WO2020246602A1 - 四官能性ケミカルプローブ、及び該プローブを用いた生細胞または生組織からの標的膜タンパク質の同定方法 - Google Patents

四官能性ケミカルプローブ、及び該プローブを用いた生細胞または生組織からの標的膜タンパク質の同定方法 Download PDF

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凜 宮島
隆史 林
康次 酒井
祐基 大谷
美佳世 林
貴史 和田津
昭 長袋
正貴 田中
雄貴 西川
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大塚製薬株式会社
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    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a probe capable of directly identifying a target protein of a specific ligand from living cells and tissues reflecting a phenotype by using a chemoproteomics method, and an identification method using the probe.
  • probes capable of detecting various target membrane proteins including ion channels, GPCRs, multimembrane and multimembrane receptors from living cells and brain slices that are living tissues, and target membranes using them. Regarding the method for identifying proteins.
  • the chemoproteomics method is a method that enables unbiased and comprehensive direct identification of target proteins from living cells or tissues that reflect phenotypes, and unknown drug candidate compounds found by phenotypic screening. It is considered to contribute significantly to the development of pharmaceuticals, such as identification of target proteins and antigen identification of unknown antigen antibodies.
  • Non-Patent Document 1 Conventional techniques for detecting known membrane proteins include a method of labeling a living cell using a photoaffinity reactive group (Non-Patent Document 1) and a method of identifying a membrane protein by proteomics from a cell membrane fraction of a living cell.
  • Non-Patent Document 2 Method for detecting target membrane protein from forced expression cells using chemical probe (Non-Patent Documents 3 and 4), Detection of target membrane protein from cultured cells and primary cultured cells using chemical probe Method (Non-Patent Document 5), Method of detecting intracellular and on-membrane target protein from cultured cells using chemical probe (Non-Patent Document 6), Fluorescence of target membrane protein on brain slice using chemical probe
  • An imaging method Non-Patent Document 7 and a method for identifying a target membrane protein using a protein such as a growth factor EGF or FGFR antibody (Non-Patent Document 8) are known.
  • a probe having a site (ligand site) that specifically binds to the target protein is used.
  • a site ligand site
  • there are known methods for identifying a target protein using a compound in which biotin is bound to one end and a ligand having an affinity for the target protein is bound to the other end for example, Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 1). Patent Document 9 etc.).
  • this probe by binding the target protein via a ligand and then forming a biotin-avidin complex via biotin, the target protein can be isolated, purified and identified using this as an index. Is.
  • Non-Patent Document 1 discloses a method for detecting a target protein having an affinity for a ligand using a probe in which tetrazole is placed near the ligand.
  • a covalent bond is formed between the tetrazole and the protein by irradiating with ultraviolet rays, so that the protein coordinated to the ligand is not eliminated in a step such as purification.
  • Non-Patent Document 9 discloses a probe in which a cleavage site is introduced at an appropriate position between a ligand and biotin in order to remove a non-specific protein group containing avidin under mild conditions.
  • Patent Document 1 describes (i) a ligand of interest having at least one binding site on a target glycoprotein receptor as a probe for identifying a target glycoprotein present on a living cell or in a biological fluid.
  • Ligand-reactive groups for conjugation (ii) oxidized receptor-hydrazone groups for capture of glycoproteins, (iii) azides for detection, isolation and purification of captured glycoproteins and
  • a trifunctional cross-linking reagent carrying an affinity group selected from Alkin is disclosed.
  • An object of the present invention is to provide a novel compound that can be used as a probe for identifying a protein expressed in a living cell or tissue. More preferably, it is to provide a novel compound that can be used as a probe capable of identifying even a membrane protein having a low expression level. Furthermore, the present invention provides a method for identifying a target protein, preferably a target membrane protein, present in a living cell or tissue using the compound as a probe.
  • a tetrafunctional compound having four functions was designed as a means for achieving the above object. Specifically, 1) a ligand binding site (Ligand binding moiety) for conjugating a ligand having affinity (binding) to the target protein, and 2) a reactive site (Reactive) for capturing the target protein.
  • Ligand 1) a ligand binding site (Ligand binding moiety) for conjugating a ligand having affinity (binding) to the target protein, and 2) a reactive site (Reactive) for capturing the target protein.
  • Ligand 3) Cleavable motif, which is a cleavage site for selectively eluting the target protein captured in avidin beads, and 4) useful for concentrating or purifying after capturing the target protein. It is a biotin tag.
  • target membrane proteins By binding a low molecular weight compound or antibody having affinity (binding) to a target protein as a ligand to the tetrafunctional compound and using it as a tetrafunctional chemical probe, in living cells or tissues. We have found that target membrane proteins can be detected in certain brain slices.
  • Item 1 A tetrafunctional compound in which a ligand binding site (A), a reactive site (D), a cleavable site (E), and a biotin site (B) are linked, if necessary, via a spacer.
  • the ligand binding site (A) is an amine-reactive group, a hydroxy-reactive group, a thiol-reactive group, an aldehyde or keto-reactive group, an alkyl or aryl halide-reactive group, an alkyl or aryl sulfonate-reactive group, or an amide reaction.
  • At least one reactive functional group selected from The reactive site (D) comprises the structure of at least one compound selected from the group consisting of 2-aryl-5-carbonyltetrazide, phenyl azide, diazirine, ⁇ -ketoamide, 4-hydroxybenzene, phthalhydrazide and benzophenone. It is a group that has The cleaving site (E) is 1- (4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene) ethyl, lebrinoyl ester, vicinaldiol, diazobenzene, bisarylhydrazone, dialkoxy.
  • the biotin site (B) is a group represented by the following formula (1). (In the formula, * means a bond with an adjacent group.);
  • the spacer is a linear or branched alkylene group having 1 or more carbon atoms, or a linear or branched chain alkylene group having 3 or more carbon atoms, and the non-adjacent-CH 2 -groups are independent of each other.
  • Ra means a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. same as below.
  • -CO-NR a- -NR a- CO-, at least one selected from the group consisting of the group represented by the following formula (1-1) and the group represented by the following formula (1-2).
  • the reactive site (D) is a group represented by the following formula (2) or (2').
  • * means a bond with an adjacent group and n means 0 or 1.
  • the cuttable site (E) is a group represented by the following formula (3).
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 each independently mean a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and * indicates an adjacent group. Means join.
  • Item 2. The tetrafunctional compound according to Item 1.
  • Item 3. The tetrafunctional compound according to Item 1 or 2, which is a compound represented by the following formula (I) or the following formula (II): (A, B, C, D and E mean the sites described in Item 1, and S 1 , S 2 , S 3 , S 4 , S 5 , S 6 and S 7 mean spacers independently of each other. .) Item 4. Item 4. The tetrafunctional compound according to any one of Items 1 to 3, wherein the ligand binding site (A) is an N-hydroxysuccinimide ester group. Item 5. Item 4.
  • the tetrafunctional compound according to Item 4 which is a compound represented by the following formula (i), (ii) or (iii): (In the formula, p indicates 2.)
  • Item 6. A tetrafunctional chemical probe in which a ligand is bound to a ligand binding site (A) of the tetrafunctional compound according to any one of Items 1 to 5.
  • Item 7. Item 6. The tetrafunctionality according to Item 6, wherein the ligand is any one selected from the group consisting of proteins, peptides, lipids, sugars and low molecular weight compounds having an affinity for membrane proteins derived from living cells or tissues. Chemical probe.
  • Item 8. Item 6. The tetrafunctional chemical probe represented by the formula (iv) according to Item 6 or 7. (In the formula, S 1 means a spacer and p means 2.)
  • Item 9 A method for detecting a target protein in a cell or tissue using the tetrafunctional chemical probe according to any one of Items 6 to 8.
  • the process of forming It includes (5) a step of cleaving the formed tetrafunctional chemical probe-avidin complex at a cleaveable site in the tetrafunctional chemical probe, and (6) a step of detecting a fraction containing a target protein. How to detect the target protein.
  • the ligand binding site (A), the reactive site (D), the cleavable site (E), and the biotin site (B) are linked via a spacer, if necessary. It can be used as a tetrafunctional chemical probe by binding a ligand that has an affinity (binding property) to a target protein to be detected or identified to the ligand binding site. it can.
  • the tetrafunctional chemical probe of the present invention Based on the structure of the tetrafunctional compound, the tetrafunctional chemical probe of the present invention has a reactive site showing high reactivity and high selectivity and a cleaving site that cleaves under mild conditions. Due to this structure, the amount of membrane protein recovered, the detection sensitivity, and the reproducibility are particularly excellent. Therefore, by using the tetrafunctional chemical probe of the present invention, identification of a target membrane protein for living cells can be performed with higher sensitivity than in the prior art. Furthermore, it is also useful for identifying target membrane proteins in living tissues, which are more sophisticated and complex physiological environments.
  • “Four-functionality” means having four kinds of functional functional groups. As described above, of the four functional groups, one is a functional group constituting a ligand binding site or a ligand site formed at the site, and the other one is a functional group constituting a reactive site. The other is a functional group that constitutes a cleaving site, and the other is a biotin residue that binds to avidin. Biotin is a type of water-soluble vitamin classified into the B vitamin group (5-[(3aS, 4S, 6aR) -2-oxahexahydro-1H-thieno [3,4-d] imidazol-4-yl). ] Pentanoic acid).
  • alkylene is a divalent radical derived from carbon hydrogen represented by the formula "-(CHR) n-" (R is a hydrogen atom or an arbitrary substituent).
  • R is a hydrogen atom or an arbitrary substituent.
  • alkyl means a straight or branched lower alkyl having 1 to 6 carbon atoms (C 1-6 ). Specific examples thereof include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, n-hexyl, isohexyl, 3-methylpentyl and the like. is there. It is preferably a linear lower alkyl having 1 to 3 carbon atoms.
  • C 1-6 alkyl also includes lower alkyl in which 1 to 3 hydrogen atoms are replaced with deuterium atoms.
  • protein and peptide refer to an amino acid polymer having the same meaning and an arbitrary length (typically, a peptide is called a protein fragment).
  • the polymer may be straight chain, branched chain or cyclic chain.
  • the amino acid may be a natural or unnatural amino acid, or a mutant amino acid.
  • the protein may be a naturally occurring protein or a synthesized protein. It may also have a synthetically engineered sequence in a naturally occurring protein.
  • the protein may be an intracellular protein, a cell surface protein (ie, a protein bound to the surface of a cell) or a protein in a solution (ie, a protein secreted into the medium).
  • the protein may be a glycoprotein or a membrane protein.
  • the proteins of interest in the present invention are any pharmaceutically or commercially relevant proteins with useful biological or chemical activity, such as receptors, antibodies, enzymes, hormones, regulators, antigens, bindings. Can be an agent.
  • the proteins listed below that can be used in the methods of the invention are merely exemplary and are not limited thereto.
  • One of ordinary skill in the art can understand that any protein can be a target protein in the probes and methods of the invention.
  • target protein refers to a protein to which one or more specific types of ligands can bind.
  • target proteins are, but are not limited to, preferably present in biological fluids, cells, or tissues derived from mammals, including humans and non-human animals. More preferably, it is a protein expressed and present on living cells or in living tissues.
  • the target protein is, for example, a membrane protein expressed on the cell surface, it has at least one amino acid that associates with the cell membrane of living cells and is sometimes exposed to extracellular space.
  • multiple ligands can be in a bindable state.
  • the target protein targeted by the present invention is not particularly limited, but a membrane protein is preferable.
  • Membrane proteins are proteins that can directly or indirectly interact with lipid membranes, especially lipid bilayers, in which one or more amino acid molecules that make up the protein are present in the extracellular environment.
  • G protein-conjugated receptor 7-transmembrane receptor, receptor-type tyrosine kinase, immunoglobulin superfamily and related proteins, scavenger receptor, and other receptors
  • transporter ion channel, solution transporter
  • Examples include active transporters, auxiliary transporter proteins, enzymes, and others.
  • G protein-conjugated receptor and 7-transmembrane receptor include Frizzled receptor, nucleic acid receptor, adenosine receptor, adrenaline receptor, angiotensin receptor, aperin receptor, and vasopressin.
  • Receptors Bradykinin Receptors, Bombesin Receptors, Chemocaine Receptors, Collesistkinin Receptors, Muscarinic Acetylcholine Receptors, Cannabinoid Receptors, Cystainyl Leukotriene Receptors, Dopamine Receptors, Sphingolipid Receptors, Risophosphatidine Receptors Body, sphingosin monophosphate receptor, endoserine receptor, protease activation receptor, free lipid receptor, galanine receptor, growth hormone secretagogue receptor, gonad stimulating hormone receptor, bile acid receptor, nicotinic acid receptor Body, lysophosphatidic acid receptor, anaferatoxin chemotactic receptor, gastrin-releasing peptide receptor, olexin receptor, histamine receptor, serotonin receptor, interleukin receptor, leucine-rich repeat-containing G protein-conjugated receptor, Leukotrien
  • receptor-type tyrosine kinases include actibin receptor, bone-forming protein receptor, TNF- ⁇ receptor, AXL receptor, epithelial growth factor receptor, efrin receptor, insulin receptor, and neurogenic growth factor receptor. , Discoidin domain receptor, vascular endothelial growth factor receptor, leukocyte receptor, hepatocellular growth factor receptor, macrophage stimulating protein receptor, platelet-derived growth factor receptor, and enterotoxin receptor, and their precursors. be able to.
  • immunoglobulin superfamily and related proteins include immunoglobulin receptors, killer cell immunoglobulin-like receptors, leukocyte immunoglobulin-like receptors, netrin receptors, T cell receptors, various cytokine receptors, and T cell surfaces.
  • immunoglobulin receptors include immunoglobulin receptors, killer cell immunoglobulin-like receptors, leukocyte immunoglobulin-like receptors, netrin receptors, T cell receptors, various cytokine receptors, and T cell surfaces.
  • examples include various fragments of the glycoprotein CD, the superfamily and their precursors.
  • receptors include, for example, adiponectin receptor, progestin receptor, contactin-related protein, dellin, integrin and its precursor, neurexin, neuropyrin, Notch receptor, plexin and its precursor, receptor-type tyrosine phosphatase, Includes selectin and its precursors, syndecane receptors, tumor necrotizing factor (TNF) receptors, Toll-like receptors, transferase receptors, soltilin and its precursors.
  • TNF tumor necrotizing factor
  • the transporters include, for example, aquaporin, chlorine ion channel, vestrophin, lyanodine receptor, potential-gated potassium channel, cyclic nucleotide-dependent channel, calcium-activated potassium channel, and transient receptor potential channel (TRP channel). ), Potential opening type sodium channel, Potential opening type calcium channel, Other potential opening type channel, Serotonin receptor, Acetylcholine receptor, ⁇ aminobutyric acid receptor, Glycin receptor, Ion channel type glutamate receptor, P2X purine receptor, etc. Can be mentioned.
  • solution transporters include various SLC family proteins, and active transporters include ion-transporting ATP-degrading enzymes and ABC transporters.
  • sample refers to any living cell or any solid or fluid sample (biological sample) obtained from an organism.
  • biological sample include, for example, tissue cultures, bioreactors, human or non-human animal tissues, plants (including fruits and vegetables), unicellular microorganisms (eg, bacteria and yeast) and multicellular organisms.
  • Biofluids may also include, for example, blood, plasma, serum, urine, bile, semen, cerebrospinal fluid, atrioventricular fluid or vitreous fluid, or any body fluid, leak, exudate (eg, abscess or infection or Fluids from any other site of inflammation) or from joints (eg, normal joints or rheumatoid arthritis, osteoarthritis, gout or joints affected by diseases such as septic arthritis) It may be a biological fluid.
  • the biological sample may also be, for example, a sample obtained from any organ or tissue, including a biopsy or autopsy specimen.
  • the cells include primary cells and cultured cells.
  • living cells and living tissues derived from human or non-human animals are not particularly limited as long as they express a protein that can be detected using a ligand, preferably a membrane protein.
  • a ligand preferably a membrane protein.
  • CHO cells MDCK cells, 3T3-L1, 293 cells, MCF7 cells, A431 cells, 3T3 cells, CV-I cells, HeLa cells, L cells, BHK21 cells, HL-60 cells, U937 cells, HaK cells, Jurkat cells, THP-1 cells, other transformed cell lines, as well as cell lines isolated from living organisms, cell lines derived from in vitro cultures of primary tissues and transplants, etc. Can be mentioned.
  • a three-dimensional culture system such as organoid culture
  • cells or the like in which these are used as hosts and a gene encoding a specific protein is introduced by a vector or the like may be used, and examples thereof include CHO-K1 cells that stably express the dopamine D2 receptor, although they are not limited. ..
  • tissue that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it expresses a protein that can be detected using a ligand, preferably a membrane protein.
  • tissue slice sections such as brain, liver, and kidney, organ slice culture, and the like can be exemplified.
  • the term "living cell” refers to a cell derived from a mammal (human or non-human animal) established as a cell line, or a cell derived from a non-mammal that has not been denatured. It also includes cells isolated from any organ or tissue under non-denaturing conditions (eg, blood cell cells, cells constituting the organ, primary cultured cells, etc.). In addition to two-dimensional culture, this also includes those cultivated in a three-dimensional culture system, such as organoid culture. Further, in the present specification, the term “living tissue” means a tissue section or tissue culture sample (for example, brain, liver or kidney) isolated from any organ or tissue of a mammal (human or non-human animal) under non-degenerative conditions. Refers to tissue slice sections and organ slice cultures).
  • the "ligand” means a compound having an affinity for a target protein and capable of binding to the target protein. It preferably refers to any compound that is not limited, but is capable of binding to the cell membrane and interacting with or binding to the target membrane protein expressed and present on the cell surface.
  • ligands are peptides, polypeptides, proteins containing glycoproteins or phosphoproteins, carbohydrates, glycolipids, phospholipids, oligonucleotides, polynucleotides, aptamers, vitamins, antigens and fragments thereof, haptens, receptor agonists, moieties.
  • Target agonists, mixed agonists, antagonists, drugs, chemokines, hormones eg, LH, FSH, TRH, TSH, ACTH, CRH, PRH, MRH, MSH, glucagon and prolactin; transferase; lactoferrin; angiotensin; histamine; insulin; lectin ), Transmitters, autoacoids, growth factors (eg PDGF, VEGF, EGF, TGFa, TBF ⁇ , GM-CSF, G-CSF, M-CSF, FGF, IGF, bombesin, thrombopoetin, erythropoetin, oncostatin and endoserine 1) , Interleukins (eg, interleukins 1-15), lymphocaines and cellular signaling molecules, cytokines (eg, including tumor necrosis factors (eg, tumor necrosis factors ⁇ and ⁇ ) and interferons (eg, interferons ⁇ ,
  • the ligand may be an antibody.
  • Antibodies have the ability to specifically bind to a particular antigen.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • Preferred antibodies are monoclonal antibodies, in particular the therapeutic antibodies exemplified by, for example, trastuzumab and bevacizumab.
  • the antibody can be a humanized antibody.
  • the primary antibody method is a method in which an antibody (primary antibody) having an affinity for the target protein is used as a ligand
  • the secondary antibody method is a method in which the secondary antibody is integrated with the ligand binding site of the probe and is a ligand.
  • a primary antibody forms a complex with a secondary antibody that is a ligand binding site. Even if the antibody cannot detect the affinity with the target protein with high sensitivity by the primary antibody method, it may be detected with high sensitivity by the secondary antibody method.
  • the ligand may also be an engineered affinity binder, such as an anquilin repeat binder, in particular a His tag binder, an affinity binder produced by a phage display, or an oligonucleic acid or peptide aptamer.
  • the ligand may be a protein such as a protein receptor, or may be a domain of a cell surface protein such as a cell surface protein receptor.
  • the ligand may be a microorganism or a virus.
  • the ligand interacts with its target protein via its binding site.
  • the binding site is a specific peptide fragment of the target protein, eg, a specific amino acid sequence or three-dimensional structure of that fragment of the target protein, and is referred to as the binding site.
  • the term "interaction" with respect to a ligand that binds to its (cell surface or secreted) target protein binding site is a temporary or permanent direct or indirect relationship between the cell surface or secreted target protein and the ligand.
  • Contact is included and can be characterized by its binding affinity, ie the dissociation equilibrium constant Kd.
  • the typical binding affinity of the ligand for the target protein can be at least 10-5 M, preferably 10-6 M or higher, such as about 10-7 M to about 10-12 M.
  • the ligand is not particularly limited as long as it is a compound having an affinity for the target protein, but is preferably a compound (pharmaceutical compound) used as an active ingredient of a drug used for treating a disease of a human or non-human animal.
  • the pharmaceutical compound may be any of a low molecular weight compound, a medium molecular weight compound, a natural product, and a protein containing an antibody.
  • the pharmaceutical compound may be modified in order to bind to the ligand binding site of the tetrafunctional compound of the present invention as long as it does not affect the affinity with the target protein.
  • the ligand and the reactive site can be bound via a spacer.
  • the alkylation reaction, hydrolysis reaction, amination reaction, esterification reaction, amidation reaction, etherification reaction, nucleophilic substitution reaction, addition reaction, oxidation reaction, and reduction reaction are methods known per se. means. Examples of such a method include an experimental chemistry course (5th edition, edited by the Chemical Society of Japan, Maruzen Co., Ltd.), an organic functional group preparations (ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS) 2nd edition, and Academic Press (Academic Press). ACADEMIC PRESS, INC. 1989; Comprehensive Organic Transformations VCH Publishers Inc., 1989, by PGM Nuts and TW Greene, "Greene's Protective Groups in Organic” The methods described in “Synthesis” (4th edition, 2006) and the like can be mentioned.
  • the “palladium compound” is not particularly limited, but for example, tetravalent palladium catalysts such as sodium hexachloropalladium (IV) tetrahydrate and potassium hexachloropalladium (IV); [ 1,1'-bis (diphenylphosphino) ferrocene] Palladium (II) dichloride dichloromethane adduct (Pd (dppf) Cl 2 ⁇ CH 2 Cl 2 ), (2-dicyclohexylphosphino-2', 4', 6'-Triisopropyl-1,1'-biphenyl) [2- (2'-amino-1,1'-biphenyl)] Palladium (II) Palladium methanesulfonate (XPhos Pd G3), Palladium chloride (II), Palladium bromide (II), Palladium acetate (II), Palladium acetylacetonate (II), Dich
  • Divalent palladium catalysts tris (dibenzilidenacetone) dipalladium (0) (Pd 2 (dba) 3 ), tris (dibenzilidenacetone) dipalladium chloroform complex (0), tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0)
  • Examples thereof include zero-valent palladium catalysts such as (Pd (PPh 3 ) 4 ). These palladium compounds are used alone or in admixture of two or more.
  • Carbodiimide includes, for example, dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDAC), 3-ethyl-1.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • EDAC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • 3-ethyl-1 3-ethyl-1.
  • protecting group refers to, for example, t-butoxycarbonyl (BOC) group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl (Troc) group, benzyl.
  • BOC t-butoxycarbonyl
  • Fmoc 9-fluorenylmethyloxycarbonyl
  • Troc 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl
  • benzyl examples thereof include an oxycarbonyl (Z) group, an allyloxycarbonyl (Alloc) group, a trifluoroacetyl group, a phthaloyl group, a paratoluenesulfonyl (Ts) group and a 2-nitrobenzenesulfonyl (Ns) group.
  • solvent means a solvent inert to the reaction, for example, water, ether (eg, dioxane, tetrahydrofuran, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, diethylene glycol dimethyl ether, ethylene glycol dimethyl ether), and the like.
  • ether eg, dioxane, tetrahydrofuran, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, diethylene glycol dimethyl ether, ethylene glycol dimethyl ether
  • Halo hydrocarbons eg methylene chloride, chloroform, 1,2-dichloroethane, carbon tetrachloride
  • aromatic hydrocarbons eg benzene, toluene, xylene
  • lower alcohols eg methanol, ethanol, isopropanol
  • polar solvents For example, N, N-dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP), dimethyl sulfoxide (DMSO), hexamethylphosphate triamide, acetonitrile. These solvents are used alone or in admixture of two or more.
  • the "amine” includes trialkylamine (for example, trimethylamine, triethylamine, N, N-diisopropylethylamine), dialkylamine (for example, diethylamine, diisopropylamine) and the like.
  • examples of the “base” include inorganic bases and organic bases.
  • examples of the “inorganic base” include alkali metal hydroxides (eg, lithium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide) and alkaline earth metal hydroxides (eg, magnesium hydroxide, calcium hydroxide, barium hydroxide).
  • Alkali metal carbonates eg sodium carbonate, potassium carbonate, cesium carbonate
  • alkaline earth metal carbonates eg magnesium carbonate, calcium carbonate, barium carbonate
  • alkali metal hydrogen carbonates eg sodium hydrogen carbonate, carbon dioxide
  • alkali metal phosphates eg sodium phosphate, potassium phosphate, cesium phosphate
  • alkaline earth metal phosphates eg magnesium phosphate, calcium phosphate
  • alkali metal alkoxides eg sodium methoxy
  • Do sodium ethoxydo, potassium tert-butoxide
  • alkali metal hydride eg, sodium hydride, potassium hydride
  • organic base examples include trialkylamines (eg, trimethylamine, triethylamine (TEA), N, N-diisopropylethylamine (DIPEA)), dialkylamines (eg, diethylamine, diisopropylamine), 4-dimethylaminopyridine (DMAP). , N-methylmorpholin, picolin, 1,5-diazabicyclo [4.3.0] non-5-ene, 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane and 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene (DBU) and the like. From these, one kind or two or more kinds can be appropriately selected and mixed and used.
  • trialkylamines eg, trimethylamine, triethylamine (TEA), N, N-diisopropylethylamine (DIPEA)
  • dialkylamines eg, diethylamine, diisopropylamine
  • the "condensing agent” includes, for example, 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 3-hydroxy-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazine-4-one (HOOBt), N-. Hydroxybenzotriazole (NHS), Dicyclohexylcarbodiimide (DCC), Diisopropylcarbodiimide (DIC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDAC), 2- (1H-7-azabenztriazole-1- Il) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU), 2- (1H-benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluoro Phosphate (HBTU), 3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazine-4-one-3-oxytetramethyluronium hexafluor
  • the "deprotecting agent” is not particularly limited as long as the protecting group can be eliminated, but for example, a base such as piperidine or lithium diisopropylamide, an acid such as zinc or TFA, or a zero-valent palladium catalyst coexist.
  • a base such as piperidine or lithium diisopropylamide
  • an acid such as zinc or TFA
  • a zero-valent palladium catalyst coexist.
  • examples thereof include a nucleophile, a basic aqueous solution, methylamine, hydrazine, a one-electron reducing agent, and thiols.
  • a tetrafunctional compound and a tetrafunctional chemical probe The tetrafunctional compound of the present invention has a ligand binding moiety (A), a reactive moiety (D), and a cleaving moiety (E:).
  • a tetrafunctional chemical probe useful for detection, identification or purification of the target protein is prepared by binding a ligand having an affinity (binding property) to the target protein at the ligand binding site. be able to.
  • the ligand moiety, the reactive moiety (D), the cleavable moiety (E), and the biotin moiety (B) are linked with or without a spacer. It is a compound having a structure consisting of
  • the ligand binding site (A) is a site (coupling site) for binding a ligand to the tetrafunctional compound. Therefore, it can be a reactive functional group or an activating functional group that reacts with a reactive counterpart group existing on the ligand (these are collectively referred to as "ligand reactive group").
  • Activated functional group refers to a reactive functional group activated by standard chemical techniques to obtain the corresponding activated functional group.
  • the activating functional group is an amine-reactive group, a hydroxyl-reactive group, a thiol-reactive group, an aldehyde or keto-reactive group, an alkyl or aryl halide-reactive group, an alkyl or aryl sulfonate-reactive group. , Amido-reactive group, sulfonamide-reactive group, aryl-reactive group, diol-reactive group and carboxy-reactive group.
  • amine-reactive group is an activated functional group that reacts with a primary or secondary amine.
  • Typical amine-reactive groups include aryl or alkyl-activated carboxylic acid esters-COORs such as N-hydroxysuccinimide esters or derivatives thereof (eg sulfo-N-hydroxysuccinimide esters), phenol esters or derivatives thereof (eg).
  • R is phenol, p-nitrophenol, tetrafluorophenol).
  • amine-reactive groups include acyl chloride (-COCl), aryl or alkylimidate-C (NH) OME), alkyl or arylisocyanate (-NCO), isothiocyanate (-NCS), aldehydes, in particular. Includes 2-pyridinecarboxyaldehyde, carbonyl, epoxy, ⁇ , ⁇ unsaturated carbonyl, alkyl or aryl halides, alkyl or aryl sulfonate.
  • hydroxyl reactive group is an activated functional group that reacts with hydroxyl.
  • Typical hydroxyl-reactive groups include, for example, alkyl or arylisocyanate-NCO, aryl or alkyl-activated carboxylic acid ester-COOR, epoxy, ⁇ , ⁇ unsaturated carbonyl, alkyl or aryl halide, alkyl or aryl sulfonate. Can be mentioned.
  • a "thiol-reactive group” is an activated functional group that reacts with a thiol.
  • Typical thiol-reactive groups include, for example, maleimide, ⁇ -haloamide (-NH-CO-CH 2- Hal), epoxy, ⁇ , ⁇ unsaturated carbonyl, alkyl or aryl halide, alkyl or aryl sulfonate. ..
  • aldehyde or keto-reactive group is an activating functional group that reacts with an aldehyde or ketone.
  • Typical aldehyde or keto-reactive groups include, for example, aryl or alkylamine, aryl or alkylhydrazine (-NHNH 2 ), aryl or alkylacylhydrazine (-CO-NHNH 2 ), alkyl or arylhydroxylamine (-ONH 2). ), Alkyl or arylmagnesium halides.
  • alkyl or aryl halide reactive group is an activation reactive group that reacts with an alkyl or aryl halide.
  • Typical alkyl or aryl halide activation reactive groups include amines, alcohols, mercaptos, amides, sulfonamides, carboxylic acids, alkenes, alkins, boronic acids, boronic acid esters, and alkyltins.
  • alkyl or aryl sulfonate reactive group is an activation reactive group that reacts with an alkyl or aryl sulfonate.
  • Typical alkyl or aryl sulfonate activation reactive groups include amines, alcohols, mercaptos, amides, sulfonamides, carboxylic acids, alkenes, alkins, boronic acids, boronic acid esters, and alkyltin.
  • amide-reactive group is an activation-reactive group that reacts with an unsubstituted or substituted amide.
  • Typical amide-reactive groups include epoxy, ⁇ , ⁇ unsaturated carbonyls, alkyl or aryl halides, and alkyl or aryl sulfonates.
  • a "sulfonamide reactive group” is an activation reactive group that reacts with an unsubstituted or substituted sulfonamide.
  • Typical sulfonamide reactive groups include epoxy, ⁇ , ⁇ unsaturated carbonyls, alkyl or aryl halides, and alkyl or aryl sulfonates.
  • aryl-reactive group is an activated functional group that reacts with an aryl group.
  • Typical aryl reactive groups include, for example, 4-hydroxybenzene and phthalhydrazide.
  • diol reactive group is an activated functional group that reacts with the diol group.
  • Typical diol-reactive groups include, for example, boronic acid.
  • Carboxy-reactive group is an activated functional group that reacts with a carboxyl group.
  • Typical carboxy-reactive groups include, for example, halogens, alkyl or aryl sulfonates, hydroxyls, epoxies, mercaptos, aminos, isocyanatos and carbodiimides.
  • activating reagents used to activate reactive functional groups are 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 3-hydroxy-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazine-4. -On (HOOBt), N-hydroxysuccinimide (NHS), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDAC), 2- (1H-) 7-Azabenztriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU), 2- (1H-benzotriazole-1-yl) -1,1,3 3-Tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), 3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazine-4-one-3-oxytetramethyluronium hexafluorophosphate
  • the ligand binding site (A) is an amine-reactive group, a hydroxyl-reactive group, a thiol-reactive group, an aldehyde or keto-reactive group, an alkyl or aryl halide-reactive group, an alkyl or aryl sulfonate-reactive group.
  • Particularly preferred is an aryl- or alkyl-activated carboxylic acid ester-COOR, such as the N-hydroxysuccinimide ester represented by the formula below. (In the formula, * means the binding site with the adjacent group.)
  • it is a reactive functional group selected from the group consisting of aryl halides, alkyls, vinyls or aryl sulfonates, alkynyls, azides, epoxys and click tags.
  • Crick tags are functional groups used in bioorthogonal reactions, such as diphenylphosphinylphenyl, 1,2,4,5-tetrazine-3-yl, trans-cyclooctenyl, norbornenyl, cyclopropenyl, boronovinyls, boronoaryls, Aryl halides, and the like.
  • the reactive site (D), another functional site in the tetrafunctional compound of the present invention, is a group capable of forming a covalent bond with the target protein.
  • the group is not particularly limited as long as it has the above-mentioned action, but is preferably a group that forms a covalent bond under simple reaction conditions.
  • a group for example, the structure of at least one compound selected from the group consisting of 2-aryl-5-carbonyltetrazole (ACT), phenyl azide, diazirine, ⁇ -ketoamide, 4-hydroxybenzene, phthalhydrazide and benzophenone ( A group having a moiety) can be mentioned.
  • ACT can be covalently bonded mainly to a carboxyl group of a protein
  • phenyl azide can be covalently bonded mainly to an amino group of a protein.
  • 4-Hydroxybenzene and phthalhydrazide can be covalently attached to the predominantly 4-hydroxyphenyl group of proteins.
  • Diazirine, ⁇ -ketoamide and benzophenone can also form non-specific covalent bonds with proteins.
  • a preferable group is a group having an ACT structure represented by the following formula (2):
  • N means 0 or 1.
  • n means 0 means that there is no group coordinated to the benzene ring, that is, ACT is the present. It means that it is located at the end of the tetrafunctional compound of the invention.
  • n 1, the bond with the adjacent group is in the ortho, meta or para position with respect to the tetrazole group coordinated to the benzene ring. Any of the ranks is acceptable, but the para rank is preferable.
  • ultraviolet irradiation can be mentioned as a simple reaction.
  • the wavelength and irradiation time of the ultraviolet rays to be irradiated are not particularly limited as long as the reactive site of the tetrafunctional compound of the present invention and the target protein form a covalent bond.
  • the preferred wavelength is 254 to 365 nm, more preferably 302 nm.
  • the preferred irradiation time is 1 second to 10 minutes, more preferably 30 seconds to 5 minutes, and even more preferably 1 minute.
  • Another preferred group is a group having a diazirine structure represented by the following formula (2'):
  • ultraviolet irradiation can be mentioned as a simple reaction.
  • the wavelength and irradiation time of the ultraviolet rays to be irradiated are not particularly limited as long as the reactive site of the tetrafunctional compound of the present invention and the target protein form a covalent bond.
