JPH0779794A - ハプテンに対するモノクロナール抗体の作製方法 - Google Patents
ハプテンに対するモノクロナール抗体の作製方法Info
- Publication number
- JPH0779794A JPH0779794A JP5230471A JP23047193A JPH0779794A JP H0779794 A JPH0779794 A JP H0779794A JP 5230471 A JP5230471 A JP 5230471A JP 23047193 A JP23047193 A JP 23047193A JP H0779794 A JPH0779794 A JP H0779794A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- immunogen
- monoclonal antibody
- hapten
- molecular weight
- mouse
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- Pending
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 キャリヤタンパク質に結合したハプテンを免
疫原に用いて、ハプテンに対する抗体産生の確率を上げ
たモノクロナール抗体の作製方法を提供。 【構成】 低分子化合物に特異的なモノクロナール抗体
を作製する方法において、低分子化合物を免疫原性担体
に結合させた免疫原を免疫感作させる際に、該免疫原か
ら少なくとも低分子化合物部分を除いたものに対する免
疫感作を行うマウスと同系のマウスの抗血清を投与する
ことを特徴とするモノクロナール抗体の作製方法。
疫原に用いて、ハプテンに対する抗体産生の確率を上げ
たモノクロナール抗体の作製方法を提供。 【構成】 低分子化合物に特異的なモノクロナール抗体
を作製する方法において、低分子化合物を免疫原性担体
に結合させた免疫原を免疫感作させる際に、該免疫原か
ら少なくとも低分子化合物部分を除いたものに対する免
疫感作を行うマウスと同系のマウスの抗血清を投与する
ことを特徴とするモノクロナール抗体の作製方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、低分子化合物（ハプテ
ン）に対するモノクロナール抗体の作製方法に関する。
ン）に対するモノクロナール抗体の作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ハプテン（低分子化合物）に対するモノ
クロナール抗体を作製する場合、一般にハプテンには免
疫原性がないため、高分子量の化合物例えばタンパク質
等に結合させて免疫原として用いる。このような免疫原
を用いて免疫操作を行った場合、ハプテン部分に対する
抗体のみならず、前記タンパク質（キャリヤタンパク
質）に対する抗体も同時に高い割合で生成する。
クロナール抗体を作製する場合、一般にハプテンには免
疫原性がないため、高分子量の化合物例えばタンパク質
等に結合させて免疫原として用いる。このような免疫原
を用いて免疫操作を行った場合、ハプテン部分に対する
抗体のみならず、前記タンパク質（キャリヤタンパク
質）に対する抗体も同時に高い割合で生成する。
【０００３】従来細胞融合後のハイブリドーマ・スクリ
ーニング操作の際に、別の種類のキャリヤタンパク質に
ハプテンを結合させたものを用いてハプテン部分にのみ
反応するモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ
を選択していた。そのため、殆どのハイブリドーマはキ
ャリヤタンパク質に反応する抗体を産生するものであ
り、ハプテン部分に対する抗体を産生するものが得られ
る確率は低く場合によっては、得られないこともあっ
た。
ーニング操作の際に、別の種類のキャリヤタンパク質に
ハプテンを結合させたものを用いてハプテン部分にのみ
