮａ₂ＣＯ₃（0.5 M, 41.4 mL, 2.0 eq）水溶液を加え、次いでＢｏｃ₂Ｏ（2.62 mL, 11.4 mmol, 1.1 eq）を加えた。反応混合物を室温にて１８時間撹拌した後、濃縮した。得られた溶液に１ＭＨＣｌを加えて０℃にてｐＨ３．０に酸性化し、ＥｔＯＡｃにて抽出した。有機層を合わせて水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（MeOH/CH₂Cl₂, 1/5）で精製し、化合物２０を黄色油状物（2.27 g, 9.18 mmol, 91%）として得た; Rf 0.64 (MeOH/CH₂Cl₂ = 1:5); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5.56 (1H, d, J = 8.64 Hz, NH), 4.62 (1H, m, H20), 3.72 (3H, s, OCH₃), 3.04 (1H, dd, J = 17.2, 4.5 Hz, H19), 2.85 (1H, dd, J = 17.4, 4.9 Hz, H19), 1.43 (9H, s, tBu)。

（合成例９）
(S)-21-tert-Butyl 18-methyl-20-((tert-butoxycarbonyl)amino)oxobutanedioate（化合物２１）の合成

化合物２０（1.16 mg, 4.69 mmol, 1.0 eq）、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（1.06 mg, 4.69 mmol, 1.0 eq）および炭酸カリウム（4.22 g, 30.5 mmol, 6.5 eq）の化合物をＭｅＣＮ（15.6 mL）中、室温中で５時間激しく撹拌した。２－ブロモ－２－メチルプロパン（5.37 mL, 47.8 mmol, 10.2 eq）を加え、反応混合物を５０℃に温めて急速に撹拌した。反応混合物は２～３時間後に非常に高粘度となった。これにさらにＭｅＣＮ（7 mL）を加えて撹拌を促進し、得られた反応混合物を２４時間撹拌した。その後、反応混合物を室温まで冷却し、大部分のＭｅＣＮをロータリーエバポレーターにより除去した。そして、反応混合物をＥｔＯＡｃおよび水の間で分割した。水層をＥｔＯＡｃにて抽出した。ＥｔＯＡｃ層を飽和食塩水にて洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上での乾燥、濾過および濃縮をおこなった。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 8:1）で精製し、生成物である化合物２１を無色固体（1.14 g, 3.76 mmol, 80%）として得た; R_f 0.58 (hexane/EtOAc = 2:1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ5.43 (1H, d, J = 8.8 Hz, NH), 4.48-4.42 (1H, m, H20), 3.69 (3H, s, OCH₃), 2.95 (1H, dd, J = 16.6, 4.6 Hz, H19), 2.76 (1H, dd, J = 16.6, 5.0 Hz, H19), 1.45 (9H, s, tBu), 14.8 (9H, s, tBu)。

（合成例１０）
(S)-21-tert-Butyl 20-((tert-butoxycarbonyl)amino)-18-oxobutanoic acid（化合物２２）の合成

化合物１２（500.7 mg, 1.65 mmol, 1.0 eq）のＭｅＯＨ（0.75 mL）溶液に、２ＭＮａＯＨ（0.85 mL）を加えた。室温にて３時間撹拌後、ＭｅＯＨを減圧下で除去し、残った水層をエーテルで洗浄した。そして、水層に３ＭＨＣｌを加えてｐＨ２に酸性化し、ＥｔＯＡｃにより抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 3/1）で精製して化合物２２（437 mg, 1.51 mmol, 92%）を無色固体として得た; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ5.40 (1H, d, NH), 4.47-4.43 (1H, m, H20), 3.00 (2H, dd, J = 18.5, 4.6 Hz, H19), 2.84 (2H, dd, J = 17.2, 5.02 Hz, H19), 1.48 (9H, s, tBu), 1.45 (9H, s, tBu)。

（合成例１１）
(S)-21-tert-Butyl 20-((tert-butoxycarbonyl)amino)-18-hydroxybutanoate（化合物２３）の合成