  • the preferred wavelength is 254 to 380 nm, more preferably 365 nm.
  • the preferred irradiation time is 5 to 30 minutes, more preferably 10 to 20 minutes, and even more preferably 15 minutes.
  • the cleaveable site (E), which is another functional site in the tetrafunctional compound of the present invention, is a group that can be cleaved under specific conditions.
  • the group is not particularly limited as long as it has the above-mentioned action, but is preferably a group that cleaves under mild reaction conditions.
  • Such groups include, for example, 1- (4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-iriden) ethyl (Dde), lebrinoyl ester, vicinal diol, diazobenzene, bisaryl.
  • a group having a group or a disulfide group can be mentioned.
  • it is a group having a Dde structure represented by the following formula (3):
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 each independently mean a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, preferably R 1 and R 2 are used. It is an alkyl group, and R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are hydrogen atoms.
  • the alkyl group is preferably an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and more preferably a methyl group. Yes. * Means a bond with an adjacent group.
  • the mild reaction condition described above is a condition in which the protein captured by the treatment is not decomposed and the contaminating protein non-specifically bound to the avidin beads is not eluted.
  • Specific examples thereof include conditions for chemically or biochemically cleaving the cleaveable site (E).
  • dilute hydrazine aqueous solution dilute sodium periodate aqueous solution, dilute sodium dithionate aqueous solution, dilute formic acid solution, etc.
  • TUV tabaccoetchvirus
  • a dilute (tris (2-carboxyethyl) phosphine aqueous solution and a dilute dithiotreitol aqueous solution can be mentioned.
  • a dilute hydrazine aqueous solution is used.
  • it means a concentration of 5% by mass or less, preferably 3% by mass or less.
  • biotin site B
  • the biotin site (E) which is another functional site in the tetrafunctional compound of the present invention, is a group having a biotin structure represented by the following formula (1):
  • the biotin site is a tag that can be specifically bound to a solid support to which avidin or streptavidin is bound (for example, magnetic particles, beads, plates, filters, membranes, chromatographic resins, etc.).
  • the biotin site functions effectively in the field of detecting, identifying or purifying the target protein.
  • the tetrafunctional compound of the present invention is formed by linking the above-mentioned four functional functional group sites via spacers that are independent of each other.
  • the spacer connecting the four functional functional group sites is an alkylene composed of a linear or branched alkylene group having 1 or more carbon atoms and a linear or branched alkylene group having 3 or more carbon atoms.
  • the non-adjacent -CH 2 -groups are independent of each other, -O-, -OCH 2- , -CH 2 O-, -CO-, -NR a-
  • Ra is a hydrogen atom or 1 to 1 carbon atom. It means an alkyl group of 6. same as below.
  • -CO-NR a- -NR a- CO-, at least one selected from the group consisting of the group represented by the following formula (1-1) and the group represented by the following formula (1-2).
  • a group formed by substituting with a cross-linking group can be mentioned.
  • the bridging group, -CH 2 in the alkylene chain - can replace the group - -CH 2 end groups or alkylene chain.
  • Ra is preferably a hydrogen atom.
  • n means 1 or 2.
  • the type and length of the spacer can be selected so that steric congestion is minimized and the actions of the four functional functional groups described above are not impaired.
  • the number of carbon atoms (alkylene chain length) of the alkylene group is not limited, but the number of carbon atoms is preferably 1 to 20, and more preferably 2 to 10 carbon atoms can be exemplified.
  • the tetrafunctional compound of the present invention includes a linear compound represented by the following formula (I) and a branched chain compound represented by the following formula (II).
  • Examples of the spacer group represented by S 1 include the group represented by the following formula (5). (In the formula, a is an integer of 0 to 10, and b, c, d, e, f, g and h are integers independently selected from 0 to 6.)
  • a linear alkylene group having 1 or more carbon atoms can be mentioned. This corresponds to the case where g, c and h are 0 and a is an integer of 1 or more in the formula (5). a may be an integer of 1 or more, but is preferably 1 to 30, and more preferably 1 to 10.
  • alkylene chain consisting of straight-chain alkylene group having 3 or more carbon atoms, -CH 2 nonadjacent - independently of groups from one another, -O -, - OCH 2 - , - CH 2 O-, -CO-, -NR a-
  • Ra means a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. same as below.
  • -CO-NR a- and -NR a -CO- selected from the group consisting of at least one cross-linking group, preferably -O-, -CO- and -NH-CO-.
  • 3 to 40 As the number of carbon atoms, 3 to 40, preferably 10 to 35, can be exemplified without limitation. Specifically, for example, in equation (5), g is 0, a, b, d and e are 2, c and f are 4, h is 1, and g, c and f are 0, a. Can be exemplified when 3 is 3, d is 4 and h is 1.
  • Examples of the spacer groups represented by S 2 and S 3 include groups represented by the following formula (6) independently of each other.
  • a, b, c, d, e, f, g and h are integers independently selected from 0 to 6, respectively, and i is 0 or 1.
  • a, c, h, and i cannot be 0 at the same time.
  • the alkylene chain consisting of straight-chain alkylene group having 1 or more carbon atoms, -CH 2 nonadjacent - independently of groups from one another, -O -, - OCH 2 - , - CH 2 O-, -CO-, -NR a-
  • Ra means a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. same as below.
  • -CO-NR a- and -NR a -CO- selected from the group consisting of at least one cross-linking group, preferably -O-, -NH-, and -NH-CO-. Examples thereof include groups substituted with at least one cross-linking group.
  • the number of carbon atoms 1 to 20, preferably 1 to 5, can be exemplified without limitation.
  • a case where a and c are 0, d is 3, f and g are 0, and i is 1, can be exemplified.
  • the alkylene chain consisting of straight-chain alkylene group having 3 or more carbon atoms, -CH 2 nonadjacent - independently of groups from one another, -O -, - OCH 2 - , - CH 2 O-, -CO-, -NR a-
  • Ra means a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. same as below.
  • -CO-NR a- and -NR a- CO- at least one cross-linking group selected from the group consisting of, preferably -O-, and -NH- consisting of at least one cross-linking group.
  • a group formed by substituting with a group can be mentioned.
  • the number of carbon atoms 3 to 20, preferably 5 to 15, can be exemplified without limitation.
  • a case where a and b are 2, c is 4, and h and i are 0 can be exemplified.
  • the molecular weight of the linear tetrafunctional compound is such that a protein having a high affinity for the ligand can be appropriately coordinated in a state where the ligand is bound to the ligand binding site (that is, a tetrafunctional chemical probe).
  • a protein having a high affinity for the ligand can be appropriately coordinated in a state where the ligand is bound to the ligand binding site (that is, a tetrafunctional chemical probe).
  • Well, but not limited, it is usually 500-3000. It is preferably 800 to 2000, and more preferably 1000 to 1500.
  • membrane permeability can be suppressed.
  • the number of hydrogen bond donor groups is 6 or more and the number of hydrogen bond accepting groups is 15 in order to suppress membrane permeability.
  • the polar surface area is 140 ⁇ 2 or more, more preferably 300 ⁇ 2 or more.
  • the tetrafunctional compound and the tetrafunctional chemical probe of the present invention which will be described later, have 6 to 9 hydrogen bond donating groups, 15 to 28 hydrogen bond accepting groups, and a polar surface area of 300 ⁇ 2 or more.
  • membrane permeability depends on molecular size rather than molecular weight. For medium molecules, there are examples of cyclic peptides actually measured, and it is known that membrane permeability is attenuated when the molecular size is 800 ⁇ or more, and extremely attenuated when the molecular size is 1000 ⁇ or less.
  • the tetrafunctional compound and the tetrafunctional chemical probe of the present invention which will be described later, have a molecular size of 900 ⁇ or more. Further, in the above-mentioned document, it is said that the number of rotatable bonds is 10 or less and the membrane permeability is good. That is, it is considered that the number of rotatable bonds for suppressing the membrane permeability is preferably 10 or more, more preferably 30 or more. The number of rotatable bonds of the tetrafunctional compound and the tetrafunctional chemical probe of the present invention is 33 to 60.
  • the tetrafunctional chemical probe of the present invention designed in this way can efficiently coordinate with a membrane protein because the permeability of the cell membrane is suppressed and the membrane cannot penetrate.
  • the following is an example of a method for producing a compound in which the ligand binding site is an N-hydroxysuccinimide ester group (NHS ester group) among linear tetrafunctional compounds, and a compound (CPA-306) (see Production Example 15). It is explained as.
  • an antibody probe capable of recognizing and binding a specific antigen as a target protein can be prepared by binding an antibody to the ligand binding site.
  • Step 2 the compound obtained in the first step and 2-aryl-5-carboxytetrazole (ACT) were added to N- [1- (Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylideneaminooxy) dimethylamino (morpholino)] uronium hexafluorophosphate ( It can be carried out by stirring in a reaction solvent inert to the reaction in the presence of COMU) and amines, usually for 0.1 hours to 5 days under temperature conditions ranging from 0 ° C. to heating reflux.
  • ACT 2-aryl-5-carboxytetrazole
  • the compound obtained in the second step is heated from 0 ° C. in the presence of a morpholine and a palladium compound in a reaction solvent inert to the reaction, usually for 0.1 hour to 5 days. It is carried out by stirring under temperature conditions ranging from reflux to reflux.
  • Step 2 Deprotection
  • the compound and deprotecting agent obtained in the fourth step are subjected to heating and refluxing from 0 ° C. in a reaction solvent inert to the reaction, usually for 0.1 hour to 5 days. It can be performed by stirring in a range of temperature conditions.
  • the compound obtained in the 6th step is usually subjected to a reaction solvent inert to the reaction in the presence of 1,3-dimethylbarbitulic acid and a palladium compound for 0.1 hours to 5 days. It can be carried out by stirring under temperature conditions ranging from 0 ° C. to heating reflux.
  • the compound obtained in the seventh step and N-hydroxysuccinimide in the presence of carbodiimide (WSC) are usually heated to reflux from 0 ° C. for 0.1 hour to 5 days in a reaction solvent inert to the reaction. It can be performed by stirring in a range of temperature conditions.
  • the method for binding a desired antibody to the ligand binding site (NHS ester group) of the linear tetrafunctional compound thus prepared can be carried out according to a known method, and thus, according to the present invention.
  • a linear tetrafunctional chemical probe can be produced.
  • the following methods can be exemplified as a method for binding a desired antibody to an NHS ester group.
  • a compound whose ligand binding site is a ligand-reactive group other than the NHS ester group is in a state in which a desired ligand is directly bound to the ligand binding site, that is, tetrafunctional. It can be manufactured as a sex chemical probe. An example of the manufacturing method will be described below.
  • compound 1-1, carbodiimide and cyclohexane-1,3-dione are usually 0.1 in the reaction solvent inactive in the presence of N, N-dimethyl-4-aminopyridine (DMAP). It can be carried out by stirring for hours to 5 days under temperature conditions ranging from 0 ° C. to heating reflux.
  • DMAP N, N-dimethyl-4-aminopyridine
  • This step involves compounding compounds 1-3 and 1-4 in the presence of COMU and amines in a reaction-inert reaction solvent, typically in the range from 0 ° C. to heating reflux over 0.1 hours to 5 days. It can be carried out by stirring under temperature conditions.
  • a reaction-inert reaction solvent typically in the range from 0 ° C. to heating reflux over 0.1 hours to 5 days. It can be carried out by stirring under temperature conditions.
  • This step is carried out by stirring Compounds 1-5 in the presence of a base in a reaction solvent inert to the reaction, usually for 0.1 hours to 5 days under temperature conditions ranging from 0 ° C. to heating reflux. can do.
  • Examples of the "weak acid” that can be used in this reaction include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, citric acid, and oxalic acid.
  • Examples of the "amine” that can be used in this reaction include diisopropylethylamine and triethylamine.
  • Compounds 1-9 thus produced have a desired ligand bound to the ligand binding site of the tetrafunctional compound of the present invention, and can be used as a tetrafunctional chemical probe.
  • the ligand the above-mentioned ones excluding the antibody can be exemplified without limitation.
  • (II-2) Branched chain tetrafunctional compound and tetrafunctional chemical probe
  • the ligand binding site represented by A the reactive site represented by D, and the cleavagetable represented by E.
  • the site and the biotin site indicated by B are as described above.
  • the sites represented by S 4 , S 5 , S 6 and S 7 are spacer groups independent of each other.
  • the spacer group represented by S 4 can be a group represented by the following formula (7).
  • a, b, c, d, e, f, g, h and i are integers independently selected from 0 to 6. However, a, c, and i do not become 0 at the same time, and d, f, and g do not become 0 at the same time.
  • the alkylene chain consisting of straight-chain alkylene group having 3 or more carbon atoms, -CH 2 nonadjacent - independently of groups from one another, -O -, - OCH 2 - , - CH 2 O-, -CO-, -NR a-
  • Ra means a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. same as below.
  • -CO-NR a- and -NR a- CO- at least one cross-linking group selected from the group consisting of, preferably -O-, and -NH- consisting of at least one cross-linking group.
  • a group formed by substituting with a group can be mentioned.
  • the number of carbon atoms 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 3 to 10, can be exemplified without limitation.
  • a case where a is 2, b is 2, c is 2, h is 0, and i is 0 can be exemplified.
  • Examples of the spacer group represented by S 5 include groups represented by the following formulas (8) to (10). (In the formula, w, x, y, and z are integers independently selected from 0 to 6. However, x and y cannot be 0 at the same time.)
  • Ra means a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. same as below. ]
  • -CO-NR a- , and -NR a- CO- at least one cross-linking group selected from the group, preferably -CO-, -NH-, -CO-NH-, and -NH-CO.
  • Examples thereof include groups substituted with at least one cross-linking group selected from the group consisting of ⁇ .
  • the number of carbon atoms 3 to 20, preferably 3 to 15, and more preferably 5 to 15 can be exemplified without limitation.
  • x and y are 4, for example, can be exemplified.
  • Examples of the spacer group represented by S 6 include the group represented by the following formula. (In the formula, a, b, c and d are integers independently selected from 0 to 6. However, a and c cannot be 0 at the same time.)
  • alkylene chain consisting of straight-chain alkylene group having 3 or more carbon atoms, -CH 2 nonadjacent - independently of groups from one another, -O -, - OCH 2 - , - CH 2 O-, -CO-, -NR a-
  • Ra means a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. same as below.
  • -CO-NR a- and -NR a- CO- at least one cross-linking group selected from the group consisting of, preferably -O-, and -NH- consisting of at least one cross-linking group.
  • a group formed by substituting with a group can be mentioned.
  • the number of carbon atoms 3 to 20, preferably 5 to 15, can be exemplified without limitation.
  • a case where a is 3, b is 2, c is 3, and d is 1, can be exemplified.
  • Examples of the spacer group represented by S 7 include a group represented by the following formula. (In the formula, a, b, c, d, e, f, g and h are integers independently selected from 0 to 6. However, a and c do not become 0 at the same time. Also, a, c, g, and h cannot be 0 at the same time.)
  • alkylene chain consisting of straight-chain alkylene group having 3 or more carbon atoms, -CH 2 nonadjacent - independently of groups from one another, -O -, - OCH 2 - , - CH 2 O-, -CO-, -NR a-
  • Ra means a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. same as below.
  • -CO-NR a- and -NR a -CO- selected from the group consisting of at least one cross-linking group, preferably -O-, -CO- and -NH-CO-.
  • the number of carbon atoms 3 to 40, preferably 3 to 30, more preferably 3 to 20, can be exemplified without limitation.
  • a case where g is 0, a is 5, c is 0, d is 2, f is 0, and h is 1, can be exemplified.
  • Another aspect of the spacer group represented by S 7, can be a group represented by the following formula.
  • a, b, c, d, e, f and g are integers independently selected from 0 to 6.
  • a and c cannot be 0 at the same time
  • a, c, and h cannot be 0 at the same time.
  • Crosslinking groups preferably -O-, -CO-, -NH-CO-, groups represented by the following formula (1-3), groups represented by the following formula (1-7), and the following formula (1-15).
  • ) Can be cited as a group substituted with at least one cross-linking group selected from the group consisting of the groups represented by).
  • the number of carbon atoms 3 to 40, preferably 3 to 30, more preferably 3 to 20, can be exemplified without limitation.
  • a case where g is 0, a is 5, c is 0, d is 2, f is 0, and h is 1, can be exemplified.
  • n means 1 or 2.
  • the molecular weight of the branched tetrafunctional compound is such that a protein having a high affinity for the ligand can be appropriately coordinated in a state where the ligand is bound to the ligand binding site (that is, a tetrafunctional chemical probe).
  • a protein having a high affinity for the ligand can be appropriately coordinated in a state where the ligand is bound to the ligand binding site (that is, a tetrafunctional chemical probe).
  • Well, but not limited, it is usually 500-3000. It is preferably 800 to 2000, and more preferably 1000 to 1500.
  • membrane permeability can be suppressed.
  • the number of hydrogen bond donor groups is 6 or more and the number of hydrogen bond accepting groups is 15 in order to suppress membrane permeability.
  • the polar surface area is 140 ⁇ 2 or more, more preferably 300 ⁇ 2 or more.
  • the tetrafunctional compound and the tetrafunctional chemical probe of the present invention which will be described later, have 6 to 9 hydrogen bond donating groups, 15 to 28 hydrogen bond accepting groups, and a polar surface area of 300 ⁇ or more.
  • membrane permeability depends on molecular size rather than molecular weight. For medium molecules, there are examples of cyclic peptides actually measured, and it is known that membrane permeability is attenuated when the molecular size is 800 ⁇ or more, and extremely attenuated when the molecular size is 1000 ⁇ or less.
  • the tetrafunctional compound and the tetrafunctional chemical probe of the present invention which will be described later, have a molecular size of 900 ⁇ or more. Further, in the above-mentioned document, it is said that the number of rotatable bonds is 10 or less and the membrane permeability is good. That is, it is considered that the number of rotatable bonds for suppressing the membrane permeability is preferably 10 or more, more preferably 30 or more. The number of rotatable bonds of the tetrafunctional compound and the tetrafunctional chemical probe of the present invention is 33 to 60.
  • the tetrafunctional chemical probe of the present invention designed in this way can efficiently coordinate with a membrane protein because the permeability of the cell membrane is suppressed and the membrane cannot penetrate.
  • the following is an example of a method for producing a compound in which the ligand binding site is an N-hydroxysuccinimide ester group (NHS ester group) among the branched tetrafunctional compounds, and the compound (CPA-306) (see Production Example 15) is an example. It is explained as.
  • an antibody probe capable of recognizing and binding a specific antigen as a target protein can be prepared by binding an antibody to the ligand binding site.
  • reaction step I (In the formula, t means an integer of 0 to 6 and v means an integer of 1 to 5.)
  • This step can be carried out by stirring the diamine and acid chloride in a reaction solvent inert to the reaction, usually for 0.1 hours to 5 days, under temperature conditions ranging from 0 ° C. to heating reflux.
  • a linker having a diamine and a branched amine with a protecting group in the first step is usually used in a reaction solvent inert to the reaction in the presence of carbodiimide (WSC) and 1-hydroxybenzotriazole (HOBt). It can be carried out by stirring under temperature conditions ranging from 0 ° C. to heating reflux for 0.1 hours to 5 days.
  • WSC carbodiimide
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • the compound obtained in the second step is heated to 0 ° C. in the presence of 1,3-dimethylbarbituric acid and a palladium compound in a reaction solvent which is inert to the reaction, usually for 0.1 hour to 5 days. It can be carried out by stirring under temperature conditions ranging from to heating and reflux.
  • the compound obtained in the third step and the biotin compound are subjected to a temperature condition in the range of 0 ° C. to heating reflux, usually for 0.1 hour to 5 days in the presence of amine in a reaction solvent inert to the reaction. It can be carried out by stirring with.
  • the compound obtained in the third step is mixed in the presence of piperidine in a reaction solvent inert to the reaction, usually for 0.1 hour to 5 days under temperature conditions ranging from 0 ° C. to heating reflux. It can be carried out by stirring.
  • the 1-aminoalkylcarboxylic acid and alkyldicarboxylic acid anhydride obtained in the first step are subjected to a reaction solvent inert to the reaction in the presence of an amine, usually for 0.1 hour to 5 days. It can be carried out by stirring under temperature conditions ranging from 0 ° C. to heating and reflux.
  • the alkyldicarboxylic acid anhydride used in the above reaction is not limited, and examples thereof include succinic anhydride, glutaric anhydride, and adipic acid anhydride.
  • a carboxylic acid containing a BOC-protected diamine and tetrazole is heated from 0 ° C. to reflux in the presence of amine and HATU in a reaction solvent inert to the reaction, usually for 0.1 hours to 5 days. It can be performed by stirring under temperature conditions in the range.
  • Step 2 the compound and the deprotecting agent obtained in the first step are stirred in a reaction solvent inert to the reaction, usually for 0.1 hour to 5 days, under temperature conditions ranging from 0 ° C. to heating and refluxing. It can be done by doing.
  • This step and the fourth step are arbitrary steps in the case of further extending the linker length.
  • the compound obtained in the second step and the aminocarboxylic acid in which the amino group is BOC-protected are heated from 0 ° C. in the presence of amine and COMU in a reaction solvent inert to the reaction, usually for 0.1 hour to 5 days. It can be carried out by stirring under temperature conditions ranging from reflux.
  • Step 2 the compound and the deprotecting agent obtained in the first step are stirred in a reaction solvent inert to the reaction, usually for 0.1 hour to 5 days, under temperature conditions ranging from 0 ° C. to heating and refluxing. It can be done by doing.
  • the compound obtained in the second step and the alkyldicarboxylic acid anhydride are subjected to heating and refluxing from 0 ° C. in the presence of amine in a reaction solvent inert to the reaction, usually for 0.1 hour to 5 days. It can be performed by stirring in a range of temperature conditions.
  • the compound and cyclohexanedione obtained in the third step are mixed with water-soluble carbodiimide (WSC) and N, N-dimethyl-4-aminopyridine (DMAP) in a reaction solvent inert to the reaction. It can usually be carried out by stirring for 0.1 hours to 5 days under temperature conditions ranging from 0 ° C. to heating reflux.
  • WSC water-soluble carbodiimide
  • DMAP N, N-dimethyl-4-aminopyridine
  • reaction step V (In the formula, C, u, v, w, t, R 1 and R 2 are as described above.)
  • first step the compounds obtained in the reaction steps III and IV are put into a reaction solvent inert to the reaction in the presence of amine, and usually in the range of 0 ° C. to heating reflux for 0.1 hour to 5 days. It can be carried out by stirring under temperature conditions.
  • Step 2 the compound obtained in the first step is put into a reaction solvent inert to the reaction in the presence of a palladium compound and 1,3-dimethylbarbituric acid, and usually at 0 ° C. for 0.1 hour to 5 days. It can be carried out by stirring under temperature conditions ranging from to heating and reflux.
  • the compound obtained in the second step and N-hydroxysuccinimide are heated from 0 ° C. in the presence of carbodiimide (WSC) in a reaction solvent inert to the reaction, usually for 0.1 hour to 5 days. It can be carried out by stirring under temperature conditions ranging from reflux.
  • WSC carbodiimide
  • This step is an arbitrary step and is a step of converting the ligand binding site.
  • the compound obtained in the third step and 6- (piperazine-1-ylmethyl) picolinaldehyde are usually added to the reaction solvent in the presence of amine (DIPEA) for 0.1 hours to 5 hours. It can be carried out by stirring for days at temperature conditions ranging from 0 ° C. to heating reflux.
  • the method for binding a desired antibody to the ligand binding site (NHS ester group) of the branched chain tetrafunctional compound thus prepared can be carried out according to a known method, and thus, according to the present invention.
  • a branched chain tetrafunctional chemical probe can be produced.
  • the above-mentioned antibody labeling method for a tetrafunctional compound can be exemplified.
  • the product in each reaction in each of the above-mentioned reaction formulas, can be used as a reaction solution as it is or as a crude product in the next reaction, but it can also be isolated from the reaction mixture according to a conventional method, and is usually separated. It can also be easily purified by means. Common separation means include, for example, recrystallization, distillation, chromatography.
  • the starting material compound, the intermediate compound and the target compound (the tetrafunctional compound and the tetrafunctional chemical probe of the present invention) in each step include geometric isomers, steric isomers, optical isomers and tautomers. Is done. Various isomers can be separated by a general optical resolution method. It can also be produced from a suitable optically active raw material compound.
  • the tetrafunctional compound and the tetrafunctional chemical probe of the present invention are not limited to the synthetic methods shown in the above reaction formulas, and may be produced by a method equivalent thereto or another method. it can. Further, as the raw material compound in the production, unless otherwise specified, a commercially available compound may be used, or a compound produced according to a method known per se or a method similar thereto may be used.
  • the starting material compound and the target compound in each step can be used in an appropriate salt form.
  • these salts include acid addition salts or salts with bases depending on the type of substituent.
  • acids forming such acid addition salts include inorganic acids (eg, hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitrate, sulfuric acid, phosphoric acid, etc.); and organic acids (eg, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, etc.).
  • bases that form salts include inorganic bases (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium hydrogencarbonate, potassium hydrogencarbonate, etc.); and organic bases (eg, sodium hydroxide, potassium hydrogencarbonate, etc.).
  • ammonium salts and the like may be formed with amino acids such as lysine, arginine, aspartic acid, and glutamic acid.
  • tetrafunctional chemical probe of the present invention By using the above-mentioned tetrafunctional chemical probe of the present invention, it is possible to detect the target protein in the sample. Detection of the target protein using the tetrafunctional chemical probe of the present invention can be carried out by a method having the following steps, though not limited. (1) A step of reacting a cell or tissue in a sample with a tetrafunctional chemical probe to bind a ligand in the tetrafunctional chemical probe to a target protein. (2) A step of forming a covalent bond between the reactive site (D) in the tetrafunctional chemical probe and the target protein.
  • a step of purifying the fraction containing the target protein to which the tetrafunctional chemical probe is bound (4) The biotin moiety in the tetrafunctional chemical probe is bound to avidin to form a tetrafunctional chemical probe-avidin complex.
  • the process of forming (5) A step of cleaving the formed tetrafunctional chemical probe-avidin complex at a cleaveable site in the tetrafunctional chemical probe. (6) A step of detecting or identifying a target protein.
  • Step of binding ligand and protein Although not limited, cells expressing the target protein were cultured at 37 ° C in a 5% CO 2 atmosphere, and the cells became confluent. After confirmation, the tetrafunctional chemical probe of the present invention prepared to the desired concentration by DMSO is added, and the mixture is allowed to stand at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for about 30 to 60 minutes. it can.
  • Step of forming a covalent bond between the reactive site (D) in the tetrafunctional chemical probe and the target protein This step is not limited, but the wavelength is preferably 254 to 365 nm using a UV crosslinker. Can be carried out by irradiating at 302 nm for 1 second to 10 minutes, preferably 30 seconds to 5 minutes, more preferably 1 minute.
  • Step of purifying the fraction containing the target protein to which the tetrafunctional chemical probe is bound is not limited, the following method can be used as an example. First, Tris Homogenate Buffer is added to the cells for homogenization, and then the cells are centrifuged. The precipitate is separated, homogenized by adding Sodium Carbonate Buffer, and then incubated. By centrifuging and separating the precipitate, a fraction containing the target protein to which the tetrafunctional chemical probe is bound (for example, a membrane fraction) can be purified and recovered.
  • Tris Homogenate Buffer is added to the cells for homogenization, and then the cells are centrifuged. The precipitate is separated, homogenized by adding Sodium Carbonate Buffer, and then incubated.
  • a fraction containing the target protein to which the tetrafunctional chemical probe is bound for example, a membrane fraction
  • Step of binding the biotin moiety in the tetrafunctional chemical probe with avidin to form a tetrafunctional chemical probe-avidin complex This step is not limited, but for example, in the fraction recovered above. For example, a RIPA buffer containing 8M Urea is added, and the fraction is dissolved in the buffer using an ultrasonic grinder. Centrifuge to separate the supernatant and add, for example, streptavidin magnetic particles.
  • the biotin site in the chemical probe binds to avidin to form a tetrafunctional chemical probe-avidin complex.
  • the tetrafunctional chemical probe-avidin complex can be purified and recovered by performing magnetic separation according to a conventional method and discarding the supernatant.
  • a step of cleaving the formed tetrafunctional chemical probe-avidin complex at a cleaveable site in the tetrafunctional chemical probe This step is not limited, but for example, the tetrafunctional chemical probe recovered in the above step.
  • -It can be carried out by adding SDS (sodium dodecyl sulfate) and an aqueous solution of hydrazine to the avidin complex (magnetic particle complex) and allowing it to stand at room temperature (1 to 30 ° C.) for 30 minutes.
  • This reaction cleaves the cleaveable site in the tetrafunctional chemical probe, allowing the tetrafunctional chemical probe-avidin complex to be split into a target protein binding region and a biotin-avidin binding region.
  • the binding region fragment of the target protein can be recovered.
  • a pre-recovered binding region fragment of the target protein may be subjected to a purification treatment or a hydrolysis treatment, if necessary.
  • a purification treatment or a hydrolysis treatment e.g., dithiothreitol is added to the obtained supernatant and stirred at 70 ° C. for 15 minutes. Then add iodoacetamide and let stand at room temperature for 30 minutes. SP3 beads are added to the solution thus obtained, MeCN is added, and the mixture is incubated for 18 minutes. After completion of the incubation, magnetic separation is performed and the supernatant is discarded.
  • a trypsin solution is added to the residue recovered above, and the mixture is incubated at 37 ° C. for 12 to 16 hours. MeCN is added, incubated for 18 minutes, magnetically separated, and the supernatant is discarded. Add aqueous TFA solution to the residue and incubate for 3 minutes. Magnetically separate to obtain a supernatant.
  • the peptide thus prepared is desalted and resuspended in a suitable buffer solution for analysis using a high mass accuracy mass spectrometer.
  • the mass spectrometer automatically switches the device from MS to MS / MS mode for ion signals that exceed a predetermined threshold to generate a collision-induced dissociation (CID) or high-energy collision-dissociation (HCD) spectrum of the peptide. It is operated in the data-dependent acquisition mode. All MS / MS spectra are searched against a standard protein database.
  • the peptide thus obtained is analyzed. Any method for analyzing such compounds available in the art can be used, the preferred method being mass spectrometry. Methods of mass spectrometry are well known to those skilled in the art (eg, Yates, J. Mass Spec. 33: 1-19 (1998); Kinter and Sherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry (Protein). See Quenching and Identification Using Tandem Mass Spectrometry), John Willey and Sons, New York (2000); Aeversold and Goodlett, Chem. Rev101 (see Abersold and Goodlet, Chem. Rev101).
  • liquid chromatography ESI-MS / MS or automated LC-MS / MS using capillary reverse phase chromatography can be used as the separation method (Yates et al., Methods Mol. Biol). .112: 553-569 (1999)).
  • a data-dependent collision-induced dissociation (CID) or high-energy collision dissociation (HCD) with dynamic exclusion is used as the method of mass spectrometry of choice (Goodlett et al., Anal. Chem. 72: 1112-1118). (2000))).
  • mass spectrometers are typically designed to generate collision-induced dissociation (CID) or high-energy collision-dissociation (HCD) spectra of peptides for ion signals that exceed a predetermined threshold. It is operated in data-dependent acquisition mode, which automatically starts the device to switch from MS to MS / MS mode.
  • CID collision-induced dissociation
  • HCD high-energy collision-dissociation
  • the concentration of membrane protein in the sample may be quantitatively compared with the control sample. This makes the specific enrichment of the target membrane protein receptor detectable.
  • reverse phase chromatography immediately prior to mass spectrometry can be displayed as an MS feature map plotting retention time features relative to mass / charge ratio. As detected by a mass spectrometer, the peptides in such a map appear in a clear isotope pattern over a period of time and at a defined ion current intensity depending on the abundance in the sample.
  • MS feature maps of different samples can then be overlaid and compared to obtain the peptide abundance ratio. For stochastically labeled peptides derived from membrane proteins, these ratios should be about 1, and ligand-based specifically captured membrane protein peptides have higher values compared to control samples. To get.
  • alternative mass spectrometric-based quantification methods such as single reaction monitoring (SRM), stable isotope labeling with amino acids in cell cultures (SILAC; eg, Nisson et al., Nat Methods (2010) vol. 7). (9) pp. 681-5), mass spectrometric data-independent acquisition (SWATH MS; for example, Gillet et al., (Targeted Data Extension of the MS / MS Special Generated by Data-independent Protein Association). See and Accurate Protein Analogis), Tandem mass spectrometry (TMT; for example, Dayon et al. it can.
  • SRM single reaction monitoring
  • SILAC stable isotope labeling with amino acids in cell cultures
  • SWATH MS mass spectrometric data-independent acquisition
  • TMT Tandem mass spectrometry
  • MS analysis can be replaced with other analysis methods. Such other methods are included as part of this method.
  • the binding position between the target protein and the ligand can be determined.
  • the binding position with the ligand can be recognized, so that the identification of the target protein can be made more accurate.
  • probes with enhanced detection of target proteins can be designed.
  • Root temperature in the following examples usually indicates about 10 ° C to about 35 ° C.
  • the ratio shown in the mixed solvent indicates the volume ratio unless otherwise specified.
  • 1 HNMR proto nuclear magnetic resonance spectrum
  • Fourier transform NMR either Bruker AVANCE III 400 (400MHz) or Bruker AVANCE III HD (500MHz)
  • tetramethylsilane is used as a standard substance.
  • the spectral splitting pattern is described as singlet (s), doublet (d), triplet (t), quadruple (q), multiplet or more overlapping signal (m), wide signal (br).
  • the solvents are shown in parentheses.
  • the mass spectrum was measured by electrospray ionization (ESI) using a combination of Waters ACQUITY H-Class and SQD Mass spectrometer.
  • High-resolution mass spectrometry (HRMS) was measured by electrospray ionization (ESI) using a Waters Xevo G2-XS QTof spectrometer.
  • [M + H] + means the molecular weight of monoisotopic.
  • the anti-CD71 antibody OKT9 used in the test example was manufactured by Thermo Fisher Scientific (Cat # 16-0719-85), the anti-CD71 antibody DF1513 was manufactured by Abcam (ab212863), and His-Tag EGF was manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd. (47061000). ), Goat anti-mouse IgG was manufactured by Southern Biotech (Cat.1030-01).
  • Production Example 1 Production of compound (CPI-003) Compound (CPI-003) was produced according to the method shown in the following formula.
  • Production Example 2 Production of compound (CPI-005) Compound (CPI-005) was produced according to the method shown in the following formula.
  • Production Example 3 Production of compound (CPI-104) Compound (CPI-104) was produced according to the method shown in the following formula.
