JP2015178957A - 化合物、これを用いた定量分析用標準物質およびデスモシン類の定量方法 - Google Patents
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Abstract
Description
下記一般式(I)に示される化合物が提供される。
また、本発明によれば、測定対象の試料に前記本発明における化合物を添加するステップを含む、デスモシン類の定量方法が提供される。
なお、本明細書において、デスモシンおよびイソデスモシンをあわせて「デスモシン類」とも呼ぶ。
また、本発明によれば、前記本発明における化合物を内部標準物質等の標準物質として使用するデスモシン類の分析または定量方法が提供される。
なお、スキーム1においては、アミノ基の保護基をt−ブトキシカルボニル(Boc)基とし、カルボキシル基の保護基をベンジル(Bn)基とする場合を例に挙げて説明するが、アミノ基およびカルボキシル基のそれぞれについて、保護基の有無、数および種類に制限はなく、適宜選択することができる。
一般式(IV)中、X4およびX5は、それぞれ異なるハロゲンである。一般式(IV)に示した化合物として、たとえば3,5−ジブロモ−4−ヨードピリジンが挙げられる。
一般式(V)中、R2は一般式(I)におけるR2と同じであり、X2はハロゲンである。
また、式(VI)中、R3は一般式(I)におけるR3と同じであり、X3はハロゲンである。
なお、スキーム1において、R11がメチレン基であり、R2がジメチレン基であり、かつ、R3がテトラメチレン基であることはない。
また、根岸クロスカップリングにより、ピリジン環の3位および5位に、一般式(V)に示した化合物の−R2−C(NHBoc)CO2Bn基を導入する。ここで、R2は一般式(I)におけるR2と同じであり、X2はハロゲンである。
なお、薗頭クロスカップリングによる反応と根岸クロスカップリングによる反応の順序に制限はない。
その後、ピリジン環の4位の側鎖に含まれるエチニレン基の還元反応をおこない、炭素−炭素三重結合を一重結合とする。そして、各側鎖のアミノ基およびカルボキシル基を脱保護する。
以上の手順により、一般式(I)に示した化合物が得られる。
各手順における詳細な反応条件については、実施例の項において後述する。
本実施形態における化合物は、デスモシン類との構造の類似性が高く、かつ、デスモシン類に対して分子量の絶対値を14m/z以上シフトさせることができる。このため、デスモシン類の定量分析用標準物質として好適に用いられる。さらに具体的には、LC−MSやLC−MS/MS法等の質量分析を含む方法によりデスモシン類を定量分析する際の内部標準物質として好適である。このとき、デスモシン類の定量方法は、たとえば測定対象の試料に本実施形態における化合物を添加するステップを含む。また、本実施形態における化合物は、たとえばCOPDバイオマーカー分析における内部標準物質として用いることができる。
また、本実施形態の化合物は、製造工程中に同位体標識工程を必要としないため、デスモシン類の同位体標識化合物と比べて合成が容易である。このため、本実施形態の化合物は、大量生産に好適である。
また、質量分析において異なる質量数であっても同一の構造の化合物が同時に存在すると、お互いに干渉し合い、厳密性が損なわれる場合がある。これに対し、本実施形態の化合物を質量分析の内部標準物質として用いることにより、たとえばデスモシン類との干渉を抑制することも可能となるため、より厳密な定量分析に寄与しうる。
本実施例では、スキーム2に示す手順にてデスモシン−CH2(化合物18)の合成をおこなった。また、デスモシン−CH2(化合物18)およびこれに関連する化合物の炭素原子の番号付けは以下の通りである。
(試薬)
非水系の反応は、すべて、窒素雰囲気下、マグネチックスターラーを用いておこない、特に記載のない場合には蒸留した新鮮な溶媒を用いた。Diisopropylethylamine (iPr2NEt) および trimethylsilyl chloride (TMSCl) は蒸留により乾燥した。Dimethylformamide (DMF) はMgSO4 により蒸留し、活性化したモレキュラーシーブ上で保存した。脱水したtetrahydrofuran (THF)、methanol (MeOH) および ethanol (EtOH) は関東化学社より購入し、活性化したモレキュラーシーブ上で保存した。すべての試薬を製造業者より入手し、特に記載のない場合にはさらに精製することなく用いた。
