JP4270522B2 - ホウ素化合物錯化試薬及び高度に安定な錯体 - Google Patents

Description

発明の技術分野
本発明は生物結合体製造分野、より詳細には生物高分子の結合に有用なホウ素化合物錯化試薬の類と、前記試薬の製造及び使用方法に関する。
発明の背景
生物結合とは、少なくとも１種が生物高分子である２種以上の異なる分子種を化学的又は生物学的手段により結合することを意味する用語である。生物結合の非限定的な例としては、タンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム及び細胞の相互結合又は有用な性質を付加する他の任意分子種（非限定的な例として薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、発色団、蛍光団、リガンド等）との結合が挙げられる。生物高分子の固定化も、高分子が可逆的又は不可逆的に不溶性支持体に結合した生物結合の特殊な例とみなされる。生物結合は生化学、免疫化学及び分子生物学研究で広く利用されている。生物結合の主要用途としては、遺伝子プローブの検出、ＥＬＩＳＡ、モノクローナル抗体薬剤ターゲティング及び医療イメージングが挙げられる。
生物結合体は一般に直接結合体と間接結合体に分類される。直接結合体は、２種以上の成分が直接共有化学結合により結合しているものを指す。他方、間接結合体は、２種以上の成分が生物高分子を含む中間複合体を介して結合しているものを指す。本明細書に記載する系は、中間生物高分子によらずに間接結合体の形成を可能にした最初のものである。
アビジン−ビオチン系
間接生物結合体製造方法は多数のものが記載されているが、文献に報告されているものの大半はアビジン−ビオチン系を利用して製造されており、補因子ビオチン（ビタミンＨ）に対するタンパク質アビジン（卵白から精製）又はストレプトアビジン（細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｉｄｉｎｉｉから精製）の結合特異性を利用してアビジンに結合した高分子をビオチン化高分子と架橋している。アビジンとストレプトアビジンはいずれも４個の非常に高親和性（Ｋ＝１０¹⁵ｍｏｌ^-1）のビオチン結合部位をもつ。
アビジン−ビオチン系はＥＬＩＳＡに広く利用されており、まず固定化抗原又はハプテンに抗体を結合した後に、（酵素基質との反応により着色又は化学発光産物を生じることにより検出に有用な）酵素−アビジン結合体を利用してビオチン化抗体の存在を検出している。アビジン−ビオチン系の適用例は数百を数え、最近の文献に記載されている（Ｗｉｌｃｈｅｋ，Ｍ．とＢａｙｅｒ，Ｉ．Ａ．，（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８４）。
アビジン−ビオチン系は広く利用されているにも拘わらず、一般にアビジン分子の塩基性に起因すると考えられる非特異的結合や、アビジン分子上の炭水化物残基の存在に起因すると考えられる非特異的結合や、真核細胞と原核細胞の両者に遍在する内因性ビオチンの存在に結び付けられるバックグラウンド干渉等の点でいくつかの制約を伴うことが知られている。
ジゴキシゲニンα−ジゴキシゲニン
アビジン−ビオチン系に伴う制約の一部を解消するように構成された代替間接生物結合系がＥＬＩＳＡによる遺伝子プローブの検出用として最近開発された（Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｃ．，Ｈｏｌｔｋｅ，Ｈ．−Ｊ．，Ｓｅｉｂｌ，Ｒ．，Ｂｕｒｇ，Ｊ．及びＭｕｈｌｅｇｇｅｒ，Ｋ．，（１９９０）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，３７１，９１７−９６５）。この系はＤｉｇｉｔａｌｉｓ植物に広く存在するアルカロイドであるステロイドハプテンジゴキシゲニンと、ジゴキシゲニンに対するポリクローナルヒツジ抗体（α−ジゴキシゲニン）から誘導されるＦａｂフラグメントを使用している。各種α−ジゴキシゲニン抗体は特異性が高いため、バックグラウンドが低く、アビジン−ビオチン系で認められる非特異的結合がない。ジゴキシゲニン標識ＤＮＡ及びＲＮＡプローブはヒトゲノムサザンブロットで単一コピー配列を検出することができる。ジゴキシゲニンα−ジゴキシゲニン系の開発は最近の文献に記載されている（Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｃ．（１９９０）ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ｏｂｅ，Ｇ．編）１０５−１５２頁，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ／Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）。ジゴキシゲニンα−ジゴキシゲニン系は生物結合に現在使用されている数種のハプテン−抗体系のうちで最新のものである。
固定化フェニルボロン酸
フェニルボロン酸は所定の必須官能基をもつ広範な極性分子と相互作用することが知られている。１，２−ジオール、１，３−ジオール、１，２−ヒドロキシ酸、１，３−ヒドロキシ酸、１，２−ヒドロキシルアミン、１，３−ヒドロキシルアミン、１，２−ジケトン及び１，３−ジケトンを含む様々の安定性の錯体が中性フェニルボロン酸又はフェニルボロン酸アニオンと形成されることは知られている。従って、固定化フェニルボロン酸は種々の生物試料から必須官能基をもつ分子種を選択的に保持するためのクロマトグラフィー支持休として利用されている。炭水化物、カテコールアミン、プロスタグランジン、リボヌクレオシド及びステロイド等の多数の主要生物分子は必須官能基を含み、この方法で分析又は精製されている。フェニルボロン酸クロマトグラフィー媒体を生物分子の単離及び分離に使用することは数件の文献に記載されている（Ｓｉｎｇｈａｌ，Ｒ．Ｐ．とＤｅＳｉｌｖａ，Ｓ．Ｓ．Ｍ．（１９９２）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，３１，２９３−３３５；Ｍａｚｚｅｏ，Ｊ．Ｒ．とＫｒｕｌｌ，Ｉ．Ｓ．（１９８９）ＢｉｏＣｈｒｏｍａｔｏｇ．，４，１２４−１３０；及びＢｅｒｇｏｌｄ，Ａ．とＳｃｏｕｔｅｎ，Ｗ．Ｈ．（１９８３）ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｗ．Ｈ．編）１４９−１８７頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
ホウ酸等のフェニルボロン酸はルイス酸であり、直接脱プロトン化でなく水和によりイオン化し、四面体フェニルボロン酸アニオン（ｐＫ_a＝８．８６）を与える。フェニルボロン酸は硼酸としての酸の３倍の強度である。ホウ素はイオン化すると

三方配位から

四面体配位アニオンに変化するので、フェニルボロン酸のイオン化は錯形成における重要な因子である。
シス又は共軸１，２−ジオール及び１，３−ジオール官能基をもつ分子種、特に炭水化物は固定化フェニルボロン酸アニオンと錯化し、アルカリ水性条件下で環状エステルを形成することが知られている（Ｌｏｒａｎｄ，Ｊ．Ｐ，とＥｄｗａｒｄｓ，Ｊ．Ｏ．（１９５９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４，７６９）。
１，２−ジオール及び１，３−ジオール錯体は中性ｐＨまで酸化するとジオール含有種を放出することが知られているが、これは環状エステルの加水分解によると予想される。１，８−ジヒドロキシナフタレン等の共面芳香族１，３−ジオールは６員環ボロン酸エステルの加水分解安定性により酸性条件下でも錯化することが知られている（Ｓｉｅｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．Ａ．とＲｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｃ．（１９８０）Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｎｕｃｌ．Ｃｈｅｍ．，４２，１５５９−１５７１）。ジオール含有種の保持に関連する分子種と同様に、側基１，２−ヒドロキシルアミン、１，３−ヒドロキシルアミン、１，２−ヒドロキシルアミド、１，３−ヒドロキシルアミド、１，２−ヒドロキシオキシム及び１，３−ヒドロキシオキシム官能基をもつ分子種もアルカリ水性条件下でフェニルボロン酸と可逆的に錯化することが知られている（Ｔａｎｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．とＢｒｕｉｃｅ，Ｔ．Ｃ．（１９６７）．Ｊ，Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８９，６９５４）。
フェニルボロン酸生物結合体
オルト置換アセトアミドフェニルボロン酸は糖タンパク質に関達する炭水化物残基の隣接ジオール部分を介する選択的生物結合の潜在的リンカーであると示唆されている（Ｃａｉ，Ｓ．Ｘ．とＫｅａｎａ，Ｊ．Ｆ．Ｗ．（１９９１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２，３１７−３２２）。３−イソチオシアナトフェニルボロン酸から誘導されるフェニルボロン酸生物結合体は放射性テクネチウムジオキシム錯体を医療イメージング用モノクローナル抗体に結合するために使用され、成果をあげている（Ｌｉｎｄｅｒ，Ｋ．Ｅ．，Ｗｅｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｎｏｗｏｔｎｉｋ，Ｄ．Ｐ．，Ｍａｌｌｅｙ，Ｍ．Ｆ．，Ｇｏｕｇｏｕｔａｓ，Ｊ．Ｚ．，Ｎｕｎｎ，Ａ．Ｄ．及びＥｃｋｅｌｍａｎ，Ｗ．Ｃ．（１９９１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２，１６０−１７０；Ｌｉｎｄｅｒ，Ｋ．Ｅ．，Ｗｅｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｎｏｗｏｔｎｉｋ，Ｄ，Ｐ．，Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ，Ｋ．，Ｓｈａｒｋｅｙ，Ｒ．Ｍ．，Ｙｏｓｔ，Ｆ．，Ｎａｒｒａ，Ｒ．Ｋ．及びＥｃｋｅｌｍａｎ，Ｗ，Ｃ．（１９９１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２，４０７−４１４）。
３−アミノフェニルボロン酸は種々の化学的方法によりタンパク質に共有結合されており、得られたフェニルボロン酸生物結合体はＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース及びグリコヘモグロビン（ＧＨｈ）結合について試験されている。相互作用は可逆的であり、親和性が非常に低いため、生物結合体の実用は非常に限られていることが分かっている。また、アルカリホスファターゼフェニルボロン酸生物結合体を酵素アッセイで使用してＧＨｂを検出しようと試みたが、グリコプロテインの存在を検出することはできなかった（Ｆｒａｎｔｚｅｎ，Ｆ．，Ｇｒｉｍｓｒｕｄ，Ｋ．，Ｈｅｇｇｌｉ，Ｄ．及びＳｕｎｄｒｅｈａｇｅｎ，Ｅ．（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，６７０，３７−４５）。
必須官能基をもつ生物分子のクロマトグラフィー分離には固定化フェニルボロン酸が使用されているが、相当量の生物結合研究とこの分野の相当量の投資にも拘わらず、フェニルボロン酸の選択性はまだ十分に利用されておらず、生物高分子を相互間又は有用な性質を付加する他の分子種と結合するには至っていない。
発明の要約
本発明は生物結合体の製造に有用な新規類のホウ素化合物錯化試薬と、このような試薬の製造及び使用方法に関する。１態様において、ホウ素化合物は本発明の錯化試薬と錯化するフェニルボロン酸又はその誘導体である。特に指定しない限り、フェニルボロン酸錯化試薬なる用語は本明細書では広義類のホウ素化合物錯化試薬の意味で使用し、フェニルボロン酸なる用語は本明細書ではホウ素化合物錯化試薬と錯化する広義類のホウ素化合物の意味で使用する。本発明では、従来技術のアビジン−ビオチン及びジゴキシゲニンα−ジゴキシゲニン系の代わりに、ホウ素化合物錯化試薬を（多くは従来技術で公知の）フェニルボロン酸試薬等のホウ素化合物と併用し、中間生物高分子を使用せずに化学結合を助長する。生物結合体の製造では多くの場合、非限定的な例として例えばタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム及び細胞等の数種の成分を相互に又は非限定的な例として例えば薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、固相支持体及びホウ素化合物錯化試薬等の有用な性質を付加する他の任意生物種と結合する。生物結合体の製造に使用されるこれらの種々の成分を総称して各々生物学的活性種又は生物活性種と呼ぶ。
側基フェニルボロン酸部分をもつ別の（又は同一）生物活性種との後期結合のためにフェニルボロン酸錯化部分を組み込む目的で生物活性種を修飾するのに利用可能な試薬は、一般式Ｉ：