  • Production Example 4 Production of compound (CPP-112) Compound (CPP-112) was produced according to the method shown in the following formula.
  • Production Example 6 Production of compound (CPP-124) Compound (CPP-124) was produced according to the method shown in the following formula.
  • the purified product was dissolved in MeOH (10 mL), an aqueous 2M HCl solution (2.1 mL) was added dropwise, the mixture was stirred at room temperature for 15 hours, and the solvent was evaporated. AcOEt was added to the residue, and the mixture was stirred, and the resulting solid was collected by filtration to obtain the desired product (0.35 g).
  • Production Example 7 Production of compound (CPP-125) Compound (CPP-125) was produced according to the method shown in the following formula.
  • Production Example 8 Production of compound (CPF-202) Compound (CPF-202) was produced according to the method shown in the following formula.
  • Production Example 10 Production of compound (CPF-224) Compound (CPF-224) was produced according to the method shown in the following formula.
  • Production Example 11 Production of compound (CPF-232) A compound (CPF-232) was produced according to the method shown in the following formula.
  • Production Example 12 Production of compound (CPP-127) Compound (CPP-127) was produced according to the method shown in the following formula.
  • Production Example 13 Production of compound (CPP-133) Compound (CPP-133) was produced according to the method shown in the following formula.
  • Production Example 14 Production of compound (CPA-302) Compound (CPA-302) was produced according to the method shown in the following formula.
  • Production Example 15 Production of compound (CPA-306) Compound (CPA-306) was produced according to the method shown in the following formula.
  • Production Example 16 Production of compound (CPA-310) Compound (CPA-310) was produced according to the method shown in the following formula.
  • Production Example 17 Production of compound (CPA-311)
  • CPA-317 The compound (CPA-315) (0.11 g) and compound (CPA-316) (0.087 g) represented by the above formula were dissolved in DMF (5 mL) and combined with HATU (0.209 g). DIPEA (0.160 ml) was added at room temperature, and the mixture was stirred for 20 hours, and then the solvent was distilled off. The residue was purified by column chromatography (silica gel, hexane / AcOEt) to obtain the desired product (0.11 mg).
  • CPA-502 The compound (CPA-501) (40 mg) represented by the above formula was dissolved in DCM (2 mL), TFA (258 ⁇ L) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was distilled off to obtain the desired product (41 mg).
  • TSTU 105 mg
  • DMF 3 mL
  • DIPEA 166 ⁇ L
  • 6-Aminocaproic acid 41 mg was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The temperature was raised to 50 ° C. and the mixture was stirred for 5 hours. The solvent was distilled off, and the residue was purified by column chromatography (ODS, water / MeCN) to obtain the desired product (102 mg).
  • Production Example 39 Production of Labeled Antibody (CPA-321 Labeled Antibody) Anti-CD71 antibody OKT9 (# 16-0719-85, Thermo Fisher Scientific), or mouse IgG1 isotype control antibody (# 553447, BD Biosciences) as a control antibody.
  • NHS labeling buffer 25 mM HEPES-NaOH pH 8.2, 150 mM NaCl
  • Test example The action of the compound of the present invention will be described below by showing the test results using a representative compound among the tetrafunctional compound and the tetrafunctional chemical probe of the present invention.
  • the present invention is not limited to these test examples.
  • Test Example 1 Isolation and detection of target molecule from living cells using compound (CPP-127) 1.
  • Cell culture and treatment method of cultured cells with this compound CHO-K1 cells that stably express the human dopamine receptor D2 (DRD2) were cultured on a 10 cm plate until they became confluent. After washing the cells with medium, the cells were replaced with a medium containing DMSO or an unmodified ligand and reacted for 30 minutes. Next, the medium was discarded, replaced with a medium containing the compound (CPP-127) synthesized in Production Example 12, and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes.
  • D2 human dopamine receptor D2
  • the medium was discarded, the cells were washed with PBS, 1 ml of PBS was added to the cells on the plate, and then the cells were irradiated with UV light at 302 nm for 1 minute using a UV crosslinker.
  • the cells after UV irradiation were collected with a cell scraper, and the collected cell pellets were cryopreserved at ⁇ 80 ° C.
  • Membrane protein elution Membrane fraction protein prepared by the above method with a membrane lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% SDC, 1% Triton-X-100, 8M Urea) was added, and the membrane fraction protein was dissolved with an ultrasonic grinder. Streptavidin beads (# 88816, Thermo Fisher Scientific) were added to the solubilized membrane protein solution, and the mixture was stirred and mixed for 60 minutes to adsorb the biotin-labeled protein on the beads.
  • a membrane lysis buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% SDC, 1% Triton-X-100, 8M Urea
  • LC-MS analysis and identification of target protein The obtained trypsin digest was desalted and purified, and protein analysis was performed by LC-MS.
  • LC-MS was performed on an LC-MS system combining a nano-HPLC device (Ultimate 3000, Thermo Scientific) and a mass spectrometer (Q Exactive, Thermo Scientific).
  • Nano-HPLC device a column (stationary phase) consisting of a trap column (C18 Acclaim PepMap, Thermo Scientific) and a chip column (75 ⁇ m id, 12 cm long, 3 ⁇ m C18 particles, Nikkyo Technos) and moving Gradient analysis was performed by reverse phase chromatography using a 0.1% formic acid-acetonitrile system in the phase. The flow rate is 300 nl / min and the peptide is eluted with a linear gradient that increases the acetonitrile concentration from 4% to 35% over 48 minutes. For mass spectrometry, ionization by nanoelectrospray was performed in positive ion mode.
  • the full scan MS spectrum was performed at m / z 380 to 1600, and the product ion spectrum was measured in a data-dependent acquisition mode.
  • the data obtained by LC-MS was analyzed by analysis software Proteome Discovere 2.2 (PD 2.2, Thermo Fisher Scientific).
  • Proteome Discovere 2.2 PD 2.2, Thermo Fisher Scientific
  • the search engine Sequest provided in PD2.2 was used to search the database downloaded from Uniprot. Calculations were performed using the false discovery rate, filtering was performed so that the false positive protein identification rate was less than 1%, and then proteins with a PSM value of 5 or higher were used as identification proteins in order to select more reliable candidate proteins.
  • the data was narrowed down using the number of unique peptides identified.
  • the protein was quantified by the quantification method LFQ provided in PD2.2, and the specifically recovered protein was discriminated by performing a quantitative comparative analysis with the unmodified ligand-treated group.
  • the analysis was performed in two independent tests and the results can be expressed as a ratio to the unmodified ligand-treated group.
  • Test Example 2 Isolation and detection of target molecule from living tissue using compounds (CPF-224, CPF-202, CPF-242) DBA / 2CrSlc mice were inhaled with isoflurane, anesthetized, decapitated, and quickly decapitated. I took it out.
  • the removed brain was immersed in artificial cerebrospinal fluid (ACSF) at 0 ° C. for 60 seconds with continuous aeration of mixed gas (95% O 2 , 5% CO 2 ).
  • the olfactory bulb and cerebellum were removed with a scalpel, and the brain was fixed to the stage of a vibrating blade microtome (Leica, VT1200) using instant adhesive.
  • Slice sections of the brain containing the striatum and hippocampus were prepared in 0 ° C. ACSF with the mixed gas continuously aerated. Sliced sections were placed in a dish containing artificial cerebrospinal fluid, unmodified ligand or DMSO was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Next, the compound produced in Production Example 10 (CPF-224) or the compound produced in Production Example 8 (CPF-202) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • the solution was removed and the slice sections were irradiated with 302 nm UV light for 1 minute (CPF-224 and CPF-202) and 365 nm UV light for 15 minutes (CPF242).
  • the sliced sections were washed and collected with PBS, and the supernatant was removed by centrifugation (3000 ⁇ g, 4 ° C., 5 minutes).
  • the obtained pellets were analyzed by the same method as in Test Example 1. The analysis was performed in two independent tests and can be expressed as a ratio to the unmodified ligand-treated group.
  • the result of using the compound (CPF-224) is shown in FIG. 2, the result of using the compound (CPF-202) is shown in FIG. 3, and the result of using the compound (CPF-242) is shown in FIG.
  • AMPA-type glutamate receptors (Gria1, Gria2, Gria3, Gria4) and GABA receptors contained in brain tissue in the unmodified ligand-treated group when the tetrafunctional chemical probe of the present invention was used. Since the body subunits (Gabra1, Gabra2, Gabra5, Gabrg2) were significantly suppressed by using CPF-224, CPF-202 and CPF242, it was confirmed that each membrane protein was specifically recovered. It was.
  • Test Example 3 Capture of cell surface antigen using labeled antibody Using the CPA-321 labeled anti-CD71 antibody or CPA-321 labeled anti-mouse IgG1 control antibody produced in Production Example 21, an antigen molecule from THP-1 cells. was obtained. Specifically, THP-1 cells were collected and washed with SB Buffer (PBS Buffer containing 2% FCS). The washed cells were suspended in SB buffer containing 0.1% Fc block reagent (Invitrogen, 16-9161-73) and reacted at 4 ° C. for 15 minutes.
  • SB Buffer PBS Buffer containing 2% FCS
  • the supernatant was removed by centrifugation (600 ⁇ g, 3 minutes, 4 ° C.), and SB Buffer was added to the antibody solution (CPA-321 labeled antibody solution (20 ⁇ g) prepared in Production Example 21) to make 1 mL.
  • the product was added and reacted at 4 ° C. for 20 minutes.
  • the antibody solution was removed by centrifugation, and the cells were washed with SB Buffer and suspended in 0.5 ml SB Buffer. Irradiate the cell suspension with UV light at 302 nm for 1 minute and remove the SB Buffer by centrifugation.
  • the obtained cells were analyzed by the method shown in Test Example 1. The analysis was performed in two independent tests, and the results were expressed as a ratio of the amount of protein obtained with the anti-CD71 antibody to the mouse IgG1 isotype control antibody (anti-mouse IgG antibody) [Fig. 5].
  • Test Examples 4 to 13 Capture of cell surface antigen using labeled antibody (1) Using the labeled antibody shown in Table 1, an antigen molecule was searched for from the cells shown in Table 1. Specifically, the cells shown in Table 1 were washed with SB Buffer (PBS Buffer containing 2% FCS) and suspended in SB buffer containing 0.1% Fc block reagent (Invitrogen, 16-9161-73). , Reacted at 4 ° C for 15 minutes. The supernatant was removed by centrifugation (600 ⁇ g, 3 minutes, 4 ° C.), a labeled antibody-containing solution prepared according to the production of the labeled antibody was added, and the mixture was reacted at 4 ° C. for 20 minutes.
  • SB Buffer PBS Buffer containing 2% FCS
  • SB buffer containing 0.1% Fc block reagent Invitrogen, 16-9161-73
  • the antibody solution was removed by centrifugation, and the cells were washed with SB Buffer and suspended in 0.5 ml SB Buffer.
  • the cell suspension was irradiated with ultraviolet rays having the wavelengths shown in the table for the time shown in the table, and SB Buffer was removed by centrifugation.
  • the recovered cells were analyzed by the method shown in Test Example 1. The test was carried out in two independent tests, and the detected amounts of the membrane proteins to be analyzed shown in the table were compared (FIGS. 6 to 8).
  • His-Tag EGF was placed in a 12.5 ⁇ g tube and diluted with NHS labeling buffer to a final concentration of approximately 0.25 mg / ml.
  • a labeling ligand solution was prepared by adding 2 ⁇ L of 5 mM CPA-354 to 48 ⁇ L of this solution. This solution was stored at 4 ° C until use.
  • Test Example 14 Capture of cell surface antigen using labeled antibody (2) Antigen molecules were searched from A431 cells using the labeled OKT9 prepared in the table below. First, the cells were washed with SB Buffer (PBS Buffer containing 2% FCS), then SB buffer containing 0.1% Fc block reagent (Invitrogen, 16-9161-73) was added, and the cells were reacted at 4 ° C for 15 minutes. It was. The supernatant was removed, 250 ⁇ L of a ligand solution diluted 10-fold with SB Buffer was added, and the mixture was reacted at 4 ° C. for 20 minutes.
  • SB Buffer PBS Buffer containing 2% FCS
  • SB buffer containing 0.1% Fc block reagent Invitrogen, 16-9161-73
  • the ligand solution was removed, the cells were washed with PBS, and then irradiated with UV light at 302 nm for 1.5 minutes. Proteins were extracted from cells in a lysis buffer containing 1% NP-40 and analyzed by the method shown in Test Example 1. In addition, the non-probeed OKT9 antibody was used as a negative control (No Probe), and the amount of CD71 detected by each probed ligand was compared (Fig. 9).
  • the anti-CD71 antibody OKT9 was placed in a 10 ⁇ g tube, 5 ⁇ L of 30 mM Sodium Periodate (in Phosphate Buffer pH 6.5) was added, and then Phosphate buffer pH 6.5 was added to bring the total liquid volume to 100 ⁇ L. After the reaction at room temperature for 15 minutes, the solvent was exchanged for PBS using a Zaba Spin column (Thermo Scientific). To 100 ⁇ L of the obtained antibody solution, add 1 ⁇ L of a 500 mM 5-MA aqueous solution, then add 1 ⁇ L of a 10 mg / ml CPA-342 or CPA-344 DMSO solution, and then under room temperature shading conditions. It was allowed to react for 1.5 hours. After the reaction, the solvent was exchanged with PBS using a ZabaSpin column to remove excess reagents.
  • Test Example 17 Supplementation of cell surface antigen using labeled antibody (secondary antibody method) An antigen molecule was searched for from THP-1 cells using the labeled secondary antibody produced by the method for producing the CBP-198 labeled secondary antibody. Specifically, THP-1 cells were washed with SB Buffer (PBS Buffer containing 2% FCS), suspended in SB buffer containing 0.1% Fc block reagent (Invitrogen, 16-9161-73), and then 4 The reaction was carried out at ° C. for 15 minutes. The supernatant was removed by centrifugation (600 x g, 3 minutes, 4 ° C).
  • SB Buffer PBS Buffer containing 2% FCS
  • Fc block reagent Invitrogen, 16-9161-73
  • the SB Buffer was removed by centrifugation after irradiation with UV light at 365 nm for 15 minutes.
  • the recovered cells were analyzed by the method shown in Test Example 1.
  • the test was carried out in two independent tests, and the detection amount of CD71 was compared.
  • the amount of CD71 detected was calculated in the same manner as in Test Example 11 except for the anti-CD71 antibody OKT9 and the anti-CD71 antibody DF1513 (FIG. 10).
  • SEQ ID NOs: 1 and 2 are amino acid sequences of peptides which are one aspect of the tetrafunctional compound of the present invention or the compound constituting the cleaveable site (E) of the tetrafunctional chemical probe.

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Abstract

リガンド結合部位（Ａ）またはリガンド、反応性部位（Ｄ）、切断可能部位（Ｅ）、及びビオチン部位（Ｂ）が、必要に応じてスペーサーを介して、連結してなる四官能性化合物であって、前記リガンド結合部位（Ａ）は、アミン反応性基等の活性化官能基、または－ＣＯＯＨ等の反応性官能基であり、前記反応性部位（Ｄ）は、2-アリール-5-カルボキシテトラゾール等の化合物の構造を有する基であり、前記切断可能部位（Ｅ）は、1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキ-1-イリデン)エチル等の化合物の構造を有する基であり、前記スペーサーが、直鎖または分岐鎖状の炭素数１以上のアルキレン基等の架橋基で置換されてなる基である、四官能性化合物。

Description

四官能性ケミカルプローブ、及び該プローブを用いた生細胞または生組織からの標的膜タンパク質の同定方法
　ケモプロテオミクス法を用いて、フェノタイプを反映する生細胞および生組織から、不偏かつ網羅的に特定リガンドの標的タンパク質を直接同定することができるプローブ、及びそのプローブを用いた同定方法に関する。特に、生細胞および生組織である脳スライスからイオンチャネルやGPCR、複数膜貫通型および多量体を形成する受容体を含む各種標的膜タンパク質を検出することができるプローブ、及びそれを用いた標的膜タンパク質の同定方法に関する。
　近年、ケミカルバイオロジーという研究分野において、分子生物学的な手法に加えて有機化学的な手法を駆使して、タンパク質又は生理活性物質などの微量の生体内分子を検出・定量し、その生体内分子の機能又は反応を解明する研究が行われている。それらの一環として生体内分子の機能又は反応の解明のために、生体内分子に特異的に作用する化合物、すなわちケミカルプローブの開発が行われている。
　この研究分野で、有機化学的手法を用いてタンパク質の構造と機能を解明する方法としてケモプロテオミクス法がある。
　ケモプロテオミクス法は、フェノタイプを反映する生細胞または生組織から、不偏かつ網羅的に標的タンパク質を直接同定することを可能とする方法であり、表現型スクリーニングで見出された医薬品候補化合物の未知標的タンパク質の同定及び抗原未知抗体の抗原同定など、医薬品の開発に大きく寄与すると考えられている。
　公知の膜タンパク質を検出するための従来技術としては、光親和性反応基を利用して生細胞をラベリングする方法（非特許文献１）、生細胞の細胞膜画分からプロテオミクスにより膜タンパク質を同定する方法（非特許文献２）、ケミカルプローブを用いた強制発現細胞からの標的膜タンパク質の検出法（非特許文献３及び４）、ケミカルプローブを用いた培養細胞および初代培養細胞からの標的膜タンパク質の検出法（非特許文献５）、ケミカルプローブを用いて培養細胞から細胞内および膜上の標的タンパク質を検出する方法（非特許文献６）、ケミカルプローブを用いた脳スライス上での標的膜タンパク質の蛍光イメージング方法（非特許文献７）、及び成長因子ＥＧＦやＦＧＦＲ抗体等のタンパク質を用いて標的とする膜タンパク質を同定する方法（非特許文献８）が知られている。
　こうした標的タンパク質の同定には、標的タンパク質と特異的に結合する部位（リガンド部位）を有するプローブが用いられる。例えば、一方の末端にビオチンを、他方の末端に標的タンパク質と親和性のあるリガンドを結合させた化合物をプローブとして、標的タンパクを同定する方法が知られている（例えば、非特許文献１及び非特許文献９等）。このプローブによると、リガンドを介して標的タンパク質を結合させた後に、ビオチンを介してビオチン・アビジン複合体を形成することで、それを指標として、標的タンパク質を単離精製し、同定することが可能である。しかし、発現量が少ない膜タンパクを特定することは容易ではない。
　具体的には、非特許文献１には、テトラゾールをリガンドの近くに配置したプローブを用いてリガンドと親和性のある標的タンパク質を検出する方法が開示されている。この方法では、リガンドに標的タンパク質が配位した後に、紫外線を照射することによりテトラゾールとタンパク質との間に共有結合を形成するため、精製等の工程においてリガンドに配位したタンパク質が脱離しないという特徴がある。
　非特許文献９には、アビジンを含む非特異的タンパク質群を穏和な条件で除去するために、リガンドとビオチンの間の適切な場所に開裂部位を導入したプローブが開示されている。　
　また、特許文献１には、生細胞上または生体液中に存在する標的糖タンパク質を同定するためのプローブとして、（i）標的糖タンパク質受容体上に少なくとも１つの結合部位を有する目的のリガンドとのコンジュゲーションのためのリガンド反応性基、（ii）酸化された受容体－糖タンパク質の捕捉のためのヒドラゾン基、（iii）捕捉された糖タンパク質の検出、単離及び精製のためのアジド及びアルキンから選択された親和性基を担持する三官能性架橋試薬が開示されている。
　しかしながら、上記の方法はいずれも、フェノタイプを正確に反映する生細胞または生組織から、再現性および実用性高く標的膜タンパク質を同定する技術ではない。その理由として、細胞膜上のタンパク質の多くは発現量が低く、また公知のケモプロテオミクス法において汎用される反応性基は標的膜タンパク質を捕捉する効率が低いため、真の標的膜タンパク質を特異的に高感度で検出することが難しいことを挙げることができる。さらにはアビジンビーズの熱処理若しくはビーズ上でのタンパク質消化に起因する非特異的タンパク質が精製後のサンプルに混入するという問題もある。これらの理由から、ケモプロテオミクスを利用した生組織からの標的膜タンパク質の同定例は報告されていない。
国際公開２０１７／０８１０６９号
J. Am. Chem. Soc., 138, 14609-14615 (2016) Cell Chemical Biology 2017, 24, 3－8 ChemBioChem 2017, 18, 1639－1649 Mol. Pharmacol. 2019, 95, 196－209 J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 6067－6075 J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 4259－4268 Nature Communications, 8, 14850 (2017) Nature Communications, 9, 1519 (2018) Chem Commun, 49, 5366 (2013)
　本発明の目的は、生細胞または生組織において発現しているタンパク質を同定するためのプローブとして使用できる新規化合物を提供することである。より好ましくは、発現量の低い膜タンパク質でも同定が可能なプローブとして使用できる新規化合物を提供することである。さらに、本発明は、当該化合物をプローブとして用いた生細胞または生組織に存在する標的タンパク質、好ましくは標的膜タンパク質の同定方法を提供することである。
　本発明では上記目的を達成する手段として４つの機能を有する四官能性化合物を設計した。具体的には、1）標的タンパク質に対して親和性（結合性）を有するリガンドをコンジュゲートさせるためのリガンド結合部位（Ligand binding moiety）、2） 標的タンパク質を捕捉するための反応性部位（Reactive moiety）、3)アビジンビーズに捕捉された標的タンパク質を選択的に溶出するための切断部分である切断可能部位（Cleavable moiety）、及び4）標的タンパク質を捕捉した後に濃縮または精製するために有用なビオチン部分（Biotin tag）である。当該四官能性化合物に、リガンドとして標的タンパク質に対して親和性（結合性）を有する低分子化合物または抗体を結合させて、それを四官能性ケミカルプローブとして用いることで、生細胞または生組織である脳スライスから標的膜タンパク質を検出することができることを見出した。
　本発明は、こうした知見に基づいて、さらなる検討を重ねて完成したものであり、以下の態様を含む。
　項１．リガンド結合部位（Ａ）、反応性部位（Ｄ）、切断可能部位（Ｅ）、及びビオチン部位（Ｂ）が、必要に応じてスペーサーを介して、連結してなる四官能性化合物であって、
　前記リガンド結合部位（Ａ）は、アミン反応性基、ヒドロキシ反応性基、チオール反応性基、アルデヒドまたはケト反応性基、アルキルまたはアリールハライド反応性基、アルキルまたはアリールスルホナート反応性基、アミド反応性基、スルホンアミド反応性基、アリール反応性基、ジオール反応性基及びカルボキシ反応性基からなる群より選択される少なくとも１つの活性化官能基であるか、または、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＣＨ＝ＣＨ－、－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ＝ＣＨ－、アルキル、ビニルまたはアリールハライド、アルキル、ビニルまたはアリールスルホナート、アルキニル、アジド、エポキシ及びクリックタグからなる群から選択される少なくとも１つの反応性官能基であり、
　前記反応性部位（Ｄ）は、2-アリール-5-カルボニルテトラゾール、フェニルアジド、ジアジリン、α－ケトアミド、４－ヒドロキシベンゼン、フタルヒドラジド及びベンゾフェノンからなる群より選択される少なくとも１つの化合物の構造を有する基であり、
　前記切断可能部位（Ｅ）は、1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキ-1-イリデン)エチル、レブリノイルエステル、ビシナルジオール、ジアゾベンゼン、ビスアリールヒドラゾン、ジアルコキシジフェニルシラン、ジスルフィド、ENLYFQG（配列番号１）の配列からなるペプチド、及びENLYFQS（配列番号２）の配列からなるペプチドからなる群より選択される少なくとも１つの化合物の構造を有する基であり、
　前記ビオチン部位（Ｂ）は、下式（１）で示される基であり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、＊は、隣接する基との結合を意味する。）；
　前記スペーサーが、直鎖若しくは分岐鎖状の炭素数１以上のアルキレン基、または直鎖若しくは分岐鎖状の炭素数３以上のアルキレン基において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、－ＮＲａ－ＣＯ－、下記式（１－１）で示される基、及び下記式（１－２）で示される基からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基である、四官能性化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、ｍは０又は１を、ｎは１又は２を意味する。）
　項２．前記反応性部位（Ｄ）が、下式（２）又は（２´）で示される基であり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、＊は、隣接する基との結合を意味し、ｎは０または１を意味する。）
または／および、
　前記切断可能部位（Ｅ）が、下式（３）で示される基である、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、各々独立して水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味し、＊は、隣接する基との結合を意味する。）
項１に記載する四官能性化合物。
　項３．下式（Ｉ）または下式（ＩＩ）で示される化合物である、項１または２に記載する四官能性化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは項１に記載する部位を意味し、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６及びＳ７は互いに独立してスペーサーを意味する。）
　項４．前記リガンド結合部位（Ａ）が、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である項１～３のいずれかに記載する四官能性化合物。
　項５．下式（i）、（ii）または（iii）で示される化合物である、項４に記載する四官能性化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 （式中、ｐは２を示す。）
　項６．項１～５のいずれかに記載する四官能性化合物のリガンド結合部位（Ａ）に、リガンドが結合してなる四官能性ケミカルプローブ。
　項７．前記リガンドが、生細胞または生組織に由来する膜タンパク質に親和性を有するタンパク質、ペプチド、脂質、糖及び低分子化合物からなる群より選択されるいずれかである、項６に記載する四官能性ケミカルプローブ。
　項８．式（iv）で示される、項６または７に記載する四官能性ケミカルプローブ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （式中、Ｓ１はスペーサーを意味し、ｐは２を意味する。）
　項９．項６～８のいずれかに記載する四官能性ケミカルプローブを用いた、細胞または組織中の標的タンパク質の検出方法であって、
（１）細胞または組織に四官能性ケミカルプローブを反応させて、四官能性ケミカルプローブ中のリガンドと標的タンパクとを結合させる工程、
（２）四官能性ケミカルプローブ中の反応性部位（Ｄ）と標的タンパク質との間で共有結合を形成させる工程、
（３）四官能性ケミカルプローブが結合した標的タンパク質を含む画分を精製する工程、（４）四官能性ケミカルプローブ中のビオチン部位をアビジンと結合させて、四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を形成する工程、
（５）形成した四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を、四官能性ケミカルプローブ中の切断可能部位で開裂する工程、及び
（６）標的タンパク質を含有する画分を検出する工程
の工程を含む標的タンパク質の検出方法。
　本発明の四官能性化合物は、リガンド結合部位（Ａ）、反応性部位（Ｄ）、切断可能部位（Ｅ）、及びビオチン部位（Ｂ）が、必要に応じてスペーサーを介して、連結してなる化合物であり、リガンド結合部位に、検出または同定する標的タンパク質に対して親和性（結合性）を有するリガンドを、前記リガンド結合部位に結合させることで、四官能性ケミカルプローブとして使用することができる。
　本発明の四官能性ケミカルプローブは、前記四官能性化合物の構造に基づいて、高い反応性と高い選択性を示す反応性部位と、温和な条件で開裂する切断可能部位を有しており、この構造により、特に膜タンパク質の回収量、検出感度、及び再現性に優れることを特徴とする。このため、本発明の四官能性ケミカルプローブを用いることで、生細胞を対象とした標的膜タンパク質の同定が従来技術に比べてより高感度に実施することができる。さらには、より高度で複雑な生理環境である生組織を対象とした標的膜タンパク質の同定にも有用である。
化合物（CPP-127）を用いて生細胞からの標的分子を単離した試験例１の結果を示す図である。 化合物（CPF-224）を用いて生組織からの標的分子を単離した試験例２の結果を示す図である。 化合物（CPF-202）を用いて生組織からの標的分子を単離した試験例２の結果を示す図である。 化合物（CPF-242）を用いて生組織からの標的分子を単離した試験例２の結果を示す図である。 ラベル化抗体（CPA-321ラベル化抗CD71抗体）を用いて細胞表面抗原を捕捉した試験例３の結果を示す図である。 異なるリンカー長の化合物でラベル化された抗CD71抗体を用いてTHP-1細胞より抗原であるCD71の検出量の結果を示すグラフである。 架橋基の異なるプローブでラベルした抗CD71抗体を用い，A431細胞より抗原であるCD71の検出量の結果を示すグラフである。 異なるプローブでラベルしたHis-Tag EGFを用い，MDA-MB-231細胞より抗原であるEGF受容体の検出量の結果を示すグラフである。 異なる手法でラベル化された抗CD71抗体を用いてA431細胞より抗原であるCD71の検出量の結果を示すグラフである。 二次抗体法でラベル化された抗CD71抗体DF1513を用いてTHP-1細胞より抗原であるCD71の検出量の結果を示すグラフである。
　（Ｉ）本明細書で使用する用語の説明
　特に説明がない限り、本明細書で用いる用語及び語句は、以下に説明する意味で使用される。
　「四官能性」とは、４種の機能的官能基を有することを意味する。前述するように、４種の機能的官能基のうち、１つはリガンド結合部位を構成する官能基または当該部位に形成されるリガンド部位、他の１つは反応性部位を構成する官能基、他の１つは切断可能部位を構成する官能基、残りの１つはアビジンと結合性を有するビオチン残基である。なお、ビオチンは、ビタミンＢ群に分類される水溶性ビタミンの一種（5-[(3aS,4S,6aR)-2-オキサヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル]ペンタン酸）である。
　本明細書において「アルキレン」は、式「－（ＣＨＲ）ｎ－」（Ｒは水素原子または任意の置換基）で示される、炭素水素から誘導される二価ラジカルである。
好ましくは、アルキレン基は１～３０個程度（ｎ＝１～３０）、好ましくは１～１０個程度の炭素原子を有する。
　本明細書において「アルキル」は、炭素数１～６（C1-6）の直鎖または分枝鎖状の低級アルキルを意味する。その具体例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、3-メチルペンチル等である。好ましくは炭素数１～３の直鎖状の低級アルキルである。また、「C1-6アルキル」には、１～３個の水素原子が重水素原子に置換された低級アルキルも包含される。