薄層クロマトグラフィー(Thin Layer Chromatography:TLC)分析にはメルク社製のSilica gel 60 F254プレートを用いた。
カラムクロマトグラフィーには、酸性 Silica gel 60 (spherical, 40-50 μm) または中性Silica gel 60N (spherical, 40-50 μm) を用いた(いずれも関東化学社製)。
逆相シリカゲルクロマトグラフィーは、Wako gel 100 C18(和光純薬工業社製)を用いておこなった。
融点の測定には、ATM-01装置(アズワン社製)を用いた。
旋光度の測定には、JASCO P-2200 デジタル旋光計およびナトリウムランプ (λ= 589 nm) D線を用いた。測定結果を「[α]D T (c g/100 mL, solvent)」と表記する。
UVスペクトル測定にはJASCO V-560 UV/VIS分光光度計を用いた。
赤外線(IR)スペクトル測定には、JASCO FT-IR 4100分光計を用いた。測定結果を波数(cm-1) で示す。
1H および 13C NMRスペクトル測定には、JEOL JNM-EXC 300 スペクトロメータ (300 MHz) または JEOL JNM-ECA 500 スペクトロメータ (500 MHz) を用いた。
1H NMRデータは、以下のように示す:化学シフト (δ, ppm)、積分値、多重度 (s, singlet; d, doublet; t, triplet; q, quartet; m, multiplet), カップリング定数 (J) in Hz、帰属。
13C NMR データは、化学シフト (δ, ppm)により示す。
EI-MS スペクトル測定は、Shimadzu GCMS QP-5050 装置またはJEOL JMS-700 装置によりおこなった。FAB-MS スペクトル測定にもJEOL JMS-700を用いた。ESI-MSスペクトル測定は、JEOL JMS-T100LC 装置またはThermo Exactive スペクトロメータを用いた。
−5℃にて15分撹拌後、−20℃に冷却し、化合物14の反応混合物に、新たに調製した(2-bromoethynyl)trimethylsilane (1.0 mL, 7.16 mmol, 2.0 eq)を5分かけて滴下した。その後、混合液を徐々に室温まで温め、17時間撹拌を続けた。得られた混合物をEtOAcで希釈し、飽和NH4Cl溶液でクエンチした。続いて、EtOAcにより水層を抽出した。有機層をあわせて食塩水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、さらに真空中で濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(hexane/EtOAc = 20/1→10/1)により精製し、化合物19を非分離副生物とともに得た(870.4 mg)。
得られた粗生成物のTHF (30.0 mL)およびEtOH (654μL)溶液を0 ℃に冷却し、そこにtetrabutylammonium fluoride (TBAF) (607μL, 1.0 M solution in THF)を加えた。0 ℃にて1.5時間撹拌した後、反応混合物をEtOAcにて希釈し、飽和NH4Cl溶液でクエンチした。そして、水層をEtOAcにて抽出した。有機層をあわせて食塩水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、さらに真空中で濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(hexane/EtOAc = 15/1)により精製し、化合物20を白色固体として得た(496.4 mg, 1.18 mmol, 44% (2 steps)); Rf 0.29 (hexane/EtOAc = 8/1); [α]D 20 +5.7 (c 0.1, CHCl3); mp 61-62 ℃; IR (ATR, cm-1) 3400, 3326, 1755, 1683, 1514, 1451, 1368, 1295, 1254, 1213, 1160, 1052, 959, 755, 695, 638; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.37-7.33 (5H, m, Bn), 5.22-5.17 (2H, m, Bn), 5.13 (1H, s, 17NH), 4.43 (1H, m, H17), 2.29-2.23 (2H, m, H15), 2.13-2.04 (1H, m, H16), 1.96 (1H, t, J = 2.84 Hz, H13), 1.92-1.79 (1H, m, H16), 1.43 (9H, s, t-Bu); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ171.8, 155.0, 135.0, 128.3, 128.2, 128.0, 82.5, 79.7, 69.0, 66.9, 52.6, 31.1, 28.0, 14.5; FAB-MS (m/z) calcd for C18H24NO4 [M+H]+ 318.17, found 318.25。
トリフルオロ酢酸(TFA)および蒸留水の混合物 (2.9 mL, TFA/water = 95/5) を濾液に加え、室温で3時間撹拌した。その後、溶媒を真空中で除去した。C18シリカゲルカラムクロマトグラフィー (0.1% TFA in distilled water) により精製し、化合物18 (6.7 mg, 10.3 μmol, 44% (2 steps)) を黄色油状物質として得た; Rf 0.22 [MeOH (0.1% TFA)/H2O (0.1% TFA)]; [α]D 20 +16.4 (c 0.1, H2O); 1H NMR (500 MHz, D2O) δ8.55 (2H, s, H2/6),4.1 (2H, t, J = 7.6 Hz, H7), 4.10 (2H, t, J = 6.1 Hz,H21/21’), 5.14 (1H, m, NH), 4.04-3.97 (2H, m, H11/17), 3.10-3.04 and 2.97-2.89 (4H, m, H19/19’), 2.97-2.89 (2H, m, H13), 2.26-2.21 (4H, m, H20/20’), 2.07-1.94 (8H, m, H8/10/15/16), 1.68-1.55 (4H, m, H9/14); 13C NMR (75 MHz, D2O) δ173.2, 173.1, 172.8 (C12/18/22/22’), 160.1 (C4), 142.3 (C2/6), 140.3 (C3/5), 61.2 (C7), 53.7, 53.6 (C11/17/21/21’), 31.0, 30.5, 30.1, 29.8 (C8/10/15/20/20’), 29.1 (C13), 26.1, 25.2 (C9/14), 21.6 (C16); ESI-HRMS (m/z) calcd for C25H42N4O8 [M]+ 540.3033, found 540.3031。
本例では、実施例1で得られたdesmosine-CH2(「des-CH2」とも呼ぶ。)のLC-MSによる分析をおこなった。
desmosine-CH2の溶液(3.4 mg/ml in 1mM HFBA、3 mM NH4Ac aq)を希釈してLC-MS用のサンプル(100 μg/ml)を調製し、以下の条件にて分析をおこなった。
・LC-MS(Waters社製)
・カラム温度:30 ℃
・オートサンプラー内温度:18 ℃
・インジェクション量:10 μL
・流速:0.2 mL/min
・移動相溶媒:A…7 mM heptafluorobutyric acid (HFBA) および 5 mM NH4Ac aq
B…7 mM HFBA および 5 mM NH4Ac in 80% Acetonitrile
・溶媒比率 (A:B):時間(分) A B
0-6 100 0
6-7 95 5
7-8 10 90
・MS分析時間:1-8 min
・Cone voltage:45 V
また、すべての化合物のMSを検出するfull scan modeにてdesmosine-CH2溶液を分析した結果、desmosine-CH2は540.5 m/zで検出された。そこで、MSで特定の質量の化合物のみを選択して検出するSelected Ion Monioring (SIM)では540.5 m/zを追跡することとした。これによりその他の質量の化合物は検出されなくなるため、より低濃度のサンプルであってもdesmosine-CH2を検出することができるようになる。
図1は、SIM modeおよびFull scan modeでのLC-MS測定結果を示す図である。