で表され、式中、Ｒ₁基は推定フェニルボロン酸錯化試薬と生物活性種の反応に利用可能な反応性求電子又は求核部分であり、Ｚ基は鎖長約０〜６炭素当量の飽和又は不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ鎖長約６〜１８炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約３〜１２炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、Ｒ₂基はアルキル（例えばメチル、エチル等）及び電気陰性置換基をもつメチレンから選択される。
一般式Ｉの試薬と生物活性種の反応により、一般式ＩＩ：

の（１個以上の）側基推定フェニルボロン酸錯化部分をもつ結合体が得られる。尚、上記式中、ＢＡＳは生物学的活性種（即ち生物活性種）を表し、この生物活性種を試薬に結合するために使用される（それ自体スペーサーをもっていてもよい）反応性部分の一部を含んでいてもいなくてもよい。多くの態様では、一般式Ｉの数個の同一試薬が単一ＢＡＳ分子と反応することが理解されよう。例えば、ＢＡＳがタンパク質である場合には、多数のフェニルボロン酸錯化試薬がこのタンパク質と反応し、各々タンパク質上の数個のＲ₁基反応性部位の１つで反応する。一般式ＩＩにおけるＺ基は鎖長約０〜６炭素当量の飽和又は不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ鎖長約６〜１８炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約３〜１２炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーである。Ｒ₂基はアルキル（例えばメチル、エチル等）及び電気陰性置換基をもつメチレンから選択される。
一般式ＩＩの試薬を更に反応させると、一般式ＩＶ：

のホウ素化合物錯化試薬、例えば１個以上の側基フェニルボロン酸錯化部分をもつ試薬の類の結合体が得られる。
一般式ＩＶの結合体に関して、Ｚ基は鎖長約０〜６炭素当量の飽和又は不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ鎖長約６〜１８炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約３〜１２炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサである。Ｒ₃基はＨ、アルキル及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレンの１種から選択される。最後に、ＢＡＳは生物活性種を表し、この生物活性種を結合するために使用される反応性部分の一部を含んでいてもいなくてもよい。
本明細書に記載する一般式ＩＩＩ及び一般式ＩＶの組成物とその製造方法は、参考資料として本明細書の一部とする本願出願人名義の米国同時係属出願（発明の名称「Ｂｏｒｏｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」、出願日１９９６年８月５日、発明者Ｍａｒｋ Ｌ．Ｓｔｏｌｏｗｉｔｚ，Ｒｏｅｒｔ Ｊ．Ｋａｉｓｅｒ及びＫｅｖｉｎ Ｐ．Ｌｕｎｄ）の主題である。
フェニルボロン酸試薬は多くのものが従来技術で公知であり、参考資料として本明細書の一部とする本願出願人名義の米国同時係属出願（発明の名称「Ｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉｃ Ａｌｄ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」、出願日１９９４年１月２８日、出願番号第０８／１８８，９５８号）に詳細に記載されており、生物活性種に結合すると、一般式Ｖ：

（式中、ＢＡＳ＊は第２の生物活性種を表し、この生物活性種はリンカー部分を含んでいてもよいし、生物活性種ＢＡＳと異なるものでもよい）の（１個以上の）側基フェニルボロン酸部分をもつ結合体が得られる。ＢＡＳ＊は、生物活性種をフェニルボロン酸試薬に結合するために使用される反応性部分の一部を含んでいてもよい。
少なくとも１種の生物活性種と（１個以上の）側基フェニルボロン酸、錯化部分をもつ一般式ＩＶの結合体を、第２の生物活性種ＢＡＳ＊から製造した（１個以上の）側基フェニルボロン酸部分をもつ一般式Ｖの結合体と錯化すると、一般式ＶＩ：

（式中、ＢＡＳ及びＢＡＳ＊とＺ及びＲ₃基は上記と同義である）の生物結合体が得られる。このように、生物高分子を相互に又は有用な性質を付加する他の官能基と結合することができる。
一般式ＶＩの生物結合体は水性緩衝液又は有機溶剤中で製造することができる。生物結合体は約４℃〜７０℃の温度範囲で数分以内に形成される。所与ｐＨ及び温度の水溶液中の生物結合体の安定性は置換基Ｒ₃にかなり影響される。一般式ＶＩの生物結合体は約３．５＜ｐＨ＜１０．５の水溶液中で安定である。
生物結合反応（フェニルボロン酸錯化）はイオン強度の有意変化、有機溶剤の存在、界面活性剤の存在及びカオトロピック剤（タンパク変性剤）の存在に非感受性であり、これに対して従来技術の間接標識系では必要な結合性を保存するために生物高分子の構造を維持する必要があるのでカオトロピック剤は不適合である。殆どの場合、本明細書に記載する系で生物結合体の形成に付随する制約は、生物活性種の生存性を維持するために必要な条件により加えられるものに限られる。
要約すると、本発明はホウ素化合物錯化試薬、前記試薬の中間試薬及び試薬の合成方法に関する。一般式Ｉ及びＩＩとして示すものを含むこれらの試薬を使用すると、本明細書に記載する別の反応後にフェニルボロン酸又はその誘導体等のホウ素化合物と錯化することができる。
側基フェニルボロン酸部分をもつ別の（又は同一）生物活性種との後期結合のためにフェニルボロン酸錯化部分を組み込む目的で生物活性種を修飾するのに利用可能な試薬は、一般式ＩＩＩ：

で表され、式中、Ｒ₁基はフェニルボロン酸錯化試薬と生物活性種の反応に利用可能な反応性求電子又は求核部分であり、Ｚ基は鎖長約０〜６炭素当量の飽和又は不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ鎖長約６〜１８炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約３〜１２炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、Ｒ₃基はＨ、アルキル及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレン部分の１種から選択される。
Ｒ₃基はＨ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ及びＣＨ₂ＯＣＨ₃の１種から選択すると好ましい。Ｒ₃がＨであるとき、Ｒ₁基はアクリルアミド、アミノ、ジチオピリジル、ヒドラジド、イミド酸エステル、マレイミド及びチオール部分の１個から選択すると好ましい。Ｚ基は一般式（ＣＨ₂）_n（式中、ｎ＝１〜６）の非分枝アルキル鎖が好ましい。
一般式ＩＩＩの試薬と生物活性種の反応により、一般式ＩＶ：

の（１個以上の）側基フェニルボロン酸錯化部分をもつ結合体が得られる。尚、上記式中、ＢＡＳは生物学的活性種（即ち生物活性種）を表し、生物活性種を試薬に結合するために使用される（それ自体スペーサーをもっていてもよい）反応性部分の一部を含んでいてもいなくてもよい。多くの態様では、一般式ＩＩＩの数個の同一試薬が単一ＢＡＳ分子と反応することが理解されよう。例えば、ＢＡＳがタンパク質である場合には、多数のフェニルボロン酸錯化試薬がこのタンパク質と反応し、各々タンパク質上の数個のＲ₁基反応性部位の１つで反応する。一般式ＩＶにおけるＺ基は鎖長約０〜６炭素当量の飽和又は不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ鎖長約６〜１８炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約３〜１２炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーである。Ｒ₃基はＨ、アルキル及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレン部分の１種から選択される。
本明細書に記載する一般式Ｉ及び一般式ＩＩの組成物とその製造方法は、参考資料として本明細書の一部とする本願出願人名義の米国同時係属出願（発明の名称「Ｂｏｒｏｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」、出願日１９９６年８月５日、発明者Ｍａｒｋ Ｌ．Ｓｔｏｌｏｗｉｔｚ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｊ，Ｋａｉｓｅｒ及びＫｅｖｉｎ Ｐ．Ｌｕｎｄ）の主題である。
フェニルボロン酸試薬は多くのものが従来技術で公知であり、参考資料として本明細書の一部とする本出願人名義の米国同時係属出願（発明の名称「Ｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉ Ａｌｄ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ Ｆｏｒ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」、出願日１９９４年１月２８日、出願番号第０８／１８８，９５８号）に詳細に記載されており、生物活性種に結合すると、一般式Ｖ：

（式中、ＢＡＳ＊は第２の生物活性種を表し、この生物活性種はリンカー部分を含んでいてもよいし、生物活性種ＢＡＳと異なるものでもよい）の（１個以上の）側基フェニルボロン酸部分をもつ結合体が得られる。ＢＡＳ＊は、生物活性種をフェニルボロン酸試薬に結合するために使用される反応性部分の一部を含んでいてもよい。
少なくとも１種の生物活性種と（１個以上の）側基フェニルボロン酸錯化部分をもつ一般式ＩＶの結合体を、第２の生物活性種ＢＡＳ＊から製造した（１個以上の）側基フェニルボロン酸部分をもつ一般式Ｖの結合体と錯化すると、一般式ＶＩ：

（式中、ＢＡＳ及びＢＡＳ＊とＺ及びＲ₃基は上記と同義である）の生物結合体が得られる。このように、図１’に示すように生物高分子を相互結合又は有用な性質を付加する他の官能基と結合することができる。
要約すると、本発明はホウ素化合物錯化試薬、前記試薬の中間試薬、ホウ素化合物錯体、並びに前記試薬及び錯体の合成方法に関する。これらの試薬及び錯体を一般式ＩＩＩ、ＩＶ及びＶＩに示す。１態様では、一般式ＩＩＩの試薬を使用すると、生物活性種（ＢＡＳ）と縮合後に一般式ＩＶの試薬を生成することができる。一般式ＩＶの試薬を使用すると、一般式ＶＩに示す錯体のようにホウ素化合物と錯体を形成することができる。
一般式ＶＩの生物結合休は水性緩衝液又は有機溶剤中で製造することができる。生物結合体は約４℃〜７０℃の温度範囲で数分以内に形成される。所与ｐＨ及び温度の水溶液中の生物結合体の安定性は置換基Ｒ₃にかなり影響される。一般式ＶＩの生物結合体は約３．５＜ｐＨ＜１０．５の水溶液中で安定である。生物結合反応（フェニルボロン酸錯化）はイオン強度の有意変化、有機溶剤の存在、界面活性剤の存在及びカオトロピック剤（タンパク変性剤）の存在に非感受性であり、これに対して従来技術の間接標識系では必要な結合性を保存するために生物高分子の構造を維持する必要があるのでカオトロピック剤は不適合である。殆どの場合、本明細書に記載する系で生物結合体の形成に付随する制約は、生物活性種の生存性を維持するために必要な条件により加えられるものに限られる。
【図面の簡単な説明】
図１は一般式ＶＩの生物結合体を製造するために使用可能な一般式ＩＶの結合体を製造するための、一般式Ｉの推定フェニルボロン酸錯化試薬と一般式ＩＩＩのフェニルボロン酸錯化試薬の使用を示す。
図２はＲ₂がアルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル等）である一般式Ｉの試薬の合成中間体である４−及び５−アミノメチルサリチル酸アルキルの製造を要約する。４−及び５−アミノメチルサリチル酸アルキルは一般式ＩＩＩの試薬の生成にも有用な合成中間体である。
図３はＲ₂が電気陰性部分をもつメチレン基（例えばカルボキシメチル、シアノメチル、メトキシメチル等）である一般式Ｉの試薬の合成中間体である４−及び５−アミノメチルサリチル酸アルキルの製造を要約する。
図４はＲ₃がアルキル基又は電気陰性部分をもつメチレンもしくはエチレン基の１種である一般式ＩＩＩの試薬の合成中間体である４−及び５−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸の製造を要約する。
図５はＲ₂がアルキル基又は電気陰性部分をもつメチレン基の１種であり、Ｒ₁がイミダゾリド、ヒドラジド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分から選択される一般式Ｉ及びＩＩＩの試薬の合成を要約する。
図６はＲ₂がアルキル基又は電気陰性部分をもつメチレン基の１種であり、Ｒ₁がブロモ、クロロ、ヨード、マレイミド、ジチオピリジル及びイミド酸エステル部分から選択される一般式Ｉ及びＩＩＩの試薬の合成を要約する。
図７はＲ₁がＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルであり、Ｚが中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ鎖長約６〜１８炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Ｉ及びＩＩＩの試薬の合成を要約する。
発明の詳細な説明
生物結合体の製造に一般式Ｉの試薬を利用する３段法を図１に要約する。まず、所望の生物活性種との反応に利用可能な適当な反応性求電子又は求核基Ｒ₁を含む一般式Ｉの試薬を選択する。