　本明細書において「タンパク質」および「ペプチド」は、同じ意味を有し、任意の長さを有するアミノ酸ポリマー（典型的にはペプチドはタンパク質の断片と呼ばれる）を指す。このポリマーは、直鎖、分枝鎖または環状鎖であってよい。アミノ酸は、天然もしくは非天然のアミノ酸、または変異アミノ酸であってよい。
　本発明では、タンパク質は天然に存在するタンパク質であっても、また合成されたものであってもよい。また天然に存在するタンパク質において合成的に操作された配列を有するものであってもよい。タンパク質は、細胞内タンパク質、細胞表面タンパク質（すなわち、細胞の表面に結合したタンパク質）または溶液中のタンパク質（すなわち、培地中に分泌されるタンパク質）であってよい。またタンパク質は糖タンパク質であっても、また膜タンパク質であってもよい。本発明で対象とするタンパク質は、有用な生物学的または化学的活性を有する任意の医薬的、または商業的に関連するタンパク質、例えば、受容体、抗体、酵素、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤であることができる。本発明の方法において使用され得る以下に列記するタンパク質は単なる例示であり、これらに限定されるものではない。当業者であれば、任意のタンパク質が本発明のプローブ及び方法における標的タンパク質になり得ることを理解することができる。
　本明細書において「標的タンパク質」は、１または複数の特定の種類のリガンドが結合し得るタンパク質を指す。このような標的タンパク質は、制限されないものの、好ましくはヒトや非ヒト動物を含む哺乳動物に由来する生体液中、細胞上、または組織中に存在し得るものである。より好ましくは生細胞上、または生組織中で発現し存在するタンパク質である。このため、標的タンパク質が、例えば細胞表面上で発現している膜タンパク質である場合、これは、生細胞の細胞膜と会合し、時には細胞外空間に曝される少なくとも１つのアミノ酸を有し、１または複数のリガンドが結合可能な状態にあることができる。
　本発明が対象とする標的タンパク質は、特に限定されないが、膜タンパク質が好ましい。膜タンパク質とは、脂質膜、特に脂質二重膜と直接的あるいは間接的に相互作用しうるタンパク質で、タンパク質を構成するアミノ酸分子が細胞外の環境に一つ以上存在するものを指す。例えば、Gタンパク質共役受容体，7回膜貫通型受容体，受容体型チロシンキナーゼ，免疫グロブリンスーパーファミリーとその関連タンパク質，スカベンジャー受容体，及びその他の受容体；輸送体，イオンチャンネル，溶液輸送体，能動輸送体，補助輸送体タンパク質，酵素，その他のものが挙げられる。
　より具体的には、例えば、Gタンパク質共役受容体および7回膜貫通型受容体の例として、Frizzled受容体，核酸受容体，アデノシン受容体，アドレナリン受容体，アンジオテンシン受容体，アペリン受容体，バソプレシン受容体，ブラジキニン受容体，ボンベシン受容体，ケモカイン受容体，コレシストキニン受容体，ムスカリン性アセチルコリン受容体，カンナビノイド受容体，システイニルロイコトリエン受容体，ドパミン受容体，スフィンゴ脂質受容体，リゾホスファチジン受容体，スフィンゴシン一リン酸受容体，エンドセリン受容体，プロテアーゼ活性化受容体，遊離脂質受容体，ガラニン受容体，成長ホルモン分泌促進因子受容体，性腺刺激ホルモン受容体，胆汁酸受容体，ニコチン酸受容体，リゾホスファチジン酸受容体，アナフェラトキシン走化性受容体，ガストリン放出ペプチド受容体，オレキシン受容体，ヒスタミン受容体，セロトニン受容体，インターロイキン受容体，ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体，ロイコトリエン受容体，副腎皮質刺激ホルモン受容体，メラノコルチン受容体，メラニン凝集ホルモン受容体，メラトニン受容体，ニューロメジン受容体，神経ペプチド受容体，ニューロテンシン受容体，オピオイド受容体，ノシセプチン受容体，オキソグルタル酸受容体，オキシトシン受容体，P2Yプリン受容体，プロスタグランジン受容体，ロドプシン，リラキシン受容体，ソマトスタチン受容体，コハク酸受容体，サブスタンスP受容体，サブスタンスK受容体，トロンボキサン受容体，ウロテンシン受容体，カルシトニン受容体，味覚受容体， 代謝型グルタミン受容体，及び嗅覚受容体などを挙げることができる。
　また受容体型チロシンキナーゼの例としては、アクチビン受容体，骨形成タンパク質受容体，TNF-β受容体，AXL受容体，上皮増殖因子受容体，エフリン受容体，インシュリン受容体，神経性成長因子受容体，ジスコイジンドメイン受容体，血管内皮増殖因子受容体，白血球受容体，肝細胞増殖因子受容体，マクロファージ刺激タンパク質受容体，血小板由来増殖因子受容体，及びエンテロトキシン受容体、並びにそれらの前駆体を挙げることができる。
　免疫グロブリンスーパーファミリーとその関連タンパク質の例としては、免疫グロブリン受容体，キラー細胞免疫グロブリン様受容体，白血球免疫グロブリン様受容体，ネトリン受容体，T細胞受容体，各種サイトカイン受容体，T細胞表面糖タンパクCDの各種フラグメント，スーパファミリーおよびそれらの前駆体が挙げられる。その他の受容体には、例えば、アディポネクチン受容体，プロゲスチン受容体，コンタクチン関連タンパク質，デルリン，インテグリンおよびその前駆体，ニューレキシン，ニューロピリン，Notch受容体，プレキシンおよびその前駆体，受容体型チロシンホスファターゼ，セレクチンおよびその前駆体，シンデカン受容体，腫瘍壊死因子（TNF)受容体，Toll様受容体，トランスフェリン受容体，ソルチリンおよびその前駆体が含まれる。
　また、輸送体としては、例えば、アクアポリン，塩素イオンチャンネル，ベストロフィン，リアノジン受容体，電位開口型カリウムチャンネル，環状ヌクレオチド依存性チャンネル，カルシウム活性化カリウムチャンネル，一過性受容器電位チャンネル（TRPチャンネル），電位開口型ナトリウムチャンネル，電位開口型カルシウムチャンネル，その他電位開口型チャンネル，セロトニン受容体，アセチルコリン受容体，γアミノ酪酸受容体，グリシン受容体，イオンチャンネル型グルタミン酸受容体，P2Xプリン受容体などが挙げられる。溶液輸送体の例としては、各種SLCファミリータンパク質が挙げられ、また能動輸送体としては、イオン輸送性ATP分解酵素およびABCトランスポーターが挙げられる。さらに酵素としては、NADH-ユビキノン酸化還元酵素，シトクロームc，フラビン含有モノオキシゲナーゼ，シトクロームP450，その他の酸化還元酵素；アシル転移酵素，グルコース転移酵素，硫酸転移酵素，その他の転移酵素；リガーゼ，チロシンホスファターゼ，リン酸ジエステル加水分解酵素，グリコシラーゼ，セリンペプチド内部加水分解酵素，金属エンドペプチダーゼ，ヌクレオシド2リン酸ホスファターゼ，その他の加水分解酵素が挙げられる。
　本明細書において「試料」または「生体試料」は、任意の生きた細胞、または生物から得られる任意の固体または流体試料（生体試料）を指す。これらには、例えば、組織培養物、バイオリアクター、ヒトまたは非ヒト動物の組織、植物（果物や野菜を含む）、単細胞微生物（例えば、細菌および酵母）および多細胞生物が含まれる。また生体試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、***、脳脊髄液、眼房水もしくは硝子体液、または任意の身体分泌物、漏出液、滲出物（例えば、膿瘍または感染症もしくは炎症の任意の他の部位から得られる流体）または関節から得られる流体（例えば、正常な関節または関節リウマチ、変形性関節症、痛風または敗血症性関節炎などの疾患に侵された関節）から得られる生体液であってよい。生体試料は、また、例えば、任意の器官または組織（生検または剖検標本を含む）から得られた試料であってもよい。また細胞には、初代細胞、及び培養細胞が含まれる。
　好ましくは、ヒトまたは非ヒト動物に由来する生細胞、及び生組織である。本発明で使用できる生細胞は、リガンドを用いて検出することができるタンパク質、好ましくは膜タンパク質が発現しているものであればよく、特に限定されない。制限されないものの、例えば、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、３Ｔ３-Ｌ１、２９３細胞、ＭＣＦ７細胞、Ａ４３１細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ-Ｉ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＬ-６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＴＨＰ-１細胞、その他の形質転換されて得られた細胞株、ならびに生体より単離された血球細胞、初代組織および初代移植片のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物に由来する細胞株などが挙げられる。また、2次元的培養以外にも3次元培養システムにて培養されたもの，例えばオルガノイド培養なども含まれる。また、これらを宿主とし、特定のタンパク質をコードする遺伝子をベクター等によって導入した細胞等でもよく、制限されないものの、例えばドパミンD2受容体を安定に発現するCHO-K1細胞などを例示することができる。
　本発明で使用できる組織も、リガンドを用いて検出することができるタンパク質、好ましくは膜タンパク質が発現しているものであればよく、特に限定されない。制限されないものの、例えば脳・肝・腎などの組織スライス切片や臓器スライス培養などを例示することができる。
　本明細書において「生細胞」とは、細胞株として樹立された哺乳類（ヒトまたは非ヒト動物）由来、あるいは哺乳類以外を由来とする細胞を培養して変性処理を施していないものを指す。また、任意の器官または組織より非変性条件にて単離された細胞（例えば血球細胞や器官を構成する細胞，初代培養細胞など）も含まれる。これいは、2次元的培養以外にも3次元培養システムにて培養されたもの、例えばオルガノイド培養なども含まれる。また本明細書において「生組織」とは、哺乳類（ヒトまたは非ヒト動物）の任意の器官または組織より非変性条件にて単離された組織切片や組織培養試料（例えば脳、肝または腎などの組織スライス切片や臓器スライス培養物）を指す。
　本発明において「リガンド」とは、標的タンパク質と親和性を有し、それに結合し得る化合物を意味する。制限されないものの、好ましくは、細胞膜に結合し、細胞表面上に発現し存在する標的膜タンパク質と相互作用または結合することができる任意の化合物を指す。リガンドの例としては、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質またはリンタンパク質を含むタンパク質、炭水化物、糖脂質、リン脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ビタミン、抗原およびその断片、ハプテン、受容体アゴニスト、部分的アゴニスト、混合アゴニスト、拮抗薬、薬物、ケモカイン、ホルモン（例えば、ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＲＨ、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、ＣＲＨ、ＰＲＨ、ＭＲＨ、ＭＳＨ、グルカゴンおよびプロラクチン；トランスフェリン；ラクトフェリン；アンジオテンシン；ヒスタミン；インスリン；レクチン）、伝達物質、オータコイド、成長因子（例えば、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦａ、ＴＢＦβ、ＧＭ-ＣＳＦ、Ｇ-ＣＳＦ、Ｍ-ＣＳＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ボンベシン、トロンボポエチン、エリスロポエチン、オンコスタチンおよびエンドセリン１）、インターロイキン（例えば、インターロイキン１～１５）、リンホカインおよび細胞シグナル伝達分子、サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子（腫瘍壊死因子αおよびβ）およびインターフェロン（例えばインターフェロンα、βおよびγ）を含む）、補欠分子族、補酵素、補因子、調節因子、及び、受容体に特異的に結合することができる天然または合成の有機分子、並びに同じ結合特性を維持するこれらの断片、類似体および他の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
　リガンドは抗体であってもよい。抗体は、特定の抗原に特異的に結合する能力を有する。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。好ましい抗体はモノクローナル抗体であり、特に例えばトラスツズマブおよびベバシズマブなどで例示される治療用抗体であることができる。さらに抗体は、ヒト化抗体であることができる。
　また、一次抗体法、二次抗体法のいずれであってもよい。一次抗体法とは、標的タンパク質と親和性を有する抗体（一次抗体）をリガンドとして用いる方法であり、二次抗体法とは、二次抗体がプローブのリガンド結合部位と一体化しており、リガンドである一次抗体がリガンド結合部位である二次抗体と複合体を形成させたものである。一次抗体法では標的タンパク質との親和性を感度よく検出できなかった抗体であっても、二次抗体法では感度よく検出できる場合がある。
　またリガンドは、操作された親和性結合剤、例えばアンキリンリピート結合剤、特にＨｉｓタグ結合剤、ファージディスプレイによって生成された親和性結合剤、またはオリゴ核酸またはペプチドアプタマーなどであってもよい。またリガンドは、タンパク質受容体などのタンパク質であってもよいし、また細胞表面タンパク質受容体などの細胞表面タンパク質のドメインであってもよい。さらに、リガンドは微生物またはウイルスであってもよい。
　本発明によれば、リガンドは、その標的タンパク質とその結合部位を介して相互作用する。結合部位は、標的タンパク質の特異的ペプチド断片、例えば標的タンパク質のその断片の特定のアミノ酸配列または３次元構造であり、結合部位と称される。その（細胞表面または分泌）標的タンパク質の結合部位に結合するリガンドに関する「相互作用」という用語は、細胞表面または分泌された標的タンパク質とリガンドとの間の一時的または永続的な直接的または間接的な接触を含み、その結合親和性、すなわち解離平衡定数Ｋｄによって特徴付けることができる。その標的タンパク質に対するリガンドの典型的な結合親和性は、少なくとも１０-５Ｍ、好ましくは１０-６Ｍ以上、例えば約１０-７Ｍ～約１０-１２Ｍであり得る。
　このようにリガンドは、標的タンパク質と親和性のある化合物であれば特に限定されないが、好ましくはヒトまたは非ヒト動物の疾患の治療に供される医薬品の有効成分として使用される化合物（医薬化合物）である。当該医薬化合物は、低分子化合物、中分子化合物、天然物、及び抗体を含むタンパク質のいずれであってもよい。また当該医薬化合物は、本発明の四官能性化合物のリガンド結合部位と結合させるために、標的タンパク質との親和性に影響を与えない範囲で修飾してもよい。本発明の四官能性ケミカルプローブにおいて、リガンドと反応性部位はスペーサーを介して結合することができる。
　本明細書において、アルキル化反応、加水分解反応、アミノ化反応、エステル化反応、アミド化反応、エーテル化反応、求核置換反応、付加反応、酸化反応、還元反応とは、自体公知の方法を意味する。このような方法としては、例えば、実験化学講座（第５版、日本化学会編、丸善株式会社）、オーガニック・ファンクショナル・グループ・プレパレーションズ（ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS）第２版、アカデミックプレス社（ACADEMIC PRESS, INC.）1989年刊；コンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ（Comprehensive Organic Transformations）VCH Publishers Inc.、1989年刊、ウッツ（P.G.M.Wuts)およびグリーン（T.W.Greene)著、「Greene's Protective Groups in Organic Synthesis」(第4版、2006年）等に記載の方法等が挙げられる。
　本明細書において、「パラジウム化合物」とは、特に限定するものではないが、例えば、ヘキサクロロパラジウム(IV)酸ナトリウム四水和物、ヘキサクロロパラジウム(IV)酸カリウム等の４価パラジウム触媒類；[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II)ジクロリド ジクロロメタン付加物（Pd(dppf)Cl2・CH2Cl2）、(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',4',6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホナート（XPhos Pd G3）、塩化パラジウム(II)、臭化パラジウム(II)、酢酸パラジウム(II)、パラジウムアセチルアセトナート(II)、ジクロロビス（ベンゾニトリル）パラジウム(II)、ジクロロビス（アセトニトリル）パラジウム(II)、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(II)、ジクロロテトラアンミンパラジウム(II)、ジクロロ（シクロオクタ-1,5-ジエン）パラジウム(II)、パラジウムトリフルオロアセテート(II)、1,1'-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンジクロロパラジウム(II)-ジクロロメタン錯体等の２価パラジウム触媒類；トリス（ジベンジリデンアセトン）二パラジウム(0)（Pd2(dba)3）、トリス（ジベンジリデンアセトン）二パラジウムクロロホルム錯体(0)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0)（Pd(PPh3)4）等の０価パラジウム触媒類等が挙げられる。これらのパラジウム化合物は、１種単独でまたは２種以上混合して使用される。
　本明細書において、「カルボジイミド」としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDAC）、3-エチル-1-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド (WSC)、N-[3-(Dimethylamino)propyl]-N'-ethylcarbodiimide、N-[3-(Dimethylamino)propyl]-N'-ethylcarbodiimide methiodide、N-tert-Butyl-N'-ethylcarbodiimide、N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate、N,N'-Di-tert-butylcarbodiimide、N,N'-Di-p-tolylcarbodiimide等が挙げられる。
　本明細書において「保護基」とは、例えば、t-ブトキシカルボニル（BOC）基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基、2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル（Troc）基、ベンジルオキシカルボニル（Z）基、アリルオキシカルボニル（Alloc）基、トリフルオロアセチル基、フタロイル基、パラトルエンスルホニル（Ts)基、2-ニトロベンゼンスルホニル（Ns)基が挙げられる。
　本明細書において「溶媒」とは、反応に不活性な溶媒を意味し、例えば、水、エーテル（例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、1,2-ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル）、ハロ炭化水素（例えば、塩化メチレン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、四塩化炭素）、芳香族炭化水素（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン）、低級アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール）、極性溶剤（例えば、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、N-メチルピロリドン（NMP）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ヘキサメチルリン酸トリアミド、アセトニトリル）が挙げられる。これらの溶媒は、１種単独で又は２種以上混合して使用される。
　本明細書において「アミン」とは、トリアルキルアミン（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン）、ジアルキルアミン（例えば、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン）等が挙げられる。
　本明細書において「塩基」としては、例えば、無機塩基、有機塩基等が挙げられる。「無機塩基」としては、アルカリ金属水酸化物（例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）、アルカリ土類金属水酸化物（例えば、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム）、アルカリ金属炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム）、アルカリ土類金属炭酸塩（例えば、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸バリウム）、アルカリ金属炭酸水素塩（例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム）、アルカリ金属リン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸セシウム）、アルカリ土類金属リン酸塩（例えば、リン酸マグネシウム、リン酸カルシウム）、アルカリ金属アルコキシド（例えば、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtert-ブトキシド）、アルカリ金属ヒドリド（例えば、ナトリウムヒドリド、カリウムヒドリド）等が挙げられる。「有機塩基」としては、トリアルキルアミン（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン（TEA）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA））、ジアルキルアミン（例えば、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン）、4-ジメチルアミノピリジン（DMAP）、N-メチルモルホリン、ピコリン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノン-5-エン、1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン及び1,8-ジアザビシクロ[5.4.0] -7-ウンデセン（DBU）等が挙げられる。これらから１種または２種以上を適宜選択、混合して使用することができる。
　本明細書において「縮合剤」としては、例えば、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３－ヒドロキシ－３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン（ＨＯＯＢｔ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、２－（１Ｈ－７－アザベンズトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン－３－オキシテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＤＴＵ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス－（ピロリジノ）－ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢｏｐ）、（３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン－３－オキシ）ジエチルホスファート（ＤＥＰＢｔ）、３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン－３－オキシトリス－（ピロリジノ）－ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰＤＯＰ）、２－（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）－１，３－ジメチル－２－ピロリジン－１－イル－１，３，２－ジアザホスホリジニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＭＰ）、５－（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）－３，４－ジヒドロ－１－メチル２Ｈ－ピロリウムヘキサクロロアンチモナート（ＡＯＭＰ）、（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＡＯＰ）、５－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－３，４－ジヒドロ－１－メチル２Ｈ－ピロリウムヘキサクロロアンチモナート：Ｎ－オキシド（ＢＤＭＰ）、２－ブロモ－３－エチル－４－メチルチアゾリウムテトラフルオロボラート（ＢＥＭＴ）、２－ブロモ－１－エチルピリジニウムテトラフルオロボラート（ＢＥＰ）、２－ブロモ－１－エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモナート（ＢＥＰＨ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルメタンイミニウムヘキサクロロアンチモナート（ＢＯＭＩ）、Ｎ、Ｎ’ －ビス（２－オキソ－３－オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢＯＰ－Ｃｌ）、１－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）フェニルメチレンピロリジニウムヘキサクロロ－アンチモナート（ＢＰＭＰ）、１，１，３，３－ビス（テトラメチレン）フルオロウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＴＦＦＨ）、４－（クロロ―４－モルホリニルメチレン）モルホリニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＭＭＭ）、２－クロロ－１，３－ジメチル－１Ｈ－ベンズイミダゾリウムヘキサフルオロホスファート（ＣＭＢＩ）、２－フルオロ－１－エチルピリジニウムテトラフルオロボラート（ＦＥＰ）、２－フルオロ－１－エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモナート（ＦＥＰＨ）、１－（１－ピロリジニル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－１－イルメチレン）ピロリジニウムヘキサフルオロ－ホスファートＮ－オキシド（ＨＡＰｙＵ）、Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ビス－（ペンタメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＰｉｐＵ）、Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）Ｎ，Ｎ，Ｎ０，Ｎ０－ビス（テトラメチレン）ウリニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＰｙＵ）、（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＡＯＰ）、ブロモ－トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢｒＯｐ）、クロロ－トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＣｌＯＰ）、１，１，３，３－ビス（テトラメチレン）クロロウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＣｌＵ）、テトラメチルフルオロ－マミジニウムヘキサフルオロホスファート（ＴＦＦＨ）、トリホスゲン、トリアジン系試薬［塩化シアヌル、フッ化シアヌル、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）、２－クロロ－４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン（ＣＤＭＴ）］、ビス（２－クロロフェニル）ホスホロクロリダート、ジフェニルホスホロクロリダート、ジフェニルホスホロアジド（ＤＰＰＡ）、N－[1－(シアノ－2－エトキシ－2－オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ(モルホリノ)]ウロニウム　ヘキサフルオロリン酸（COMU)、N,N,N',N'-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボラート(TSTU)等を挙げられる。
　本明細書において「脱保護剤」とは、保護基を脱離させることができれば特に限定されないが、例えば、ピペリジンやリチウムジイソプロピルアミドなどの塩基、亜鉛、TFAなどの酸、０価パラジウム触媒を共存させた求核剤、塩基性水溶液、メチルアミン、ヒドラジン、一電子還元剤、チオール類が挙げられる。
　（ＩＩ）四官能性化合物、及び四官能性ケミカルプローブ
　本発明の四官能性化合物は、リガンド結合部位（Ａ：ligand binding moiety）、反応性部位（Ｄ：Reactive moiety）、切断可能部位（Ｅ：Cleavable moiety）、及びビオチン部位（Ｂ：Biotin tag）が、必要に応じてスペーサーを介して、連結してなる構造を有する化合物である。この化合物によれば、そのリガンド結合部位に、標的タンパク質と親和性（結合性）を有するリガンドを結合させることで、当該標的タンパク質の検出、同定または精製に有用な四官能性ケミカルプローブを調製することができる。つまり、四官能性ケミカルプローブは、リガンド部位（ligand moiety）、反応性部位（Ｄ）、切断可能部位（Ｅ）、及びビオチン部位（Ｂ）が、スペーサーを介するか／または介することなく、連結してなる構造を有する化合物である。
　以下、本発明の四官能性化合物及び四官能性ケミカルプローブが有する４つの機能性官能基部位、及びそれらを連結するスペーサーについて説明する。
（リガンド結合部位）
　本発明の四官能性化合物において、リガンド結合部位（Ａ）は、四官能性化合物にリガンドを結合させるための部位（カップリング部位）である。このため、リガンド上に存在する反応性カウンターパート基と反応する反応性官能基または活性化官能基（これらを総称して「リガンド反応性基」と称する）であり得る。
　「活性化官能基」は、対応する活性化官能基を得るために標準的な化学技術によって活性化された反応性官能基を指す。特定の実施形態において、活性化官能基は、アミン反応性基、ヒドロキシル反応性基、チオール反応性基、アルデヒドまたはケト反応性基、アルキルまたはアリールハライド反応性基、アルキルまたはアリールスルホナート反応性基、アミド反応性基、スルホンアミド反応性基、アリール反応性基、ジオール反応性基およびカルボキシ反応性基からなる群から選択される。
　「アミン反応性基」は、第１級または第２級アミンと反応する活性化官能基である。典型的なアミン反応性基としては、アリールまたはアルキル活性化カルボン酸エステル－ＣＯＯＲ、例えばＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはこれらの誘導体（例えば、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、フェノールエステルまたはこれらの誘導体（例えば、Ｒはフェノール、ｐ－ニトロフェノール、テトラフルオロフェノールである）が挙げられる。他のアミン反応性基としては、塩化アシル（－ＣＯＣｌ）、アリールまたはアルキルイミダート－Ｃ（ＮＨ）ＯＭｅ）、アルキルまたはアリールイソシアナート（－ＮＣＯ）、イソチオシアナート（－ＮＣＳ）、アルデヒド、特に２－ピリジンカルボキシアルデヒド、カルボニル、エポキシ、α,β不飽和カルボニル、アルキルまたはアリールハライド、アルキルまたはアリールスルホナートが含まれる。
　「ヒドロキシル反応性基」は、ヒドロキシルと反応する活性化官能基である。典型的なヒドロキシル反応性基としては、例えばアルキルまたはアリールイソシアナート－ＮＣＯ、アリールまたはアルキル活性化カルボン酸エステル－ＣＯＯＲ、エポキシ、α,β不飽和カルボニル、アルキルまたはアリールハライド、アルキルまたはアリールスルホナートが挙げられる。
　「チオール反応性基」は、チオールと反応する活性化官能基である。典型的なチオール反応性基としては、例えばマレイミド、α－ハロアミド（－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｈａｌ）、エポキシ、α,β不飽和カルボニル、アルキルまたはアリールハライド、アルキルまたはアリールスルホナートが挙げられる。
　「アルデヒドまたはケト反応性基」は、アルデヒドまたはケトンと反応する活性化官能基である。典型的なアルデヒドまたはケト反応性基としては、例えばアリールまたはアルキルアミン、アリールまたはアルキルヒドラジン（－ＮＨＮＨ２）、アリールまたはアルキルアシルヒドラジン（－ＣＯ－ＮＨＮＨ２）、アルキルまたはアリールヒドロキシルアミン（－ＯＮＨ２）、アルキルまたはアリールマグネシウムハライドが挙げられる。
　「アルキルまたはアリールハライド反応性基」は、アルキルまたはアリールハライドと反応する活性化反応性基である。典型的なアルキルまたはアリールハライド活性化反応性基としては、アミン、アルコール、メルカプト、アミド、スルホンアミド、カルボン酸、アルケン、アルキン、ボロン酸、ボロン酸エステル、及びアルキルスズが挙げられる。
　「アルキルまたはアリールスルホナート反応性基」は、アルキルまたはアリールスルホナートと反応する活性化反応性基である。典型的なアルキルまたはアリールスルホナート活性化反応性基としては、アミン、アルコール、メルカプト、アミド、スルホンアミド、カルボン酸、アルケン、アルキン、ボロン酸、ボロン酸エステル、及びアルキルスズが挙げられる。
　「アミド反応性基」は、無置換または置換アミドと反応する活性化反応性基である。典型的なアミド反応性基は、エポキシ、α,β不飽和カルボニル、アルキルまたはアリールハライド、及びアルキルまたはアリールスルホナートが挙げられる。
　「スルホンアミド反応性基」は、無置換または置換スルホンアミドと反応する活性化反応性基である。典型的なスルホンアミド反応性基は、エポキシ、α,β不飽和カルボニル、アルキルまたはアリールハライド、及びアルキルまたはアリールスルホナートが挙げられる。
　「アリール反応性基」は、アリール基と反応する活性化官能基である。典型的なアリール反応性基としては、例えば、４－ヒドロキシベンゼンおよびフタルヒドラジドが挙げられる。
　「ジオール反応性基」は、ジオール基と反応する活性化官能基である。典型的なジオール反応性基としては、例えば、ボロン酸が挙げられる。
　「カルボキシ反応性基」は、カルボキシル基と反応する活性化官能基である。典型的なカルボキシ反応性基としては、例えばハロゲン、アルキルまたはアリールスルホナート、ヒドロキシル、エポキシ、メルカプト、アミノ、イソシアナトおよびカルボジイミドが挙げられる。
　「反応性官能基」は、特に言及がない限り、保護されていない遊離官能基を指す。具体的には、反応性官能基は、―ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＣＨ＝ＣＨ－，－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ＝ＣＨ－、アルキル、ビニルまたはアリールハライド、アルキル，ビニルまたはアリールスルホナート、アルキニル、アジド、エポキシおよびクリックタグからなる群から選択することができる。
　反応性官能基を活性化するために使用される活性化試薬の例としては、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３－ヒドロキシ－３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン（ＨＯＯＢｔ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、２－（１Ｈ－７－アザベンズトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン－３－オキシテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＤＴＵ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス－（ピロリジノ）－ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢｏｐ）、（３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン－３－オキシ）ジエチルホスファート（ＤＥＰＢｔ）、３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン－３－オキシトリス－（ピロリジノ）－ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰＤＯＰ）、２－（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）－１，３－ジメチル－２－ピロリジン－１－イル－１，３，２－ジアザホスホリジニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＭＰ）、５－（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）－３，４－ジヒドロ－１－メチル２Ｈ－ピロリウムヘキサクロロアンチモナート（ＡＯＭＰ）、（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＡＯＰ）、５－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－３，４－ジヒドロ－１－メチル２Ｈ－ピロリウムヘキサクロロアンチモナート：Ｎ－オキシド（ＢＤＭＰ）、２－ブロモ－３－エチル－４－メチルチアゾリウムテトラフルオロボラート（ＢＥＭＴ）、２－ブロモ－１－エチルピリジニウムテトラフルオロボラート（ＢＥＰ）、２－ブロモ－１－エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモナート（ＢＥＰＨ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルメタンイミニウムヘキサクロロアンチモナート（ＢＯＭＩ）、Ｎ、Ｎ’ －ビス（２－オキソ－３－オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢＯＰ－Ｃｌ）、１－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）フェニルメチレンピロリジニウムヘキサクロロ－アンチモナート（ＢＰＭＰ）、１，１，３，３－ビス（テトラメチレン）フルオロウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＴＦＦＨ）、４－（クロロ―４－モルホリニルメチレン）モルホリニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＭＭＭ）、２－クロロ－１，３－ジメチル－１Ｈ－ベンズイミダゾリウムヘキサフルオロホスファート（ＣＭＢＩ）、２－フルオロ－１－エチルピリジニウムテトラフルオロボラート（ＦＥＰ）、２－フルオロ－１－エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモナート（ＦＥＰＨ）、１－（１－ピロリジニル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－１－イルメチレン）ピロリジニウムヘキサフルオロ－ホスファートＮ－オキシド（ＨＡＰｙＵ）、Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ビス－（ペンタメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＰｉｐＵ）、Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）Ｎ，Ｎ，Ｎ０，Ｎ０－ビス（テトラメチレン）ウリニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＰｙＵ）、（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＡＯＰ）、ブロモ－トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢｒＯｐ）、クロロ－トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＣｌＯＰ）、１，１，３，３－ビス（テトラメチレン）クロロウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＣｌＵ）、テトラメチルフルオロ－マミジニウムヘキサフルオロホスファート（ＴＦＦＨ）、トリホスゲン、トリアジン系試薬［塩化シアヌル、フッ化シアヌル、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）、２－クロロ－４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン（ＣＤＭＴ）］、ビス（２－クロロフェニル）ホスホロクロリダート、ジフェニルホスホロクロリダート、ジフェニルホスホロアジド（ＤＰＰＡ）、N－[1－(シアノ－2－エトキシ－2－オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ(モルホリノ)]ウロニウム　ヘキサフルオロリン酸（COMU)、 塩基、ルイス酸、酢酸パラジウム、1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン，硫酸銅、(トリス(2－カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP)、アスコルビン酸ナトリウム、トリス[(1－ベンジル－1H－1,2,3－トリアゾール－4－イル)メチル]アミン（TBTA)、トリス(2-ベンゾイミダゾリルメチル)アミン、3,3′,3′′－(4,4′,4′′－(ニトリロトリス(メチレン))トリス(1H－1,2,3－トリアゾール－4,1-ジイル))トリス(プロパン-1-オール)およびこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
　当業者であれば、選択されたリガンドとのカップリングのためにどのリガンド反応性基を選択すべきかは容易に理解することができ、前述するなかから適宜選択して使用することができる。
　好ましい態様において、リガンド結合部位（Ａ）は、アミン反応性基、ヒドロキシル反応性基、チオール反応性基、アルデヒドまたはケト反応性基、アルキルまたはアリールハライド反応性基、アルキルまたはアリールスルホナート反応性基、アミド反応性基、スルホンアミド反応性基、アリール反応性基、ジオール反応性基及びカルボキシ反応性基からなる群から選択される活性化官能基である。特に好ましくは、アリール－またはアルキル－活性化カルボン酸エステル－ＣＯＯＲ、例えば下式で示されるＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （式中、＊は隣接する基との結合部位を意味する。）
　また、他の好ましい態様において、リガンド結合部位（Ａ）は、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＣＨ＝ＣＨ－、－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ＝ＣＨ－、アルキル、ビニルまたはアリールハライド、アルキル、ビニルまたはアリールスルホナート、アルキニル、アジド、エポキシおよびクリックタグからなる群から選択される反応性官能基である。クリックタグとは、生体直交型反応に用いられる官能基であり、例えばジフェニルホスフィニルフェニル、１，２，４，５－テトラジンー３－イル、trans-シクロオクテニル、ノルボルネニル、シクロプロペニル、ボロノビニル、ボロノアリール、ハロゲン化アリール、及びが挙げられる。
（反応性部位：Ｄ）
　本発明の四官能性化合物におけるもう1つの機能性部位である反応性部位（Ｄ）は、標的タンパク質と共有結合を形成することができる基である。かかる基としては、上記作用を有する基であれば特に制限されないが、好ましくは簡便な反応条件下で共有結合を形成する基である。かかる基として、例えば、2-アリール-5-カルボニルテトラゾール（ACT）、フェニルアジド、ジアジリン、α－ケトアミド、４－ヒドロキシベンゼン、フタルヒドラジド及びベンゾフェノンからなる群より選択される少なくとも１つの化合物の構造（moiety）を有する基を挙げることができる。なお、ACTはタンパク質の主にカルボキシル基と、またフェニルアジドはタンパク質の主にアミノ基と共有結合することができる。４－ヒドロキシベンゼンおよびフタルヒドラジドはタンパク質の主に４－ヒドロキシフェニル基と共有結合することができる。またジアジリン、α－ケトアミドおよびベンゾフェノンはタンパク質と非特異的に共有結合を形成することができる。
　好ましい基は、下式（２）で示されるACTの構造を有する基である：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 （式中、＊は隣接する基との結合部位であることを意味する。ｎは０または１を意味する。ｎが０とはベンゼン環に配位する基がないこと、つまり、ＡＣＴが本発明の四官能性化合物の末端に位置することを意味する。ｎが１である場合、隣接する基との結合は、ベンゼン環に配位するテトラゾール基に対して、オルト位、メタ位またはパラ位のいずれでもよいが、好ましくはパラ位である。）
　前記において、簡便な反応としては紫外線照射を挙げることができる。照射する紫外線の波長および照射時間は、本発明の四官能性化合物の反応性部位と標的タンパク質とが共有結合を形成する条件であれば特に限定されない。好ましい波長は254～365nmであり、より好ましくは302nmである。好ましい照射時間は1秒から10分であり、より好ましくは30秒から5分であり、さらに好ましくは1分である。
　別の好ましい基は、下式（２´）で示されるジアジリンの構造を有する基である：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （式中、＊は隣接する基との結合部位であることを意味する。）
　前記において、簡便な反応としては紫外線照射を挙げることができる。照射する紫外線の波長および照射時間は、本発明の四官能性化合物の反応性部位と標的タンパク質とが共有結合を形成する条件であれば特に限定されない。好ましい波長は254～380nmであり、より好ましくは365nmである。好ましい照射時間は5分から30分であり、より好ましくは10分から20分であり、さらに好ましくは15分である。
（切断可能部位：Ｅ）
　本発明の四官能性化合物におけるもう1つの機能性部位である切断可能部位（Ｅ）は、特定の条件下にて開裂することができる基である。かかる基としては、上記作用を有する基であれば特に制限されないが、好ましくは緩和な反応条件下で開裂する基である。かかる基として、例えば、1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキ-1-イリデン)エチル（Dde）、レブリノイルエステル、ビシナルジオール（vicinal diol）、ジアゾベンゼン、ビスアリールヒドラゾン、ジアルコキシジフェニルシラン、ジスルフィド、ENLYFQG（配列番号１）の配列からなるペプチド、及びENLYFQS（配列番号２）の配列からなるペプチドよりなる群から選択される少なくとも１つの化合物の構造（moiety）を有する基、またはジスルフィド基を挙げることができる。好ましくは、下式（３）で示されるDdeの構造を有する基である：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、各々独立して水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。好ましくはＲ１及びＲ２がアルキル基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が水素原子である態様である。ここでアルキル基として、好ましくは炭素数１～３のアルキル基であり、より好ましくはメチル基である。＊は、隣接する基との結合を意味する。）
　前記において穏和な反応条件とは、その処理によって捕捉したタンパク質が分解せず、またアビジンビーズに非特異的に結合した夾雑タンパク質が溶出しない条件である。具体的には切断可能部位（Ｅ）を化学的あるいは生化学的に切断する条件を挙げることができ、例えば希薄ヒドラジン水溶液，希薄過ヨウ素酸ナトリウム水溶液，希薄亜ジチオン酸ナトリウム水溶液，希薄ギ酸溶液、tabacco etch virus（TEV）プロテアーゼ溶液、希薄(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン水溶液及び希薄ジチオトレイトール水溶液による処理を挙げることができる。より好ましくは希薄ヒドラジン水溶液である。なお、ここで希薄とは、制限されないものの、５質量％以下、好ましくは３質量％以下の濃度を意味する。
（ビオチン部位：Ｂ）
　本発明の四官能性化合物におけるもう1つの機能性部位であるビオチン部位（Ｅ）は、下式（１）で示されるビオチンの構造を有する基である：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （式中、＊は、隣接する基との結合を意味する。）
　当該ビオチン部位は、アビジンまたはストレプトアビジンが結合した固体支持体（例えば、磁性粒子、ビーズ、プレート、フィルター、膜、クロマトグラフィー用樹脂など）に特異的に結合することができるタグである。当該ビオチン部位は、標的タンパク質を、検出、同定または精製をする場面において有効に機能する。
（スペーサー）
　前述する４つの機能性官能基部位が、互いに各々独立したスペーサーを介して連結することで、本発明の四官能性化合物は形成されている。ここで４つの機能性官能基部位を連結するスペーサーとしては、直鎖または分岐鎖状の炭素数１以上のアルキレン基、並びに、直鎖または分岐鎖状の炭素数３以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、－ＮＲａ－ＣＯ－、下記式（１－１）で示される基、及び下記式（１－２）で示される基からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。当該架橋基は、アルキレン鎖内の－ＣＨ２－基またはアルキレン鎖の末端の－ＣＨ２－基を置換することができる。Ｒａは、好ましくは水素原子である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （式中、ｍは０又は１を、ｎは１又は２を意味する。）