化合物２２（1.33 mg, 4.60 mmol, 1.0 eq）のＴＨＦ（95.8 mL）溶液を－１５℃に冷却し、そこへＮ－メチルモルホリン（556 μL, 5.06 mmol, 1.1 eq）およびＥｔＯＣＯＣｌ（481.3 μL, 5.06 mmol, 1.1 eq）を加えた。－１５℃で１時間撹拌した後、沈澱したＮ－メチルモルホリン塩酸塩を濾過して除去し、ＴＨＦ（73.2 mL）にて洗浄した。ろ液を０℃に冷却してこれにＮａＢＨ₄（257 mg, 6.89 mmol, 1.5 eq）を加え、次いで水を滴下した。０℃にて０．５時間撹拌後、反応混合物に飽和ＮＨ₄Ｃｌ溶液を加えて反応停止した。そして、水層をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 3/1）で精製してアルコールである化合物２３を白色固体（1.24 mg, 4.50 mmol, 98%）として得た; R_f 0.30 (hexane/EtOAc = 2:1);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5.34 (1H, d, J = 6.6 Hz, NH), 4.38-4.31 (1H, m, H20), 3.71-3.63 (2H, m, H19), 2.19-2.04 (1H, m, H18), 1.67-1.58 (1H, m, H19), 1.47 (9H, s, tBu), 1.44 (9H, s, tBu)。

（合成例１２）
(S)-21-tert-Butyl 20-((tert-butoxycarbonyl)amino)-18-iodobutanoate（化合物９）の合成

トリフェニルホスフィン（2.51 g, 9.0 mmol, 2.0 eq）およびイミダゾール（653.0 mg, 9.0 mmol, 2.0 eq）を、窒素雰囲気下、２０℃で撹拌しながら、ＣＨ₂Ｃｌ₂（14.2 mL）に溶解した。ヨウ素粉末（2.43 g, 9.0 mmol, 2.0 eq）を加えた後、混合物を室温まで温め、10分間撹拌したのち、０℃まで冷却した。この冷却溶液に、化合物２３すなわち(S)-21-tert-butyl 20-((tert-butoxycarbonyl)amino)-18-hydroxybutanoate（1.32 g, 4.5 mmol, 1.0 eq）のＣＨ₂Ｃｌ₂（15 mL）溶液を加えた。０℃にて１時間撹拌後、反応混合物を減圧濃縮した。残渣を中性シリカゲルのショートカラムに通し、hexane/Et₂O = 1/1にて溶出し、ろ液を濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 10:1）で精製し、化合物９を白色固体（1.69 mg, 4.38 mmol, 92%）として得た; R_f 0.68 (hexane/EtOAc = 2:1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ 5.06 (1H, s, NH), 4.22-4.17 (1H, m, H20), 3.20-3.14 (2H, m, H19), 2.44-2.32 (1H, m, H18), 2.21-2.09 (1H, m, H19), 1.45 (9H, s, tBu), 1.48 (9H, s, tBu)。

（合成例１３）
1-Benzyl-5-methyl-2-(S)-[(tert-butoxycarbonyl)-amino]-pentanedioate（化合物２５）の合成

トリエチルアミン（0.185 mL, 1.33 mmol, 1.5 eq）を、2-(S)-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-pentanedionic acid 1-benzyl ester（化合物２４）（300.0 mg, 0.889 mmol, 1.0 eq）のＣＨ₂Ｃｌ₂（4.03 mL）溶液に添加した。混合物を０℃に冷却し、その後、ＤＭＡＰ（10.9 mg, 88.9 μmol, 0.1 eq）およびＭｅＯＣＯＣｌ（82.3 μL, 1.07 mmol, 1.2 eq）を順次添加した。この溶液を室温まで温め、１時間撹拌した。反応混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈し、１ＭＮａＨＣＯ₃水溶液で洗浄した。水層をＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 4:1）にて精製し、1-benzyl-5-methyl-2-(S)-[(tert-butoxycarbonyl)-amino]-pentanedioate（化合物２５）を無色固体（272.2 mg, 77.5 μmol, 87%）として得た; R_f 0.68 (hexane/EtOAc = 1:1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ7.40-7.32 (5H, m, Bn), 5.17 (2H, dd, J = 13.2, 12.3 Hz, Bn), 5.10 (1H, m, NH), 4.37 (1H, m, CH), 3.67 (3H, s, CO₂CH₃), 2.48-2.30 (2H, m, CH₂), 2.27-2.12 (1H, m, CHCH₂CH₂), 2.01-1.89 (1H, m, CHCH₂CH₂), 1.42 (9H, s, Boc)。

（合成例１４）
2-(S)-[(tert-Butoxycarbonyl)-amino]-pentanedioic acid 1-tert-butyl ester 5-methyl ester（化合物２６）の合成