様々な濃度のサンプル(200, 1000, 2000, 5000, 10000, 15000, 20000 ng/mL)を調製し、SIMモードにて測定をおこなった。各サンプルについて測定されたピーク面積値から検量線を作成したところ、以下の式が得られた。
y = 4.5928x - 1631.2 (R2 = 0.9978)
上記式中、xはdesmosine-CH2の濃度であり、yはピーク面積値である。
測定結果を表1および図2に示す。
検量線の信頼性を確認するため、QC (Quality Control)サンプルを用いて定量を行った。
QCサンプルとして既知濃度のdesmosine-CH2溶液(entry 1:2600 ng/mL、entry 2:16700 ng/mL)を新たに調製し、これをLC-MSによって分析した。そして得られたピーク面積値を式のyに代入することで濃度xを算出した。結果を表2に示す。
・溶媒比率(A:B):85:15
・Curve:6
・Cone voltage:45 V
とすることが好ましい条件であった。
本例では、実施例1で得られたdesmosine-CH2のLC-MS/MSによる分析をおこなった。
Full Scan Modeにおけるフラグメンテーションの確認
LC-MS/MS分析では、SIMモードで選択した分子を開裂させることで得られるフラグメンテーションを選択的に検出できる(Selected Reaction Monitoring = SRM )。そのため、SIMモードよりもさらに高感度となり、より低濃度の化合物を分析することが可能となる。
そこでまずはdesmosine-CH2のLC-MS/MS分析をおこなうために、すべての化合物を検出するfull scanにおいて測定し、化合物を開裂させるためのcollision energyを調節することでdesmosine-CH2から得られるフラグメンテーションを確認した。図3は、desmosine-CH2のLC-MS/MS測定で得られたフラグメンテーションを示す図である。
比較的高濃度である10000 ng/mLのdesmosine-CH2の溶液を、シリンジから一定の流速で直接MS/MSにインジェクトした。その後、測定画面を確認しながらcollision energyを調節し、生成するフラグメンテーションを確認したところ、40 Vのcollision energyにおいて495.14 m/zのピークが最も強く検出された。そこでdesmosine-CH2をSRMモードで分析する際には、collision energyを40 Vとし、追跡するフラグメンテーションを495.14 m/zとした。
LC-MS/MSにおけるdesmosine-CH2の分析条件は以下の通りである。
・LC-MS/MS(Thermo社製)
HPLC: FINNIGAN Surveyor
MS/MS: FINNIGAN Quantum discovery
・カラム:N-dc18-2x150 mm
・インジェクション量:10 μL
・流速:0.2 mL/min
・移動相溶媒:A…7 mM HFBA および 5 mM NH4Ac aq
B…7 mM HFBA および 5 mM NH4Ac in 80% Acetonitrile
・溶媒比率(A:B):時間(分) A B
0-10 100 0
10-11 75 25
11-14 10 90
14-17 10 90
17-30 100 0
各濃度のサンプル(2, 10, 20, 50, 100, 150, 200 ng/ml)をSRMモードにて分析し、ピーク面積値から検量線を作成したところ、以下の式が得られた。
y = 415.17x - 5379.2 (R2 = 0.967)
上記式中、xはdesmosine-CH2の濃度であり、yはピーク面積値である。
測定結果を表3および図5に示す。
Me:メチル
Et:エチル
Pr:プロピル
Bu:ブチル
Ac:アセチル
rt:室温
min:分
h:時間
d:日
Claims (5)
- 請求項1に記載の化合物において、R2がジメチレン基であり、R3がテトラメチレン基である、化合物。
- 請求項1または2に記載の化合物において、当該化合物とデスモシンとの分子量差が−14以上28以下である、化合物。
- 請求項1乃至3いずれか一項に記載の化合物を含む、定量分析用標準物質。
- 測定対象の試料に請求項1乃至3いずれか一項に記載の化合物を添加するステップを含む、デスモシン類の定量方法。
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