　上記式（１－１）で示される基又は式（１－２）で示される基の具体例として、下記式（１－３）～式（１－１６）を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　スペーサーは、立体的な混雑が最小限に抑えられ、前述する４つの機能性官能基の作用が損なわれないように、その種類及び長さを選択することができる。この限りにおいて、アルキレン基の炭素数（アルキレン鎖長）は制限されないものの、好ましくは炭素数１～２０であり、より好ましくは炭素数２～１０を例示することができる。
　本発明の四官能性化合物には、下式（Ｉ）で示される直鎖状の化合物、及び下式（ＩＩ）で示される分岐鎖状の化合物が含まれる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　（ＩＩ－１）直鎖状の四官能性化合物、及び四官能性ケミカルプローブ
　式（Ｉ）において、Ａで示されるリガンド結合部位、Ｄで示される反応性部位、Ｅで示される切断可能部位、及びＢで示されるビオチン部位は、前述した通りである。式（Ｉ）において、Ｓ１、Ｓ２及びＳ３で示される部位はお互いに独立したスペーサー基である。
　Ｓ１で示されるスペーサー基としては、下式（５）で示される基を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 （式中、ａは０～１０の整数、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ及びｈは、各々独立して、０～６から選択される整数である。）
　Ｓ１の１つの態様として、炭素数１以上の直鎖状のアルキレン基を挙げることができる。これは、式（５）において、ｇ、ｃ及びｈが０であり、ａが１以上の整数である場合に該当する。ａは１以上の整数であればよいが、好ましくは１～３０であり、より好ましくは１～１０である。
　Ｓ１の別の態様として、直鎖状の炭素数３以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、及び－ＮＲａ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－Ｏ－、－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては３～４０、好ましくは１０～３５を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、式（５）において、ｇが０、ａ、ｂ、ｄ及びｅが２、ｃ及びｆが４、ｈが１である場合、並びにｇ、ｃ及びｆが０、ａが３、ｄが４、ｈが１である場合を例示することができる。
　Ｓ２及びＳ３で示されるスペーサー基としては、互いに独立して、下式（６）で示される基を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 （式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ及びｈは、各々独立して、０～６から選択される整数である。また、ｉは、０または１である。但し、ａとｃとｈとｉが同時に０になることはない。）
　Ｓ２の１つの態様として、直鎖状の炭素数１以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、及び－ＮＲａ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－Ｏ－、－ＮＨ－、及び－ＮＨ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては１～２０、好ましくは１～５を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、式（６）において、例えばａ及びｃが０、ｄが３、ｆ及びｇが０、ｉが１である場合を例示することができる。
　Ｓ３の１つの態様として、直鎖状の炭素数３以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、及び－ＮＲａ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－Ｏ－、及び－ＮＨ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては３～２０、好ましくは５～１５を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、式（６）において、例えばａ及びｂが２，ｃが４、及びｈとｉが０である場合を例示することができる。
　直鎖状の四官能性化合物の分子量は、リガンド結合部位にリガンドを結合した状態（つまり、四官能性ケミカルプローブ）として、当該リガンドと親和性の高いタンパク質を適切に配位できるものであればよく、制限されないものの、通常５００～３０００である。好ましくは８００～２０００であり、より好ましくは１０００～１５００である。このような分子量を有することで、膜透過性を抑えることができる。また各種リガンドの細胞膜透過性について論じた文献（Methods Mol Biol. 2015 ; 1266: 29－53）によると、膜透過性を抑えるためには、水素結合供与基数は6以上、水素結合受容基数は15以上、または極性表面積は140Å2以上、さらに好ましくは300Å2以上であることが望ましいと考えられる。後述する本発明の四官能性化合物及び四官能性ケミカルプローブは、水素結合供与基数６～９、水素結合受容基数１５～２８、極性表面積300Å2以上である。また、近年では分子量よりは分子サイズに膜透過性が依存するとされている。中分子では環状ペプチドで実測されている例があり、分子サイズ800Å以上で膜透過性が減弱し、1000Å以下で極端に減弱することが知られている。後述する本発明の四官能性化合物及び四官能性ケミカルプローブは、分子サイズが900Å以上である。また前記の文献では回転可能結合数が10以下で膜透過性がよいとされている。つまり、膜透過性を抑えるための回転可能な結合数は10以上、さらに好ましくは30以上が望ましいと考えられる。本発明の四官能性化合物及び四官能性ケミカルプローブの回転可能結合数は３３～６０である。このようにデザインされた本発明の四官能性ケミカルプローブは細胞膜の透過性が抑制されており膜透過ができないため、膜タンパクと効率的に配位することができる。
　以下に直鎖状の四官能性化合物のうち、リガンド結合部位がＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基（NHSエステル基）である化合物の製造方法を、化合物（CPA-306）（製造例１５参照）を一例として説明する。なお、リガンド結合部位がNHSエステル基である化合物によれば、当該リガンド結合部位に抗体を結合させることで、標的タンパク質として特定の抗原を認識結合することができる抗体プローブを調製することができる。
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
［リガンド結合部位がNHSエステル基である直鎖状四官能性化合物の製造方法］（例）
Figure WO-DOC-CHEMICAL-18
Figure WO-DOC-CHEMICAL-18a
（式中、ｑは、それぞれ独立して０～６の整数を意味する。）
（第一工程）
　本工程は、PEG-NH2およびアリルアルコールを、塩化チオニル存在下、無溶媒または反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第二工程）
　本工程は、第一工程で得られた化合物および2-アリール-5-カルボキシテトラゾール（ACT）を、N-[1-(Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylideneaminooxy)dimethylamino(morpholino)]uronium hexafluorophosphate （COMU）およびアミンの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第三工程）脱保護
　本工程は、第二工程で得られた化合物をモルホリンおよびパラジウム化合物存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行される。
（第四工程）側鎖延長
　本工程は、第一工程及び第三工程で得られた化合物を、COMUおよびアミン存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第五工程）脱保護
　本工程は、第四工程で得られた化合物および脱保護剤を、反応に不活性な反応溶媒中で通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第六工程）
　本工程は、第五工程で得られた化合物と脱保護化合物とをアミン存在下、反応に不活性な反応溶媒中で通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第七工程）脱保護
　本工程は、第六工程で得られた化合物を1,3-ジメチルバルビツル酸およびパラジウム化合物存在下、反応に不活性な反応溶媒中で通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第八工程）　
　本工程は、第七工程で得られた化合物およびN-ヒドロキシスクシンイミドをカルボジイミド（WSC）存在下、反応に不活性な反応溶媒中で通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
　このようにして調製される直鎖状四官能性化合物のリガンド結合部位（NHSエステル基）に、所望の抗体を結合させる方法は、公知の方法に従って行うことができ、斯くして、本発明の直鎖状四官能性ケミカルプローブを製造することができる。制限されないものの、所望の抗体をNHSエステル基に結合させる方法としては、下記の方法を例示することができる。
（四官能性化合物の抗体ラベル化方法）
　標的タンパク質に親和性を有する所望の抗体を、慣用のNHSラベリングバッファーで濃度を調製した後に、本発明の四官能性化合物を加え、0～37℃の温度条件で5～60分間程度反応させる。次に、リジン溶液を加え、0～37℃で5～60分間程度反応させる。斯くして、本発明の四官能性化合物のリガンド結合部位（NHSエステル基）に所望の抗体が結合した直鎖状四官能性ケミカルプローブ（ラベル化抗体）を得ることができる。
　一方、直鎖状の四官能性化合物のうち、リガンド結合部位がNHSエステル基以外のリガンド反応性基である化合物は、直接、リガンド結合部位に所望のリガンドを結合させた状態に、つまり四官能性ケミカルプローブとして、製造することができる。以下に、その製造方法の一例を説明する。
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
［直鎖状四官能性ケミカルプローブの製造方法］（例）
[第一工程]
Figure WO-DOC-CHEMICAL-19
（式中、ｒは１～６の整数を意味する。Ｒ１及びＲ２は前述の通り。）　　
　本工程は、化合物1-1、カルボジイミドおよびシクロヘキサン-1,3-ジオンを、N,N-ジメチル-4-アミノピリジン（DMAP）の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
[第二及び三工程]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-20
　　（式中、ｍは１～６の整数を意味する。）　　
（第二工程）
　本工程は、化合物1-3および化合物1-4を、COMUおよびアミンの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第三工程）
　本工程は、化合物1-5を塩基の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
（第四工程）
Figure WO-DOC-CHEMICAL-21
（式中、ｓは１～１０の整数を意味する。ｍは前記と同じ）　　
　本工程は、化合物1-7および第三工程で得られた化合物1-6を、HATUおよびアミン存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
（第五工程）
Figure WO-DOC-CHEMICAL-22
（式中、ｍ、ｒ、ｓ、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ）　　
本工程は、第四工程で得られた化合物1-8を、弱酸存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌して濃縮操作を行った後、第一工程で得られた化合物1-2とアミン存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。この反応に使用できる「弱酸」は、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、シュウ酸等が挙げられる。また、この反応に使用できる「アミン」としては、ジイソプロピルエチルアミン、及びトリエチルアミン等が挙げられる。
　斯くして製造される化合物1-9は、本発明の四官能性化合物のリガンド結合部位に所望のリガンドが結合されており、四官能性ケミカルプローブとして使用することができる。なお、ここでリガンドとしては、抗体を除く、前述のものを制限なく例示することができる。
　（ＩＩ－２）分岐鎖状の四官能性化合物、及び四官能性ケミカルプローブ
　前述する式（ＩＩ）において、Ａで示されるリガンド結合部位、Ｄで示される反応性部位、Ｅで示される切断可能部位、及びＢで示されるビオチン部位は、前述した通りである。また式（ＩＩ）において、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６及びＳ７で示される部位はお互いに独立したスペーサー基である。
　Ｓ４で示されるスペーサー基としては、下式（７）で示される基を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 　式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ及びｉは、各々独立して、０～６から選択される整数である。但し、ａとｃとｉが同時に０になることはなく、またｄとｆとｇが同時に０になることはない。
　Ｓ４の１つの態様として、直鎖状の炭素数３以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、及び－ＮＲａ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－Ｏ－、及び－ＮＨ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては１～２０、好ましくは１～１５、より好ましくは３～１０を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、上記式において、例えばａが２、ｂが２，ｃが２、ｈが０、及びｉが０である場合を例示することができる。
　Ｓ５で示されるスペーサー基としては、下式（８）～（１０）で示される基を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 （式中、ｗ、ｘ、ｙ、及びｚは、各々独立して、０～６から選択される整数である。但し、ｘ及びｙが同時に０になることはない。）
　Ｓ５の１つの態様として、直鎖状の炭素数３以上の（置換基を有する）アルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、及び－ＮＲａ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－ＣＯ－、－ＮＨ－、－ＣＯ－ＮＨ－、及び－ＮＨ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては３～２０、好ましくは３～１５、より好ましくは５～１５を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、上記式（８）において、例えばx及びyが４である場合を例示することができる。
　Ｓ６で示されるスペーサー基としては、下式で示される基を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 （式中、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、各々独立して、０～６から選択される整数である。但し、ａとｃが同時に０になることはない。）
　Ｓ６の１つの態様として、直鎖状の炭素数３以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、及び－ＮＲａ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－Ｏ－、及び－ＮＨ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては３～２０、好ましくは５～１５を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、上記式（１１）において、例えばａが３、ｂが２，ｃが３、及びｄが１である場合を例示することができる。
　Ｓ７で示されるスペーサー基としては、下式で示される基を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 （式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ及びｈは、各々独立して、０～６から選択される整数である。但し、ａとｃが同時に０になることはなく、またａとｃとｇとｈが同時に０になることはない。）
　Ｓ７の１つの態様として、直鎖状の炭素数３以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、及び－ＮＲａ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－Ｏ－、－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては３～４０、好ましくは３～３０、より好ましくは３～２０を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、上記式において、例えばｇが０、ａが５、ｃが０、ｄが２、ｆが０、ｈが１である場合 を例示することができる。
　Ｓ７で示されるスペーサー基の別の態様としては、下式で示される基を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 （式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇは、各々独立して、０～６から選択される整数である。但し、ａとｃが同時に０になることはなく、またａとｃとｈが同時に０になることはない。）
　Ｓ７の１つの態様として、直鎖状の炭素数３以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、－ＮＲａ－ＣＯ－、下記式（１－１）で示される基、及び下記式（１－２）で示される基からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、下記式（１－３）で示される基、下記式（１－７）で示される基、及び下記式（１－１５）で示される基からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては３～４０、好ましくは３～３０、より好ましくは３～２０を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、上記式（１３）において、例えばｇが０、ａが５、ｃが０、ｄが２、ｆが０、ｈが１である場合を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 （式中、ｍは０又は１を、ｎは１又は２を意味する。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　分岐鎖状の四官能性化合物の分子量は、リガンド結合部位にリガンドを結合した状態（つまり、四官能性ケミカルプローブ）として、当該リガンドと親和性の高いタンパク質を適切に配位できるものであればよく、制限されないものの、通常５００～３０００である。好ましくは８００～２０００であり、より好ましくは１０００～１５００である。このような分子量を有することで、膜透過性を抑えることができる。また各種リガンドの細胞膜透過性について論じた文献（Methods Mol Biol. 2015 ; 1266: 29－53）によると、膜透過性を抑えるためには、水素結合供与基数は6以上、水素結合受容基数は15以上、または極性表面積は140Å2以上、さらに好ましくは300Å2以上であることが望ましいと考えられる。後述する本発明の四官能性化合物及び四官能性ケミカルプローブは、水素結合供与基数６～９、水素結合受容基数１５～２８、極性表面積300Å以上である。また、近年では分子量よりは分子サイズに膜透過性が依存するとされている。中分子では環状ペプチドで実測されている例があり、分子サイズ800Å以上で膜透過性が減弱し、1000Å以下で極端に減弱することが知られている。後述する本発明の四官能性化合物及び四官能性ケミカルプローブは、分子サイズが900Å以上である。また前記の文献では回転可能結合数が10以下で膜透過性がよいとされている。つまり、膜透過性を抑えるための回転可能な結合数は10以上、さらに好ましくは30以上が望ましいと考えられる。本発明の四官能性化合物及び四官能性ケミカルプローブの回転可能結合数は３３～６０である。このようにデザインされた本発明の四官能性ケミカルプローブは細胞膜の透過性が抑制されており膜透過ができないため、膜タンパクと効率的に配位することができる。
　以下に分岐鎖状の四官能性化合物のうち、リガンド結合部位がＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基（NHSエステル基）である化合物の製造方法を、化合物（CPA-306）（製造例１５参照）を一例として説明する。なお、リガンド結合部位がNHSエステル基である化合物によれば、当該リガンド結合部位に抗体を結合させることで、標的タンパク質として特定の抗原を認識結合することができる抗体プローブを調製することができる。
［リガンド結合部位がNHSエステル基である分岐鎖状四官能性化合物の製造方法］（例）
　以下、説明の都合、反応工程を大きく５つに分けて説明する：
［反応工程Ｉ］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 （式中、ｔは０～６の整数、ｖは１～５の整数を意味する。）
（第一工程）
　本工程は、ジアミンおよび酸クロライドを、反応に不活性な反応溶媒中で通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第二工程）
　本工程は、第一工程で保護基が付されたジアミンおよび分岐アミンを有するリンカーを、カルボジイミド（WSC）および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第三工程）
　本工程は、第二工程で得られた化合物を、1,3-ジメチルバルビツル酸およびパラジウム化合物の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第四工程）
　本工程は、第三工程で得られた化合物およびビオチン化合物を、アミン存在下、反応に不活性な反応溶媒中で通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第五工程）
　本工程は、第三工程で得られた化合物を、ピペリジンの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
［反応工程II］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 （式中、ｗは０～６の整数を意味する。）　
（第一工程）
　本工程は、1-アミノアルキルカルボン酸およびアリルアルコールを塩化チオニルの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第二工程）
　本工程は、第一工程で得られた1-アミノアルキルカルボン酸、およびアルキルジカルボン酸無水物を、アミンの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。上記反応に使用するアルキルジカルボン酸無水物は、制限されないものの、例えば、無水コハク酸、グルタル酸無水物、アジピン酸無水物等が挙げられる。
［反応工程III］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 （式中、ｃ及びｄは各々０～６の整数を意味する。）
（第一工程）
　本工程は、BOC保護されたジアミンおよびテトラゾールを含むカルボン酸を、アミンおよびHATUの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第二工程）
　本工程は、第一工程で得られた化合物及び脱保護剤を、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第三工程）
　本工程および第四工程は、リンカー長をさらに延長させる場合の任意の工程である。第二工程で得られた化合物およびアミノ基がBOC保護されたアミノカルボン酸をアミンおよびCOMUの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第四工程）
　本工程は、第三工程で得られた化合物及び脱保護剤を、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
［反応工程IV］
Figure WO-DOC-CHEMICAL-33
（式中、ｔ及びｕはそれぞれ独立して０～６の整数、ｖ、ｗ、Ｒ１、及びＲ２は前述の通り。）
（第一工程）
　本工程は、反応工程II及びIIIで得られた化合物を、水溶性カルボジイミド（WSC）および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第二工程）
　本工程は、第一工程で得られた化合物及び脱保護剤を、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第三工程）
　本工程は、第二工程で得られた化合物およびアルキルジカルボン酸無水物をアミンの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第四工程）
　本工程は、第三工程で得られた化合物およびシクロヘキサンジオンを水溶性カルボジイミド（WSC）およびN,N-ジメチル-4-アミノピリジン（DMAP）の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
［反応工程V］
Figure WO-DOC-CHEMICAL-34
（式中、Ｃ、ｕ、ｖ、ｗ、ｔ、Ｒ１、及びＲ２は前述の通り。）
（第一工程）
　本工程は、反応工程III及びIVでそれぞれ得られた化合物を、アミンの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第二工程）
　本工程は、第一工程で得られた化合物を、パラジウム化合物および1,3-ジメチルバルビツル酸の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第三工程）
　本工程は、第二工程で得られた化合物およびＮ－ヒドロキシスクシンイミドを、カルボジイミド（WSC）の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第四工程）
　本工程は任意の工程であり、リガンド結合部位を変換する工程である。本工程は、第三工程で得られた化合物および6-(ピペラジン-1-イルメチル)ピコリンアルデヒドを、アミン（DIPEA）の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
　このようにして調製される分岐鎖状四官能性化合物のリガンド結合部位（NHSエステル基）に、所望の抗体を結合させる方法は、公知の方法に従って行うことができ、斯くして、本発明の分岐鎖状四官能性ケミカルプローブを製造することができる。制限されないものの、所望の抗体をNHSエステル基に結合させる方法としては、前述する四官能性化合物の抗体ラベル化方法を例示することができる。
　なお、前述する各反応式における各反応において、生成物は反応液のまま、または粗生成物として次反応に用いることもできるが、常法に従って反応混合物から単離することもでき、通常の分離手段により容易に精製することもできる。通常の分離手段としては、例えば、再結晶、蒸留、クロマトグラフィーが挙げられる。
　また各工程における出発原料化合物、中間体化合物および目的化合物（本発明の四官能性化合物、四官能性ケミカルプローブ）には、幾何異性体、立体異性体、光学異性体および互変異性体が含まれる。各種異性体は一般的な光学分割法により分離できる。また、適当な光学活性な原料化合物より製造することもできる。
　なお、本発明の四官能性化合物、及び四官能性ケミカルプローブは、上記の各反応式にて示された合成方法に拘束されるものではなく、それに準ずる方法また別の方法により製造することもできる。また、製造における原料化合物は特に言及していない場合、市販のものを用いてもよく、自体公知の方法またはそれに準ずる方法に従って製造したものを用いてもよい。
　また各工程における出発原料化合物および目的化合物は、適切な塩形態で使用することができる。制限されないものの、これらの塩には、酸付加塩または置換基の種類によっては塩基との塩が含まれる。かかる酸付加塩を形成する酸の例としては、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等）；および有機酸（例えば、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸，クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸等）等が挙げられる。また塩を形成する塩基の例としては、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等）；および有機塩基（例えば、メチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン、グアニジン、ピリジン、ピコリン、コリン等）；およびアンモニウム塩等が挙げられる。また、例えばリジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸と塩を形成してもよい。
（ＩＩ）標的タンパク質の検出方法
　前述する本発明の四官能性ケミカルプローブを用いることで、試料中の標的タンパク質を検出することが可能である。本発明の四官能性ケミカルプローブを用いた標的タンパク質の検出は、制限されないものの、下記の工程を有する方法で実施することができる。
（１）試料中の細胞または組織に四官能性ケミカルプローブを反応させて、四官能性ケミカルプローブ中のリガンドと標的タンパク質とを結合させる工程、
（２）四官能性ケミカルプローブ中の反応性部位（Ｄ）と標的タンパク質との間で共有結合を形成させる工程、
（３）四官能性ケミカルプローブが結合した標的タンパク質を含む画分を精製する工程、（４）四官能性ケミカルプローブ中のビオチン部位をアビジンと結合させて、四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を形成する工程、
（５）形成した四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を、四官能性ケミカルプローブ中の切断可能部位で開裂する工程、
（６）標的タンパク質を検出または同定する工程。
　以下、これらの各工程について説明する：
（１）リガンドとタンパク質とを結合する工程
　本工程は、制限されないものの、標的タンパク質が発現している細胞を5％CO2雰囲気下37℃にて培養して、細胞がコンフルエントになったことを確認した後に、DMSOにて所望の濃度に調製した本発明の四官能性ケミカルプローブを添加し、30～60分間程度、5％CO2雰囲気下37℃にて静置することで実施することができる。
（２）四官能性ケミカルプローブ中の反応性部位（Ｄ）と標的タンパク質との間で共有結合を形成させる工程
　本工程は、制限されないものの、ＵＶクロスリンカーを用いて、波長254～365nm、好ましくは302nmで、1秒～10分間、好ましくは30秒～5分間、さらに好ましくは1分間照射することで実施することができる。
（３）四官能性ケミカルプローブが結合した標的タンパク質を含む画分を精製する工程　本工程は、制限されないものの、一例を挙げると、下記の方法を用いることができる。まず、細胞にTris Homogenate Bufferを加えてホモジナイズした後に、遠心分離する。沈殿物を分離し、Sodium Carbonate Bufferを加えホモジナイズした後に、インキュベートする。遠心分離して、沈殿物を分離することで、四官能性ケミカルプローブが結合した標的タンパク質を含む画分（例えば、膜画分）を精製し、回収することができる。
（４）四官能性ケミカルプローブ中のビオチン部位をアビジンと結合させて、四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を形成する工程
　本工程は、制限されないものの、例えば、上記で回収した画分に、例えば8M Urea含有RIPA bufferを加え、超音波粉砕機を用いて当該画分をバッファーに溶解させる。遠心分離して上清を分離し、例えばストレプトアビジン磁気粒子を加える。斯くして、ケミカルプローブ中のビオチン部位がアビジンと結合して、四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体が形成される。さらに、定法に従って磁気分離を行い、上清を廃棄することで、四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を精製し回収することできる。
（５）形成した四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を、四官能性ケミカルプローブ中の切断可能部位で開裂する工程
　本工程は、制限されないものの、例えば、前記工程で回収した四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体（磁気粒子複合体）に、SDS (sodium dodecyl sulfate)およびヒドラジン水溶液を加え、室温（1～30℃）で30分静置することで実施することができる。この反応により、四官能性ケミカルプローブ中の切断可能部位が開裂し、四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を、標的タンパク質の結合領域とビオチン・アビジン結合領域とに分断することができる。反応液を磁気分離して、上清を得ることで、標的タンパク質の結合領域断片を回収することができる。
（６）標的タンパク質を検出または同定する工程
　標的タンパク質を検出または同定するにあたり、必要に応じて、事前に回収した標的タンパク質の結合領域断片を精製処理や加水分解処理に供してもよい。制限されないものの、具体的には、例えば、得られた上清にジチオトレイオールを加え、15分間70℃で撹拌する。次にヨードアセトアミドを加え、30分間室温で静置する。斯くして得られた溶液にSP3ビーズを添加し、MeCNを加え、18分間インキュベーションする。インキュベーション終了後、磁気分離を行い、上清を廃棄する。ペプチド分解処理は、例えば、上記で回収した残渣にトリプシン溶液を添加し、37℃で12～16時間インキュベーションする。MeCNを添加し、18分間インキュベーションし、磁気分離を行い、上清を廃棄する。残渣にTFA水溶液を添加し、3分間インキュベーションする。磁気分離して、上清を得る。
　斯くして調製したペプチドは脱塩され、高質量精度質量分析計を用いた分析のための適切な緩衝溶液中に再懸濁される。質量分析計は、所定の閾値を超えるイオン信号が、ペプチドの衝突誘起解離（ＣＩＤ）スペクトルまたは高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）スペクトルを生成するためにＭＳからＭＳ／ＭＳモードに切り替えるように装置を自動的に始動させる、データ依存的取得モードで操作される。全てのＭＳ／ＭＳスペクトルを標準タンパク質データベースに対して検索する。
　このようにして得られたペプチドを分析する。この分野で利用可能なこのような化合物を分析するための任意の方法を使用することができ、好ましい方法は質量分析法である。質量分析法の方法は、当業者に周知である（例えば、Ｙａｔｅｓ、Ｊ．Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔ．３３：１－１９（１９９８）；ＫｉｎｔｅｒおよびＳｈｅｒｍａｎ、タンデム質量分析法を用いたタンパク質配列決定および同定（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｕｓｉｎｇ　Ｔａｎｄｅｍ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（２０００）；ＡｅｂｅｒｓｏｌｄおよびＧｏｏｄｌｅｔｔ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：２６９－２９５（２００１）を参照）。高分解能ポリペプチド断片分離のために、分離法としてキャピラリー逆相クロマトグラフィーを使用する液体クロマトグラフィーＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳまたは自動ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用することができる（Ｙａｔｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：５５３－５６９（１９９９））。好ましくは、動的除外を伴うデータ依存性衝突誘起解離（ＣＩＤ）または高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）が、選択される質量分析法として使用される（Ｇｏｏｄｌｅｔｔら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：１１１２－１１１８（２０００）））。このような分析のために、質量分析計は、典型的には、所定の閾値を超えるイオン信号が、ペプチドの衝突誘起解離（ＣＩＤ）スペクトルまたは高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）スペクトルを生成するためにＭＳからＭＳ／ＭＳモードに切り替えるように装置を自動的に始動させる、データ依存的取得モードで操作される。
　タンパク質同定においては，標準アルゴリズム（ＳＥＱＵＥＳＴ、Ｍａｓｃｏｔ、Ｘ！ｔａｎｄｅｍ、MS Aandaなど）を使用して、全てのＭＳ／ＭＳスペクトルを標準タンパク質データベースに対して検索し、偽陽性タンパク質識別率を１％未満に制限するために典型的なフィルタリングを行う。
　１つの実施形態において、試料中の膜タンパク質の濃度を対照試料と定量的に比較してもよい。これは、標的膜ンパク質受容体の特異的濃縮を検出可能にする。この非標識質量分析のために、質量分析の直前の逆相クロマトグラフィーを、質量／電荷比に対して保持時間の特徴をプロットしたＭＳ特徴マップとして表示することができる。質量分析計によって検出されるように、このようなマップ中のペプチドは、所定の時間にわたって明確な同位体パターンで現れ、試料中の存在量に応じて規定されたイオン電流強度で現れる。ペプチドが断片化およびＭＳ／ＭＳ分析によって同定されると、この情報をＭＳマップの特定のペプチドの特徴に割り当てることができ、MaxQuant（Coxら、Nature Biotechnology（２００８）ｖｏｌ．２６ ｐｐ．１３６７－１３７２頁）またはProteome Discoverer（Thermo Fischer scientific）のようなオープンソースまたは商用アルゴリズムを用いた半定量的データ解析と組み合わせることができる。次いで、ペプチド存在量の比率を得るために、異なる試料のＭＳ特徴マップ（例えば、試料対対照）を重ね合わせて比較することができる。膜タンパク質由来の確率論的に標識されたペプチドについては、これらの比は約１のはずであり、リガンドに基づいて特異的に捕捉される膜タンパク質ペプチドは、対照試料に比してより高い値を得る。
　他の実施形態において、代わりの質量分析に基づく定量方法、例えば単一反応モニタリング（ＳＲＭ）、細胞培養物におけるアミノ酸による安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ；例えば、Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）ｖｏｌ．７（９）ｐｐ．６８１－５頁）、質量スペクトルのデータ非依存的取得（ＳＷＡＴＨ　ＭＳ；例えば、Ｇｉｌｌｅｔら、（Ｔａｒｇｅｔｅｄ　Ｄａｔａ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＭＳ／ＭＳ　Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｂｙ　Ｄａｔａ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ：Ａ　Ｎｅｗ　Ｃｏｎｃｅｐｔ　ｆｏｒ　Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ａｎｄ　Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）を参照）、タンデム質量タグ（ＴＭＴ；例えば、Ｄａｙｏｎら、（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ　Ｆｌｕｉｄｓ　ｂｙ　ＭＳ／ＭＳ　ｕｓｉｎｇ　６－Ｐｌｅｘ　Ｉｓｏｂａｒｉｃ　Ｔａｇｓ）を参照）、などを使用することができる。
　ＭＳ分析は、他の分析方法に置き換えることができると考えられる。このような他の方法は、本方法の一部として含まれる。
　本発明のケミカルプローブを用いてプローブ構造の一部が付加されたペプチド配列を質量分析法によって同定することにより、標的タンパク質とリガンドの結合位置を決定することができる。これにより、リガンドとの結合位置を認識することができるため、標的タンパク質の同定をより正確なものにすることができる。さらに、標的タンパク質の検出力を高めたプローブをデザインすることができる。
　本明細書において引用されるすべての特許文献および非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
　本発明は、更に以下の試験例および製造例によって詳しく説明されるが、これらは本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。
　本明細書において、以下の略語を用いることがある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
　以下の実施例中の「室温」は、通常、約10℃～約35℃を示す。混合溶媒において示した比は、特に断らない限り容量比を示す。％は、特に断らない限り質量％を示す。
　1HNMR（プロトン核磁気共鳴スペクトル）は、フーリエ変換型NMR（Bruker AVANCE III 400（400MHz）およびBruker AVANCE III HD（500MHz）の何れか）で測定し、テトラメチルシランを標準物質として用いて測定しスペクトル***パターンを一重項(ｓ)、二重項(ｄ)、三重項(ｔ)、四重項(ｑ)、多重項またはより重複したシグナル(ｍ)、幅広シグナル(ｂｒ)として記載し、溶媒を括弧内に示した。
　またマススペクトルは、Waters社製ACQUITY H-Classと SQD Mass分光計を組み合わせて使用し、エレクトロスプレーイオン化法（ESI)にて測定した。高分解能質量分析（HRMS）はWaters社製 Xevo G2-XS QTof 分光計を用い，エレクトロスプレーイオン化法（ESI)にて測定した。[Ｍ＋Ｈ]＋はモノアイソトピック分子量を意味する。
　実施例のシリカゲルカラムクロマトグラフィーには山善株式会社ハイフラッシュカラムもしくはバイオタージ社SNAP Ultra HP-Sphere 25 μmを使用した。 ODSカラムクロマトグラフィーには山善株式会社オクタデシルC18もしくはバイオタージ社SNAP Ultra C18を使用した。
　試験例で用いた抗CD71抗体OKT9はThermo Fisher Scientific社製（Cat # 16-0719-85)、抗CD71抗体DF1513はAbcam社製（ab212863)、His-Tag EGFはオリエンタル酵母工業株式会社製（47061000)、Goat anti-mouse IgGはSouthernBiotech社製（Cat.1030-01）を使用した。
製造例１：化合物(CPI-003)の製造
　下式に示す方法に従って、化合物（CPI-003）を製造した。
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-35
（1）化合物（CPI-002）の製造
　N-(tert-ブトキシカルボニル)-4-アミノ酪酸 (0.24 g)、上記式に示す化合物(CPI-001) (0.31 g)、COMU (0.55 g)、およびDIPEA (0.44 ml)をDMF (2 mL)を溶解して室温で17時間撹拌したのち、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、目的物（CPI-002）（0.45 g）を得た。　1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ10.31(s, 1H), 8.08 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.86 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.47 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.98 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.71 (m, J = 7.2 Hz, 2H), 1.38 (t, J = 7.1 Hz, 12H) ; 
HRMS (ESI) calcd for C19H27N6O5 419.2043 [M+H] +, found 419.2054.
（2）化合物（CPI-003）の製造
　前記で合成したCPI-002(0.45 g)のMeOH (15 ml)溶液、0.2 M LiOH水溶液 (5.9 mL)を氷冷下添加し、30分間撹拌を行った。反応液にAcOH (0.30μL)を添加後、溶媒を除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、目的物（0.45g）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.30 (s, 1H), 8.06 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 6.86 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 2.98 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.71 (m, J = 7.2 Hz, 2H), 1.38 (s, 9H) ; HRMS (ESI) calcd for C17H23N6O5 391.1730 [M+H] +, found 391.1724.
製造例２：化合物(CPI-005)の製造
　下式に示す方法に従って、化合物（CPI-005）を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　ジメドン(63 mg) 、上記に示す化合物（CPI-004）(0.20 g)、WSC塩酸塩(82 mg)、DMAP(50 mg)、DMF(3 mL)の混合物を室温で14時間攪拌した後、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、目的物（0.14 g）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.82 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.41 (br, 1H), 6.35 (br, 1H ), 4.30 (dd, J = 7.9, 5.0 Hz, 1H), 4.14－4.11 (m, 1H), 3.68 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.52－3.49 (m, 12H), 3.39 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.23 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.18 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 3.11－3.07 (m, 1H), 2.82 (dd, J = 12.5, 5.1 Hz, 1H), 2.63 (s, 2H), 2.57 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.33 (s, 2H), 2.06 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.64－1.57 (m, 1H), 1.54－1.42 (m, 3H), 1.36－1.24 (m, 2H), 1.00 (s, 6H) ; HRMS (ESI) calcd for C29H48N3O9S 614.3111 [M+H] +, found 614.3112.
製造例３：化合物(CPI-104)の製造
　下式に示す方法に従って、化合物（CPI-104）を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
（1）化合物(CPI-102)の製造
　上記に示す化合物（CPI-101）(0.21 g)、1-ブロモ-3-クロロプロパン(5.0 mL)、NMP(5 mL)の混合液をマイクロウェーブ反応装置を使用して、120℃にて6時間反応を行った。反応液に水を加え、AcOEtで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製し、中間体 (0.18 g)を得た。中間体 (0.18 g) 、フタルイミド (0.20 g), 炭酸カリウム (0.19 g)、ヨウ化ナトリウム (14 mg)のDMF (9 mL)懸濁液を70 ℃にて10時間撹拌した。溶媒を留去したのち水を加え、AcOEtで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製し、化合物(0.24 g)を得た。得られた化合物(0.24 g)をDCM (9 mL)に溶解し、クロロアセチルクロリド(0.15 mL)およびトリエチルアミン (0.25 mL)を加えて室温にて2時間撹拌した。反応液に水を加え、DCMで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製して目的物 (0.18 g）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.83-7.69 (m, 6H), 7.63-7.59 (m, 2H), 7.55 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.49-7.45 (m, 3H), 4.15-4.05 (m, 1H), 3.99 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 3.87 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 3.64 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.02-2.95 (m, 1H), 1.82-1.75 (m, 2H) ; 
LC-MS: [M+H] + = 495.04.