1-benzyl-5-methyl-2-(S)-[(tert-butoxycarbonyl)-amino]-pentanedioate（化合物２５）（303.5 mg, 0.864 mmol, 1.0 eq）のＭｅＯＨ（1.4 mL）溶液を、１０％Ｐｄ／Ｃ（9.19 mg, 8.64 μmol, 1.0 mol%）にて処理し、室温中、バルーン圧にて接触水素化した。室温中で３時間撹拌後、中性シリカゲルおよびセライトに通し、ＭｅＯＨで溶出して不溶物を濾別した。そして、ろ液を減圧濃縮した。ろ液の濃縮物から5-methyl-2-(S)-[(tert-butoxycarbonyl)-amino]-pentanedioate（化合物２５'）（229.9 mg, 0.864 mmol, quant）を無色固体として得た; R_f 0.18 (hexane/EtOAc = 1:1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ5.10 (1H, m, NH), 4.37 (1H, m, CH), 3.66 (3H, s, CO₂CH₃), 2.50-2.44 (2H, m, CH₂), 2.04-2.02 (1H, m, CHCH₂CH₂), 2.04-2.00 (1H, m, CHCH₂CH₂), 1.45 (9H, s, tBu)。

5-Methyl-2-(S)-[(tert-butoxycarbonyl)-amino]-pentanedioate（化合物２５'）（8.13 g, 31.5 mmol, 1.0 eq）のｔＢｕＯＨ（21 mL）溶液に、（Ｂｏｃ）₂Ｏ（8.68 ml, 37.8 mmol, 1.2 eq）のｔＢｕＯＨ（42 mL）溶液およびＤＭＡＰ（384.8 mg, 3.15 μmol, 0.1 eq）を添加した。反応混合物を３時間撹拌した。ショートカラムに通した後、シリカゲルクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 5:1）にて精製し、2-(S)-[(tert-butoxycarbonyl)-amino]-pentanedioic acid 1-tert-butyl ester 5-methyl ester（化合物２６）を無色油状物（5.9 g, 18.6 mmol, 63%）として得た; R_f 0.43 (hexane/EtOAc = 2:1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5.10 (1H, m, NH), 4.12 (1H, dd, J = 9.6, 4.8 Hz, CH), 3.67 (3H, s, CO₂CH₃), 2.57-2.45 (1H, m, CHCH₂CH₂), 2.44-2.36 (1H, m, CH₂), 2.27-2.15 (1H, m, CHCH₂CH₂), 1.50 (9H, s, tBu), 1.45 (9H, s, tBu)。

（合成例１５）
1-tert-Butyl-5-methyl-2-(S)-[bis-(tert-butoxycarbonyl)-amino]-pentanedioate（化合物２７）の合成

まず、ＤＭＡＰ（9.58 mg, 78.4 μmol, 0.2 eq）および2-(S)-[(tert-butoxycarbonyl)-amino]-pentanedioic acid 1-tert-butyl ester 5-methyl ester（化合物２６）（124.4 g, 0.392 mmol, 1.0 eq）をＭｅＣＮ（1.23 mL）に溶解した溶液に加えた。この混合物に、（Ｂｏｃ）₂Ｏ（0.36 ml, 1.57 mmol, 4.0 eq）のＭｅＣＮ（258 μL）溶液を室温にて加え、２０時間撹拌した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 8:1）にて精製し、1-tert-butyl-5-methyl-2-(S)-[bis-(tert-butoxycarbonyl)-amino]-pentanedioate（化合物２７）を無色油状物（153 mg, 0.366 mmol, 94%）として得た; R_f 0.50 (hexane/EtOAc = 4:1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4.97 (1H, dd, J = 9.6, 4.8 Hz, CH), 3.67 (3H, s, CO₂CH₃), 2.57-2.45 (1H, m, CHCH₂CH₂), 2.44-2.36 (2H, m, CH₂), 2.27-2.15 (1H, m, CHCH₂CH₂), 1.50 (18H, s, tBu), 1.45 (9H, s, tBu)。

（合成例１６）
(S)-2-[Bis-(tert-butoxycarbonylamino)]-4-(formylbutanoic acid)-tert-butyl ester（化合物２８）の合成

水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ－Ｈ, ヘキサン中１Ｍ溶液, 1.68 mL, 1.68 mmol, 1.4 eq）を、－７８℃に冷却した1-tert-butyl-5-methyl-2-(S)-[bis-(tert-butoxycarbonyl)-amino]-pentanedioate（化合物２７）（502.2 mg, 1.20 mmol, 1.0 eq）のＥｔ₂Ｏ（12 mL）溶液に、３分かけて滴下した。反応混合物を５分間撹拌し、水で反応停止した後、室温まで温めた。得られた白色濃厚液をセライトパウダーで濾過し、Ｅｔ₂Ｏで洗浄した。ろ液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 4:1）で精製して(S)-2-[bis-(tert-butoxycarbonylamino)]-4-(formylbutanoic acid)-tert-butyl ester（化合物２８）を無色油状物（417.2 mg, 1.08 mmol, 90%）として得た; R_f 0.38 (hexane/EtOAc = 4:1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 9.77 (1H, s, CHO), 4.92 (1H, dd, J = 9.4, 5.0 Hz, CH), 2.69-2.44 (3H, m, CHCH₂CH₂), 2.24-2.13 (1H, m, CHCH₂CH₂), 1.50 (18H, s, tBu), 1.45 (9H, s, tBu)。