Ｒ₁基は推定フェニルボロン酸錯化試薬と生物活性種の反応に利用可能な反応性求電子又は求核部分である。Ｒ₁基は非限定的な例として、アクリルアミド、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド、アミノ及びチオール部分から選択することが好ましい。
Ｚ基は鎖長約０〜６炭素当量の飽和又は不飽和鎖、好ましくは不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ鎖長約６〜１８炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約３〜１２炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーである。Ｚ基は一般式（ＣＨ₂）_n（式中、ｎ＝１〜６）の非分枝アルキル鎖から選択することが好ましい。
Ｒ₂基はアルキル（例えばメチル、エチル等）及び電気陰性置換基をもつメチレンから選択される。電気陰性置換基は陰性双極子モーメントをもつ置換基であり、例えばＣＮ、ＣＯＯＨ等である。Ｒ₂基はＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂及びＣＨ₂ＯＣＨ₃の１種から選択すると好ましい。
３段法による生物結合体製造の次段階では適当な試薬を生物活性種と縮合し、一般式ＩＩ：

の結合体を得る。一般式ＩＩ中、Ｚ及びＲ₂は上記と同義であり、ＢＡＳは生物学的活性種を表し、生物活性種を試薬に結合するために使用される反応性部分の一部（及びスペーサー）を含んでいてもいなくてもよい。
次に、結合体を一般式ＮＨ₂ＯＲ₃（式中、Ｒ₃はＨ、アルキル（例えばメチル、エチル等）又は電気陰性部分をもつメチレンもしくはエチレンから選択される）のヒドロキシルアミン誘導体と反応させる。利用可能なヒドロキシルアミン誘導体の非限定的な例としては、ＮＨ₂ＯＨ、ＮＨ₂ＯＣＨ₃、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＮ、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＯＮＨ₂及びＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨを挙げることができる。得られる結合体は一般式ＩＶ：

をもつ。一般式ＩＶ中、Ｚ及びＢＡＳ基は上記と同義であり、Ｒ₃基はＨ、アルキル及び電気陰性置換基をもつメチレン部分の１種から選択される。
次に、一般式ＩＶの結合体を、一般式Ｖ：

（式中、ＢＡＳ＊は第２の生物活性種を表し、この生物活性種はリンカー部分を含んでいてもよいし、錯化試薬の生物活性種ＢＡＳと異なるものでもよい）のフェニルボロン酸と錯化する。ＢＡＳ＊は、生物活性種をフェニルボロン酸試薬に結合するために使用される反応性部分の一部を含んでいてもよい。錯化により、一般式ＶＩ：

の（四面体ホウ素を中心とする）立休異性錯体が得られる。
生物結合体の製造に一般式ＩＩＩの試薬を使用する２段法を図１に要約する。まず、所望の生物活性種との反応に利用可能な適当な反応性求電子又は求核基Ｒ₁を含む一般式ＩＩＩ：

の試薬を選択する。
Ｒ₁基はフェニルボロン酸錯化試薬と生物活性種との反応に利用可能な反応性求電子又は求核部分である。Ｒ₁基は非限定的な例として、アクリルアミド、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド、アミノ及びチオール部分から選択することが好ましい。
Ｚ基は鎖長約０〜６炭素当量の飽和又は不飽和鎖、好ましくは不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ鎖艮約６〜１８炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約３〜１２炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーである。Ｚ基は一般式（ＣＨ₂）_n（式中、ｎ＝１〜６）の非分枝アルキル鎖から選択することが好ましい。
Ｒ₃基はＨ、アルキル及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレン部分の１種から選択される。電気陰性置換基とは、陰性双極子モーメント部分、例えば、ＣＮ，ＣＯＯＨ等を有する置換基である。
Ｒ₃基はＨ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ及びＣＨ₂ＯＣＨ₃の１種から選択すると好ましい。Ｒ₃基がＨであるときには、Ｒ₁基はアクリルアミド、アミノ、ジチオピリジル、ヒドラジド、イミド酸エステル、マレイミド及びチオール部分の１種から選択することが好ましい。
一般式ＩＩＩの試薬を生物活性種と縮合し、一般式ＩＶ：

（式中、Ｚ及びＢＡＳは上記と同義であり、Ｒ₃はＨ、アルキル及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレン部分の１種から選択される）の結合体を得る。
次に、一般式ＩＶの結合体を、一般式Ｖ：

（式中、ＢＡＳ＊は第２の生物活性種を表し、この生物活性種はリンカー部分を含んでいてもよいし、錯化試薬の生物活性種ＢＡＳと異なるものでもよい）をもつフェニルボロン酸結合体と錯化する。ＢＡＳ＊は、生物活性種をフェニルボロン酸試薬に結合するために使用される反応性部分の一部を含んでいてもよい。錯化により、一般式ＶＩ：

の（四面体ホウ素を中心とする）立体異性錯体が得られる。
生物結合体の製造に一般式Ｉの試薬を使用する代替３段法も図１に要約した。まず、所望の生物活性種との反応に利用可能な適当な反応性求電子又は求核基Ｒ₁を含む一般式Ｉ：

の試薬を選択する。
Ｒ₁基は推定フェニルボロン酸錯化試薬と生物活性種との反応に利用可能な適当な反応性求電子又は求核部分である。Ｒ₁基は非限定的な例として、アクリルアミド、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド、アミノ及びチオール部分から選択することが好ましい。
Ｚ基は鎖長約０〜６炭素当量の飽和又は不飽和鎖、好ましくは不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ鎖長約６〜１８炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約３〜１２炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーである。Ｚ基は一般式（ＣＨ₂）_n（式中、ｎ＝１〜６）の非分枝アルキル鎖から選択することが好ましい。
Ｒ₂基はアルキル（例えばメチル、エチル等）及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレンから選択される。電気陰性置換基は陰性双極子モーメントをもつ置換基であり、例えばＣＮ、ＣＯＯＨ等である。Ｒ₂基はＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂及びＣＨ₂ＯＣＨ₃から選択すると好ましい。
３段法による生物結合体製造の次段階では適当な試薬を生物活性種と縮合し、一般式ＩＩ：

の結合体を得る。一般式ＩＩ中、Ｚ、及びＲ₂は上記と同義であり、ＢＡＳは生物学的活性種を表し、生物活性種を試薬に結合するために使用される反応性部分の一部（及びスペーサー）を含んでいてもいなくてもよい。
次に、結合体を一般式ＮＨ₂ＯＲ₃（式中、Ｒ₃はＨ、アルキル（例えばメチル、エチル等）又は電気陰性置換基をもつメチレンもしくはエチレンから選択される）のヒドロキシルアミン誘導体と反応させる。利用可能なヒドロキシルアミン誘導体の非限定的な例としては、ＮＨ₂ＯＨ、ＮＨ₂ＯＣＨ₃、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＮ、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＯＮＨ₂及びＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨを挙げることができる。得られる結合体は一段式ＩＶ：

（式中、Ｚ及びＢＡＳ基は上記と同義であり、Ｒ₃基はＨ、アルキル及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレン部分の１種から選択される）をもつ。
次に、一般式ＩＶの結合体を、一段式Ｖ：

（式中、ＢＡＳ＊は第２の生物活性種を表し、この生物活性種はリンカー部分を含んでいてもよいし、錯化試薬の生物活性種ＢＡＳと異なるものでもよい）のフェニルボロン酸と錯化する。ＢＡＳ＊は、生物活性種をフェニルボロン酸試薬に結合するために使用される反応性部分の一部を含んでいてもよい。錯化により、一般式ＶＩ：