（2）化合物(CPI-103)の製造
　前記で合成した化合物（CPI-102）(0.18 g)をEtOH (5 mL)に溶解し、ヘキサメチレンテトラミン(0.10 g)およびAcONH4 (56 mg)を加えて、9時間加熱還流した。ヘキサメチレンテトラミン(51 mg)およびAcONH4 (28 mg)を追加し、9時間加熱還流した。反応液に水を加え、AcOEtで抽出して有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製して目的物(0.14 g)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.83-7.79 (m, 2H), 7.73-7.68 (m, 2H), 7.67-7.64 (m, 2H), 7.50-7.40 (m, 4H), 7.31-7.29 (m, 2H), 4.80 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 4.38 (dt, J = 14.4, 7.9 Hz, 1H), 3.74 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 3.71-3.52 (m, 3H), 1.93 (tt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H) ;
LC-MS: [M+2H] 2+ = 458.08.
（3）化合物(CPI-104)の製造
　前記で合成した化合物（CPI-103）(10 mg）のMeOH溶液 (0.5 mL)に、メチルアミン、40% MeOH溶液(22μL)を加え、室温にて2時間撹拌した。メチルアミン、40% MeOH溶液 (22μL)を追加し、室温にて2時間撹拌した。反応液に水を加え、AcOEtで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (ODS, 水/MeCN)で精製して目的物(1.6 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.66 (d, J = 1.4 Hz, 2H), 7.58-7.45 (m, 6H), 7.24 (t, J = 1.4 Hz, 1H), 4.64 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 4.53-4.43 (m, 1H), 3.86 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 3.82-3.76 (m, 1H), 2.46-2.43 (m, 2H), 1.73-1.53 (m, 2H) ; LC-MS: [M+H] + = 328.17.
製造例４：化合物(CPP-112)の製造
　下式に示す方法に従って、化合物（CPP-112）を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　上記式に示す化合物（CPP-111）(0.44 g)、 塩酸ヒドロキシルアミン(0.18 g)、ピリジン(1.0 ml)、EtOH(20 mL)の混合物を、2時間加熱還流した。溶媒を留去し、残渣を2M塩酸で酸性にして、DCMで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥した。溶媒を留去して、無色油状の粗生成物 (0.51 g)を得た。DMAP(0.26 g)のDCM(15 mL)溶液に氷冷下、塩化チオニル(0.31 ml)を加え、30分撹拌した。氷冷下、前工程で得られた粗生成物(0.51 g)のDCM溶液(5 mL)とDMAP(0.39 g)を加え、室温に昇温して3日間撹拌した。反応液に水を加え、DCMで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して溶媒を留去した。カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製して目的物 (0.30 g)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.94-7.89 (m, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.42-7.37 (m, 2H), 3.92 (s, 3H), 2.84 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.02 (tt, J = 7.3, 7.3 Hz, 2H) ; 
LC-MS: [M+H] + = 204.02.
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
製造例５：化合物（CPP-117）の製造
　下式に示す方法に従って、化合物（CPP-117）を製造した。
Figure WO-DOC-CHEMICAL-39
（1）CPP-114の製造
　上記式に示す化合物（CPP-113）(100 mg)、THF (3 mL)の混合物に-78℃にて1.6M n-ブチルリチウム、n-ヘキサン溶液(0.53 mL)を加えて1時間撹拌した。製造例４で製造した化合物（CPP-112）(84 mg)のTHF溶液(2 mL)を加え、－78℃にて5時間撹拌した。3時間かけて室温に昇温し、室温にて13時間撹拌した。反応液に水を加え、AcOEtで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製して目的物 (48 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.66-7.36 (m, 6H), 7.31-7.13 (brm, 1H), 3.14-2.92 (brm, 3H), 2.90-2.77 (brs, 2H), 2.34 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.00 (tt, J = 6.9, 6.9 Hz, 2H), 1.26 (s, 9H) ;
LC-MS: [M+Na] + = 434.94.
（2）CPP-115の製造
　前記で製造した化合物（CPP-114）(48 mg)のDCM(2mL)溶液に、TFA(0.45ml)を加え、室温にて2時間撹拌し、溶媒を留去した。残渣をDCM(2 mL)で希釈し、TEA(49μL)、クロロアセチルクロリド(28μL)を加えて、室温にて3時間撹拌した。反応液に水を加え、AcOEtで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製した。精製物(38 mg)、ヘキサメチレンテトラミン (33 mg)、AcONH4 (18 mg)、EtOH(2 mL)の混合物を、6時間加熱還流した。溶媒を留去し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製して目的物 (28 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.53 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.41-7.30 (m, 4H), 7.27 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 4.84 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.77 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.40 (s, 3H), 2.88-2.77 (m, 2H), 2.36 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.05-1.97 (m, 2H) ;
 LC-MS: [M+H] + = 352.08.
（3）CPP-116の製造
　前記で製造した化合物（CPP-115）(28 mg)、30%過酸化水素水(0.16 mL)、 K2CO3(11 mg)、DMSO(1 mL)の混合物を、室温にて2時間撹拌した。チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えて撹拌した後、AcOEtで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル, AcOEt/MeOH)で精製して目的物 (28 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.52 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 7.50-7.46 (brm, 1H), 7.37-7.28 (m, 5H), 5.60-5.18 (brm, 2H), 4.82 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.77 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.40 (s, 3H), 2.79-2.65 (m, 2H), 2.23 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.08-1.91 (m, 2H) ;
 LC-MS: [M+H] + = 370.00.
（4）CPP-117の製造
前記で製造した化合物（CPP-116）(28 mg)、四酢酸鉛(40 mg)、t-BuOH (0.72 mL)の混合物を、80℃にて3時間撹拌した。四酢酸鉛(40 mg)を追加し、80℃にて3時間撹拌後、水/AcOEtを加えてセライトろ過した。ろ液をAcOEtで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製して目的物 (19 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.53-7.49 (m, 2H), 7.33-7.28 (m, 5H), 4.83 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.62-4.47 (brs, 1H), 3.77 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.40 (s, 3H), 3.22-3.10 (brm, 2H), 2.68 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.82 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H) ;
 LC-MS: [M+H] + = 442.11.
製造例６：化合物(CPP-124)の製造
　下式に示す方法に従って、化合物（CPP-124）を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
（1）化合物（CPP-122）の製造
　前記式に示す化合物（CPP-121）(0.51 g)、60%NaH(72 mg)、DMF(50 mL)の混合物を、室温にて30分撹拌した。反応液に1-ブロモ-3-クロロプロパン(0.18 mL)を加え、室温にて60時間撹拌した。反応液に水を加えた後、濃縮した。残渣にAcOEtを加え、水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, AcOEt/MeOH)で精製して、目的物（0.45 g）を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.61 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.27 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 8.3, 2.7 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.70 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.63 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.59 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.20 (br, 4H), 2.94 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.73 (br, 4H), 2.64 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.15 (m, J = 6.7 Hz, 2H), 2.04 (m, J = 6.5 Hz, 2H) ; HRMS (ESI) calcd for C27H33N3O2S 498.1982 [M+H] +, found 498.1979.
（2）化合物（CPP-123）の製造
　前記で製造した化合物（CPP-122）（0.45 g）、フタルイミド(0.16 mg)、 K2CO3(0.15 g)、およびNaI(41 mg)のDMF(10 mL)懸濁液を、70℃にて17時間撹拌した。反応液を濃縮し、残渣に水を加えた後、EtOAcで抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, AcOEt/MeOH)で精製して、目的物（0.43 g）を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.84 (d, J = 3.0 Hz, 1H) 7.83 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.41 (dd, J = 5.5, 0.6 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.27 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.98 (dd, J = 8.3, 2.8 Hz, 1H), 6.90 (dd, J = 7.7, 0.6 Hz, 1H), 4.10 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.77 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 3.66 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.57 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.20 (br, 4H), 2.96 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.75 (br, 4H), 2.65 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.07－ 2.01 (m, 4H) ;
HRMS (ESI) calcd for C35H37N4O4S 609.2535 [M+H] +, found 609.2538.
（3）化合物（CPP-124）の製造
　前記で製造した化合物（CPP-123（0.43 g））、ヒドラジン一水和物(0.069 mL)、EtOH(12 mL)の混合物を、8時間加熱還流した。反応液を濃縮し、残渣に1M NaOH水溶液（50 mL）を加えた後、AcOEtで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル, DCM/MeOH)で精製した。精製物をMeOH (10 mL)に溶解し、2M HCl 水溶液(2.1 mL)を滴下して、室温にて15時間撹拌後、溶媒を留去した。残渣にAcOEtを加え、撹拌した後、生じた固体をろ取して、目的物（0.35 g）を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 11.4 (br, 1H), 7.98 (br, 3H), 7.78 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.10 (dd, J = 8.3 , 2.7 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.13 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.66 (br, 2H), 3.57－3.53 (m, 6H), 3.37 (br, under the water signal), 3.27 (t, J = 11.9 Hz, 2H), 2.92 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.82－2.76 (m, 2H), 2.30－2.25 (m, 2H), 1.88 (m, J = 7.3 Hz, 2H) ; 
HRMS (ESI) calcd for C27H35N4O2S 479.2481 [M+H] +, found 479.2482.
製造例７：化合物(CPP-125)の製造
　下式に示す方法に従って、化合物（CPP-125）を製造した。
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-41
　製造例６で製造した化合物（CPP-124）(20 mg), Boc-5-アミノ-n-吉草酸 (7.9 mg), COMU (17 mg) 、DIPEA (27μL)、DMF (1 ml)の混合物を，室温で5時間攪拌し、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、目的物（15 mg）を得た。
1H NMR (500 MH, DMSO-d6) δ 7.78 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.27 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.05 (dd, J = 8.3, 2.6 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.77 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.06 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.50 (t, J = 7.0 Hz, under the water signal), 3.46 (t, J = 6.6 Hz, under the water signal), 3.08－3.03 (m, 6H), 2.91－2.87 (m, 4H), 2.64 (br, 4H), 2.54 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.04 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.93 (m, J = 6.7 Hz, 2H), 1.82 (s, 3H), 1.67 (m, J = 7.0 Hz, 2H), 1.46 (m, J = 7.5 Hz, 2H), 1.36－1.31 (m, 11H) ;HRMS (ESI) calcd for C37H52N5O5S 678.3689 [M+H] +, found 678.3693.
製造例８：化合物(CPF-202)の製造
　下式に示す方法に従って、化合物（CPF-202）を製造した。
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-42
（1）CPF-201の製造
　製造例３で製造した化合物（CPI-104）(9.0 mg)、製造例１で製造した化合物（CPI-003）(11 mg) 、COMU (13 mg)、DIPEA(11μL)、DMF(1 mL)の混合物を、室温にて2時間撹拌した。溶媒を留去し、カラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN, 0.1% AcOH含有)で精製して、目的物 (10 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.57 (s, 1H), 8.13 (dt, J = 9.1, 2.4 Hz, 2H), 7.87 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.64-7.59 (m, 3H), 7.54-7.47 (m, 2H), 7.45-7.39 (m, 3H), 7.30 (d, J = 2.4 Hz), 4.88-4.83 (m, 2H), 4.54-4.47 (m, 1H), 3.81-3.71 (m, 2H), 3.64-3.56 (m, 1H), 3.29 (dt, J = 6.1, 6.1 Hz, 2H), 3.11-3.03 (m, 1H), 2.44-2.41 (m, 2H), 2.00-1.86 (m, 3H), 1.77-1.65 (m, 1H), 1.50 (s, 9H) ; LC-MS: [M+H] + = 700.29.
（2）CPF-202の製造
　前記で製造した化合物（CPF-201）(10 mg)、TFA(0.11 mL)、DCM(1 mL)の混合物を室温で2時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣、製造例２で製造した化合物（CPI-005） (10 mg) 、DIPEA (10μL)、及びDMF (1 mL)の混合物を、60 ℃にて3時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物 (11 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 13.69-13.66 (m, 1H), 9.41 (s, 1H), 8.09 (dt, J = 9.0, 2.4 Hz, 2H), 7.88-7.86 (m, 3H), 7.61-7.59 (m, 2H), 7.54-7.48 (m, 2H), 7.45-7.39 (m, 3H), 7.30 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.44-6.39 (m, 1H), 5.61-5.58 (m, 1H), 4.85 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 4.68 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.53-4.46 (m, 2H), 4.35-4.32 (m, 1H), 3.81-3.48 (m, 20H), 3.37-3.29 (m, 4H), 3.17-3.05 (m, 2H), 2.95-2.90 (m, 1H), 2.72 (dd, J = 12.8, 4.0 Hz, 1H), 2.57 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.34 (s, 4H), 2.14 (dd, J = 7.1, 7.1 Hz, 4H), 1.99-1.91 (m, 1H), 1.77-1.52 (m, 6H), 1.47-1.41 (m, 2H), 1.00 (s, 6H) ; 
LC-MS: [M+H] + = 1195.3.
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
　製造例９：化合物（CPF-212）の製造
Figure WO-DOC-CHEMICAL-43
（1）CPF-211の製造
　製造例５で製造した化合物（CPP-117）(19 mg)のDCM(1 mL)溶液にTFA(0.17 mL)を滴下し、室温にて2時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、中間体化合物 (13 mg)を得た。中間体化合物(13 mg)および製造例１で製造した化合物（CPI-003）(16.78 mg)をDMF(1 mL)に溶解し、COMU(18 mg)、およびDIPEA(0.23 mL)を加えて、室温にて3時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して，目的物 (18 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.62 (s, 1H), 8.14 (dt, J = 9.1, 2.4 Hz, 2H), 7.90-7.87 (m, 2H), 7.53-7.50 (m, 2H), 7.38-7.33 (m, 3H), 7.30 (dd, J = 5.6, 3.1 Hz, 2H), 7.26-7.22 (m, 1H), 4.84-4.82 (m, 2H), 3.77 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.60 (dt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 3.40 (s, 3H), 3.29 (dt, J = 6.1, 6.1 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.44-2.41 (m, 2H), 2.07-2.00 (m, 2H), 1.92-1.86 (m, 2H), 1.50 (s, 9H) ; 
LC-MS: [M+H] + = 714.08.
（2）CPF-212の製造
　前記で製造した化合物(CPF-211)(18 mg)のDCM(1 mL)溶液にTFA(97μL)を滴下して室温にて1.5時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣および製造例２で製造した化合物（CPI-005）(22 mg)のDMF(1 mL)溶液に、DIPEA(18μL)を加えて、60℃にて3時間撹拌した。DIPEA(18μL)を追加し、60℃にてさらに3時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物 (13 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.53 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 10.37 (s, 1H), 9.19 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.06 (dt, J = 9.1, 2.3 Hz, 2H), 7.89 (dt, J = 9.1, 2.3 Hz, 2H), 7.81 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.70 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.42-7.36 (m, 2H), 7.30 (dt, J = 7.4, 1.6 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.40 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.57 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.13-4.10 (m, 1H), 3.78 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 3.63-3.58 (m, 3H), 3.47-3.46 (m, 9H), 3.38-3.05 (m, under the water signal), 2.80 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.71-2.66 (m, 3H), 2.58-2.49 (m, overlapped with the DMSO signal), 2.28 (s, 4H), 2.05 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.97-1.84 (m, 4H), 1.64-1.55 (m, 1H), 1.52-1.40 (m, 3H), 1.32-1.24 (m, 2H), 0.94 (s, 6H) ; LC-MS: [M+H] + = 1209.12.
製造例１０：化合物(CPF-224)の製造
　下式に示す方法に従って、化合物（CPF-224）を製造した。
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-44
（1）化合物（CPF-222）の製造
　製造例１で製造した化合物（CPI-003, 20 mg）および上記式で示した化合物（CPF-221, 23 mg）をDMF（2 mL）に溶解し、COMU(24 mg)およびDIPEA (0.020 mL)を加えて1時間攪拌した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して目的物（33 mg）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.46 (br, 1H), 10.30 (s, 1H), 9.43 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.60 (s, 1H), 7.52 (br, 1H), 6.88－6.83 (m, 3H), 6.28 (dd, J = 2.9, 1.7 Hz, 1H), 5.00 (s, 2H), 4.41 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.13 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.98 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.71 (m, J = 7.3 Hz, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.17 (t, J = 7.1 Hz, 3H) ; 
LC-MS: [M+H] + = 783.31.
（2）化合物（CPF-223）の製造
　前記で合成した化合物（CPF-222）(33 mg)のMeOH(2 ml)溶液に、1M LiOH水溶液 (0.13 mL)、水(0.36 mL) を加え，21時間撹拌を行った。0.1% AcOH水溶液で反応液を中和し、溶液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して目的物（30 mg）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.46 (s, 1H), 10.30 (s, 1H), 9.43 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.88 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.61 (s, 1H), 7.47 (br, 1H), 6.90－6.83 (m, 3H), 6.28 (dd, J = 2.9, 1.7 Hz, 1H), 4.92 (s, 2H), 4.41 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 2.98 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.71 (m, J = 7.2 Hz, 2H), 1.38 (s, 9H) ; 
LC-MS: [M+H] + = 754.99.
（3）化合物（CPF-224）の製造
　前記で合成した化合物（CPF-223）(29 mg)をDCM (3 ml)に溶解し、TFA(0.29 mL)を滴下して室温で2時間攪拌した後、溶液を濃縮した。残渣にDIPEA (27μL)、製造例２で製造した化合物（CBI-455）(39 mg)、DMF(2 mL)を加え、60℃で5時間撹拌した後、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%TFA含有）にて精製して、目的物（17 mg）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.53 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 12.47 (s, 1H), 10.38 (s, 1H), 9.44 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.82 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.49 (br, 1H), 6.90 (br, 1H), 6.84 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 6.41 (br, 1H), 6.35 (br, 1H), 6.28 (dd, J = 2.8, 1.7 Hz, 1H), 4.95 (s, 2H), 4.41 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.30 (dd, J = 7.8, 4.4 Hz, 1H), 4.12 (dd, J = 7.6, 4.4 Hz, 1H), 3.61 (t, J = 6.3 Hz, 4H), 3.49－3.46 (m, under the water signal), 3.30 －3.25 (m, 4H), 3.17 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 3.10－3.06 (m, 1H), 2.81 (dd, J = 12.5, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.47 (t, overlapped with the DMSO signal), 2.28 (s, 4H), 2.05 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.93 (m, J = 6.9 Hz, 2H), 1.60－1.55 (m, 1H), 1.53－1.40 (m, 3H), 1.33－1.23 (m, 2H)), 0.94 (s, 6H) ; 
HRMS (ESI) calcd for C57H71N13O14F3S 1250.4916 [M+H] +, found 1250.4919..
製造例１１：化合物(CPF-232)の製造
　下式に示す方法に従って、化合物（CPF-232）を製造した。
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-45
（1）化合物（CPF-231）の製造
　製造例６で製造した化合物（CPP-124，40 mg）および製造例１で製造した化合物（CPI-003, 26 mg）をDMF(2 ml)で希釈し、HATU (26 mg) およびDIPEA (0.036 ml)を加えて5時間撹拌した後、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%TFA含有）で精製して、目的物（50 mg）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.96 (br, 1H), 10.30 (s, 1H), 9.16 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.30 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.07 (dd, J = 8.3, 2.7 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.86 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.10 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.62－3.51 (m, 6H), 3.38－3.35 (m, under the water signal), 3.10 (br, 2H), 2.98 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.92 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.08 (br, 2H), 1.91 (s, 3H), 1.86 (m, J = 7.0 Hz, 2H), 1.72 (m, J = 7.2 Hz, 2H) ; LC-MS: [M+H] + = 609.52
（2）化合物（CPF-232）の製造
前記で製造した化合物（CPF-231）(19 mg)をDCM (2 mL) に溶解し、TFA(0.16 mL)を滴下して室温で1時間撹拌した後、反応液を濃縮した。残渣に製造例２で製造した化合物(CPI-005(15 mg))、DIPEA(17μL)、およびDMF(2 ml)を加え、60℃で2時間撹拌した後、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーODS，水/MeCN, 0.1%TFA含有）で精製して（8.7 mg）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.53 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 10.38 (s, 1H), 9.51 (br, 1H ), 9.17 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.81 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.25 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.08 (dd, J = 8.3, 2.7 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.41 (br, 1H), 6.36 (br, 1H ), 4.29 (dd, J = 7.8, 4.9 Hz, 1H), 4.14－4.10 (m, 3H), 3.70 (br, 2H), 3.62－3.55 (m, under the water signal), 3.41－3.34 (m, under the water signal), 3.27 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.16 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 3.10－3.06 (m, 3H), 2.92 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.80 (dd, J = 12.3, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.28 (s, 4H), 2.22－2.17 (m, 2H), 2.05 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.93 (m, J = 7.1 Hz, 2H), 1.86 (m, J = 6.8 Hz, 2H), 1.63－1.56 (m, 1H), 1.51－1.40 (m, 3H), 1.33－1.22 (m, 2H), 0.94 (s, 6H) ; HRMS (ESI) calcd for C68H92N13O12S2 1346.6429 [M+H] +, found 1346.6445.
製造例１２：化合物(CPP-127)の製造
　下式に示す方法に従って、化合物（CPP-127）を製造した。
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-46
（1）化合物(CPP-126)の製造
　製造例７で製造した化合物（CPP-125, 15 mg）をDCM (3 mL)に溶解し、TFA (0.15μL)、を滴下して室温で2時間撹拌後、反応液を濃縮した。残渣を製造例１で製造した化合物(CPI-003(9.1 mg))、DMF(2 ml)で希釈し、COMU(9.35 mg)、およびDIPEA (15μL) を加え、1時間室温にて撹拌した後、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、目的物（16 mg）を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.94 (br, 1H), 10.29 (s, 1H), 9.14 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.87 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.81 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.69 (br, 1H), 7.61 (br, 1H ), 7.41－7.38 (m, 2H), 7.28 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.04 (dd, J = 8.5, 2.7 Hz, 1H), 6.90 (br, 1H), 6.86 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.05 (br, 2H), 3.50 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.46 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.09－3.04 (m, 6H), 2.98 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.87 (ｔ, J = 6.7 Hz, 2H), 2.64（br，4H），2.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.10 (br, 2H), 1.94 (br, 2H), 1.91 (s, 3H), 1.71 (m, J = 7.2 Hz, 2H), 1.67 (m, J = 7.0 Hz, 2H), 1.55 (br, 4H), 1.37 (s, 9H) ;
HRMS (ESI) calcd for C49H64N11O7S 950.4711 [M+H] +, found 950.4713.
（2）化合物(CPP-127)の製造
　前記で製造した化合物（CPP-126）(14 mg)をDCM (5 ml)に溶解し、TFA(0.23 mL)を滴下して室温で12時間撹拌した後、反応液を濃縮した。残渣に製造例２で製造した化合物(CPI-005(9.2 mg))、DIPEA (12μL)、DMF (2 mL)を加え、60℃で2時間撹拌した後、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%TFA含有）で精製して、目的物（13 mg）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.53 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 10.38 (s, 1H), 9.63 (br, 1H), 9.15 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.88 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.84－7.81 (m, 2H), 7.78 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.51 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.06 (dd, J = 8.4, 2.8 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.41 (br, 1H), 6.36 (br, 1H), 4.29 (dd, J = 7.9, 4.9 Hz, 1H), 4.13－4.10 (m, under the water signal), 3.70 (br, 2H), 3.62－3.58 (m, 6H), 3.52－3.49 (m, 4H), 3.47－3.46 (m, 12H), 3.41 (br, 4H), 3.37 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.32 (br, 2H), 3.27 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.17 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 3.11－3.04 (m, 5H), 2.88 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 2.48 (d, overlapped with the DMSO signal), 2.28 (s, 4H), 2.22－2.17 (m, 2H), 2.11 (br, 2H), 2.05 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.93 (m, J = 7.0 Hz, 2H), 1.68 (m, J = 6.9 Hz, 2H), 1.62－1.41 (m, 8H), 1.33－1.23 (m, 2H), 0.94 (s, 6H) ; HRMS (ESI) calcd for C73H101N14O13S2 1445.7114 [M+H] +, found 1445.7126.
製造例１３：化合物(CPP-133)の製造
　下式に示す方法に従って、化合物（CPP-133）を製造した。
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-47
（1）CPP-132の製造
　化合物（CPP-131）(15 mg)および製造例１で製造した化合物（CPI-003）(16 mg) をDMF溶液(1 mL)に溶解し、COMU(19 mg)およびDIPEA(15μL)を加えて、室温にて20時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (ODS, 水/MeCN)で精製し、目的物(22 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.30 (s, 1H), 9.11 (s, 1H), 8.10 (dt, J = 9.1, 2.4 Hz, 2H), 7.85 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.31-7.25 (m, 2H), 7.05 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.01 (td, J = 7.5, 0.9 Hz, 1H), 6.86 (dd, J = 7.7, 0.7 Hz, 1H), 6.82 (dd, J = 8.3, 2.4 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.21 (s, 1H), 4.87-4.78 (brm, 1H), 3.70 (dt, J = 5.6, 5.6 Hz, 2H), 3.66-3.50 (brs, 4H), 3.28 (dt, J = 6.0, 6.0 Hz, 2H), 2.67-2.64 (m, 6H), 2.43-2.40 (m, 2H), 1.93-1.84 (m, 4H), 1.48 (s, 9H); LC-MS: [M+H] + = 742.29.
（2）CPP-133の製造
　上記で製造した化合物（CPP-132）(22 mg)をDCM(1 mL)に希釈し、TFA(0.11 mL)を滴下して室温にて20時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣に製造例２で製造した化合物（CPI-005）(18 mg)、DIPEA (21μL)およびDMF(1.5 mL)を加え、60℃にて3時間撹拌した。DIPEA(26μL)を追加し、60℃にてさらに1時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN, 0.1% AcOHを含む)で精製して目的物 (16 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 13.73-13.66 (brm, 1H), 9.28-9.16 (brm, 2H), 8.06 (dt, J = 9.1, 2.4 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.31-7.26 (m, 2H), 7.04 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.00 (td, J = 7.5, 0.9 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.81 (dd, J = 8.3, 2.4 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.49-6.39 (brs, 1H), 5.58 (s, 1H), 5.39 (s, 1H), 4.65 (s, 1H), 4.52-4.49 (m, 1H), 4.34-4.31 (m, 1H), 3.77 (t, J = 11.4 Hz, 2H), 3.72-3.48 (m, 23H), 3.38-3.28 (m, 4H), 3.16-3.12 (m, 1H), 2.92 (dd, J = 12.9, 5.0 Hz, 1H), 2.72-2.54 (m, 8H), 2.35 (s, 4H), 2.19-2.09 (m, 4H), 1.90-1.82 (m, 2H), 1.73-1.41 (m, 6H), 1.01 (s, 6H); LC-MS: [M+H] + = 1237.14.
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
製造例１４：化合物(CPA-302)の製造
　下式に示す方法に従って、化合物（CPA-302）を製造した。
Figure WO-DOC-CHEMICAL-48
（1）CPA-301の製造
 　3-[2-[2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸 (22 mg)およびアリルアルコール (78μL)の混合物に塩化チオニル(0.17 mL)を加え、室温にて1時間撹拌した。水を加えたのちに減圧濃縮した。残渣および製造例１で製造した化合物（CPI-003）(30 mg)をDMF（2 mL)に溶解しDIPEA (40μL)およびCOMU (36 mg)を加え、室温にて3時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物(37 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.60 (s, 1H), 8.14 (dt, J = 9.0, 2.5 Hz, 2H), 7.88 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.71 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 5.95-5.86 (m, 1H), 5.31 (ddt, J = 17.2, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 5.22 (ddt, J = 10.4, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 4.86-4.82 (m, 1H), 4.59 (dt, J = 5.6, 1.4 Hz, 2H), 3.78-3.60 (m, 18H), 3.32-3.27 (m, 2H), 2.63 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.44-2.41 (m, 2H), 1.92-1.86 (m, 2H), 1.50 (s, 9H); LC-MS: [M+H] + = 678.27.
（2）CPA-302の製造
　上記で製造した化合物（CPA-301）(36 mg)、モルホリン(9.3μL)、Pd(PPh3)4 (3.1 mg)およびTHF(1 mL)の混合物を室温にて6時間撹拌した。モルホリン (4.6μL)および Pd(PPh3)4(3.1 mg)を追加し、室温にて1時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物 (27 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.54 (s, 1H), 9.09 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.05 (dt, J = 9.2, 2.4 Hz, 2H), 7.91 (dt, J = 9.2, 2.3 Hz, 2H), 6.91 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 3.60-3.42 (m, 18H), 2.98 (dt, J = 6.4, 6.4 Hz, 2H), 2.66 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 2.37 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.71 (tt, J = 6.4, 6.4 Hz, 2H), 1.37 (s, 9H); 
LC-MS: [M+H] + = 638.23.
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
製造例１５：化合物(CPA-306)の製造
　下式に示す方法に従って、化合物（CPA-306）を製造した。
Figure WO-DOC-CHEMICAL-49
（1）CPA-303の製造
　3-[2-[2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸(11 mg)、塩化チオニル(8.8μL)、アリルアルコール(35μL)の混合物を室温にて1時間撹拌した。水を加た後、減圧濃縮した。残渣と製造例１４で製造した化合物（CPA-302）(22 mg)をDMF(1 mL)に溶解し、COMU(16 mg)およびDIPEA(18 μL)を加え、室温にて5時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的化合物 (17 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.63 (s, 1H), 8.13 (dt, J = 9.0, 2.3 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.78 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 6.72 (s, 1H), 5.96-5.86 (m, 1H), 5.31 (ddt, J = 17.2, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 5.23 (ddt, J = 10.4, 1.4 , 1.4 Hz, 1H), 4.89 (s, 1H), 4.59 (dt, J = 5.7, 1.4 Hz, 2H), 3.78-3.60 (m, 32H), 3.54 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.43 (dt, J = 5.3, 5.3 Hz, 2H), 3.28 (dt, J = 5.9 Hz, 2H), 2.62 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.48-2.42 (m, 4H), 1.93-1.87 (m, 2H), 1.49 (s, 9H) ; LC-MS: [M+H] + = 925.27.
（2）CPA-304の製造
　上記で製造した化合物（CPA-303）(17 mg)をDCM(1 mL)に溶解し、TFA(0.14 mL)を滴下して室温で2時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣と製造例２で製造した化合物（CPI-005）(17 mg)のDMF溶液(1 mL)にDIPEA(13μL)を加え、60℃にて4時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物 (22 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 13.68 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 9.50 (s, 1H), 8.10 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.89-7.87 (m, 3H), 6.79-6.76 (m, 1H), 6.66-6.63 (m, 1H), 5.96-5.86 (m, 2H), 5.31 (ddt, J = 17.2, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 5.23 (ddt, J = 10.4, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 5.11-5.06 (m, 1H), 4.59 (dt, J = 5.6, 1.4 Hz, 2H), 4.54-4.51 (m, 1H), 4.34-4.31 (m, 1H), 3.78-3.50 (m, 50H), 3.43 (dt, J = 5.4, 5.4 Hz, 2H), 3.38 (dt, J = 5.3, 5.3 Hz, 2H), 3.33 (dt, J = 5.5, 5.5 Hz, 2H), 3.17-3.12 (m, 1H), 2.92 (dd, J = 12.8, 4.9 Hz, 1H), 2.74 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.63 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.58 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.47 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.34 (s, 4H), 2.18 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.12 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.82-1.60 (m, 6H), 1.47-1.40 (m, 2H), 1.01 (s, 6H); 
LC-MS: [M+H] + = 1420.69.
（3）CPA-305の製造
　上記で製造した化合物（CPA-304）(10 mg)、1,3-ジメチルバルビツル酸(2.2 mg)、Pd(PPh3)4 (0.81 mg)およびAcOEt/DCM (1:1, 0.5 mL)の混合物を室温にて1時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して目的物 (9.5 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.53 (t, J = 10.4 Hz, 1H), 10.57 (s, 1H), 9.10 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.95 (s, 1H), 7.91 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.84 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.29 (dd, J = 5.6, 5.2 Hz, 1H), 4.13-4.10 (m, 1H), 3.63-3.25 (m, under the water signal), 3.17 (tt, J = 5.8, 5.8 Hz, 4H), 3.10-3.06 (m, 1H), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.58-2.49 (m, overlapped with the DMSO signal), 2.35-2.28 (m, 8H), 2.05 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.93 (tt, J = 7.0 Hz, 2H), 1.64-1.40 (m, 4H), 1.34-1.23 (m, 2H), 0.94 (s, 6H) ; 
LC-MS: [M+H] + = 1380.38.
（4）CPA-306の製造
　上記で製造した化合物（CPA-305）(8.5 mg)、NHS(1.4 mg), WSC・HCl(2.4 mg)およびDMF(0.5 mL)の混合物を室温にて4時間撹拌した。NHS(1.4 mg)および WSC・HCl(2.4 mg)を追加し、2時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製し、目的物 (7.7 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.55-13.52 (m, 1H), 10.38 (s, 1H), 9.12-9.07 (m, 1H), 8.08-7.80 (m, 6H), 6.41 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.13-4.10 (m, 1H), 3.71 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.63-3.25 (m, under the water signal), 3.17 (tt, J = 6.0, 6.0 Hz, 4H), 3.10-3.06 (m, 1H), 2.92 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.83-2.79 (m, 4H), 2.58-2.44 (m, overlapped with the DMSO signal), 2.34-2.28 (m, 8H), 2.05 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.97-1.90 (m, 2H), 1.64-1.40 (m, 4H), 1.32-1.23 (m, 2H), 0.94 (s, 6H) ; 
LC-MS: [M+2H] 2+ = 1478.07
製造例１６：化合物(CPA-310)の製造
　下式に示す方法に従って、化合物（CPA-310）を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
(1) CPA-307の製造
　ジエチレングリコールビス(3-アミノプロピル)エーテル(2.1 mL)をDCM(200 mL)に溶解し、クロロぎ酸アリル(1.0 mL)を氷冷下で滴下した後、4時間撹拌した。室温に昇温して14時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物 (0.50 g)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.26-7.37 (brs, 2H), 7.19 (t, J = 5.4, 1H), 5.95-5.85 (m, 1H), 5.26 (ddt, J = 13.8, 1.6, 1.6 Hz, 1H), 5.17 (ddt, J = 6.2, 1.6, 1.6 Hz, 1H), 4.45 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 3.54-3.36 (m, 12H), 3.03 (dt, J = 6.6, 6.6 Hz, 2H), 2.83 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.78 (tt, J = 6.6, 6.6 Hz, 2H), 1.62 (tt, J = 7.0, 7.0 Hz, 2H); 
LC-MS: [M+H] + = 305.16.