（合成例１７）
Benzyl-2-(S)-[bis-(tert-butoxycarbonyl)-amino]-5-hexenoat（化合物２９）の合成

ｎＢｕＬｉ（ヘキサン中２．６５Ｍ溶液, 0.215 mL, 0.569 mmol, 2.0 eq）を、メチルトリフェニルホスホニウムブロミド（223.9 mg, 0.67 mmol, 2.2 eq）のＴＨＦ（3.45 mL）分散液に、－７８℃にて滴下した。混合物を０℃で１時間撹拌した後、得られたオレンジ色のイリド液に、 (S)-2-[bis-(tert-butoxycarbonylamino)]-4-(formylbutanoic acid)-tert-butyl ester（化合物２８）（110.4 g, 0.285 mmol, 1.0 eq）のＴＨＦ（1.3 mL）液を－７８℃にて添加した。０℃にて０．５時間撹拌後、反応混合物に飽和ＮＨ₄Ｃｌ溶液を加えて反応停止した。混合物を水で希釈し、水層をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせてＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、減圧濃縮した。ショートカラムの後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 20:1）にて精製し、benzyl-2-(S)-[bis-(tert-butoxycarbonyl)-amino]-5-hexenoate（化合物２９）を無色油状物（65.9 mg, 0.171 mmol, 60%）として得た; R_f 0.65 (hexane/EtOAc = 4:1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5.82-5.79 (1H, tt, J = 6.47 Hz, CH₂=CH), 5.08-4.89 (2H, m, CH=CH₂), 4.92 (1H, dd, J = 9.4, 5.0 Hz, CH), 2.29-2.20 (1H, m, CHCH₂CH₂), 2.17-2.10 (2H, m, CHCH₂CH₂), 2.09-1.96 (1H, m, CHCH₂CH₂), 1.50 (18H, s, tBu), 1.45 (9H, s, tBu)。

（合成例１８）
tert-Butyl-2-(S)-[bis-(tert-butoxycarbonyl)-amino]-6-hydroxyhexanoate（化合物３０）の合成

Benzyl-2-(S)-[bis-(tert-butoxycarbonyl)-amino]-5-hexenoate（化合物２９）（135.9 mg, 0.35 mmol, 1.0 eq）のＴＨＦ（1.57 mL）液を０℃に冷却し、ＮａＢＨ₄（17.4 mg, 0.46 mmol, 1.3 eq）を加えた。１０分間撹拌後、ＢＦ₃・Ｅｔ₂Ｏ（58.1 μL, 0.459 mmol, 1.3 eq）をこの溶液に加えた。混合物を室温まで温めた後、２１時間撹拌した。その後、溶液を０℃まで冷却し、そして１ＮＮａＯＨ（0.523 mL, 0.523 mmol, 1.5 eq）および３０％Ｈ₂Ｏ₂（0.43 mL）を順次添加した。０℃にて１．５時間撹拌した後、反応混合物を水で希釈した。水層をＥｔＯＡｃにて抽出した。有機層を合わせてＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 2:1）にて精製し、tert-butyl-2-(S)-[bis-(tert-butoxycarbonyl)-amino]-6-hydroxyhexanoate（化合物３０）を無色油状物（77.7 mg, 0.193 mmol, 55%）として得た; R_f 0.18 (hexane/EtOAc = 4:1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4.73 (1H, dd, J = 9.6, 5.1 Hz, CH), 3.64 (2H, t, J = 6.6 Hz, CH₂O), 2.19-2.12 (1H, m, CHCH₂), 1.97-1.89 (1H, m, CHCH₂), 1.69-1.51 (4H, m, CHCH₂CH₂CH₂), 1.50 (18H, s, tBu), 1.45 (9H, s, tBu)。

（合成例１９）
tert-Butyl-2-(S)-[bis-(tert-butoxycarbonyl)-amino]-6-iodohexanoate（化合物３２）の合成