の（四面体ホウ素を中心とする）立体異性錯体が得られる。
一般式Ｉの推定フェニルボロン酸錯化試薬の合成

一般式Ｉの試薬は４−又は５−メチルサリチル酸から誘導される。いずれの場合も試薬は最終的に４−又は５−アミノメチル安息香酸アルキルである合成中間体から製造される。図２はＲ₂がアルキル基（例えばメチル、エチル等）である一般式Ｉの試薬の合成中間体である４−及び５−アミノメチル安息香酸アルキルの製造を要約する。図２はＲ₂がメチル基である例を示す。まずステップ１では４−又は５−メチルサリチル酸をエステル化し、対応する４−又は５−メチルサリチル酸アルキルを得る。ステップ２ではエステルをＮ−ブロモスクシンイミドとベンゾイルペルオキシド触媒で臭素化し、対応する臭化ベンジルを得る。ステップ３では、臭化ベンジルをナトリウムアジドでアルキル化し、対応するベンジルアジドを得る。最後にステップ４でベンジルアジドをＨＣｌの存在下にパラジウム触媒水素化すると、対応する塩酸ベンジルアミンが得られる。
図３はＲ₂基が電気陰性部分をもつメチレン基である一般式Ｉの試薬の合成中間体（例えば４−又は５−アミノメチルサリチル酸カルボキシメチル、アセトアミドメチル及びシアノメチル）の製造を要約する。Ｒ₂基を他の予想される置換基に変えても同様の合成により製造できると考えられる。まず、図３のステップ１では、図２に要約するように製造した４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルをメタノール中ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート及びトリエチルアミンと反応させ、対応する保護Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノメチル安息香酸メチルを得る。ステップ２では、トリメチルシラノール酸カリウムとの反応によりメチルエステルを開製し、酸水溶液中で処理し、対応する安息香酸を得る。ステップ３では、α−ハロ酸、α−ハロアセトアミド又はα−ハロアセトニトリル及びトリエチルアミンとの反応により安息香酸をアルキル化し、夫々対応するカルボキシメチル、アセトアミドメチル又はシアノメチルエステルを得る。最後に、ステップ４でテトラヒドロフラン中無水ＨＣｌとの反応によりＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）保護基を脱離すると、対応する塩酸ベンジルアミンが得られる。
図３の終産物を使用して無水アクリル酸又は塩化アクリロイルをサリチル酸アミノメチルと縮合することにより、別の試薬であるサリチル酸アミノメチルのアクリル酸アミドを単段階で製造することができる。
図５はＲ₂基がアルキル又は電気陰性部分をもつメチレンの１種であり、Ｒ₁がイミダゾリド、ヒドラジド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分から選択される一般式Ｉの試薬の合成を要約する。これらの試薬は各々無水脂肪酸を第１段階で使用する２段法で製造される。まず、図２又は３に要約するように製造した４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルを非極性有機溶剤中で好ましくは非限定的な例として無水コハク酸、無水グルタル酸、無水マレイン酸及び無水グリコール酸から選択される無水脂肪酸と縮合し、遊離末端カルボン酸部分をもつスペーサー（Ｚ基）を導入する。この縮合反応で無水脂肪酸が無水マレイン酸である場合には、得られるＺ基はアルケン基を含んでいるので不飽和である。その後、カルボン酸部分をＮ，Ｎ−カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸イソブチル及びｔｅｒｔ−ブチルカルバゼート又はＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により更に官能化すると、夫々対応するイミダゾリド、保護ヒドラジド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルが得られる。保護ヒドラジドの場合には、試薬を無水塩酸と接触させることによりＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）保護基を脱離する。
図６はＲ₂基がアルキル又は電気陰性部分をもつメチレンの１種であり、Ｒ₁基がブロモ、クロロ、マレイミド、ジチオピリジル及びイミド酸エステル部分から選択される一般式Ｉの試薬の合成を要約する。Ｒ₁基がブロモ及びクロロ部分から選択される一般式Ｉの試薬は、図２又は３に要約するように製造した４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルを夫々無水ブロモ酢酸又はクロロ酢酸と縮合することにより製造される。同様のヨード試薬は、クロロ試薬とヨウ化ナトリウムのハロゲン交換により製造される。非保護ヒドロキサム酸の分子内アルキル化の可能性により、Ｒ₃がＨであるときには、Ｒ₁がブロモ、クロロ、ヨード、ブロモアセトアミド、クロロアセトアミド及びヨードアセトアミド部分から選択される一般式Ｉの試薬は簡便に製造することができない。Ｒ₁基がマレイミド又はジチオピリジル部分から選択される一般式Ｉの試薬は、図２又は３に要約するように製造した４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルを、末端マレイミド又はジチオピリジル部分をもつ脂肪族カルボン酸エステルのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと縮合することにより製造される。Ｒ₁がイミド酸エステル部分である一般式Ｉの試薬は２段法で製造され、まず図２又は３に要約するように製造した４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルを、末端ニトリル部分をもつ脂肪族カルボン酸エステルのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと縮合する。次いで、０℃でメタノール中無水塩化水素との反応によりニトリル部分をイミド酸メチルエステルに変換する。
Ｒ₁基がＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル及びジチオピリジル部分から選択される一般式Ｉの試薬は、Ｚ基が中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Ｉの試薬を製造するための合成中間体として使用することができる。
Ｒ₁基がＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分である一般式Ｉの試薬を一般式Ｒ₁−Ｚ₂−ＮＨ₂（式中、Ｚ₂は好ましくは鎖長約１〜５炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である）の第１級脂肪族アミン部分をもつ化合物と縮合すると、Ｚ基が中間アミド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Ｉの試薬が得られる。
あるいは、好ましくはコハク酸、マレイン酸、フマル酸、アセチレンジカルボン酸及びグルタル酸から選択されるジカルボン酸から誘導される一般式ＩのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル試薬を、好ましくは非限定的な例としてグリシン、β−アラニン、アミノプロピオル酸、４−アミノ酪酸及び６−アミノカプロン酸から選択される一般式ＨＯ₂Ｃ−Ｚ₂−ＮＨ₂（式中、Ｚ₂は好ましくは鎖長約１〜５炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である）の第１級脂肪族アミン部分をもつ化合物と縮合すると、遊離末端カルボン酸部分をもつ化合物が得られ、これを図５に従って更に官能化すると、Ｚが中間アミド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Ｉの試薬が得られる。Ｒ₁がＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分であり、Ｚが中間アミド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Ｉの試薬の合成について、この方法を図７に要約する。
Ｒ₁がジチオピリジルである一般式Ｉの試薬を、一般式Ｒ₁−Ｚ₂−ＳＨ（式中、Ｚ₂は好ましくは鎖長約１〜５炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である）の末端チオール部分をもつ化合物と縮合すると、Ｚ基が中間ジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Ｉの試薬が得られる。
あるいは、好ましくはメルカプト酢酸、β−メルカプトプロピオン酸、メルカプトプロピオル酸、４−メルカプト酪酸及び６−メルカプトカプロン酸から選択されるメルカプトカルボン酸から誘導される一般式Ｉのジチオピリジル試薬を、好ましくはメルカプト酢酸、β−メルカプトプロピオン酸、メルカプトプロピオル酸、４−メルカプト酪酸及び６−メルカプトカプロン酸から選択される一般式ＨＯ₂Ｃ−Ｚ₂−ＳＨ（式中、Ｚ₂は好ましくは鎖長約１〜５炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である）のチオール部分をもつ化合物と縮合すると、遊離末端カルボン酸部分をもつ化合物が得られ、これを図５に従って更に官能化すると、Ｚが中間ジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Ｉの試薬が得られる。Ｒ₁がＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分であり、Ｚが中間ジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Ｉの試薬の合成について、この方法を図７に要約する。
Ｚが鎖長約３〜１２炭素当量のポリエチレングリコール鎖である一般式Ｉの試薬は、図２又は３に要約するように製造した４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルを、多数のものが市販されているＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分と反応性求電子又は求核部分（又はその保護前駆物質）の両者をもつポリエチレングリコール試薬と縮合し、Ｚ基が鎖長約３〜１２炭素当量のポリエチレングリコール鎖である一般式Ｉの試薬を得ることにより製造される。
一般式ＩＩＩのフェニルボロン酸錯化試薬の合成

図４はＲ₃基がアルキル又は電気陰性部分をもつメチレンの１種である一般式ＩＩＩの試薬の合成中間体である４−及び５−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸の製造を要約する。まずステップ１では、図２に要約したように製造した４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルをＮ−（ベンジルオキシカルボニル）オキシスクシンイミドと縮合し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル保護４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルを得る。ステップ２ではフェノールヒドロキシル部分を臭化ベンジルと縮合し、付加保護ベンジルエーテル中間体を得る。ステップ３では、アルキルエステルをＬｉＯＨとの反応により選択的に開製し、対応する安息香酸を得る。ステップ４では安息香酸をクロロギ酸イソブチルとの反応により活性化させ、混合無水酸を形成した後、これを好ましくは非限定的な例としてＮＨ₂ＯＨ、ＮＨ₂ＯＣＨ₃、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＮ、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＯＮＨ₂、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ及びＮＨ₂ＯＣＨ₂ＯＣＨ₃から選択されるヒドロキシルアミン誘導体と反応させ、対応する保護ヒドロキサム酸を得る。最後に、ステップ５でアミンとフェノールヒドロキシル部分の両者をＨＣｌの存在下にパラジウム触媒水素化により同時に脱保護すると、対応する塩酸４−又は５−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸が得られる。対応する４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルに構造的に関連するこれらの合成中間体を図５又は６に従って更に官能化すると、一般式ＩＩＩの試薬が得られる。
一般式ＩＶのフェニルボロン酸錯化結合体の製造
この時点で一般式Ｉの推定フェニルボロン酸錯化試薬を適当な生物活性種と反応させると、一般式ＩＩ：

の結合体が得られる。
次に一般式ＩＩの結合体をヒドロキシルアミン誘導体と縮合すると、一般式ＩＶ：

の対応するフェニルボロン酸錯化結合体が得られる。
利用可能なヒドロキシルアミン誘導体は、非限定的な例としてＮＨ₂ＯＨ、ＮＨ₂ＯＣＨ₃、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＮ、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＯＮＨ₂、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＯＣＨ₃から選択すると好ましい。一般式ＩＩにおけるＲ₂基がアルキル基である場合には、ＮＨ₂ＯＨを使用して一般式ＩＩから一般式ＩＶへの相互変換を実施すると好ましい。
あるいは、一般式ＩＩＩ：

の試薬を使用して図１に記載した経路により一般式ＩＶの結合体を製造することもできる。
一般式ＩＩＩのフェニルボロン酸錯化試薬を適当な生物活性種と反応させると、一般式ＩＶ：

の結合体が得られる。
一般式ＶＩの生物結合体の製造
一般式ＶＩの生物結合体は水性緩衝液又は有機溶剤中で製造することができる。好ましい緩衝液としては酢酸、クエン酸、リン酸、炭酸及びジグリシンが挙げられる。硼酸緩衝液はフェニルボロン酸錯化部分と錯化する可能性があるので避けるべきである。トリス、β−ヒドロキシアミン及びβ−ヒドロキシ酸緩衝液はフェニルボロン酸と錯化する可能性があるので避けるべきである。生物結合体は約４℃〜７０℃の温度範囲で数分以内に形成される。所与ｐＨ及び温度の水溶液中の生物結合体の安定性は置換基Ｒ₃によりある程度影響される。一般式ＶＩの生物結合体は約３．５＜ｐＨ＜１０．５の水溶液中で安定である。生物結合反応（フェニルボロン酸錯化）は０．０１〜１Ｍの範囲のイオン強度の有意変化、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びジメチルスルホキシド等の有機溶剤の存在、界面活性剤の存在、並びに尿素、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン及びホルムアミド等のカオトロピック剤（タンパク変性剤）の存在に非感受性であるが、これに対して従来技術の間接標識系では必要な結合性を保存するために生物高分子の構造を維持する必要があるのでカオトロピック剤は不適合である。一旦形成されると、生物結合体は水を除去しても安定であり、凍結乾燥保存することができる。
所与ｐＨの生物結合体の安定性はある程度まで置換基Ｒ₃により決定される。Ｒ₃基がＨである一般式ＶＩのフェニルボロン酸錯体は約３．５〜１０．５のｐＨ範囲の水性緩衝液中で安定である。Ｒ₃基がＣＨ₃である一般式ＶＩのフェニルボロン酸錯体は約４．５〜１０．５のｐＨ範囲の水性緩衝液中で安定である。Ｒ₃基が電気陰性部分を含む一般式ＶＩのフェニルボロン酸錯体は約３．５〜１０．５のｐＨ範囲の水性緩衝液中で安定である。
酸触媒加水分解に対するフェニルボロン酸錯体の安定性は、錯体に関与するヒドロキサム酸のｐＫ_aに関係する。ヒドロキサム酸部分のｐＫ_aが低いほど、錯体は安定である。従って、Ｒ₃基が電気陰性部分を含む一般式ＶＩのフェニルボロン酸錯体は、Ｒ₃基がＨ又はＣＨ₃であるものよりも酸触媒加水分解に対して高い安定性を示す。
一般式ＩＩＩのフェニルボロン酸錯化試薬の合成