(2) CPA-308の製造
　前記で製造した化合物（CPA-307）(0.50 g)のDMF溶液(20 mL)にFmoc-Lys(Boc)-OH (0.77 g)、WSC・HCl (0.38 g)およびHOBt・H2O (0.30 g) を室温にて加えて15時間撹拌した後、溶媒を留去した。飽和NaHCO3水溶液を加え、AcOEtで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、Na2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, AcOEt/MeOH)で精製し、目的物 (0.80 g)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.76 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.31 (td, J = 7.4, 1.0 Hz, 2H), 6.83-6.73 (brs, 1H), 5.92-5.84 (m, 1H), 5.72-5.62 (brs, 1H), 5.44-5.34 (brs, 1H), 5.26 (d, J = 17.4 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 10.6 hz, 2H), 4.75-4.63 (brs, 1H), 4.52 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 4.42 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.21 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 4.14-4.10 (m, 1H), 3.59-3.43 (m, 13H), 3.35-3.25 (m, 3H), 3.11-3.08 (brm, 2H), 1.85-1.73 (m, 4H), 1.66-1.60 (m, 1H), 1.50-1.35 (m, 13H); 
LC-MS: [M+H] + = 755.21.
(3) CPA-309の製造
　前記で製造した化合物（CPA-308）(0.80 g)および1,3-ジメチルバルビツル酸 (0.33 g)のDCM(10 mL)溶液に、Pd(PPh3)4 (0.12 g)を加え、室温にて2時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, AcOEt/MeOH)で精製して、中間体(0.41 g)を得た。先の中間体(0.41 g)にビオチン-NHS (0.31 g)、DIPEA (0.16 mL)およびDMF (10 mL)を加え、室温にて2時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物 (0.15 g)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.89 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.85 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.74-7.72 (m, 3H), 7.44-7.40 (m, 3H), 7.33 (td, J = 7.4, 0.9 Hz, 2H), 6.76 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.31-4.19 (m, 4H), 4.13-4.10 (m, 1H), 3.91-3.86 (m, 1H), 3.50-3.44 (m, 8H), 3.39-3.33 (m, 4H), 3.14-3.03 (m, 5H), 2.91-2.85 (m, 2H), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.64-1.43 (m, 10H), 1.36-1.21 (m, 15H) ; LC-MS: [M+H] + = 897.11.
(4) CPA-310の製造
　前記で製造した化合物（CPA-309）(0.15 g)、ピペリジン(24μL)、DMF(3 mL)の混合物を室温にて2時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物(0.11 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.81 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.75 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 6.75 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.53-3.45 (m, 8H), 3.41-3.33 (m, 4H), 3.13-3.03 (m, 6H), 2.90-2.80 (m, 3H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.66-1.57 (m, 5H), 1.54-1.43 (m, 4H), 1.37-1.20 (m, 16H) ; LC-MS: [M+H] + = 675.21.
製造例１７：化合物(CPA-311)の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
　6-アミノカプロン酸(0.20 g)およびアリルアルコール(1.0 mL)に塩化チオニル(0.33 mL)を滴下し、室温にて1時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣に無水コハク酸 (0.18 g)、DIPEA (0.80 mL)およびDMF (5 mL)を加え、室温にて20時間撹拌した。無水コハク酸(0.15 g)およびDIPEA (0.4 mL)を追加し、室温にて1時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物 (0.40 g)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.02 (s, 1H), 5.97-5.87 (m, 1H), 5.32 (ddt, J = 14.1, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 5.24 (ddt, J = 10.4, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 4.58 (dt, J = 5.8, 1.4 Hz, 2H), 3.27 (dt, J = 6.6, 6.6 Hz, 2H), 2.71-2.68 (m, 2H), 2.52-2.49 (m, 2H), 2.36 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.65 (tt, J = 7.5, 7.5 Hz, 2H), 1.53 (tt, J = 7.3, 7.3 Hz, 2H), 1.40-1.32 (m, 2H) ; 
LC-MS: [M+H] + = 272.21.
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
製造例１８：化合物(CPA-314)の製造
Figure WO-DOC-CHEMICAL-52
(1) CPA-312の製造
　製造例１６で製造した化合物（CPA-310）(0.11 g)および製造例１７で製造した化合物（CPA-311）(43 mg)をDMF(4 mL)に溶解し、WSC・HCl(37 mg)およびHOBt・H2O (29 mg)を加えて、室温にて14時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して，目的物 (0.13 g)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.95 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.86-7.82 (m, 2H), 7.74 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 6.74 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.96-5.86 (m, 1H), 5.28 (ddt, J = 17.3, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 5.20 (ddt, J = 10.5, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 4.54 (dt, J = 5.4, 1.4 Hz, 2H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.14-4.06 (m, 2H), 3.52-3.45 (m, 8H), 3.40-3.33 (m, 4H), 3.12-2.98 (m, 7H), 2.89-2.80 (m, 3H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.37-2.25 (m, 6H), 2.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.65-1.19 (m, 31H) ; LC-MS: [M+H] + = 928.30.
(2) CPA-313の製造
　前記で製造した化合物（CPA-312）(0.13 g)の DCM(3 mL)溶液に、TFA(1.1 mL)を滴下し、室温にて1時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をDMF(2 mL)で希釈したのち、DIPEA(0.12 mL)およびアジピン酸無水物(36 mg)を加え、室温にて2時間撹拌した。撹拌を停止し、4日間静置した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して目的物 (75 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.02-7.95 (m, 1H), 7.89-7.84 (m, 2H), 7.78-7.75 (m, 2H), 6.43 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 5.96-5.86 (m, 1H), 5.28 (ddt, J = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 5.20 (ddt, J = 10.5, 1.5 1.5 Hz, 1H), 4.53 (dt, J = 5.5, 1.5, 2H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.14-4.06 (m, 2H), 3.52-3.33 (m, 12H), 3.12-2.96 (m, 9H), 2.82 (dd, J = 12.5, 5.2 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.38-2.27 (m, 6H), 2.21-2.16 (m, 2H), 2.06-2.02 (m, 4H), 1.65-1.21 (m, 26H) ; LC-MS: [M+H] + = 956.19.
(3) CPA-314の製造
　前記で製造した化合物（CPA-313）(75 mg)をDMF(2 mL)に溶解し、ジメドン (12 mg)、WSC・HCl (16 mg)およびDMAP(9.6 mg) を加え、室温にて14時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して目的物(31 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.89-7.82 (m, 2H), 7.74 (t, J = 10.6 Hz, 2H), 6.61 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.96-5.86 (m, 1H), 5.28 (ddt, J = 17.2, 1.6, 1.6 Hz, 1H), 5.20 (ddt, J = 10.5, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 4.53 (dt, J = 5.4, 1.4 Hz, 2H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.14-4.06 (m, 2H), 3.52-3.43 (m, 8H), 3.40-3.33 (m, 4H), 3.12-2.96 (m, 11H), 2.86-2.79 (m, 3H), 2.57 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.36-2.30 (m, 8H), 2.06-1.96 (m, 4H), 1.65-1.21 (m, 26H), 0.97 (s, 6H) ; 
LC-MS: [M+2H] 2+ = 1079.50.
製造例１９：化合物(CPA-318)の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
(1) CPA-317の製造
　上記式で示される化合物（CPA-315）(0.11g)および化合物（CPA-316）(0.087g)をDMF(5 mL)に溶解し、HATU(0.209 g)とDIPEA(0.160 ml) を室温にて加え20時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製して，目的物 (0.11 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.22-8.19 (m, 2H), 7.74-7.64 (brs, 1H), 7.61-7.52 (m, 3H), 5.15-5.02 (brs, 1H), 3.80-3.71 (m, 4H), 3.69-3.64 (m,4H), 3.58 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.36-3.33 (m, 2H), 1.43 (s, 9H) ; LC-MS: [M+H] + = 421.08.
(2) CPA-318の製造
　前記で製造した化合物（CPA-317）(0.11 mg)をDCM(2 mL)に溶解し、TFA (0.97 mL)を滴下して、室温にて1時間撹拌した後に、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物(89 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.15 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 8.15-8.12 (m, 2H), 7.74-7.64 (m, 6H), 3.61-3.58 (m, 8H), 3.54-3.49 (m, 2H), 2.97 (t, J = 5.2 Hz, 2H) ; LC-MS: [M+H] + = 321.06.
[規則26に基づく補充 14.08.2020]　
製造例２０：化合物(CPA-321)の製造
Figure WO-DOC-CHEMICAL-54
(1) CPA-319の製造
　製造例１９で製造した化合物（CPA-318）(12 mg)および製造例１８で製造した化合物（CPA-314）(30 mg)をDMF (1 mL)に溶解し、DIPEA (19μL)との混合物を60 ℃にて2時間撹拌した。カラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN) で精製して，目的物 (30 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (t, J = 4.5, 1H), 9.08 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.13-8.10 (m, 2H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.86-7.82 (m, 2H), 7.75-7.63 (m, 5H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.95-5.85 (m, 1H), 5.28 (ddt, J = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 5.20 (ddt, J = 10.4, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 4.53 (dt, J = 5.5, 1.5 Hz, 2H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.13-4.05 (m, 2H), 3.63-3.60 (m, 8H), 3.50-3.43 (m, 10H), 3.39-3.33 (m, 4H), 3.11-2.90 (m, 11H), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz., 1H), 2.36-2.27 (m, 8H), 2.23 (s, 4H), 2.11-2.02 (m, 4H), 1.65-1.21 (m, 26H), 0.91 (s, 6H) ; 
LC-MS: [M+H] + = 1380.98.
(2) CPA-320の製造
　前記で製造した化合物（CPA-319）(29 mg)、1,3-ジメチルバルビツル酸(6.6 mg)、Pd(PPh3)4 (2.4 mg)およびDCM (1 mL)の混合物を室温にて1時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN) で精製して，目的物(26 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (t, J = 4.3 Hz, 1H), 9.09 (t, J = 5.5, 1H), 8.13-8.10 (m, 3H), 7.99-7.89 (brs, 1H), 7.85 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.78-7.75 (m, 2H), 7.72-7.63 (m, 3H), 6.43 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.14-4.05 (m, 2H), 3.63-3.60 (m, 8H), 3.50-3.45 (m, 10H), 3.39-3.33 (m, 4H), 3.11-2.90 (m, 11H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.36-2.27 (m, 6H), 2.23 (s, 4H), 2.16-2.02 (m, 6H), 1.65-1.21 (m, 26H), 0.91 (s, 6H); LC-MS: [M+H] + = 1339.89.
(3) CPA-321の製造
　前記で製造した化合物（CPA-320）(25 mg)、NHS(4.3 mg)、WSC・HCl(7.2 mg)、およびDMF(0.4 mL)の混合物を室温にて3時間撹拌した。NHS(4.3 mg)、およびWSC・HCl(7.2 mg)を追加し、室温にてさらに3時間撹拌した。カラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN) で精製して、目的物(21 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (t, J = 4.4 Hz, 1H), 9.08 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.13-8.10 (m, 2H), 7.96 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.87-7.83 (m, 2H), 7.75-7.63 (m, 5H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.14-4.05 (m, 2H), 3.63-3.60 (m, 8H), 3.50-3.43 (m, 10H), 3.39-3.33 (m, 4H), 3.11-2.90 (m, 11H), 2.84-2.79 (m, 5H), 2.65 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.38-2.28 (m, 6H), 2.23 (s, 4H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.65-1.21 (m, 26H), 0.91 (s, 6H); LC-MS: [M+H] + = 1437.12.
製造例２１：CPF-242の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
(1) CPF-241の合成
　CPI-104 (14 mg)およびDMF (1 mL)の混合物にCPI-006 (6.6 mg)，WSC・HCl (6.8 mg)およびHOBt・H2O (5.4 mg)を加え，室温にて3時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製した。精製物 (8.9 mg)およびDMF (1 mL)の混合物にN-Boc-1,5-ジアミノペンタン (12 μL)，WSC・HCl (11 mg)およびHOBt・H2O (9.0 mg)を加え，室温にて16時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (7.4 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.77 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.72-7.65 (m, 3H), 7.57-7.50 (m, 3H), 7.47-7.43 (m, 2H), 7.20 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.75 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.55 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 4.25-4.18 (m, 1H), 3.77 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 3.70-3.63 (m, 1H), 2.98 (dt, J = 6.5, 6.5 Hz, 2H), 2.90-2.80 (m, 4H), 1.86-1.77 (m, 4H), 1.58-1.31 (m, 19H), 1.24-1.18 (m, 2H);
LC-MS: [M+H]+ = 680.53.
(2) CPF-242の合成
前記で製造した化合物 (CPF-241)(6.6 mg)およびDCM (1 mL)の混合物にTFA (149 μL)を加え，室温にて2時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣にDMF (1 mL)，CPI-005 (6.0 mg)およびDIPEA (17 μL)を加え，60 ℃にて3時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (7.9 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.46 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 7.84-7.79 (m, 2H), 7.72-7.65 (m, 3H), 7.57-7.50 (m, 3H), 7.47-7.43 (m, 2H), 7.20 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.41 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.55 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.25-4.18 (m, 1H), 4.14-4.10 (m, 1H), 3.76 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 3.70-3.58 (m, 3H), 3.52-3.48 (m, 14H), 3.42-2.99 (m, overlapped with water signal), 2.85-2.79 (m, 3H), 2.59-2.49 (m, overlapped with DMSO signal), 2.28 (s, 4H), 2.06 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.87-1.77 (m, 4H), 1.65-1.23 (m, 18H), 0.94 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1175.70.
製造例２２：CPA-325の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
(1) CPA-322の製造
　前記式に示す化合物(CPA-316)(40 mg)，N-Boc-1,3-ジアミノプロパン (61 μL)およびCOMU (99 mg)をDMF (1 mL)に溶解し，DIPEA (121 μL)を加え，室温にて26時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (53 mg)を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.15 (br, 1H), 8.13 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.72-7.64 (m, 3H), 6.84 (br, 1H), 3.30 (br, overlapped with water signal), 2.99 (br, 2H), 1.67 (quin, J = 6.5 Hz, 2H), 1.38 (s, 9H);
LC-MS: [M+Na]+ = 369.41.
(2) CPA-323の製造
　前記で製造した化合物(CPA-322)(51 mg)をDCM (1 mL)に溶解し，氷冷下TFA (113 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣に15-(Boc-アミノ)-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカン酸 (56 mg)，COMU (76 mg)，DIPEA (85 μL)，DMF (1 mL)を加え，室温にて12時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (76 mg)を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.15 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.89 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.72-7.69 (m, 2H), 7.66 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.74 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 3.60 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.49-3.46 (m, 12H), 3.37-3.36 (m, overlapped with water signal), 3.12 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 3.05 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.68 (quin, J = 7.0 Hz, 2H), 1.36 (s, 9H);
LC-MS: [M+H]+ = 594.60.
(3) CPA-324の製造
　前記で製造した化合物(CPA-323)(67 mg)をDCM (1 mL)に溶解し，TFA (130 μL)を加え，室温にて2時間撹拌した。溶媒を留去し，目的物 (68 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.16 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.15-8.11 (m, 2H), 7.92 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.75-7.64 (m, 6H), 3.62-3.48 (m, 16H), 3.34 (dt, J = 6.7, 6.7 Hz, 2H), 3.12 (dt, J = 6.7, 6.7 Hz, 2H), 3.01-2.94 (m, 2H), 2.33 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.69 (tt, J = 6.7, 6.7 Hz, 2H);
LC-MS: [M+H]+ = 494.38.
(4) CPA-325の製造
　CPA-318を前記で製造した化合物(CPA-324)に変更した以外は製造例２０と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (s, 1H), 9.15 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.14-8.11 (m, 2H), 7.97 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.91-7.83 (m, 3H), 7.76-7.63 (m, 5H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.2 Hz, 1H), 4.14-4.05 (m, 2H), 3.61-3.34 (m, 32 H), 3.17-2.91 (m, 13 H), 2.84-2.79 (m, 5H), 2.65 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 2H), 2.37-2.26 (m, 10H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.71-1.19 (m, 28H), 0.93 (s, 6H);
LC-MS: [M+2H]2+ = 1611.63.
製造例２３：CPA-326の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
　N-Boc-1,3-ジアミノプロパンをN-Boc-3,3’-((オキシビス(エタン-2,1-ジイル))ビス(オキシ))ビス(プロパン-1-アミン)に変更した以外は製造例２１と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (s, 1H), 9.14 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.14-8.11 (m, 2H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.85 (dd, J = 9.9, 5.4 Hz, 2H), 7.79 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.87-7.63 (m, 5H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.2 Hz, 1H), 4.14-4.05 (m, 2H), 3.61-3.34 (m, 40H), 3.11-2.92 (m, 15H), 2.84-2.79 (m, 5H), 2.65 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.57 (d, J = 12.4, 1H), 2.37-2.26 (m, 12H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.83-1.77 (m, 2H), 1.65-1.19 (m, 28H), 0.93 (s, 6H);
LC-MS: [M+2H]2+ = 1757.83.
製造例２４：CPA-332の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
(1) CPA-328の製造
　前記式に示す化合物(CPA-327)(60 mg)および Nα,Nε-ジ-Boc-L-リシン (87 mg)をDMF (2 mL)に溶解し，COMU (108 mg)およびDIPEA (109 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (129 mg)を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.13 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.77-6.39 (m, 3H), 5.88 (ddt, J = 17.3, 10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.30 (dd, J = 17.3, 1.6 Hz, 1H), 5.20 (dd, J = 10.5, 1.5 Hz, 1H), 4.59-4.52 (m, 2H), 4.22 (br, 1H), 3.91 (br, 1H), 2.92-2.82 (m, 4H), 1.72-1.66 (m, 1H), 1.64-1.52 (m, 2H), 1.49-1.42 (m, 1H), 1.37-1.24 (m, 35H);
LC-MS: [M+H]+ = 615.68.
(2) CPA-329の製造
　前記で合成した化合物(CPA-328)(126 mg)をDCM (2 mL)に溶解し，TFA (474 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣に上記式に示す化合物 (CPA-316)(128 mg)，DMF (2 mL)，COMU (288 mg)およびDIPEA (235 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (132 mg)を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.18 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 9.15 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 8.92 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.52 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.12-8.09 (m, 6H), 7.70-7.62 (m, 9H), 5.87 (ddt, J = 17.3, 10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.29 (dq, J = 17.2, 1.6 Hz, 1H), 5.17 (dq, J = 10.5, 1.5 Hz, 1H), 4.60 (q, J = 7.3 Hz, 1H), 4.56 (dq, J = 5.4, 1.6 Hz, 2H), 4.32-4.27 (m, 1H), 3.32-3.30 (m, overlapped with water signal), 1.86-1.77 (m, 3H), 1.73-1.66 (m, 1H), 1.64-1.55 (m, 4H), 1.49-1.36 (m, 4H);
LC-MS: [M+H]+ = 831.77.
(3) CPA-330の製造
　前記で製造した化合物(CPA-329)(42 mg)をDCM (3 mL)に溶解し，Pd(PPh3)4 (5.8 mg)およびN-メチルアニリン (27 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (31 mg)を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.60 (br, 1H), 9.18 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 9.15 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.92 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.36 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.12-8.07 (m, 5H), 7.80-7.77 (m, 1H), 7.71-7.62 (m, 9H), 4.60 (q, J = 7.5 Hz, 1H), 4.24-4.19 (m, 1H), 3.34-3.29 (m, overlapped with water signal), 1.87-1.76 (m, 3H), 1.70-1.54 (m, 5H), 1.49-1.35 (m, 4H);
LC-MS: [M+H]+ = 791.46.
(4) CPA-331の製造
　製造例２２と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.18-9.14 (m, 2H), 8.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.17-8.07 (m, 7H), 7.97 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.71-7.62 (m, 12H), 4.56 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 4.26 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 3.59-3.53 (m, 6H), 3.42-3.16 (m, 8H), 3.00-2.96 (m, 2H), 1.86-1.80 (m, 2H), 1.70-1.28 (m, 10H);
LC-MS: [M+H]+ = 921.30.
(5) CPA-332の製造
　CPA-318をCPA-331に変更した以外は製造例２１と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (s, 1H), 9.17-9.12 (m, 2H), 8.98 (d, J = 8.4 Hz. 1H), 8.17 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.12-8.06 (m, 6H), 8.06-7.96 (m, 2H), 7.87-7.83 (m, 2H), 7.76-7.74 (m, 2H), 7.70-7.53 (m, 9H), 6.42 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.57 (dt, J = 7.5, 7.5 Hz, 1H), 4.32-4.24 (m, 2H), 4.14-4.05 (m, 2H), 3.60-2.90 (m, 37H), 2.84-2.79 (m, 5H), 2.66-2.50 (m, 3H), 2.36-2.25 (m, 10H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.86-1.80 (m, 2H), 1.68-1.20 (m, 36H), 0.91 (s. 6H);
LC-MS: [M+2H]2+ = 2039.42.
製造例２５：CPA-403の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
(1) CPA-401の製造
　4-ベンゾイル安息香酸 (50 mg)，N-Boc-2,2'-(エチレンジオキシ)ジエチルアミン (55 mg)およびDMF (3 mL)の混合物に，WSC・HCl (42 mg)およびHOBt・H2O（34 mg）を加え，室温にて15時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル，ヘキサン/AcOEt）で精製して，目的物 (61 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.07-7.88 (brm, 2H), 7.86-7.79 (m, 4H), 7.62 (tt, J = 7.4, 1.2 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 6.99-6.88 (brs, 1H), 5.03-4.91 (brs, 1H), 3.71-3.56 (m, 10H), 3.36-3.23 (brm, 2H), 1.42 (s, 9H);
LC-MS: [M+H]+ = 457.45.
(2) CPA-402の製造
　前記で製造した化合物(CBI-712)(61 mg)およびDCM (2 mL)の混合物に，TFA (515 μL)を加え，室温にて14時間撹拌した。溶媒を留去し，目的物 (63 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.73 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.01-7.98 (m, 2H), 7.82-7.69 (m, 8H), 7.61-7.57 (m, 2H), 3.60-3.56 (m, 8H), 3.49-3.38 (m, 2H), 3.00-2.93 (m, 2H);
LC-MS: [M+H]+ = 357.36.
(3) CPA-403の製造
　CPA-316をCPA-402に変更した以外は、製造例２２と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.38-13.32 (brm, 1H), 8.72 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.00-7.96 (m, 3H), 7.87-7.83 (m, 2H), 7.80-7.68 (m, 7H), 7.60-7.56 (m, 2H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.1 Hz, 1H), 4.14-4.05 (m, 3H), 3.62-3.36 (m, 22H), 3.11-2.91 (m, 11H), 2.84-2.79 (m, 5H), 2.65 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.57 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 2.37-2.24 (m, 10H), 1.68-1.19 (m, 26H), 0.91 (s, 6H);
LC-MS: [M+2H]2+ = 1474.68.
製造例２６：CPA-503の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
(1) CPA-502の製造
　上記式に示す化合物 (CPA-501)(40 mg)をDCM (2 mL)に溶解し，TFA (258 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，目的物 (41 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.93 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.87-7.66 (brs, 3H), 3.60-3.52 (m, 6H), 3.41 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.20 (dt, J = 5.9, 5.9 Hz, 2H), 2.97 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 1.97 (m, 2H), 1.56 (m, 2H), 0.98 (s, 3H);
LC-MS: [M+H]+ = 259.28.
(2) CPA-503の製造
　CPA-316をCPA-502に変更した以外は、製造例２２と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (s, 1H), 7.98-7.84 (m, 4H), 7.77-7.74 (m, 2H), 6.42 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.2 Hz, 1H), 4.14-4.06 (m, 2H), 3.61-3.16 (m, 22H), 3.12-2.92 (m, 11H), 2.84-2.80 (m, 5H), 2.65 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.59-2.56 (m, 1H), 2.37-2.27 (m, 10H), 2.10-2.02 (m, 4H), 1.97 (t, J = 7.7 Hz), 1.65-1.23 (m, 28H), 0.97 (s, 3H), 0.94 (s, 6H);
LC-MS: [M+2H]2+ = 1376.31.
製造例２７：CPA-334の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
　上記式に示す化合物 (CPA-333)およびDCM (1 mL)の混合物にTFA (80 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣に上記式に示す化合物 (CPA-321)(15 mg)，DMF (1 mL)およびDIPEA (5.5 μL)を加え，室温にて8時間撹拌した。DIPEA (1.8 μL)を追加し，室温にて14時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (12 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 9.96 (d, J = 0.7 Hz, 1H), 9.08 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.13-8.10 (m, 2H), 8.04 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.87-7.82 (m, 3H), 7.78-7.63 (m, 6H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.30 (dd, J = 7.5, 5.3 Hz, 1H), 4.14-4.05 (m, 2H), 3.63-3.60 (m, 8H), 3.50-3.29 (m, overlapped with water signal), 3.11-2.89 (m, 11H), 2.83-2.79 (m, 1H), 2.59-2.23 (m, overlapped with DMSO signal), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.65-1.24 (m, 26H), 0.91 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1528.03.
製造例２８：CPI-007の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
　アジピン酸無水物 (100 mg)およびDCM (5 mL)の混合物に，氷冷下，アリルアルコール (96 μL)，DMAP (9.5 mg)およびピリジン (170 μL)を加え，氷冷下1時間撹拌した。室温に昇温し15時間撹拌した。反応液を2 M HCl水溶液および飽和食塩水で洗浄後，Na2SO4で乾燥した。溶媒を留去し，目的物 (101 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.97-5.87 (m, 1H), 5.34-5.29 (m, 1H), 5.26-5.22 (m, 1H), 4.58 (ddt, J = 5.7, 1.3, 1.3 Hz, 2H), 2.42-2.34 (m, 4H), 1.75-1.64 (m, 4H);
LC-MS: [M+H]+ = 187.20.
製造例２９：CPA-338の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
(1) CPA-335の製造
　上記式に示す化合物 (CPA-310)(139 mg)およびDCM (5 mL)の混合物に，TEA (43 μL)およびクロロぎ酸2,2,2-トリクロロエチル (33 μL)を加え，氷冷下1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (172 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.89 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.78-7.73 (m, 2H), 6.75 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.82 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.2 Hz, 1H), 4.14-4.12 (m, 1H), 3.93-3.87 (m, 1H), 3.52-3.54 (m, 8H), 3.40-3.34 (m, 4H), 3.12-3.04 (m, 5H), 2.88-2.80 (m, 3H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.65-1.41 (m, 10H), 1.37-1.21 (m, 15H);
LC-MS: [M+H]+ = 849.56.
(2) CPA-336の製造
　前記で製造した化合物 (CPA-335)(172 mg)およびDCM (3 mL)の混合物に，TFA (468 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣にDMF (3 mL)，CBI-741 (41 mg)，WSC・HCl (47 mg)，HOBt・H2O (37 mg)およびDIPEA (141 μL)を加え，室温にて13時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (134 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.89 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.80-7.73 (m, 3H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.96-5.86 (m, 1H), 5.28 (ddt, J = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 5.20 (ddt, J = 10.5, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 4.82 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.53 (dt, J = 5.4, 1.5 Hz, 2H), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.2 Hz, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.93-3.87 (m, 1H), 3.52-3.44 (m, 8H), 3.39-3.30 (m, 4H), 3.15-3.04 (m, 5H), 3.01-2.96 (m, 2H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.35-2.31 (m, 2H), 2.06-2.02 (m, 4H), 1.64-1.21 (m, 20H);
LC-MS: [M+H]+ = 917.63.
(3) CPA-337の製造
　前記で製造した化合物 CPA-336)(134 mg)およびDCM (3 mL)の混合物に，Pd(PPh3)4 (17 mg)および1,3-ジメチルバルビツル酸 (47 mg)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (96 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.91 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.80-7.74 (m, 3H), 6.42 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.82 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 12.4 Hz), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.2 Hz, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.93-3.87 (m, 1H), 3.52-3.35 (m, 12H), 3.12-3.04 (m, 5H), 3.01-2.96 (m, 2H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.18 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.06-2.01 (m, 4H), 1.64-1.21 (m, 20H);
LC-MS: [M+H]+ = 877.54.
(4) CPA-338の製造
　前記で製造した化合物 (CPA-337)(96 mg)およびDMF (2 mL)の混合物に，ジメドン (31 mg)，WSC・HCl (42 mg)およびDMAP (27 mg)を加え，60 ℃にて2時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN，0.1%AcOH含有）で精製して，目的物 (69 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.12-11.83 (brs, 1H), 7.90 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.78-7.74 (m, 3H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.82 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.2 Hz, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.93-3.87 (m, 1H), 3.52-3.30 (m, 12H), 3.12-3.04 (m, 5H), 3.01-2.96 (m, 2H), 2.93-2.90 (m, 2H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.59-2.43 (m, 5H), 2.04 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.64-1.21 (m, 20H), 0.99 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 999.69.
製造例３０：CPI-009の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
  
　上記式に示す化合物 (CPI-008)(80 mg)，DMF (3 mL)およびDIPEA (166 μL)の混合物に，TSTU (105 mg)を加え，室温にて5分撹拌した。6-アミノヘキサン酸 (41 mg)を加え，室温にて1時間撹拌した。50 ℃に昇温し5時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (102 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.53 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.37 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.99 (dd, J = 8.8, 2.3 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.39-3.32 (m, 2H), 2.31 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.70-1.58 (m, 4H), 1.53-1.33 (m, 11H);
LC-MS: [M+H]+ = 367.30.
製造例３１：CPA-342の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
(1) CPA-339の製造
　上記式に示す化合物 (CPA-338)(29 mg)，製造例１９で製造した化合物 (CPA-318) (13 mg)およびDMF (1 mL)の混合物にDIPEA (25 μL)を加え，60 ℃にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (31 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.36-13.34 (m, 1H), 9.06 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.14-8.11 (m, 2H), 7.89 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.78-7.63 (m, 6H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.82 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.93-3.87 (m, 1H), 3.63-3.60 (m, 10H), 3.52-3.30 (m, 14H), 3.11-3.04 (m, 5H), 3.00-2.96 (m, 2H), 2.93-2.90 (m, 2H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.23 (s, 4H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.63-1.21 (m, 20H), 0.91 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1301.83.
(2) CPA-340の製造
　前記で製造した化合物 (CPA-339)(31 mg)および1,4-ジオキサン (1 mL)の混合物に，亜鉛 (16 mg)および酢酸 (68 μL)を加え，60 ℃にて2時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN，0.1%AcOH含有）で精製して，目的物 (21 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (t, J = 4.2 Hz, 1H), 9.09 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.14-8.11 (m, 2H), 7.84 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.77-7.63 (m, 5H), 6.42 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.63-3.04 (m, 32H), 3.01-2.96 (m, 2H), 2.94-2.90 (m, 2H), 2.82 (dd, J = 12.5, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.24 (s, 4H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.65-1.21 (m, 20H), 0.91 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1127.92.
(3) CPA-341の製造
　前記で製造した化合物 (CPA-340)(10 mg)，製造例２８（１）で製造した化合物 (CPI-009)(4.7 mg)およびDMF (1 mL)の混合物に，WSC・HCl (3.4 mg)，HOBt・H2O (2.7 mg)およびDIPEA (6.2 μL)を加え，室温にて12時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (5.1 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (t, J = 4.7 Hz, 1H), 9.09 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.91 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.52 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.24 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.13-8.10 (m, 2H), 7.93 (dd, J = 8.9, 1.7 Hz, 1H), 7.86-7.84 (m, 2H), 7.77-7.63 (m, 5H), 6.43 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.17-4.11 (m, 2H), 3.62-2.89 (m, 35H), 2.81 (dd, J = 12.5, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.23 (s, 4H), 2.13-2.02 (m, 6H), 1.67-1.24 (m, 35H), 0.90 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1476.01.
(4) CPA-342の製造
　前記で製造した化合物 (CPA-341)(4.7 mg)およびMeOH (50 μL)の混合物に4M HCl、 1,4-ジオキサン溶液を加え，室温にて1時間撹拌した。MeOH (100 μL)，アセトン (100 μL)およびDIPEA (70 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (2.9 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (t, J = 4.6 Hz, 1H), 9.62 (s, 1H), 9.08 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.57 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.26 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.14-8.11 (m, 2H), 7.99 (dd, J = 8.8, 2.3 Hz, 1H), 7.86-7.84 (m, 2H), 7.7607.63 (m, 5H), 7.04 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.43 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.17-4.10 (m, 2H), 3.62-3.59 (m, 10H), 3.50-2.89 (m, 25H), 2.81 (dd, J = 12.6, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 2.23 (s, 4H), 2.14-2.02 (m, 6H), 1.96 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.63-1.15 (m, 26H), 0.90 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1415.76.
製造例３２：CPA-344の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
　CPA-321をCPA-343に変更した以外は製造例３１と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (s, 1H), 9.62 (s, 1H), 9.14 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.57 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.26 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.14-8.12 (m, 2H), 7.99 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 7.86-7.84 (m, 2H), 7.81-7.63 (m, 6H), 7.04 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.43 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.17-4.10 (m, 2H), 3.60-2.91 (m, overlapped with water signal), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.61-2.45 (m, overlapped with DMSO signal), 2.29-2.26 (m, 6H), 2.14-2.02 (m, 8H), 1.96 (s, 3H), 1.93 (s, 3H), 1.80 (tt, J = 6.6, 6.6 Hz, 2H), 1.68-1.24 (m, 28H), 0.93 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1735.36.
製造例３３：CPI-016の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
(1) CPI-012の製造
　上記式に示す化合物 (CPI-011)(97 mg)およびDCM (2 mL)の混合物に，TFA (683 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣にDMF (2 mL)，N-[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]-L-グルタミン酸5-tert-ブチル水和物 (75 mg)，HATU (81 mg)およびDIPEA (155 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。N-[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]-L-グルタミン酸5-tert-ブチル水和物 (75 mg)およびHATU (68 mg)を追加し，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (136 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.76 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.66-7.60 (m, 2H), 7.40 (dd, J = 7.4, 7.4 Hz, 2H), 7.32 (ddd, J = 7.4, 7.4, 1.0 Hz, 2H), 7.28-7.25 (m, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 6.13-6.05 (brm, 1H), 4.89-4.78 (brm, 1H), 4.50-4.47 (m, 1H), 4.38-4.17 (m, 5H), 3.65-3.51 (m, 12H), 3.43-3.28 (m, 4H), 3.16-3.11 (m, 1H), 2.89 (dd, J = 12.8, 4.9 Hz, 1H), 2.68 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.42-2.28 (m, 2H), 2.19-2.05 (m, 3H), 1.98-1.89 (m, 1H), 1.81-1.57 (m, 8H), 1.49-1.39 (m, 11H);
LC-MS: [M+H]+ = 854.39.