トリフェニルホスフィン（54.2 mg, 0.562 mmol, 2.0 eq）およびイミダゾール（16.5 mg, 0.562 mmol, 2.4 eq）を、窒素雰囲気下、０℃にて撹拌しながらＣＨ₂Ｃｌ₂（0.1849 mL）に溶解した。ヨウ素粉末（52.4 mg, 0.562 mmol, 2.0 eq）を添加した後、混合物を室温まで温め、10分間撹拌したのち、０℃に冷却した。tert-butyl-2-(S)-[bis-(tert-butoxycarbonyl)-amino]-6-hydroxyhexanoate（化合物３０）（113.4 mg, 0.281 mmol, 1.0 eq）のＣＨ₂Ｃｌ₂（0.4622 mL）溶液を冷却した溶液に加えた。０℃にて１時間撹拌した後、反応混合物を減圧濃縮した。残渣を中性シリカゲルのショートカラムで濾過し、hexane/Et₂O = 1/1で溶出し、ろ液を濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 40:1）にて精製し、化合物３２を無色油状物（45.2 mg, 0.025 mmol, 85%）として得た:R_f 0.70 (hexane/EtOAc = 4:1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4.73 (1H, dd, J = 9.6, 5.1 Hz, CH), 3.18 (2H, t, J = 7.0 Hz, CH₂I), 2.10-1.97 (1H, m, CHCH₂), 1.94-1.75 (5H, m, CHCH₂, CHCH₂CH₂CH₂), 1.50 (18H, s, tBu), 1.45 (9H, s, tBu)。

（合成例２０）
(S)-tert-Butyl-16-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-13-(3,5-dibromopyridin-1-yl)pent-14-ynoate（化合物３４）の合成

３，５－ジブロモ－４－ヨードピリジン（化合物１０）（300.0 mg, 827 μmol, 1.0 eq）、(S)-tert-butyl 2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-4-pentynoate（化合物８）（377.1 mg, 1.24 μmol, 1.5 eq）、Ｐｄ₂ｄｂａ₃（75.7 mg, 82.7 μmol, 10 mol%）、Ｐ（２－ｆｕｒｙｌ）₃（76.8 mg, 331 μmol, 40 mol%）およびＣｕＩ（63.0 mg, 331 μmol, 40 mol%）のＤＭＦ（41.3 mL）溶液を、凍結脱気（freeze/pump/thaw techniques）により脱気した。ｉＰｒ₂ＮＥｔ（8.3 mL）を得られた溶液に加えた。４０℃で１７時間撹拌した後、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮＨ₄Ｃｌ溶液で反応停止した。その後、水層をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 10:1）にて精製し、化合物３４（309.7 mg, 575 μmol, 70%）を得た; R_f 0.34 (hexane/EtOAc = 4:1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.62 (2H, s, H2/6), 7.33 (5H, m, Bn), 5.76 (1H, d, J = 7.8 Hz, NH), 5.13 (2H, s, CH₂Ph), 4.55 (1H, m, H16), 3.26-3.02 (2H, m, H15), 1.46 (9H, s, tBu)。

（合成例２１）
((20S,20'S)-tert-Butyl-18,18'-(4-((S)-17-(tert-butyloxy)-16-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-17-oxopent-13-ynyl)pyridine-3,5-diyl)bis-20-(tert-butoxycarbonylamino)butanoate（化合物７）の合成

亜鉛末（182.2 mg, 2.79 mmol）を、窒素雰囲気にした１．５ｍＬのマイクロチューブ内に配置した。ドライＤＭＦ（84 μL）およびトリメチルシリルクロリド（56.3 μL, 0.44 mmol）を添加し、得られた混合物を室温にて１５分間激しく撹拌した。撹拌を停止し、溶液をマイクロシリンジで取り出した。残った固体を、減圧下、ドライヤーを用いて乾燥した。活性化した亜鉛を室温に冷却し、(S)-21-tert-butyl 20-((tert-butoxycarbonyl)amino)-18-iodobutanoate（化合物９）（178.9 mg, 0.465 mmol, 5.0 eq）のドライＤＭＦ溶液（141 μLおよび94 μLのDMFでリンス）を活性化亜鉛に加えた。反応混合物を室温にて１時間撹拌し、その時以後、ＴＬＣ分析（hexane/EtOAc = 5/1）にて出発物質が残っていないことを確認した。撹拌を停止し、遠心分離機を用いて亜鉛末を沈澱させた。１０５μＬのＤＭＦの入ったマイクロシリンジで溶液を活性化亜鉛から取り除き、氷冷したＰｄ－ＰＥＰＰＳＩ－ＩＰｒ（12.6 mg, 20 mol%）および化合物３４（50.6 mg, 0.094 mmol, 1.0 eq）の入った１０ｍＬフラスコに加えた。６０℃まで昇温したスターラーに移したのち、１．５時間撹拌を続け、反応混合物をＥｔＯＡｃにて希釈し、飽和ＮＨ₄Ｃｌ溶液で反応停止した。その後、水層をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、減圧濃縮して粗生成物を黄色油状物として得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（(hexane/EtOAc = 2:1 → 1:1）にて精製し、純粋な化合物７（45.5 mg, 50.8 μmol, 54%）を褐色油状物として得た; R_f 0.56 (hexane/EtOAc = 5:1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.29 (2H, s, H2/6), 7.33 (5H, m, Bn), 5.55 (1H, m, NH16), 5.20-5.03 (3H, m, H16/20/20'), 4.55 (2H, m, NH21/21'), 4.34 (2H, m, CH₂Ph), 3.26-3.02 (2H, m, H15), 2.73 (4H, m, H18/18'), 2.12-1.84 (4H, m, H19/19'), 1.48 (18H, s, Boc), 1.46 (27H, s, tBu); ESI-HRMS (m/z) calcd for C₄₈H₇₀N₄NaO₁₂ [M+Na]⁺ 917.4889, found 917.4858。