反応するモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ
を選択していた。そのため、殆どのハイブリドーマはキ
ャリヤタンパク質に反応する抗体を産生するものであ
り、ハプテン部分に対する抗体を産生するものが得られ
る確率は低く場合によっては、得られないこともあっ
た。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、キャ
リヤタンパク質に結合したハプテンを免疫原に用いて、
ハプテンに対する抗体産生の確率を上げたモノクロナー
ル抗体の作製方法を提供することである。
リヤタンパク質に結合したハプテンを免疫原に用いて、
ハプテンに対する抗体産生の確率を上げたモノクロナー
ル抗体の作製方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の上記の目的は、
低分子化合物に特異的なモノクロナール抗体を作製する
方法において、低分子化合物を免疫原性担体に結合させ
た免疫原を免疫感作させる際に、該免疫原から少なくと
も低分子化合物部分を除いたものに対する免疫感作を行
うマウスと同系のマウスの抗血清を投与することを特徴
とするモノクロナール抗体の作製方法により達成され
る。
低分子化合物に特異的なモノクロナール抗体を作製する
方法において、低分子化合物を免疫原性担体に結合させ
た免疫原を免疫感作させる際に、該免疫原から少なくと
も低分子化合物部分を除いたものに対する免疫感作を行
うマウスと同系のマウスの抗血清を投与することを特徴
とするモノクロナール抗体の作製方法により達成され
る。
【０００６】本発明は、ハプテン（低分子化合物）をキ
ャリヤタンパク質（免疫原性担体）に、何らかの結合方
法により結合させた免疫原Ａを調製する。一方、キャリ
ヤタンパク質Ｂのみ、又はハプテンをキャリヤタンパク
質に結合する場合に架橋試薬を用いる場合は、キャリヤ
タンパク質に当該架橋試薬のみを結合させた（ハプテン
の結合されていない）キャリヤタンパク質・架橋試薬結
合体Ｃを調製する。
ャリヤタンパク質（免疫原性担体）に、何らかの結合方
法により結合させた免疫原Ａを調製する。一方、キャリ
ヤタンパク質Ｂのみ、又はハプテンをキャリヤタンパク
質に結合する場合に架橋試薬を用いる場合は、キャリヤ
タンパク質に当該架橋試薬のみを結合させた（ハプテン
の結合されていない）キャリヤタンパク質・架橋試薬結
合体Ｃを調製する。
【０００７】例えば、あらかじめ、キャリヤタンパク質
Ｂ又はＣ、或いはキャリヤタンパク質Ｂ及びＣを免疫原
として、マウスに免疫感作した後、抗血清を回収する。
この場合免疫原に対して、抗体価が上昇していることが
必須要件である。次いで、免疫原Ａをマウスに免疫感作
するが、この際、前記抗体価が上昇した抗血清を投与す
る。以下常法に従って細胞融合し、ハイブリドーマをス
クリーニングし、クローニングし、高い確率で目的のハ
プテンに対するモノクロナール抗体を得た。
Ｂ又はＣ、或いはキャリヤタンパク質Ｂ及びＣを免疫原
として、マウスに免疫感作した後、抗血清を回収する。
この場合免疫原に対して、抗体価が上昇していることが
必須要件である。次いで、免疫原Ａをマウスに免疫感作
するが、この際、前記抗体価が上昇した抗血清を投与す
る。以下常法に従って細胞融合し、ハイブリドーマをス
クリーニングし、クローニングし、高い確率で目的のハ
プテンに対するモノクロナール抗体を得た。
【０００８】本発明で用いられるキャリヤタンパク質と
しては、キーホール リンペット ヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）などが挙げられる。
しては、キーホール リンペット ヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）などが挙げられる。
【０００９】
【実施例】以下、本発明を実施例により説明するが本発
明は以下に述べる実施例により限定されるものではな
い。
明は以下に述べる実施例により限定されるものではな
い。