一般式ＩＩＩの試薬は４−又は５−メチルサリチル酸から誘導される。いずれの場合も試薬は最終的に４−又は５−アミノメチル安息香酸アルキルである合成中間体から製造される。
図２はＲ₂がアルキル基（例えばメチル、エチル等）である一般式ＩＩＩの試薬の合成中間体である４−及び５−アミノメチルサリチル酸アルキルの製造を要約する。図２はＲ₂がメチル基である例を示す。まずステップ１では４−又は５−メチルサリチル酸をエステル化し、対応する４−又は５−メチルサリチル酸アルキルを得る。ステップ２ではエステルをＮ−ブロモスクシンイミドとベンゾイルペルオキシド触媒で臭素化し、対応する臭化ベンジルを得る。ステップ３では、臭化ベンジルをナトリウムアジドでアルキル化し、対応するベンジルアジドを得る。最後にステップ４でベンジルアジドをＨＣｌの存在下にパラジウム触媒水素化すると、対応する塩酸ベンジルアミンが得られる。
図４はＲ₃基がアルキル又は電気陰性置換基をもつメチレンもしくはエチレンの１種である一般式ＩＩＩの試薬の合成中間体である４−及び５−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸の製造を要約する。まずステップ１では、図２に要約したように製造した４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルをＮ−（ベンジルオキシカルボニル）オキシスクシンイミドと縮合し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル保護４−及び５−アミノメチルサリチル酸アルキルを得る。ステップ２ではフェノールヒドロキシル部分を臭化ベンジルと縮合し、付加保護ベンジルエーテル中間体を得る。ステップ３では、アルキルエステルをＬｉＯＨとの反応により選択的に開裂し、対応する安息香酸を得る。ステップ４では安息香酸をクロロギ酸イソブチルとの反応により活性化し、混合無水酸を形成した後、これを好ましくは非限定的な例としてＮＨ₂ＯＨ、ＮＨ₂ＯＣＨ₃、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＮ、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＯＮＨ₂、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ及びＮＨ₂ＯＣＨ₂ＯＣＨ₃から選択されるヒドロキシルアミン誘導体と反応させ、対応する保護ヒドロキサム酸を得る。最後に、ステップ５でアミンとフェノールヒドロキシル部分の両者をＨＣｌの存在下にパラジウム触媒水素化により同時に脱保護すると、対応する塩酸４−又は５−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸が得られる。
図５はＲ₃基が好ましくはＨ、ＣＨ₃及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレン部分の１種から選択され、Ｒ₁基がイミダゾリド、ヒドラジド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分から選択される一般式ＩＩＩの試薬の合成を要約する。これらの試薬は各々無水脂肪酸を第１段階で使用する２段法で製造される。まず、図４に要約するように製造した４−又は５−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸を非極性有機溶剤中で好ましくは非限定的な例として無水コハク酸、無水グルタル酸、無水マレイン酸及び無水グリコール酸から選択される無水脂肪酸と縮合し、遊離末端カルボン酸部分をもつスペーサー（Ｚ基）を導入する。この縮合反応で無水脂肪酸が無水マレイン酸である場合には、得られるＺ基はアルケン基を含んでいるので不飽和である。その後、カルボン酸部分をＮ，Ｎ−カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸イソブチル及びｔｅｒｔ−ブチルカルバゼート又はＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により更に官能化すると、夫々対応するイミダゾリド、保護ヒドラジド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルが得られる。保護ヒドラジドの場合には、試薬を無水塩酸と接触させることによりＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）保護基を脱離する。
図６はＲ₃基が好ましくはＨ、ＣＨ₃及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレン部分の１種から選択され、Ｒ₁基がブロモ、クロロ、マレイミド、ジチオピリジル及びイミド酸エステル部分から選択される一般式ＩＩＩの試薬の合成を要約する。Ｒ₁基がブロモ及びクロロ部分から選択される一般式ＩＩＩの試薬は、図４に要約するように製造した４−及び５−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸を夫々無水ブロモ酢酸又はクロロ酢酸と縮合することにより製造される。同様のヨード試薬は、クロロ試薬とヨウ化ナトリウムのハロゲン交換により製造される。非保護ヒドロキサム酸の分子内アルキル化の可能性により、Ｒ₃がＨであるときには、Ｒ₁がブロモ、クロロ、ヨード、ブロモアセトアミド、クロロアセトアミド及びヨードアセトアミド部分から選択される一般式ＩＩＩの試薬は簡便に製造することができない。Ｒ₁基がマレイミド又はジチオピリジル部分から選択される一般式ＩＩＩの試薬は、図４に要約するように製造した４−又は５−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸を、末端マレイミド又はジチオピリジル部分をもつ脂肪族カルボン酸エステルのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと縮合することにより製造される。Ｒ₁がイミド酸エステル部分である一般式ＩＩＩの試薬は２段法で製造され、まず図４に要約するように製造した４−又は５−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸を、末端ニトリル部分をもつ脂肪族カルボン酸エステルのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと縮合する。次いで、０℃でメタノール中無水塩酸との反応によりニトリル部分をイミド酸メチルエステルに変換する。
Ｒ₃がＨ以外のものであるという条件で図４の終産物を使用して無水アクリル酸又は塩化アクリロイルをアミノメチルサリチルヒドロキサム酸と縮合することにより、別の試薬であるアミノメチルサリチルヒドロキサム酸のアクリル酸アミドを単段階で製造することができる。
Ｒ₁基がＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル及びジチオピリジル部分から選択される一般式ＩＩＩの試薬は、Ｚ基が中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式ＩＩＩの試薬を製造するための合成中間体として使用することができる。
Ｒ₁基がＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分である一般式ＩＩＩの試薬を一般式Ｒ₁−Ｚ₂−ＮＨ₂（式中、Ｚ₂は好ましくは鎖長約１〜５炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である）の第１級脂肪族アミン部分をもつ化合物と縮合すると、Ｚ基が中間アミド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式ＩＩＩの試薬が得られる。
あるいは、好ましくはコハク酸、マレイン酸、フマル酸、アセチレンジカルボン酸及びグルタル酸から選択されるジカルボン酸から誘導される一般式ＩＩＩのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル試薬を、好ましくはグリシン、β−アラニン、アミノプロピオル酸、４−アミノ酪酸及び６−アミノカプロン酸から選択される一般式ＨＯ₂Ｃ−Ｚ₂−ＮＨ₂（式中、Ｚ₂は好ましくは鎖長約１〜５炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である）の第１級脂肪族アミン部分をもつ化合物と縮合すると、遊離末端カルボン酸部分をもつ化合物が得られ、これを図５に従って更に官能化すると、Ｚが中間アミド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式ＩＩＩの試薬が得られる。Ｒ₁がＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルであり、Ｚが中間アミド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式ＩＩＩの試薬の合成について、この方法を図７に要約する。
Ｒ₁がジチオピリジル部分である一般式ＩＩＩの試薬を、一般式Ｒ₁−Ｚ₂−ＳＨ（式中、Ｚ₂は好ましくは鎖長約１〜５炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である）の末端チオール部分をもつ化合物と縮合すると、Ｚ基が中間ジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式ＩＩＩの試薬が得られる。
あるいは、好ましくはメルカプト酢酸、β−メルカプトプロピオン酸、メルカプトプロピオル酸、４−メルカプト酪酸及び６−メルカプトカプロン酸から選択されるメルカプトカルボン酸から誘導される一般式ＩＩＩのジチオピリジル試薬を、好ましくはメルカプト酢酸、β−メルカプトプロピオン酸、メルカプトプロピオル酸、４−メルカプト酪酸及び６−メルカプトカプロン酸から選択される一般式ＨＯ₂Ｃ−Ｚ₂−ＳＨ（式中、Ｚ₂は好ましくは鎖長約１〜５炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である）の末端チオール部分をもつ化合物と縮合すると、遊離末端カルボン酸部分をもつ化合物が得られ、これを図５に従って更に官能化すると、Ｚが中間ジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式ＩＩＩの試薬が得られる。Ｒ₁がＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルであり、Ｚが中間ジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式ＩＩＩの試薬の合成について、この方法を図７に要約する。
Ｚが鎖長約３〜１２炭素当量のポリエチレングリコール鎖である一般式ＩＩＩの試薬は、図２及び図３に要約するように製造した４−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸を、多数のものが市販されているＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分と反応性求電子又は求核部分（又はその前駆物質）の両者をもつポリエチレングリコール試薬と縮合し、Ｚ基が鎖長約３〜１２炭素当量のポリエチレングリコール鎖である一般式ＩＩＩの試薬を得ることにより製造される。
一般式Ｉの推定フェニルボロン酸錯化試薬の合成

一般式Ｉの試薬は４−又は５−メチルサリチル酸から誘導される。いずれの場合も試薬は最終的に４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルである合成中間体から製造される。図２はＲ₂がアルキル基（例えばメチル、エチル等）である一般式Ｉの試薬の合成中間体である４−及び５−アミノメチルサリチル酸アルキルの製造を要約する。図２はＲ₂がメチル基である例を示す。まずステップ１では４−又は５−メチルサリチル酸をエステル化し、対応する４−又は５−メチルサリチル酸アルキルを得る。ステップ２ではエステルをＮ−ブロモスクシンイミドとベンゾイルペルオキシド触媒で臭素化し、対応する臭化ベンジルを得る。ステップ３では、臭化ベンジルをナトリウムアジドでアルキル化し、対応するベンジルアジドを得る。最後にステップ４でベンジルアジドをＨＣｌの存在下にパラジウム触媒水素化すると、対応する塩酸ベンジルアミンが得られる。
図３はＲ₂基が電気陰性部分をもつメチレン又はエチレンである一般式Ｉの試薬の合成中間体（例えば４−又は５−アミノメチルサリチル酸カルボキシメチル、アセトアミドメチル及びシアノメチル）の製造を要約する。Ｒ₂基を他の予想される置換基に変えても同様の合成により製造できると考えられる。まず、図３のステップ１では、図２に要約するように製造した４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルをメタノール中ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート及びトリエチルアミンと反応させ、対応する保護Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノメチル安息香酸メチルを得る。ステップ２では、トリメチルシラノール酸カリウムとの反応によりメチルエステルを開製し、酸水溶液中で処理し、対応する安息香酸を得る。ステップ３では、α−ハロ酸、α−ハロアセトアミド又はα−ハロアセトニトリル及びトリエチルアミンとの反応により安息香酸をアルキル化し、夫々対応するカルボキシメチル、アセトアミドメチル又はシアノメチルエステルを得る。最後に、ステップ４でテトラヒドロフラン中無水ＨＣｌとの反応によりＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）保護基を脱離すると、対応する塩酸ベンジルアミンが得られる。
図５はＲ₂基がアルキル又は電気陰性置換基をもつメチレンもしくはエチレンの１種であり、Ｒ₁基がイミダゾリド、ヒドラジド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分から選択される一般式Ｉの試薬の合成を要約する。これらの試薬は各々無水脂肪酸を第１段階で使用する２段法で製造される。まず、図２又は３に要約するように製造した４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルを非極性有機溶剤中で好ましくは非限定的な例として無水コハク酸、無水グルタル酸、無水マレイン酸及び無水グリコール酸から選択される無水脂肪酸と縮合し、遊離末端カルボン酸部分をもつスペーサー（Ｚ基）を導入する。その後、カルボン酸部分をＮ，Ｎ−カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸イソブチル及びｔｅｒｔ−ブチルカルバゼート又はＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により更に官能化すると、夫々対応するイミダゾリド、保護ヒドラジド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルが得られる。保護ヒドラジドの場合には、試薬を無水塩酸と接触させることによりＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）保護基を脱離する。
図６はＲ₂基がアルキル又は電気陰性置換基をもつメチレンもしくはエチレンの１種であり、Ｒ₁基がブロモ、クロロ、マレイミド、ジチオピリジル及びイミド酸エステル部分から選択される一般式Ｉの試薬の合成を要約する。Ｒ₁基がブロモ及びクロロ部分から選択される一般式Ｉの試薬は、図２又は３に要約するように製造した４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルを夫々無水ブロモ酢酸又はクロロ酢酸と縮合することにより製造される。同様のヨード試薬は、クロロ試薬とヨウ化ナトリウムのハロゲン交換により製造される。非保護ヒドロキサム酸の分子内アルキル化の可能性により、Ｒ₃がＨであるときには、Ｒ₁がブロモ、クロロ、ヨード、ブロモアセトアミド、クロロアセトアミド及びヨードアセトアミド部分から選択される一般式ＩＩＩの試薬は簡便に製造することができない。Ｒ₁基がマレイミド又はジチオピリジル部分から選択される一般式Ｉの試薬は、図２又は３に要約するように製造した４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルを、末端マレイミド又はジチオピリジル部分をもつ脂肪族カルボン酸エステルのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと縮合することにより製造される。Ｒ₁がイミド酸エステル部分である一般式Ｉの試薬は２段法で製造され、まず図２又は３に要約するように製造した４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルを、末端ニトリル部分をもつ脂肪族カルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと縮合する。次いで、０℃でメタノール中無水塩化水素との反応によりニトリル部分をイミド酸メチルエステルに変換する。
Ｒ₁基がジチオピリジル（図６）、イミダゾリド（図５）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（図５）部分から選択される一般式Ｉの試薬は、Ｚ基が中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である延長スペーサーをもつ一般式Ｉの試薬を製造するための合成中間体として使用することができる。
Ｒ₁基がイミダゾリド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分から選択される一般式Ｉの試薬を一般式Ｒ₁−Ｚ’−ＮＨ₂（式中、Ｚ’は好ましくは鎖長約１〜５炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である）の第１級脂肪族アミン部分をもつ化合物と縮合すると、Ｚ基が中間アミド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Ｉの試薬が得られる。図７ではＺ’をＺ₂として示す。
あるいは、Ｒ₁基がイミダゾリド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分から選択される一般式Ｉの試薬を、好ましくは非限定的な例としてグリシン、β−アラニン、４−アミノ酪酸及び６−アミノカプロン酸から選択される一般式Ｈ₂Ｎ−Ｚ’−ＣＯＯＨ（式中、Ｚ’は好ましくは鎖長約１〜５炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である）の第１級脂肪族アミン部分をもつ化合物と縮合すると、遊離末端カルボン酸部分をもつ化合物が得られ、これを図５に従って更に官能化すると、Ｚが中間アミド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Ｉの試薬が得られる。
Ｒ₁基がジチオピリジル部分である一般式Ｉの試薬を、一般式Ｒ₁−Ｚ’−ＳＨ（式中、Ｚ’は好ましくは鎖長約１〜５炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である）の末端チオール部分をもつ化合物と縮合すると、Ｚ基が中間ジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Ｉの試薬が得られる。
あるいは、Ｒ₁基がジチオピリジル部分である一般式Ｉの試薬を、一般式ＨＳ−Ｚ’−ＣＯＯＨ（式中、Ｚ’は好ましくは鎖長約１〜５炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である）の末端チオール部分をもつ化合物と縮合すると、遊離末端カルボン酸部分をもつ化合物が得られ、これを図５に従って更に官能化すると、Ｚが中間ジスルフィド部分の少なくとも１個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Ｉの試薬が得られる。
Ｚが鎖長約３〜１２炭素当量のポリエチレングリコール鎖である一般式Ｉの試薬は、図２又は３に要約するように製造した４−又は５−アミノメチルサリチル酸アルキルを、多数のものが市販されているＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分と反応性求電子又は求核部分（又はその前駆物質）の両者をもつポリエチレングリコール試薬と縮合し、Ｚ基が鎖長約３〜１２炭素当量のポリエチレングリコール鎖である一般式Ｉの試薬を得ることにより製造される。
一般式ＩＶのフェニルボロン酸錯化結合体の製造
この時点で一般式ＩＩＩのフェニルボロン酸錯化試薬を適当な生物活性種と反応させると、一般式ＩＶ：