（合成例２２）
3,5-Bis-{20,20'-(tert-butoxycarbonyl)-20,20'-(S)-[(tert-butoxycarbonyl)-amino]-propyl}-4-{16-(tert-butoxycarbonyl)-16-(S)-amino]-buthyl}-pyridine（化合物６）の合成

化合物７（11.0 mg, 12.2 μmol, 1.0 eq）のＭｅＯＨ（0.534 mL）溶液を１０％Ｐｄ／Ｃ（13.07 mg, 12.2 μmol, 100.0 mol%）で処理し、室温中、バルーン圧にて接触水素化した。室温にて４時間撹拌した後、反応混合物を減圧濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（hexane/EtOAc = 0/1 → CH₂Cl₂/MeOH =20/1）にて精製し、化合物６（5.3 mg, 6.93 μmol, 56%）を黄色油状物として得た; R_f 0.56 (hexane/EtOAc = 5:1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.07 (2H, s, H2/6), 3.93 (3H, m, H16/20/20'), 2.65 (6H, m, H13/18/18'), 2.00-1.55 (8H, m, H14/15/19/19'), 1.48 (18H, s, Boc), 1.46 (27H, s, tBu); ESI-HRMS (m/z) calcd for C₄₈H₆₈N₄NaO₁₀ [M+Na]⁺ 787.4833, found 787.4809。

（合成例２３）
N-Succinimidyl 4-maleimidobutyrate（化合物４１）の合成

４－アミノ酪酸（化合物３８）（200 mg, 2.04 mmol, 1.0 eq）を、無水マレイン酸（化合物３９）（10 mg, 2.04 mmol, 1.0 eq）のＤＭＦ（2 mL）溶液に加え、混合物を２時間撹拌した。得られた溶液を氷浴中で冷却し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（288.7 mg, 2.51 mmol, 1.23 eq）およびＤＣＣ（883.7 mg, 4.28 mmol, 2.1 eq）を順次加えた。５分後、氷浴を除去し、溶液を一晩激しく撹拌した。形成された白色沈澱を濾別し、ＤＭＦで洗浄し、ろ液を氷上に注いだ。水層をＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出した。ＣＨ₂Ｃｌ₂層をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、生成物として化合物４１を無色固体（157.1 mg, 0.56 mmol, 28%）として得た; Rf 0.23 (hexane/EtOAc = 1:1) ; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ6.71 (2H, s, CH=CH), 3.65(2H, t, J = 7.0 Hz, NCH₂), 2.83(4H, s, COCH₂CO), 2.65(2H, t, J = 7.7 Hz, CH₂CO), 2.05(2H, m, CH₂)。

（合成例２４）
3,5-bis-{20,20'-(tert-butoxycarbonyl)-20,20'-(S)-[(tert-butoxycarbonyl)-amino]-propyl}-4-{16-(tert-butoxycarbonyl)-16-(S)-[(25-maleimido-22-oxobuthyl)-amino]-buthyl}-pyridine（化合物５）の合成

化合物６（5.3 mg, 6.93 μmol, 1.0 eq）のＤＭＦ（100 μL）溶液に、化合物４１（2.04 mg, 7.27 mmol, 1.05 eq）およびＮＭＭ（0.5 μL）を加えた。反応混合物を４時間撹拌した後、氷水中に注いだ。溶液をｐＨ３に酸性化し、ＣＨ₂Ｃｌ₂で３回抽出した。有機層を合わせて水および飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、生成物である化合物５を無色油状物（5.2 mg, 5.59 mmol, 81%）として得た; R_f 0.14 (hexane/EtOAc = 1:1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ8.19 (2H, s, H2/6), 6.75 (2H, s, H27/28), 6.65 (1H, m. NH16) 5.45 (2H, m, NH20/20'), 4.50 (1H, m, H16), 4.26 (2H, m, H20/20'), 3.60 (2H, m, H25), 2.62 (8H, m, H13/18/18'/23), 2.00-1.55 (10H, m, H14/15/19/19'/24), 1.48 (18H, s, Boc), 1.46 (27H, s, tBu); ESI-HRMS (m/z) calcd for C₄₈H₇₆N₅O₁₃ [M+H]⁺ 930.5440, found 930.5390。