【００１０】実施例１ １．免疫原の調製 イソデスモシン（エラスチン・プロダクツ社製）を以下
の方法で、ＢＳＡに結合させた。
の方法で、ＢＳＡに結合させた。
【００１１】ＢＳＡ（牛血清アルブミン）（シグマ社
製）2.5mgをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）0.5mlに溶解
し、充分にＰＢＳで透析した。この溶液にグルタルアル
デヒドを最終濃度0.2％になるように加えて、室温で６
時間反応させ、ついで、ＰＢＳ中で透析を一晩行った。
その間ＰＢＳを２回交換した。
製）2.5mgをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）0.5mlに溶解
し、充分にＰＢＳで透析した。この溶液にグルタルアル
デヒドを最終濃度0.2％になるように加えて、室温で６
時間反応させ、ついで、ＰＢＳ中で透析を一晩行った。
その間ＰＢＳを２回交換した。
【００１２】イソデスモシン（ＩＤ）0.5mgをＰＢＳ0.1
mlに溶解したものを前述のＢＳＡ-グルタルアルデヒド
溶液に加え、室温で一晩静置した。この反応の後、グリ
シンを最終濃度で200mMとなるように添加し、セファデ
ックスＧ−25カラムにより脱塩を行い、蒸留水で２回透
析後、凍結乾燥し、「ＢＳＡ-グルタルアルデヒド-Ｉ
Ｄ」とした。
mlに溶解したものを前述のＢＳＡ-グルタルアルデヒド
溶液に加え、室温で一晩静置した。この反応の後、グリ
シンを最終濃度で200mMとなるように添加し、セファデ
ックスＧ−25カラムにより脱塩を行い、蒸留水で２回透
析後、凍結乾燥し、「ＢＳＡ-グルタルアルデヒド-Ｉ
Ｄ」とした。
【００１３】
【化１】
【００１４】２．免疫前操作処理 ＢＳＡ（シグマ社製）25mgをＰＢＳ５mlに溶解し、充分
にＰＢＳで透析した。この溶液にグルタルアルデヒドを
最終濃度0.2％になるように加えて、室温で６時間反応
させ、ついでＰＢＳ中で透析を一晩行った。その間ＰＢ
Ｓを２回交換した。この溶液にＰＢＳ１mlを加えて、さ
らに一晩静置後、グリシンを最終濃度で200mMとなるよ
うに添加し、セファデックス・Ｇ−25カラムにより脱塩
を行い、蒸留水で２回透析を行った後、凍結乾燥し、
「ＢＳＡ-グルタルアルデヒド」とした。
にＰＢＳで透析した。この溶液にグルタルアルデヒドを
最終濃度0.2％になるように加えて、室温で６時間反応
させ、ついでＰＢＳ中で透析を一晩行った。その間ＰＢ
Ｓを２回交換した。この溶液にＰＢＳ１mlを加えて、さ
らに一晩静置後、グリシンを最終濃度で200mMとなるよ
うに添加し、セファデックス・Ｇ−25カラムにより脱塩
を行い、蒸留水で２回透析を行った後、凍結乾燥し、
「ＢＳＡ-グルタルアルデヒド」とした。
【００１５】３．免疫感作 前記２で調製した「ＢＳＡ-グルタルアルデヒド（以下
ＢＳＡ-ＧＡ）」をＰＢＳに溶解し、フロイント完全ア
ジュバントを用いてエマルジョン化し、最終濃度100ml
／mlとした。これを８週令Balb／ｃマウスに200mlづつ
腹腔投与した。その後３週間間隔で同免疫原をフロイン
ト不完全アジュバントを用いて同様にエマルジョン化し
たものを200mlづつ３回、腹腔投与した。このマウスか
ら採血しＢＳＡ-ＧＡに対する抗体価が上昇したのを確
認し、遠心分離により抗血清を得た。
ＢＳＡ-ＧＡ）」をＰＢＳに溶解し、フロイント完全ア
ジュバントを用いてエマルジョン化し、最終濃度100ml
／mlとした。これを８週令Balb／ｃマウスに200mlづつ
腹腔投与した。その後３週間間隔で同免疫原をフロイン
ト不完全アジュバントを用いて同様にエマルジョン化し
たものを200mlづつ３回、腹腔投与した。このマウスか
ら採血しＢＳＡ-ＧＡに対する抗体価が上昇したのを確
認し、遠心分離により抗血清を得た。
【００１６】前記１で調製した「ＢＳＡ-グルタルアル
デヒド-ＩＤ（以下ＢＳＡ-ＧＡ-ＩＤ）」をＰＢＳに溶
解し、最終濃度200mg／mlとした。（免疫原２） 新たな８週令Balb／ｃマウスに、上述の免疫原１に対す
る抗血清をＰＢＳで５倍に希釈して、200ml静脈注射し