の結合体が得られる。
あるいは、一般式Ｉ：

の試薬を利用した図１に記載の方法によっても、一般式ＩＶの結合体が得られる。
一般式Ｉの推定フェニルボロン酸錯化試薬を適当な生物活性種と反応させると、一般式ＩＩ：

の結合体が得られる。
次に一般式ＩＩの結合体をヒドロキシルアミン誘導体と縮合すると、一般式ＩＶ：

の対応するフェニルボロン酸錯化結合体が得られる。
利用可能なヒドロキシルアミン誘導体は、非限定的な例としてＮＨ₂ＯＨ、ＮＨ₂ＯＣＨ₃、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＮ、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＯＮＨ₂、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、ＮＨ₂ＯＣＨ₂ＯＣＨ₃から選択すると好ましい。一般式ＩＩにおけるＲ₂基がアルキル基である場合には、ＮＨ₂ＯＨを使用して一般式ＩＩから一般式ＩＶへの相互変換を実施すると好ましい。
一般式ＶＩの生物結合体の製造
一般式ＶＩの生物結合体は水性緩衝液又は有機溶剤中で製造することができる。好ましい緩衝液としては酢酸、クエン酸、リン酸、炭酸及びジグリシンが挙げられる。硼酸緩衝液はフェニルボロン酸錯化部分と錯化する可能性があるので避けるべきである。トリス、β−ヒドロキシアミン及びβ−ヒドロキシ酸緩衝液はフェニルボロン酸と錯化する可能性があるので避けるべきである。生物結合体は約４℃〜７０℃の温度範囲で数分以内に形成される。所与ｐＨ及び温度の水溶液中の生物結合体の安定性は置換基Ｒ₃によりある程度影響される。一般式ＶＩの生物結合体は約３．５＜ｐＨ＜１０．５の水溶液中で安定である。生物結合反応（フェニルボロン酸錯化）は０．０１〜１Ｍの範囲のイオン強度の有意変化、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びジメチルスルホキシド等の有機溶剤の存在、界面活性剤の存在、並びに尿素、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン及びホルムアミド等のカオトロピック剤（タンパク変性剤）の存在に非感受性であるが、これに対して従来技術の間接標識系では必要な結合性を保存するために生物高分子の構造を維持する必要があるのでカオトロピック剤は不適合である。一旦形成されると、生物結合体は水を除去しても安定であり、凍結乾燥保存することができる。
所与ｐＨの生物結合体の安定性はある程度まで置換基Ｒ₃により決定される。Ｒ₃基がＨである一般式ＶＩのフェニルボロン酸錯体は約３．５〜１０．５のｐＨ範囲の水性緩衝液中で安定である。Ｒ₃基がＣＨ₃である一般式ＶＩのフェニルボロン酸錯体は約４．５〜１０．５のｐＨ範囲の水性緩衝液中で安定である。Ｒ₃基が電気陰性部分を含む一般式ＶＩのフェニルボロン酸錯体は約３．５〜１０．５のｐＨ範囲の水性緩衝液中で安定である。
酸触媒加水分解に対するフェニルボロン酸錯体の安定性は、錯体に関与するヒドロキサム酸のｐＫ_aに関係する。ヒドロキサム酸部分のｐＫ_aが低いほど、錯体は安定である。従って、Ｒ₃基が電気陰性部分を含む一般式ＶＩのフェニルボロン酸錯体は、Ｒ₃基がＨ又はＣＨ₃であるものよりも酸触媒加水分解に対して高い安定性を示す。
以下、実施例により一般式Ｉ及び一般式ＩＩＩの試薬の合成を詳細に説明する。
実施例Ｉ
塩酸４−アミノメチルサリチル酸エチルの製造

４−メチルサリチル酸エチル
４−メチルサリチル酸（２０．０ｇ，１３１ｍｍｏｌ）をエタノール（３００ｍＬ）に溶かし、濃硫酸（２．０ｍＬ）を加えた。混合物を４０時間還流した。反応混合物の容量を１００ｍＬにし、分液漏斗に移し、クロロホルム（２５０ｍＬ）と水（２００ｍＬ）で希釈した。水層のｐＨが約８（ｐＨ試験紙）になるまで固体重炭酸ナトリウムを少量ずつ加えた。漏斗内の混合物を十分に震盪し、層分離させた。有機層をまず水（１５０ｍＬ）、次いで飽和塩化ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ）で洗浄した。最後に、有機溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶剤を蒸発させると、液体４−メチルサリチル酸エチル１４．０ｇ（収率５９％）が得られた。

４−ブロモメチルサリチル酸エチル
４−メチルサリチル酸エチル（１３．１ｇ，７２．５ｍｍｏｌ）を四塩化炭素（１５０ｍＬ）に溶かし、Ｎ−ブロモスクシンイミド（１３．１ｇ，７３．２ｍｍｏｌ）とベンゾイルペルオキシド（０．２ｇ，０．８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３．５時間還流した後、室温まで放冷させた。固形分を濾去し、濾液を蒸発乾涸した。粗固体生成物をヘキサン（１００ｍＬ）から結晶させると、４−ブロモメチルサリチル酸エチル５．０ｇ（収率２７％）が得られた（ｍ．ｐ．６４−６６℃）。

塩酸４−アミノメチルサリチル酸エチル
４−ブロモメチルサリチル酸エチル（４．８ｇ，１８．６ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）に溶かし、ナトリウムアジド（１．２ｇ，１８．９ｍｍｏｌ）を加えた。懸濁液を室温で２時間撹拌した。次いで反応混合物をジクロロメタン（１５０ｍＬ）で希釈し、１Ｎ塩酸水溶液（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）及び飽和塩化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で抽出した。最後に、溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸すると、４−アジドメチルサリチル酸エチルが油状物として得られた。
炭素担持パラジウム（０．５ｇ，１０％［ｗ／ｗ］）を窒素雰囲気下に１Ｌ容水素化フラスコに加えた。粗４−アジドメチルサリチル酸エチルをエタノール（２００ｍＬ）に溶かし、水素化フラスコに移した。次いで濃塩酸水溶液（２ｍＬ）を加え、フラスコをパール水素化装置に装着した。反応混合物を室温で３５ｐｓｉ水素下に４時間震盪した。次に混合物をセライトで濾過して触媒を除去し、濾液を蒸発乾涸すると、オフホワイトの固体が得られた。最後に、固体をＥｔＯＨから結晶させると、塩酸４−アミノメチルサリチル酸エチル３．１ｇ（収率７１％）が得られた（ｍ．ｐ．２４０−２４１℃）。

実施例ＩＩ
一般式Ｉの試薬Ｎ−ヨードアセチル−４−アミノメチルサリチル酸エチルの製造

Ｎ−クロロアセチル−４−アミノメチルサリチル酸エチル
塩酸４−アミノメチルサリチル酸エチル（０．５０ｇ，２．１７ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５ｍｌ）に懸濁し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３８ｍＬ，２．１８ｍｍｏｌ）を加えた。アミン塩が溶解したら、無水クロロ酢酸（０．３９ｇ，２．２５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で４．５時間撹拌した。次に反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、この溶液を１Ｎ塩酸水溶液（１００ｍＬ）、水（５０ｍＬ）及び飽和塩化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル溶液を無水硫酸マゲネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸すると、白色固体が得られた。最後にこの固体を酢酸エチル：ヘキサン（８：２，１０ｍＬ）から結晶させると、Ｎ−クロロアセチル−４−アミノメチルサリチル酸エチル０．１３ｇ（収率２２％）が得られた（ｍ．ｐ．１２０−１２１℃）。

Ｎ−ヨードアセチル−４−アミノメチルサリチル酸エチル
Ｎ−クロロアセチル−４−アミノメチルサリチル酸エチル（０．１１ｇ，０．４０ｍｍｏｌ）をアセトン（５ｍＬ）に溶かし、ヨウ化ナトリウム（０．０６ｇ，０．４０ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を２．５時間還流した後、室温まで冷却し、濾過した。濾液を蒸発乾涸すると、Ｎ−ヨードアセチル−４−アミノメチルサリチル酸エチルの白色固体が得られた（０．１９ｇ，収率１００％）（ｍ．ｐ．１０５−１０８℃）。

実施例ＩＩＩ
一般式Ｉの試薬トリフルオロ酢酸（６−アミノヘキサノイル）アミノメチルサリチル酸エチルの製造

（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−６−アミノヘキサノイル）アミノメチルサリチル酸エチル
塩酸４−アミノメチルサリチル酸エチル（０．５２ｇ，１．２８ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５ｍｌ）に懸濁し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．７９ｍＬ，４．５３ｍｍｏｌ）、次いでＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−６−アミノヘキサン酸スクシンイミジルエステル（０．７４ｇ，２．２６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を乾燥窒素下に１８時間撹拌すると、この間に全固形分が溶解した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、１Ｎ塩酸水溶液（１００ｍＬ）で抽出した。層を分離し、酢酸エチル溶液を水（１００ｍＬ）及び飽和塩化ナトリウム水溶液（５００ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発させると、非晶質オフホワイト固体が得られた。最後にこの固体を酢酸エチルから結晶させ、濾過し、減圧乾燥すると、（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−６−アミノヘキサノイル）アミノメチルサリチル酸エチル０．６７ｇ（収率７３％）が得られた（ｍ．ｐ．１２０−１２１℃、オープンキャピラリー、未補正）。