（合成例２５）
3,5-bis-{20,20'-(tert-butoxycarbonyl)-20,20'-(S)-[(tert-butoxycarbonyl)-amino]-propyl}-4-{16-(tert-butoxycarbonyl)-16-(S)-[(25-maleimido-22-oxobuthyl)-amino]-buthyl}-1-{11-(tert-butoxycarbonyl)-1-(S)-[bis-(tert-tutoxycarbonyl)-amino]-pentyl}-pyridinium（化合物４３）の合成

化合物５（6.1 mg, 6.55 μmol, 1.0 eq）および化合物３２（6.73 mg, 13.1 μmol, 2.0 eq）の混合物をＣＨ₃ＮＯ₂（0.18 mL）中、７０℃にて８時間加熱した。反応混合物を減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Hexane/EtOAC = 1:1 → CH₂Cl₂/MeOH = 10:1）にて精製し、化合物４３（5.9 mg, 4.08 μmol, 62%）を黄色油状物として得た; R_f 0.50 (CH₂Cl₂/MeOH = 10:1); IR (ATR, cm^-1) 3036, 1709, 1593, 1367, 1248, 1155, 733, 477, 464, 453; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ8.91 (2H, s, H2/6), 6.75 (2H, s, H27/28), 6.65 (1H, m. NH16) 5.65 (2H, d, J = 8.2 Hz, NH20/20'), 4.77 (1H, m, H11), 4.65 (2H, m, H7), 4.52 (1H, m, H16), 4.16 (2H, m, H20/20'), 3.57 (2H, m, H25), 3.00-2.85 (6H, m, H13/18/18'), 2.77 (2H, m, H23), 2.25 (2H, t, J = 7.2 Hz, H8), 2.20-1.98 (10H, m, H10/14/15/19/19'), 1.97-1.75 (4H, m, H9/24), 1.50 (27H, s, Boc), 1.40 (27H, s, tBu); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ171.1, 170.8, 169.5, 152.5, 141.6, 140.7, 134.2, 83.1, 82.7, 82.4, 81.4, 80.0, 58.2, 36.9, 33.0, 32.7, 31.1, 28.3, 28.0, 27.9, 26.5, 23.1; ESI-HRMS (m/z) calcd for C₆₈H₁₁₁N₆O₁₉ [M]⁺ 1315.7904, found 1315.7874。

（合成例２６）
4-(16-(S)-[(25-maleimido-22-oxobuthyl)-amino]-16-carboxy-buthyl)-1-(11)-(S)-amino-11-carboxy-pentyl)-3,5-bis-(20,20'-(S)-amino-20,20'-carboxy-propyl)-pyridinium（化合物２）の合成

ＴＦＡおよび蒸留水の混合物（1.25 mL, TFA/water = 95:5）を化合物４３（(8.0mg, 5.54 μmol, 1.0 eq）に室温で加え、２時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターにて除去した。Ｃ１８シリカゲルカラムクロマトグラフィー（0.1% TFA in distilled water→0.1% TFA in distilled water/MeOH=9:1）にて精製し、化合物２を無色油状物（4.4 mg, 5.54 μmol, quant）として得た; R_f 0.4 [MeOH (0.1% TFA)/H₂O (0.1% TFA) = 1:9]; ¹H NMR (300 MHz, D₂O) δ8.55 (2H, s, H2/6), 6.80 (2H, s, H27/28), 4.50 (2H, t. J = 6.4 Hz, H7) 4.37 (1H, m, H16), 4.02 (2H, t, J = 5.6 Hz, H20/20'), 3.89 (1H, t, J = 4.8 Hz, H11), 3.51 (2H, t, J = 6.4 Hz, H25), 3.05 (2H, m, H13), 2.93 (4H, m, H18/18'), 2.32 (2H, t, J = 6.4 Hz, H23), 2.22 (4H, m, H19/19'), 2.03 (2H,m, H8), 1.99-1.80 (6H, m, H10/15/24), 1.61 (2H, m, H14), 1.55-1.34 (2H, m, H9). ESI-HRMS (m/z) calcd for C₃₂H₄₇N₆O₁₁ [M]⁺ 691.3303, found 691.3319。