た。その後、フロイント完全アジュバントによりエマル
ジョン化し、最終濃度100mg／mlとした免疫原２を200ml
腹腔投与した。
デヒド-ＩＤ（以下ＢＳＡ-ＧＡ-ＩＤ）」をＰＢＳに溶
解し、最終濃度200mg／mlとした。（免疫原２） 新たな８週令Balb／ｃマウスに、上述の免疫原１に対す
る抗血清をＰＢＳで５倍に希釈して、200ml静脈注射し
た。その後、フロイント完全アジュバントによりエマル
ジョン化し、最終濃度100mg／mlとした免疫原２を200ml
腹腔投与した。
【００１７】さらに以後、３週間間隔で３回、抗血清の
静脈注射と、それに続く、フロイント不完全アジュバン
トによりエマルジョン化した免疫原２の腹腔投与を繰り
返した（それぞれの量、濃度は１回目の投与と同じ）。
最終免疫として、免疫原２を300ml静脈注射した３日後
に該マウスより肝臓を摘出し、マウス・ミエローマ細胞
Ｍ8.653と常法に従い細胞融合を行った。
静脈注射と、それに続く、フロイント不完全アジュバン
トによりエマルジョン化した免疫原２の腹腔投与を繰り
返した（それぞれの量、濃度は１回目の投与と同じ）。
最終免疫として、免疫原２を300ml静脈注射した３日後
に該マウスより肝臓を摘出し、マウス・ミエローマ細胞
Ｍ8.653と常法に従い細胞融合を行った。
【００１８】融合操作後、細胞懸濁液を96穴マイクロプ
レート希釈して、37℃、50％CO2下で培養した。
レート希釈して、37℃、50％CO2下で培養した。
【００１９】４．モノクローナル抗体のスクリーニング モノクローナル抗体のスクリーニングは以下に示す方法
により行った。まずＩＤを前記１の方法に準じてオボア
ルブミン（以下ＯＶＡ）に結合させたものを調製した。
これをＰＢＳ溶液で希釈してヌンク社製96穴マイクロ・
タイター・プレートに10mg／mlの濃度で50mlづつ分注
し、37℃、１時間静置した。次に、洗浄後0.5％カゼイ
ン溶液を100mlづつ分注し、37℃、１時間、ブロッキン
グを行った。0.5％カゼイン溶液を除去した後、実施例
３の培養液50mlづつを、各ウェルに移して37℃で２時間
反応した。続いて、培養液を除去、洗浄後、抗マウスIg
-ペルオキシダーゼ標識抗体（カッペル社製）を含む0.5
％カゼイン溶液を50mlづつ分注し、室温で１時間反応さ
せた。反応終了後ＰＢＳで充分に洗浄し、0.02％過酸化
水素水、1.5mg／mlのo-フェニレンジアミン（以下ＯＰ
Ｄ）を含むクエン酸-リン酸緩衝液（pＨ5.0）を100mlづ
つ分注し常温で10分間反応させ、次いで、各ウェルに９
Ｎ硫酸50mlづつを添加して反応を停止し、492nmの吸光
度を測定した。
により行った。まずＩＤを前記１の方法に準じてオボア
ルブミン（以下ＯＶＡ）に結合させたものを調製した。
これをＰＢＳ溶液で希釈してヌンク社製96穴マイクロ・
タイター・プレートに10mg／mlの濃度で50mlづつ分注
し、37℃、１時間静置した。次に、洗浄後0.5％カゼイ
ン溶液を100mlづつ分注し、37℃、１時間、ブロッキン
グを行った。0.5％カゼイン溶液を除去した後、実施例
３の培養液50mlづつを、各ウェルに移して37℃で２時間
反応した。続いて、培養液を除去、洗浄後、抗マウスIg
-ペルオキシダーゼ標識抗体（カッペル社製）を含む0.5
％カゼイン溶液を50mlづつ分注し、室温で１時間反応さ
せた。反応終了後ＰＢＳで充分に洗浄し、0.02％過酸化
水素水、1.5mg／mlのo-フェニレンジアミン（以下ＯＰ
Ｄ）を含むクエン酸-リン酸緩衝液（pＨ5.0）を100mlづ
つ分注し常温で10分間反応させ、次いで、各ウェルに９
Ｎ硫酸50mlづつを添加して反応を停止し、492nmの吸光
度を測定した。
【００２０】またＩＤ結合ＯＶＡにかえて、ＢＳＡをＰ
ＢＳに希釈して１％濃度で用いて同様に実験を行った。
ＢＳに希釈して１％濃度で用いて同様に実験を行った。
【００２１】その結果、ＩＤ結合ＯＶＡを抗原として用
いた場合、陽性ウェルは352ウェル中135ウェルであっ
た。一方、ＢＳＡ-ＧＡを用いた場合は陽性ウェルは存