(2) CPI-013の製造
　前記で製造した化合物 (CPI-012)(136 mg)およびDMF (2 mL)の混合物に，ピペリジン (24 μL)を加え，室温にて5時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (87 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.83 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.75 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.53-3.45 (m, 8H), 3.41-3.33 (m, 6H), 3.13-3.04 (m, 6H), 2.82 (dd, J = 12.5, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.24-2.20 (m, 2H), 2.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.80-1.71 (m, 1H), 1.66-1.43 (m, 9H), 1.39 (s, 9H), 1.35-1.23 (m, 2H);
LC-MS: [M+H]+ = 632.38.
(3) CPI-015の製造
　前記で製造した化合物 (CPI-013)(87 mg)，上記式に示す化合物 (CPI-014)(22 mg)およびDMF (2 mL)の混合物に，WSC・HCl (32 mg)およびHOBt・H2O (25 mg)を加え，室温にて5時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (92 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.80-7.71 (brm, 1H), 7.22 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.85 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 6.61 (s, 1H), 5.95-5.85 (m, 1H), 5.31 (dd, J = 15.8, 1.4 Hz, 1H), 5.22 (dd, J = 9.2, 1.4 Hz, 1H), 5.01-4.79 (brs, 1H), 4.57 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 4.53-4.50 (m, 1H), 4.39-4.34 (m, 2H), 3.70-3.49 (m, 12H), 3.43-3.34 (m, 3H), 3.28-3.14 (m, 2H), 2.92 (dd, J = 12.8, 4.8 Hz, 1H), 2.72 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.69-2.65 (m, 2H), 2.61-2.57 (m, 2H), 2.39-2.26 (m, 2H), 2.15-2.03 (m, 3H), 1.98-1.36 (m, 20H);
LC-MS: [M+H]+ = 772.45.
(4) CPI-016の製造
　前記で製造した化合物 (CPI-015)(92 mg)およびDCM (1 mL)の混合物に，TFA (200 μL)を加え，室温にて20時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣にDMF (2 mL)，ジメドン (33 mg)，WSC・HCl (46 mg)およびDMAP (29 mg)を加え，60 ℃にて4時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN，0.1%AcOH含有）で精製して，目的物 (45 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.06 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.84 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.74 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.94-5.84 (m, 1H), 5.29 (ddt, J = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 5.19 (ddt, J = 10.5, 1.5, 1.5 Hz, 2H), 4.52 (dt, J = 5.3, 1.5 Hz, 2H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.22-4.16 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.52-2.45 (m, 8H), 3.40-3.30 (m, 4H), 3.14-3.02 (m, 5H), 3.01-2.91 (brs, 2H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.59-2.41 (m, 9H), 2.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.95-1.87 (m, 1H), 1.80-1.71 (m, 1H), 1.65-1.57 (m, 5H), 1.54-1.41 (m, 3H), 1.35-1.24 (m, 2H), 0.99 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 838.42.
製造例３４：CPA-346の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
　(1) CPA-345の製造
上記式に示す化合物 (CPA-316)(8.8 mg)およびDMF (1 mL)の混合物に，N-Boc-1,2-ジアミノエタン (7.3 μL)，COMU (22 mg)およびDIPEA (24 μL)を加え，室温にて5時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (8.3 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.22-8.19 (m, 2H), 7.81-7.70 (brs, 1H), 7.61-7.52 (m, 3H), 4.99-4.87 (brs, 1H), 3.68 (dt, J = 5.7, 5.7 Hz, 2H), 3.45 (dt, J = 5.7, 5.7 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H);
LC-MS: [M+H]+ = 333.16.
(2) CPA-346の製造
　CPA-345およびCPI-016を用いて、製造例20と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.31 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 9.43 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.15-8.12 (m, 2H), 7.85 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.75-7.65 (m, 4H), 6.41 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.48 (dd, J = 10.8, 3.5 Hz, 1H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.14-4.10 (m, 1H), 3.70-3.67 (m, 2H), 3.58-3.29 (m, 14H), 3.12-2.89 (m, 7H), 2.84-2.66 (m, 5H), 2.59-2.49 (m, 5H), 2.26-2.19 (m, 5H), 2.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.65-1.41 (m, 8H), 1.35-1.24 (m, 2H), 0.91 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1109.51.
製造例３５：CPA-347の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
(1) CPI-018HCLの製造
　上記式に示す化合物 (CPI-017，異性体比4:3)(63 mg)およびTHF (2 mL)の混合物に，トリフェニルホスフィン (78 mg)およびH2O (0.40 mL)を加え，室温にて一晩撹拌した。1 M HCl水溶液 (0.10 mL)を加え，室温にて1時間撹拌した。1M HCl水溶液 (0.30 mL)を追加し，室温にて1時間撹拌した。60 ℃に昇温し，6時間撹拌した後，室温にて4日間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (39 mg，異性体比10:9)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.20 (dd, J = 8.4, 0.8 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.8 Hz, 0.9H), 7.69 (d, J = 2.6 Hz, 0.9H), 7.45-7.37 (m, 2 + 0.9H), 4.21-4.15 (m, 2 + 0.9 × 2H), 3.67 (s, 0.9 × 3H), 3.65 (s, 3H), 2.95 (t, J = 7.6 Hz, 2 + 0.9 × 2H), 1.94-1.85 (m, 2 + 0.9 × 2H), 1.76-1.66 (m, 2 + 0.9 × 2H), 1.65-1.45 (m, 4 + 0.9 × 4H);
LC-MS: [M+H]+ = 292.23.
(2) CPI-019の製造
　前記で製造した化合物 (CPI-018HCL)(39 mg)，DMF (2 mL)およびDIPEA (93 μL)の混合物に，無水コハク酸 (13 mg)を加え，室温にて一晩撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (32 mg，異性体比2:1)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.19 (dd, J = 7.6, 2.0 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 8.8 Hz, 0.5H), 7.69 (d, J = 2.6 Hz, 0.5H), 7.45-7.37 (m, 2 + 0.5H), 4.19-4.12 (m, 2 + 0.5 × 2H), 3.66 (s, 0.5 × 3H), 3.64 (s, 3H), 3.19 (t, J = 6.9 Hz, 2 + 0.5 × 2H), 2.60-2.55 (m, 2 + 0.5 × 2H), 2.45 (t, J = 6.8 Hz, 2 + 0.5 × 2H), 1.91-1.82 (m, 2 + 0.5 × 2H), 1.60-1.50 (m, 4 + 0.5 × 4H), 1.48-1.39 (m, 2 + 0.5 × 2H);
LC-MS: [M+H]+ = 392.33.
(3)CPA-347の製造
　製造例１８および製造例２０と同様にして製造した（異性体比2:1）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 9.10 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.13-9.10 (m, 2.3H), 8.00 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.89-7.63 (m, 8.3H), 7.52 (s, 0.7H), 7.36 (s, 0.7H), 6.43 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.13-4.06 (m, 4H), 3.62-2.89 (m, 36H), 2.81 (dd, J = 12.5, 5.2 Hz, 1H), 2.60-2.49 (m, 3H), 2.37-2.28 (m, 4H), 2.23 (s, 4H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.78-1.71 (m, 2H), 1.65-1.23 (m, 26H), 0.90 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1500.96.
製造例３６：CPA-353の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
(1) CPA-348の製造
　上記式に示す化合物 (CPA-338)(11 mg)，N-Boc-2,2'-(エチレンジオキシ)ジエチルアミン (2.7 mg)およびDMF (1 mL)の混合物を，60 ℃にて2時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (10 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (s, 1H), 7.89 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.78-7.74 (m, 3H), 6.77 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.82 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.93-3.87 (m, 1H), 3.61-2.92 (m, 33H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.59-2.49 (m, 1H), 2.27 (s, 4H), 2.10-2.02 (m, 4H), 1.73-1.21 (m, 29H), 0.94 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1229.65.
(2) CPA-349の製造
　前記で製造した化合物 (CPA-348)(10 mg)および1,4-ジオキサン (1 mL)の混合物に，亜鉛 (11 mg)および酢酸 (47 μL)を加え，60 ℃にて30分間撹拌した。亜鉛 (11 mg)を追加し，60 ℃にて30分間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN，0.1%AcOH含有）で精製して，目的物 (8.6 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (s, 1H), 7.98-7.92 (brs, 1H), 7.75 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 6.77 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 6.32-6.29 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.61-3.28 (m, 27H), 3.14-2.92 (m, 9H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.59-2.49 (m, 1H), 2.27 (s, 4H), 2.10-2.02 (m, 4H), 1.64-1.23 (m, 29H), 0.94 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1055.66.
(3) CPA-350の製造
　前記で製造した化合物 (CPA-349)(8.6 mg)，CPA-311 (2.2 mg)およびDMF (1 mL)の混合物にWSC・HCl (3.1 mg)およびHOBt・H2O (2.5 mg)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (2.3 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (s, 1H), 7.96 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.87-7.82 (m, 2H), 7.75-7.73 (m, 2H), 6.80-6.74 (brs, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.96-5.86 (m, 1H), 5.32-5.26 (m, 1H), 5.22-5.19 (m, 1H), 4.54-4.53 (m, 2H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.14-4.04 (m, 2H), 3.61-3.16 (m, overlapped with water signal), 3.12-2.89 (m, 11H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.61-2.49 (m, overlapped with DMSO signal), 2.33-2.22 (m, 10H), 2.10-2.02 (m, 4H), 1.85 (s, 2H), 1.65-1.21 (m, 33H), 0.94 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1309.01.
(4) CPA-351の製造
　前記で製造した化合物 (CPA-350)(2.2 mg)およびDCM (0.50 mL)の混合物にTFA (130 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣にDMF (0.50 mL)，2-チオフェングリオキシル酸 (1.3 mg)，COMU (3.6 mg)およびDIPEA (15 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (1.4 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.36-13.33 (m, 1H), 8.88 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.19-8.16 (m, 2H), 7.97 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.87-7.83 (m, 2H), 7.77-7.73 (m, 2H), 7.29 (dd, J = 4.8, 4.0 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.96-5.86 (m, 1H), 5.31-5.26 (m, 1H), 5.22-5.19 (m, 1H), 4.53 (dd, J = 5.4, 1.2 Hz, 2H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.14-4.05 (m, 2H), 3.61-2.91 (m, overlapped with water signal), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.61-2.49 (m, overlapped with DMSO signal), 2.34-2.25 (m, 10H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.63-1.19 (m, 26H), 0.92 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1346.89.
(5) CPA-352の製造
　前記で製造した化合物 (CPA-351)(1.4 mg)およびDCM (0.50 mL)の混合物にPd(PPh3)4 (0.1 mg)および1,3-ジメチルバルビツル酸 (0.3 mg)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (0.7 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35-13.33 (m, 1H), 8.94-8.91 (m, 1H), 8.19-8.16 (m, 2H), 8.07-7.99 (m, 1H), 7.94-7.91 (m, 2H), 7.29 (dd, J = 4.8, 3.9 Hz, 1H), 6.47 (s, 1H), 6.37 (s, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.14-4.04 (m, 2H), 3.62-2.94 (m, overlapped with water signal), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.61-2.49 (m, overlapped with DMSO signal), 2.34-2.25 (m, 10H), 2.11-2.03 (m, 4H), 1.94-1.88 (brm, 2H), 1.62-1.11 (m, 24H), 0.92 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1306.84.
(6) CPA-353の製造
　前記で製造した化合物 (CPA-352)(0.7 mg)およびDMF (0.50 mL)の混合物にN-ヒドロキシスクシンイミド (0.6 mg)およびWSC・HCl (1.0 mg)を加え，室温にて16時間撹拌した。N-ヒドロキシスクシンイミド (0.6 mg)およびWSC・HCl (1.0 mg)を追加し，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (0.7 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.37-13.33 (m, 1H), 8.94-8.87 (m, 1H), 8.19-8.16 (m, 2H), 7.98-7.96 (m, 1H), 7.87-7.83 (m, 2H), 7.76-7.73 (m, 2H), 7.29 (dd, J = 4.9, 3.9 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.14-4.04 (m, 2H), 3.62-2.79 (m, overlapped with water signal), 2.61-2.25 (m, overlapped with DMSO signal), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.63-1.15 (m, 26H), 0.92 (s, 6H);
LC-MS: [M+2H]2+ = 1404.71.
製造例３７：CPI-018の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
CPI-018の合成
　上記式に示す化合物 (CPI-017) (20 mg)，DMF (0.5 mL) および DIPEA (14 μL) の混合物に，無水コハク酸 (2.4 mg) を加え，室温にて一晩撹拌した。反応溶液に AcOEt を加え，水および飽和食塩水で洗浄後，Na2SO4で乾燥した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (14 mg) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 4.30-4.23 (m, 1H), 3.53-3.38 (m, 8H), 3.31-3.25 (m, 2H), 3.20-3.13 (m, 4H), 2.54-2.40 (m, 4H), 2.30-2.24 (m, 2H), 2.20-2.10 (m, 1H), 1.89-1.80 (m, 1H), 1.69-1.27 (m, 66H);
LC-MS: [M+H]+ = 1073.20.
製造例３８：CPA-354の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
CPA-353の合成
　前記で製造した化合物 (CPI-018) (5.3 mg)，製造例30 (2) で製造した化合物 (CPA-340) (5.6 mg) およびDMF (0.5 mL) の混合物に，HATU (2.3 mg) および DIPEA (2.6 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (5.8 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.20-8.15 (m, 2H), 7.69-7.59 (m, 3H), 4.52-4.47 (m, 1H), 4.33-4.19 (m, 3H), 3.78-3.38 (m, 34H), 3.29-3.10 (m, 11H), 3.00-2.89 (m, 3H), 2.70 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.64-2.48 (m, 4H), 2.33-2.05 (m, 11H), 1.93-1.27 (m, 87H), 0.97 (s, 6H).
CPA-354の合成
　前記で製造した化合物 (CPA-353) (5.8 mg) および DCM (1 mL) の混合物に，TFA (0.5 mL) を加え，室温にて9時間撹拌した。溶媒を留去し，目的物 (4.5 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.19-8.15 (m, 2H), 7.69-7.59 (m, 3H), 4.52-4.46 (m, 1H), 4.34-4.20 (m, 3H), 3.80-3.46 (m, 34H), 3.29-3.10 (m, 11H), 3.00-2.89 (m, 3H), 2.74-2.68 (m, 1H), 2.67-2.48 (m, 4H), 2.33-2.09 (m, 11H), 1.93-1.26 (m, 33H), 0.97 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]2+ = 923.48.
製造例３９：ラベル化抗体（CPA-321ラベル化抗体）の製造
　抗CD71抗体OKT9(#16-0719-85, Thermo Fisher Scientific)，あるいはコントロール抗体としてマウスIgG1アイソタイプコントロール抗体（＃553447，BD Biosciences)を20μLチューブにとり、NHS labeling buffer（25 mM HEPES-NaOH pH 8.2, 150 mM NaCl）で最終濃度約0.1 mg/mlとなるように希釈した。これに製造例２０で製造した化合物（CPA-321）のDMSO溶液（10 mg/ml in DMSO)約1.5μLを加え、室温で2時間反応させた。次いで、これにリジン溶液（100 mM)を約5μL加えて、室温で20分間反応させた。これを脱塩カラム（Zeba Spin, Thermo Sscientific, 89882）に供して脱塩し、CPA-321ラベル化抗体を含む溶液（CPA-321ラベル化抗体溶液）を回収した。
［試験例］
　以下に、本発明の四官能性化合物および四官能性ケミカルプローブのうち代表的な化合物を用いた試験結果を示すことにより、本発明の化合物の作用を説明する。但し、本発明はこれらの試験例に限定されるものではない。
試験例１：化合物（CPP-127）を用いた、生細胞からの標的分子の単離と検出
１．細胞培養、及び本化合物による培養細胞の処理方法
　ヒトドパミン受容体D2（DRD2）を安定的に発現するCHO-K1細胞を10cmプレート上でコンフルエントになるまで培養した。
　細胞を培地にて洗浄後、DMSOもしくは未修飾リガンドを含んだ培地に交換して30分間反応させた。次に、培地を捨て、製造例１２で合成した化合物（CPP-127）を含む培地に交換し、30分間37℃にて静置した。培地を捨て、細胞をPBSにて洗浄し、プレート上の細胞に1 mlのPBSを加えた後、UVクロスリンカーを用いて302 nmのUV光を1分間細胞に照射した。UV照射後の細胞をセルスクレーパーにて回収し、回収した細胞ペレットを－80℃にて凍結保存した。
２．膜画分タンパク質の調製と精製
　凍結保存された細胞を50 mM Tris Homogenate Buffer（pH 7.4, 2.5 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 320 mMスクロース）で懸濁し、超音波破砕機にてホモジナイズした。ホモジナイズ後の懸濁液を遠心機にて遠心分離した(1,000g, 15分間, 4℃)。遠心後に得られた上清を別のチューブに移し、遠心分離（30,000 ×g, 30分間，4℃）した。遠心後に上清を捨て、沈殿に100mM Sodium Carbonate Buffer（Na2CO3）を加えて超音波破砕機にてホモジナイズし、氷上にて10分間インキュベートした。懸濁液を超遠心（45,2000×g，30分間, 4℃)にて遠心した後に上清を捨て、得られた沈殿をミリＱ水でリンスし、これを膜画分タンパク質とした。
３．膜タンパク質の溶出
　上記方法で調製した膜画分タンパク質に膜溶解バッファー（50mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% SDC, 1% Triton-X-100，8M Urea）を加え、超音波粉砕機にて膜画分タンパク質を溶解させた。可溶化した膜タンパク質の溶液にストレプトアビジンビーズ（#88816, Thermo Fisher Scientific)を加え、60分間撹拌混合することでビオチンラベル化タンパク質をビーズに吸着させた。ビーズを膜溶解バッファーにて洗浄後に、0.05％SDSを含む2％N2H4溶液を40μL添加し、室温で30分間静置した。磁気分離によりビーズを除き、溶液を回収した。回収した溶液に20％TFA溶液を加えて中和処理を行った後、遠心エバポレーターにて濃縮した。濃縮液にdithiothreitol及びIodoacetamideを加えて還元及びアルキル化し、トリプシン溶液を加えて37℃で一晩消化した。
４．LC-MS解析、及び標的タンパク質の同定
　得られたトリプシン消化物を脱塩精製し、LC-MSにてタンパク質解析を行った。LC-MSは、nano-HPLC 装置（Ultimate 3000, Thermo Scientific）と質量分析装置（Q Exactive, Thermo Scientific)を組み合わせたLC-MSシステムにて行った。Nano-HPLC 装置においては、トラップカラム（C18 Acclaim PepMap, Thermo Scientific） とチップカラム(75μm i.d., 12 cm long, 3 μm C18 particles, 日京テクノス)にて構成されるカラム（固定相）と、移動相に0.1％ギ酸－アセトニトリル系を用いた逆相クロマトグラフィーによるグラジエント分析にて行った。流速は300 nl/minで行い、アセトニトリル濃度を48分かけて4％から35％ に増加させるリニアグラジエントでペプチドを溶出する。質量分析は、ナノエレクトロスプレーによるイオン化を正イオンモードで行った。フルスキャンMSスペクトルはm/z 380～1600で行い、データ依存的取得モードによりプロダクトイオンスペクトルを測定した。LC-MSにて得られたデータは、解析ソフトウェアProteome Discovere 2.2（PD 2.2, Thermo Fisher Scientific)にて解析した。タンパク質同定はPD2.2に備わるサーチエンジンSequestを用い、Uniprotよりダウンロードしたデータベースに対して検索を行った。False discovery rateによる計算を行い、偽陽性タンパク質識別率を１％未満となるようにフィルタリングを行った後，さらに確実な候補タンパク質を選別するため， PSM 値 5 以上のものを同定タンパク質とした。さらに、同定されたUnique peptideの数を用いてデータの絞り込みを行った。定量解析はPD2.2に備わる定量手法LFQにてタンパク質を定量し、未修飾リガンド処理群との定量的な比較解析を行うことで、特異的に回収されたタンパク質を判別した。分析は独立した2回の試験にて実施し、その結果は未修飾リガンド処理群に対する比にて表すことができる。
５．結果
　結果を図１に示す。図１に示すように、本発明の四官能性ケミカルプローブ（化合物（CPP-127））を用いた際に，未修飾リガンド処理群でドパミン受容体D2が有意に抑制されることからドパミン受容体D2（DRD2)が特異的に回収されていることが確認された。
試験例２：化合物（CPF-224、CPF-202、CPF-242）を用いた生組織からの標的分子の単離と検出　DBA/2CrSlcマウスにイソフルラン吸入させて麻酔した後に断頭し、素早く脳を取出した。取り出した脳を、0℃の人工脳脊髄液（ACSF：artificial cerebrospinal fluid）に、混合ガス（95％O2，5％CO2）を連続的に通気した状態で60秒間浸漬した。メスで嗅球と小脳を取り除き、振動刃ミクロトーム（Leica，VT1200）のステージに瞬間接着剤を使用して脳を固定した。混合ガスを連続的に通気した状態の0℃ ACSF中で、線条体と海馬を含む脳のスライス切片（0.3 mmの厚さの薄切切片）を作製した。スライス切片を人工脳脊髄液の入ったディッシュに入れ、未修飾リガンドあるいはDMSOを添加し、5分間室温にて静置した。次に、製造例１０で製造した化合物（CPF-224）、もしくは製造例８で製造した化合物（CPF-202）を加え、室温にて30分間静置した。溶液を除去し、スライス切片に302nmのUV光を1分間（CPF-224およびCPF-202）、365nmのUV光を15分間（CPF242）照射した。スライス切片をPBSにて洗浄回収し、遠心分離（3000×g，4℃，5分間）にて上清を除去した。得られたペレットは、試験例１と同様の方法により解析した。分析は独立した2回の試験にて実施し，未修飾リガンド処理群に対する比にて表すことができる。
　化合物（CPF-224）を用いた結果を図２に、化合物（CPF-202）を用いた結果を図３に、化合物（CPF-242）を用いた結果を図４にそれぞれ示す。これらの図に示すように、本発明の四官能性ケミカルプローブを用いた際に、未修飾リガンド処理群で脳組織に含まれるAMPA型グルタミン酸受容体（Gria1, Gria2, Gria3, Gria4)及びGABA受容体サブユニット（Gabra1, Gabra2, Gabra5, Gabrg2)がCPF-224、CPF-202及びCPF242を用いてそれぞれが有意に抑制されることから、各膜タンパク質が特異的に回収されていることが確認された。
試験例３：ラベル化抗体を用いた細胞表面抗原の捕捉
　製造例２１で製造したCPA-321ラベル化抗CD71抗体あるいはCPA-321ラベル化抗マウスIgG1コントロール抗体を用い、THP-1細胞より抗原分子を取得した。具体的には、THP-1細胞を回収し、SB Buffer（2％FCSを含むPBS Buffer）にて洗浄した。洗浄後の細胞を0.1％ Fc block reagent (Invitrogen, 16-9161-73) を含むSB bufferに懸濁し、4℃にて15分間反応させた。遠心分離（600×g, 3 分間, 4℃）にて上清を除去し、抗体溶液（製造例２１で調製したCPA-321ラベル化抗体溶液（20μg）にSB Bufferを加えて1 mLにしたもの）を加え、4℃にて20分間反応させた。遠心分離にて抗体溶液を除去し、細胞をSB Bufferにて洗浄後に0.5 mlのSB Bufferに懸濁した。細胞懸濁液に302 nmのUV光を1分間照射し、遠心分離にてSB Bufferを除去する。得られた細胞を、試験例１で示した方法により解析した。分析は独立した2回の試験にて実施し、その結果を、抗CD71抗体で取得されたタンパク質の量をマウスIgG1アイソタイプコントロール抗体（抗マウスIgG抗体）に対する比にて表した［図５］。
　図５に示すように、2回の分析においてTFRC（CD71）が有意に取得されることが確認された。
試験例４～１３：ラベル化抗体を用いた細胞表面抗原の捕捉（１）
　表１に示したラベル化抗体を用い、表１に示した細胞より抗原分子を探索した。具体的には、表１に示した細胞をSB Buffer（2％FCSを含むPBS Buffer）にて洗浄し， 0.1％ Fc block reagent (Invitrogen, 16-9161-73) を含むSB bufferに懸濁後，4℃にて15分間反応させた。遠心分離（600×g, 3 分間, 4℃）にて上清を除去し、ラベル化抗体の製造に従い製造したラベル化抗体含有溶液を加え、4℃にて20分間反応させた。遠心分離にて抗体溶液を除去し、細胞をSB Bufferにて洗浄後に0.5 mlのSB Bufferに懸濁した。細胞懸濁液に表に示した波長の紫外線を表に示した時間照射し、遠心分離にてSB Bufferを除去した。回収した細胞を、試験例１で示した方法により解析した。試験は独立した2回の試験にて実施し、表に示した分析対象膜タンパクの検出量を比較した（図６～図８）。
ラベル化抗体の製造（試験例４～１２）
　表１に示した抗体をチューブにとり、NHS labeling buffer（25 mM HEPES-NaOH pH 8.2, 150 mM NaCl）で最終濃度約0.05 mg/mlとなるように希釈した。これに表１に示したプローブのDMSO溶液（10 mg/ml in DMSO)約0.9 μLをそれぞれ加え、室温で2時間反応させた。次いで、これにリジン溶液（100 mM)を約5μL加えて、室温で20分間反応させ，使用時まで4℃にて保存した。
ラベル化リガンドの製造（試験例13）
His-Tag EGFを12.5 μgチューブにとり、NHS labeling bufferで最終濃度約0.25 mg/mlとなるように希釈した。この溶液48μLに，5 mM CPA-354を2 μL加えたものをラベル化リガンド溶液とした。この溶液は，使用時まで4℃にて保存した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000081
試験例14：ラベル化抗体を用いた細胞表面抗原の捕捉（２）
　下表で製造したラベル化OKT9を用い、A431細胞より抗原分子を探索した。まず，細胞をSB Buffer（2％FCSを含むPBS Buffer）にて洗浄した後，0.1％ Fc block reagent (Invitrogen, 16-9161-73) を含むSB bufferを加え，4℃にて15分間反応させた。上清を除去し、SB Bufferで10倍希釈したリガンド溶液を250μL加え、4℃にて20分間反応させた。リガンド溶液を除去し、細胞をPBSにて洗浄後，302 nmのUV光を1.5分間照射した。1% NP-40を含む溶解バッファーにて細胞よりタンパク質を抽出し、試験例１で示した方法により解析した。また，プローブ化されていないOKT9抗体を陰性対照として用い（No Probe)，それぞれのプローブ化リガンドによるCD71の検出量を比較した（図９）。
ラベル化抗体の製造
(1)　抗CD71抗体OKT9 (Thermo Fisher Scientific, Cat # 16-0719-85)を10 μgチューブにとり、NHS labeling buffer（25 mM HEPES-NaOH pH 8.2, 150 mM NaCl）で最終濃度約0.1 mg/mlとなるように希釈した。これにCPA-321溶液（10 mg/ml in DMSO)を0.9 μL加え、室温で2時間反応させた。次いで、これにリジン溶液（100 mM)を約5μL加えて、室温で20分間反応させ，使用時まで4℃にて保存した。
(2)　抗CD71抗体OKT9 を10 μgチューブにとり，5μLの30 mM Sodium Periodate (in Phosphate Buffer pH 6.5)を加えた後，Phosphate buffer pH 6.5を加えて総液量を100 μLとした。室温にて15分間反応後に，ZabaSpinカラム（Thermo Scientific)を用いてPBSに溶媒交換した。得られた抗体溶液100 μLに対し，500 mM 5-MA水溶液を1 μL加え，続いて10 mg/ml のCPA-342あるいはCPA-344 DMSO溶液を1 μL加えた後，室温遮光条件下にて1.5時間反応させた。反応後，ZabaSpinカラムを用いてPBSに溶媒交換し，余剰試薬を除去した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000082
試験例１７：ラベル化抗体を用いた細胞表面抗原の補足（二次抗体法）
　CBP-198ラベル化二次抗体の製造方法で製造したラベル化二次抗体を用い、THP-1細胞より抗原分子を探索した。具体的には、THP-1細胞をSB Buffer（2％FCSを含むPBS Buffer）にて洗浄し， 0.1％ Fc block reagent (Invitrogen, 16-9161-73) を含むSB bufferに懸濁後，4℃にて15分間反応させた。遠心分離（600×g, 3 分間, 4℃）にて上清を除去した。細胞に，SB Bufferで5 μg/ mLに希釈した抗CD71抗体DF1513溶液を加え，4℃にて20分間反応させた。遠心分離にて抗体溶液を除去し、細胞をSB Bufferにて洗浄した。次に，細胞をCPA-503ラベル化二次抗体の製造方法で製造したラベル化二次抗体にSB Bufferを加えて1 mLにしたもの）に懸濁し，4℃にて20分間反応させた。遠心分離にて抗体溶液を除去し、細胞をSB Bufferにて洗浄後に0.5 mlのSB Bufferに懸濁した。365 nmのUV光を15分間照射し、遠心分離にてSB Bufferを除去した。回収した細胞を、試験例１で示した方法により解析した。試験は独立した2回の試験にて実施し、CD71の検出量を比較した。
　比較例として、抗CD71抗体OKT9を抗CD71抗体DF1513以外は試験例１１と同様にして、CD71の検出量を算出した（図１０）。
CPA-503ラベル化二次抗体の製造
　Goat anti-mouse IgG (5μg)をチューブにとり、NHS labeling buffer（25 mM HEPES-NaOH pH 8.2, 150 mM NaCl）で表に示した最終濃度約0.05 mg/mとなるように希釈した。CPA-503のDMSO溶液（10 mg/ml in DMSO)約0.9 μLをそれぞれ加え、室温で2時間反応させた。次いで、これにリジン溶液（100 mM)を約5μL加えて、室温で20分間反応させ，使用時まで4℃にて保存した。
　二次抗体法を用いることにより、一次抗体法では検出することができなかった膜タンパク質を検出することができる。
　配列番号１及び２は、いずれも本発明の四官能性化合物または四官能性ケミカルプローブの切断可能部位（Ｅ）を構成する化合物の一態様であるペプチドのアミノ酸配列である。

Claims (9)

  1. 　リガンド結合部位（Ａ）、反応性部位（Ｄ）、切断可能部位（Ｅ）、及びビオチン部位（Ｂ）が、必要に応じてスペーサーを介して、連結してなる四官能性化合物であって、
    　前記リガンド結合部位（Ａ）は、アミン反応性基、ヒドロキシ反応性基、チオール反応性基、アルデヒドまたはケト反応性基、アルキルまたはアリールハライド反応性基、アルキルまたはアリールスルホナート反応性基、アミド反応性基、スルホンアミド反応性基、アリール反応性基、ジオール反応性基及びカルボキシ反応性基からなる群より選択される少なくとも１つの活性化官能基であるか、または、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＣＨ＝ＣＨ－、－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ＝ＣＨ－、アルキル、ビニルまたはアリールハライド、アルキル、ビニルまたはアリールスルホナート、アルキニル、アジド、エポキシ及びクリックタグからなる群から選択される少なくとも１つの反応性官能基であり、
    　前記反応性部位（Ｄ）は、2-アリール-5-カルボニルテトラゾール、フェニルアジド、ジアジリン、α－ケトアミド、４－ヒドロキシベンゼン、フタルヒドラジド及びベンゾフェノンからなる群より選択される少なくとも１つの化合物の構造を有する基であり、
    　前記切断可能部位（Ｅ）は、1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキ-1-イリデン)エチル、レブリノイルエステル、ビシナルジオール、ジアゾベンゼン、ビスアリールヒドラゾン、ジアルコキシジフェニルシラン、ジスルフィド、ENLYFQG（配列番号１）の配列からなるペプチド、及びENLYFQS（配列番号２）の配列からなるペプチドよりなる群から選択される少なくとも１つの化合物の構造を有する基であり、
    　前記ビオチン部位（Ｂ）は、下式（１）で示される基であり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、＊は、隣接する基との結合を意味する。）；
    　前記スペーサーが、直鎖若しくは分岐鎖状の炭素数１以上のアルキレン基、または直鎖若しくは分岐鎖状の炭素数３以上のアルキレン基において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、－ＮＲａ－ＣＯ－、下記式（１－１）で示される基、及び下記式（１－２）で示される基からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基である、四官能性化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、ｍは０又は１を、ｎは１又は２を意味する。）
  2. 　前記反応性部位（Ｄ）が、下式（２）又は（２´）で示される基であり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
      （式中、＊は、隣接する基との結合を意味し、ｎは０または１を意味する。）
    または／および、
    　前記切断可能部位（Ｅ）が、下式（３）で示される基である、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
      （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、各々独立して水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味し、＊は、隣接する基との結合を意味する。）
    請求項１に記載する四官能性化合物。
  3. 　下式（Ｉ）または下式（ＩＩ）で示される化合物である、請求項１または２に記載する四官能性化合物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
      （Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは請求項１に記載する部位を意味し、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６及びＳ７は互いに独立してスペーサーを意味する。）
  4. 　前記リガンド結合部位（Ａ）が、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である請求項１～３のいずれかに記載する四官能性化合物。
  5. 　下式（i）、（ii）または（iii）で示される化合物である、請求項４に記載する四官能性化合物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
      （式中、ｐは２を示す。）
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載する四官能性化合物のリガンド結合部位（Ａ）に、リガンドが結合してなる四官能性ケミカルプローブ。
  7. 　前記リガンドが、生細胞または生組織に由来する膜タンパク質に親和性を有するタンパク質、ペプチド、脂質、糖及び低分子化合物からなる群より選択されるいずれかである、請求項６に記載する四官能性ケミカルプローブ。
  8. 　式（iv）で示される、請求項６または７に記載する四官能性ケミカルプローブ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
      （式中、Ｓ１はスペーサーを意味し、ｐは２を意味する。）
  9. 　請求項６～８のいずれかに記載する四官能性ケミカルプローブを用いた、細胞または組織中の標的タンパク質の検出方法であって、
    （１）細胞または組織に四官能性ケミカルプローブを反応させて、四官能性ケミカルプローブ中のリガンドと標的タンパクとを結合させる工程、
    （２）四官能性ケミカルプローブ中の反応性部位（Ｄ）と標的タンパク質との間で共有結合を形成させる工程、
    （３）四官能性ケミカルプローブが結合した標的タンパク質を含む画分を精製する工程、（４）四官能性ケミカルプローブ中のビオチン部位をアビジンと結合させて、四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を形成する工程、
    （５）形成した四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を、四官能性ケミカルプローブ中の切断可能部位で開裂する工程、及び
    （６）標的タンパク質を含有する画分を検出する工程
    の工程を含む標的タンパク質の検出方法。
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