（合成例２７）
Thiolated BSA（化合物３）の合成

ＢＳＡ（10.2 mg, 0.15 μmol, 1.0 eq）およびtraut's試薬（0.8 mg, 6.0 μmol, 40 eq）のＰＢＳ（pH 8.4）（1 mL、10mM EDTAを含む。）中の混合物を３２℃にて２時間インキュベートした。この溶液を、プレパックゲル脱塩カラムに適用し、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳにて各種を溶出した。タンパク質を含む画分をプールし、スルフヒドリル基濃度をエルマン分析により測定した。

（実施例１）
Desmosine BSA conjugate（化合物１）の合成

化合物２（2.2 mg, 2.70 μmol）をチオール化ＢＳＡ（化合物３）のＰＢＳ（1 mM EDTAを含む。）溶液（0.5 mL）に溶解し、室温にて２時間撹拌した。NAP 5カラムを用いて反応混合物を精製し、未反応物を除去した。試料が完全に分離床に入った後、ＰＢＳにて溶出し、初めの１．３ｍＬを回収した。
得られた複合体をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにて分析したところ、ＢＳＡ１分子あたり、平均５分子の化合物２が導入されていた。

（合成例２８）
Thiolated KLH（化合物３'）の合成

ＫＬＨ（10.2 mg）およびtraut's試薬（0.8 mg, 6.0 μmol）のＰＢＳ（pH 8.4）（1 mL、10mM EDTAを含む。）中の混合物を３２℃にて２時間インキュベートした。この溶液を、プレパックゲル脱塩カラムに適用し、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳにて各種を溶出した。タンパク質を含む画分をプールした。

（実施例２）
Desmosine KLH conjugate（化合物１'）の合成

化合物２（2.2 mg, 2.70 μmol）を、チオール化ＫＬＨ（化合物３'）溶液（0.5 mL, 1 mM EDTAを含むＰＢＳ）に溶解し、室温にて２時間撹拌した。NAP 5カラムを用いて反応混合物を精製し、未反応物を除去した。試料が完全に分離床に入った後、ＰＢＳにて溶出し、初めの１．３ｍＬを回収した。
得られた複合体をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにて分析したが、ＫＬＨの分子量が大きく、結合数を求めることができなかったため、上記式ではＸと示す。

本明細書において、以下の略記を用いた。
Ｍｅ：メチル
Ｅｔ：エチル
ｉＰｒ：イソプロピル
Ａｃ：アセチル
Ｂｏｃ：ｔ－ブトキシカルボニル
Ｃｂｚ：ベンジルオキシカルボニル
ｔＢｕ：ｔ－ブチル
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＮＭＭ：Ｎ－メチルモルホリン
ＴＭＳＣｌ：クロロトリメチルシラン
ＰＥＰＰＳＩ（商標）：Pd-pyridine-enhanced precatalyst preparation stabilization and initiation
ＰＢＳ：Phosphate Buffered Saline
ｒｔ：室温
ｈ：時間

Claims

デスモシンが、前記デスモシンのピリジン環の４位の側鎖末端において、連結基を介してタンパク質に結合している、複合体であって、
当該複合体が下記一般式（１）に示される、複合体。

（上記一般式（１）中、Ｌ１は連結基であり、Ｐ１－は、キャリアタンパク質であるＰ１由来の１価の基であり、ｎは平均値であり、０より大きく１００以下の数である。連結基Ｌ１は、－ＣＯ（ＣＨ₂）_x－、－（－ＣＨ₂－ＣＨ₂－Ｏ－）_z－、または、下記式に示される基、あるいは、下記式４０および４１に記載の化合物ならびにトリアジン系の縮合剤からなる群から選択される縮合剤由来の基である。ｘは１以上１０以下の整数である。ｚは１以上３０以下の数である。）

（上記式中、＊は結合手を示す。）
当該複合体が下記一般式（３）に示される、請求項１に記載の複合体。

（上記一般式（３）中、Ｐ２－ＮＨ－は、キャリアタンパク質であるＰ２－ＮＨ₂由来の１価の基であり、ｍは平均値であり、０より大きく１００以下の数であり、ｙは２以上１５以下の整数である。）
前記キャリアタンパク質が、牛血清アルブミン、スカシガイヘモシアニンおよびオブアルブミンからなる群から選択される１種である、請求項１または２に記載の複合体。
請求項１乃至３いずれか１項に記載の複合体を製造する方法であって、
デスモシンの４位の側鎖に、反応性基が選択的に導入されたデスモシン類誘導体を準備する工程と、
前記デスモシン類誘導体とタンパク質またはその誘導体とを接触させて、前記複合体を形成する工程と、
を含む、複合体の製造方法。
前記デスモシン類誘導体が下記一般式（４）に示される化合物である、請求項４に記載の複合体の製造方法。

（上記一般式（４）中、ｙは２以上１５以下の整数である。）