在しなかった。
いた場合、陽性ウェルは352ウェル中135ウェルであっ
た。一方、ＢＳＡ-ＧＡを用いた場合は陽性ウェルは存
在しなかった。
【００２２】比較例１ 前記実施例１の免疫原の調製で調製したＢＳＡ-ＧＡ-Ｉ
Ｄを用いて、フロイントアジュバントにて免疫感作を行
った後、細胞融合を行ったものについて同様にスクリー
ニングを行ったところ、ＩＤ結合ＯＶＡを抗原として用
いた場合、陽性ウェルは、352ウェル中16ウェルであっ
た。一方ＢＳＡ-ＧＡを用いた場合は352ウェル中297ウ
ェルであった。またＩＤ結合ＯＶＡに反応する16ウェル
のうち６ウェルは、ＢＳＡ-ＧＡとの交差反応が弱く認
められた。
Ｄを用いて、フロイントアジュバントにて免疫感作を行
った後、細胞融合を行ったものについて同様にスクリー
ニングを行ったところ、ＩＤ結合ＯＶＡを抗原として用
いた場合、陽性ウェルは、352ウェル中16ウェルであっ
た。一方ＢＳＡ-ＧＡを用いた場合は352ウェル中297ウ
ェルであった。またＩＤ結合ＯＶＡに反応する16ウェル
のうち６ウェルは、ＢＳＡ-ＧＡとの交差反応が弱く認
められた。
【００２３】
【発明の効果】本発明により、キャリヤタンパク質に結
合したハプテンを免疫原に用いて、ハプテンに対する抗
体産生の確率を上げたモノクロナール抗体の作製方法を
提供することが出来た。
合したハプテンを免疫原に用いて、ハプテンに対する抗
体産生の確率を上げたモノクロナール抗体の作製方法を
提供することが出来た。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (1)
- 【請求項１】 低分子化合物に特異的なモノクロナール
抗体を作製する方法において、低分子化合物を免疫原性
担体に結合させた免疫原を免疫感作させる際に、該免疫
原から少なくとも低分子化合物部分を除いたものに対す
る免疫感作を行うマウスと同系のマウスの抗血清を投与
することを特徴とするモノクロナール抗体の作製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5230471A JPH0779794A (ja) | 1993-09-16 | 1993-09-16 | ハプテンに対するモノクロナール抗体の作製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5230471A JPH0779794A (ja) | 1993-09-16 | 1993-09-16 | ハプテンに対するモノクロナール抗体の作製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0779794A true JPH0779794A (ja) | 1995-03-28 |
Family
ID=16908346
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5230471A Pending JPH0779794A (ja) | 1993-09-16 | 1993-09-16 | ハプテンに対するモノクロナール抗体の作製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0779794A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019167301A (ja) * | 2018-03-22 | 2019-10-03 | 学校法人上智学院 | 複合体 |
-
1993
- 1993-09-16 JP JP5230471A patent/JPH0779794A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019167301A (ja) * | 2018-03-22 | 2019-10-03 | 学校法人上智学院 | 複合体 |
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