トリフルオロ酢酸（６−アミノヘキサノイル）アミノメチルサリチル酸エチル
（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−６−アミノヘキサノイル）アミノメチルサリチル酸エチル（０．５８ｇ，１．４１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶かし、溶液を氷／水浴で冷却した。トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を加え、反応混合物を室温まで昇温させた。２時間後に反応混合物を蒸発乾涸すると油状生成物が得られ、これを水酸化カリウムペレットで減圧乾燥すると、トリフルオロ酢酸（６−アミノヘキサノイル）アミノメチルサリチル酸エチル０．５９ｇ（収率９９％）が得られた。

実施例ＩＶ
一般式Ｉの試薬４−スクシニルアミノメチルサリチル酸メチルスクシンイミジルエステルの製造

４−メチルサリチル酸メチル
４−メチルサリチル酸（１００ｇ，６５８ｍｍｏｌ）を水性メタノール（５００ｍＬ）に溶かし、濃硫酸（２５ｍＬ）を慎重に加えた。溶液を１８時間還流した後、室温まで冷却した。反応混合物を約１５０ｍＬまで濃縮し、酢酸エチル（２５０ｍＬ）を加えた。酢酸エチル溶液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液で２回（各２５０ｍＬ）、次いで飽和塩化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させ、透明赤茶色液体を得た。この粗生成物を減圧蒸留（オイルポンプ）し、得られた透明粘性液体を放置すると、凝固し、４−メチルサリチル酸メチル９８．１ｇ（収率９０％）が得られた。

４−ブロモメチルサリチル酸メチル
４−メチルサリチル酸メチル（９８．１ｇ，５９０ｍｍｏｌ）を四塩化炭素（６００ｍＬ）に溶かし、Ｎ−ブロモスクシンイミド（１０５．０ｇ，５９０ｍｍｏｌ）とベンゾイルペルオキシド（０．７ｇ，３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を窒素下に還流した。２時間後、付加量（０．７ｇ）のＮ−ブロモスクシンイミドを加えた。還流を１６時間続けた。反応混合物室温まで冷却し、固形分を濾去した。黄色い濾液を蒸発乾涸すると、粘稠な黄色いシロップが得られ、放置すると凝固した。固体にヘキサン（５００ｍＬ）を加え、ほぼ全固形分が溶解するまで混合物を煮沸した。熱ヘキサン溶液を濾過し、固体が沈殿し始めるまで濃縮した。混合物を加熱して固形分を溶解させ、溶液を室温までゆっくりと放冷させた。薄黄色結晶がゆっくり形成された。次いで混合物を２時間氷冷し、結晶化を完了した。最後に固体を濾過し、冷ヘキサン（１００ｍＬ）で洗浄し、減圧乾燥すると、４−ブロモメチルサリチル酸メチル８３．５ｇ（収率５８％）が得られた（ｍ．ｐ．７３−７５℃、オープンキャピラリー、未補正）。

４−アジドメチルサリチル酸メチル
４−ブロモメチルサリチル酸メチル（８３．５ｇ，３４１ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）に溶かし、ナトリウムアジド（９２５．０ｇ，３８０ｍｍｏｌ）を加えた。黄色い懸濁液を室温で撹拌すると、固形分は迅速に溶解した。溶液は茶変し、臭化ナトリウムの沈殿が形成された。反応混合物を１６時間撹拌後、濾過した。濾液を蒸発させて茶色い油状物を得、ヘキサンと酢酸エチルの混合物（１：１［ｖ／ｖ］，１００ｍＬ）に溶かした。シリカゲル（２５ｇ，フラッシュクロマトグラフィーグレード）を茶色い溶液に加え、混合物をよくかき混ぜた。シリカをガラスフリット上で濾去し、ヘキサン：酢酸エチル（１：１［ｖ／ｖ］，各５０ｍＬ）で３回洗浄した。シリカゲルをフリット上で乾燥し、濾液をあわせて蒸発乾涸すると、暗黄色液体が得られた。粗生成物（次の反応で使用）は多少の残留Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを含有していることが判明した。

塩酸４−アミノメチルサリチル酸メチル
２Ｌ容パール水素化フラスコで粗４−アジドメチルサリチル酸メチルをメタノール（７５０ｍＬ）に溶かした。水（２５ｍＬ）中炭素担持パラジウム触媒（１０％［ｗ／ｗ］，３．８ｇ）、次いで濃塩酸（３５ｍＬ）を加えた。フラスコをパール水素化装置に装着し、混合物を室温で４０ｐｓｉ水素下に１６時間震盪した。次に反応混合物を０．４５ｍｍナイロンフィルターで濾過した。次いで保持固形分をメタノール（１５０ｍＬ）、水（１００ｍＬ）及び再びメタノール（１５０ｍＬ）で洗浄した。濾液をあわせて蒸発乾涸すると、褐色の固体が得られた。この固体を熱変性エタノール（１５０ｍＬ）に溶かし、溶液を室温まで放冷させた。すぐに白色結晶が形成された。最後に、混合物を１６〜１８時間４℃に冷却し、結晶化を完了した。固形分を濾過紙、少量の冷エタノール（５０ｍＬ）、次いでジエチルエーテル（１５０ｍＬ）で洗浄し、水酸化カリウムペレットで減圧乾燥すると、塩酸４−アミノメチルサリチル酸メチル５１．５ｇ（４−ブロモメチルサリチル酸メチルに対する収率６５％）が得られた（ｍ．ｐ．２２５−２２７℃、オープンキャピラリー、未補正）。

４−スクシニルアミノメチルサリチル酸メチル
塩酸４−アミノメチルサリチル酸メチル（３．００ｇ，１３．８ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（２５ｍＬ）に懸濁し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．７ｍＬ，１５．５ｍｍｏｌ）を加えた。懸濁液を氷／水浴中で１５分間撹拌した後、無水コハク酸（１．３６ｇ，１３．６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温まで昇温させると、この間に出発固形分は溶解した。２時間撹拌後、混合物を蒸発乾涸し、得られた固体を酢酸エチル（３００ｍＬ）と１Ｍ塩酸水溶液（１００ｍＬ）に分配した。層を分離し、酢酸エチル溶液を１Ｍ塩酸（１００ｍＬ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸すると、白色固体が得られた。最後に、固体を酢酸エチル／ヘキサンから結晶させ、濾過し、減圧乾燥すると、４−スクシニルアミノメチルサリチル酸メチル３．０２ｇ（収率８７％）が得られた（ｍ．ｐ．１６１−１６３℃）。

４−スクシニルアミノメチルサリチル酸メチルスクシンイミジルエステル
４−スクシニルアミノメチルサリチル酸メチル（２．６０ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）に溶かし、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．２９ｇ，１１．２ｍｍｏｌ）と１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．１０ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を乾燥窒素下に室温で撹拌すると、固形分は迅速に溶解した。約２０分後に白色沈殿が形成された。反応混合物を１６〜１８時間撹拌後、−２０℃で数時間冷却した。混合物を冷濾過し、固形分を少量のテトラヒドロフラン（２５ｍＬ）で洗浄した。濾液をあわせて蒸発乾涸し、残渣を酢酸エチル／ヘキサンから結晶させ、濾過し、減圧乾燥すると、４−スクシニルアミノメチルサリチル酸メチルスクシンイミジルエステル２．３９ｇ（収率６２％）が得られた（ｍ．ｐ．１３３−１３５℃）。

実施例Ｖ
一般式Ｉの試薬塩酸（６−アミノヘキサノイル）アミノメチルサリチル酸メチルの製造

（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−６−アミノヘキサノイル）アミノメチルサリチル酸メチル
塩酸４−アミノメチルサリチル酸メチル（２．２５ｇ，１０．３ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３０ｍｌ）に懸濁し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．６ｍＬ，２０．７ｍｍｏｌ）、次いでＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−６−アミノヘキサン酸スクシンイミジルエステル（３．３８ｇ，１０．３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を乾燥窒素下に１８時間撹拌すると、この間に全固形分は溶解した。次に溶剤を蒸発させると、薄茶色のシロップが残り、これを酢酸エチル（１００ｍＬ）と１Ｍ塩酸水溶液（１００ｍＬ）に分配した。層を分離し、酢酸エチル溶液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸すると、非晶質オフホワイト固体が得られた。この固体を酢酸エチル／ヘキサンから結晶させ、濾過し、減圧乾燥すると、（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−６−アミノヘキサノイル）アミノメチルサリチル酸メチル３．２５ｇ（収率８０％）が得られた（ｍ．ｐ．１２０−１２１℃、オープンキャピラリー、未補正）。

塩酸（６−アミノヘキサノイル）アミノメチルサリチル酸メチル
（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−６−アミノヘキサノイル）アミノメチルサリチル酸メチル（３．００ｇ，７．６０ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶かし、溶液に無水塩化水素をゆっくりとバブリングした。ガスが溶解するにつれて反応混合物は昇温した。５分後にガスを遮断し、溶液を室温で撹拌した。溶液中に自色沈殿が形成された。３０分後に反応混合物を２時間氷冷却した後、固形分を濾過し、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄し、水酸化カリウムペレットで減圧乾燥すると、塩酸（６−アミノヘキサノイル）アミノメチルサリチル酸メチル２．５０ｇ（収率９９％）が得られた（１５８−１６０℃で発泡分解、オープンキャピラリー、未補正）。

実施例ＶＩ
一般式Ｉの試薬４−グルタリルアミノメチルサリチル酸シアノメチルスクシンイミジルエステルの製造

Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸メチル
塩酸４−アミノメチルサリチル酸メチル（１０．９ｇ，５０ｍｍｏｌ）を無水メタノール（２００ｍＬ）に懸濁し、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（１０．９ｇ，５０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（７．０ｍＬ，５０ｍｍｏｌ）を加えた。固形分はすぐに溶解し、ゆっくりとガスが発生した。反応混合物を乾燥窒素下に室温で１８時間撹拌後、蒸発乾涸すると、白色非晶質体が得られた。この非晶質体を酢酸エチル（２００ｍＬ）と水（１００ｍＬ）に分配した。層を分離し、酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶液を濾過し、蒸発させると、白色固体が得られた。この固体を酢酸エチル／ヘキサンから結晶させ、濾過し、減圧乾燥すると、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸メチル１３．７ｇ（収率９７％）が得られた（ｍ．ｐ．９５−９６℃、オープンキャピラリー、未補正）。

Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸メチル（８．７ｇ，３０．９ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）に溶かし、トリメチルシラノール酸カリウム（４．４ｇ，３０．９ｍｍｏｌ，純度９０％）を加えた。黄色い溶液を２４時間還流すると、この間に褐色の沈殿が形成され、溶剤は薄茶色になった。混合物を蒸発乾涸し、固形分を冷水（１００ｍＬ）に溶かした。茶色い溶液を氷浴で冷却し、溶液を撹拌しながら飽和硫酸水素カリウム水溶液でｐＨ２〜３に滴定した。滴定中にオフホワイトの固体が沈殿した。固体を濾過し、冷水で洗浄し、水酸化カリウムで減圧乾燥すると、粗Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸６．７ｇ（収率８１％）が得られた（ｍ．ｐ．１４１−１４４℃、融点で発泡しながら分解、オープンキャピラリー、未補正）。

Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸シアノメチル
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸（８．２ｇ，３０．６ｍｍｏｌ）をクロロアセトニトリル（２５ｍＬ）に懸濁し、トリエチルアミン（４．３ｍＬ，３０．６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５０℃で乾燥窒素下に撹拌し、固形分を溶解させた。溶液を１８時間撹拌後、室温まで冷却した。溶剤を蒸発させ、残渣を酢酸エチル（２５０ｍＬ）と水（２５０ｍＬ）に分配した。層を分離し、酢酸エチル層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸した。残留している淡褐色固形分を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶かし、シリカゲル（１０ｇ，フラッシュクロマトグラフィーグレード）を加えた。混合物をよくかき混ぜ、室温で５分間放置した。シリカをガラスフリット上で濾去し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で洗浄した。濾液を蒸発乾涸した。固体残渣を酢酸エチル／ヘキサンから結晶させると、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸シアノメチル７．９ｇ（収率８８％）が得られた（ｍ．ｐ．１４４−１４６℃、オープンキャピラリー、未補正）。

塩酸アミノメチルサリチル酸シアノメチル
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸シアノメチル（７．７ｇ，２６．２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）に溶かし、無水塩化水素を溶液にゆっくりとバブリングした。ガスが溶解するにつれて反応混合物は昇温した。５分後にガスを遮断し、溶液を室温で撹拌した。粘稠クリーム状白色沈殿が溶液中に形成された。３０分後に反応混合物を２時間氷冷した後、固形分を濾過し、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）で洗浄し、水酸化カリウムペレットで減圧乾燥すると、塩酸アミノメチルサリチル酸シアノメチル５．８ｇ（収率９１％）が得られた（ｍ．ｐ．２１０℃で暗色化、２２８℃で分解、オープンキャピラリー、未補正）。

４−グルタリルアミノメチルサリチル酸シアノメチル
塩酸４−アミノメチルサリチル酸シアノメチル（１．２２ｇ，５．０４ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（１００ｍＬ）に懸濁し、懸濁液を氷／水浴中で撹拌した。次に、無水グルタル酸（０．５７ｇ，５．０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．７ｍＬ，５．０ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２５ｍＬ）溶液を１５分間かけて滴下した。混合物を室温まで昇温させ、反応混合物を１８時間撹拌した。混合物を蒸発乾涸し、得られた固体を冷０．１Ｍ塩酸水溶液（５０ｍＬ）下に摩砕した。固形分を濾取し、冷水で洗浄し、水酸化カリウムペレットで減圧乾燥すると、４−グルタリルアミノメチルサリチル酸シアノメチル１．４３ｇ（収率８９％）が得られた（ｍ．ｐ．１２５−１２６℃）。

４−グルタリルアミノメチルサリチル酸シアノメチルスクシンイミジルエステル
４−グルタリルアミノメチルサリチル酸シアノメチル（１．００ｇ，３．１ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶かし、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３６ｇ，３．１ｍｍｏｌ）と１，３−ジクロロヘキシルカルボジイミド（０．６４ｇ，３．１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を乾燥窒素下に室温で撹拌すると、固形分はすぐに溶解した。約６０分後に自色沈殿が形成された。反応混合物を２４時間撹拌後、−２０℃で数時間冷却した。混合物を冷濾過し、固形分を少量のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）で洗浄した。濾液をあわせて蒸発乾涸し、残渣を酢酸エチル／ヘキサンから結晶させ、濾過し、減圧乾燥すると、４−グルタリルアミノメチルサリチル酸シアノメチルスクシンイミジルエステル１．０４ｇ（収率８０％）が得られた（ｍ．ｐ．１１６−１１９℃）。

実施例ＶＩＩ
一般式Ｉの試薬４−（６−マレイミドヘキサノイル）アミノメチルサリチル酸シアノメチルの製造

４−（６−マレイミドヘキサノイル）アミノメチルサリチル酸シアノメチル
塩酸４−アミノメチルサリチル酸シアノメチル（７９ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）と６−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１００ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）に懸濁し、懸濁液を室温で撹拌した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８７μＬ，０．５０ｍｍｏｌ）を加えた。固形分はすぐに溶解し、透明な薄黄色溶液が得られた。３０分後に混合物を蒸発乾涸し、残渣を酢酸エチル（２５ｍＬ）と冷０．１Ｍ塩酸水溶液（２５ｍＬ）に分配した。層を分離し、酢酸エチル溶液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させると、白色固体が得られた。固体を酢酸エチル／ヘキサンから結晶させると、４−（６−マレイミドヘキサノイル）アミノメチルサリチル酸シアノメチル１０８ｍｇ（収率８４％）が得られた（ｍ．ｐ．１４１−１４４℃）。

実施例ＶＩＩＩ
一般式Ｉの試薬４−（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル）アミノメチルサリチル酸シアノメチルの製造

４−（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル）アミノメチルサリチル酸シアノメチル
塩酸４−アミノメチルサリチル酸シアノメチル（７９ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）と（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１００ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）に懸濁し、懸濁液を室温で撹拌した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８７μＬ，０．５０ｍｍｏｌ）を加えた。固形分はすぐに溶解し、透明な淡褐色溶液が得られた。３０分後に混合物を蒸発乾涸し、残渣を酢酸エチル（２５ｍＬ）と冷０．１Ｍ塩酸水溶液（２５ｍＬ）に分配した。層を分離し、酢酸エチル溶液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させると、透明油状物が得られた。冷ヘキサン下に摩砕すると、４−（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル）アミノメチルサリチル酸シアノメチルのガム６４ｍｇ（収率４８％）が得られた。

実施例ＩＸ
一般式ＩＩＩの試薬４−グルタリルアミノメチルサリチルヒドロキサム酸ヒドラジドの製造

４−グルタリルアミノメチルサリチル酸メチルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルヒドラジド
［無水コハク酸の代わりに無水グルタル酸を使用して上記スクシニル誘導体と同様に製造した］４−グルタリルアミノメチルサリチル酸メチルスクシンイミジルエステル（２．５７ｇ，６．８ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）に溶かし、ｔｅｒｔ−ブチルカルバゼート（０．９０ｇ，６．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で６０時間撹拌した。次いで、溶液を蒸発乾涸し、残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶かした。酢酸エチル溶液を飽和重炭酸カリウム水溶液（１００ｍＬ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。次いで、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸した。残渣を温和に昇温しながら酢酸エチル（５０ｍＬ）に溶かし、温溶液にヘキサン（５０ｍＬ）を加え、−２０℃に冷却することにより結晶させた。結晶化が開始したら、更にヘキサン（５０ｍＬ）を加え、混合物を−２０℃に１８時間冷却した。最後に、固形分を濾過し、ヘキサン：酢酸エチル（２：１［ｖ／ｖ］，９０ｍＬ）で洗浄し、減圧乾燥すると、４−グルタリルアミノメチルサリチル酸メチルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルヒドラジド２．５１ｇ（収率９０％）が得られた（ｍ．ｐ．６８−７２℃、オープンキャピラリー、未補正）。

４−グルタリルアミノメチルサリチルヒドロキサム酸Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルヒドラジド
硫酸ヒドロキシルアミン（０．８２ｇ，５．０ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（１．００ｇ，２５．０ｍｍｏｌ）及び亜硫酸ナトリウム（０．２０ｇ，ｍｍｏｌ）の冷（氷／水浴）水（２５ｍＬ）溶液に４−グルタリルアミノメチルサリチル酸メチルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルヒドラジド（２．００ｇ，４．９ｍｍｏｌ）を加えた。懸濁液を暗所で１８時間撹拌し、室温まで昇温させた。次いで溶液を濾過し、多少の不溶分を除去し、薄黄色溶液を氷／水浴で冷却した。冷反応混合物を冷硫酸（２５％［ｖ／ｖ］水溶液）でｐＨ３〜４までゆっくりと滴定すると、この間にガム状物質が沈殿した。次いで混合物を数時間氷冷し、液体をデカントした。残留非晶質固体をメタノール（２５ｍＬ）に溶かし、濾過し、蒸発させると、白色泡状物が得られた。泡状物を減圧乾燥すると、粗４−グルタリルアミノメチルサリチルヒドロキサム酸Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルヒドラジド１．８６ｇ（収率９４％）が得られた。

塩酸４−グルタリルアミノメチルサリチルヒドロキサム酸ヒドラジド
４−グルタリルアミノメチルサリチルヒドロキサム酸Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルヒドラジド（１．８６ｇ，４．６ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）に溶かし、無水塩化水素を溶液にゆっくりとバブリングした。ガスが溶解するにつれて反応混合物は昇温した。５分後にガスを遮断し、溶液を室温で撹拌した。溶液中に白色沈殿が形成された。３０分後に反応混合物を２時間氷冷した後、固形分を濾過し、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄し、水酸化カリウムペレットで減圧乾燥すると、塩酸４−グルタリルアミノメチルサリチルヒドロキサム酸ヒドラジド１．５１ｇ（収率９５％）が得られた（ｍ．ｐ．６５℃で減量、１００℃で発泡分解、オープンキャピラリー、未補正）。

実施例Ｘ
一般式ＩＩＩの試薬４−グルタリルアミノメチルサリチル（Ｏ−メチル）ヒドロキサム酸スクシンイミジルエステルの製造

Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−４−アミノメチルサリチル酸メチル
塩酸４−アミノメチルサリチル酸メチル（５．０４ｇ，２３．２ｍｍｏｌ）をクロロホルム（８０ｍＬ）に懸濁し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４．１０ｍＬ，２３．５ｍｍｏｌ）とＮ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（６．４８ｇ，２６．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で４時間撹拌すると、この間に全固形分が溶解した。次に反応混合物を１Ｎ塩酸水溶液（１００ｍＬ）、水（７５ｍＬ）及び飽和塩化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で抽出した。クロロホルム溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸すると、白色固体が得られた。生成物を酢酸エチル：ヘキサンから結晶させると、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−４−アミノメチルサリチル酸メチル６１．７ｇ（収率８４％）が得られた（ｍ．ｐ．９１−９２℃、オープンキャピラリー、未補正）。

Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−４−アミノメチル−２−Ｏ−ベンジルサリチル酸メチル
Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−４−アミノメチルサリチル酸メチル（６．０６ｇ，１９．２ｍｍｏｌ）をアセトン（１５０ｍＬ）に溶かし、臭化ベンジル（２．６０ｍＬ，２１．９ｍｍｏｌ）と無水炭酸カリウム（１３．２８ｇ，９６．１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を撹拌し、２２時間加熱還流した。混合物を濃縮し、アセトンの大部分を除去し、酢酸エチル（１００ｍＬ）を加えた。頻繁にかき混ぜながら塩酸水溶液（１Ｎ，２００ｍＬ）をゆっくり加え、固形炭酸塩を溶解させた。層を分離し、水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル溶液をあわせ、水（１００ｍＬ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、約５０ｍＬまで濃縮した。この溶液を沸点まで加熱し、ヘキサン（１５０ｍＬ）を加えた。溶液を氷冷すると、結晶がゆっくりと形成された。結晶を濾取し、ヘキサンで洗浄し、減圧乾燥すると、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−４−アミノメチル−２−Ｏ−ベンジルサリチル酸メチル６．９７ｇ（収率８９％）が得られた（ｍ．ｐ．１０６−１０７℃、オープンキャピラリー、未補正）。

Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−４−アミノメチル−２−Ｏ−ベンジルサリチル酸
Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−４−アミノメチル−２−Ｏ−ベンジルサリチル酸メチル（６．８１ｇ，１６．８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶かした。水酸化リチウム・１水和物（０．７８ｇ，１８．５ｍｍｏｌ）の水（２５ｍＬ）溶液を加え、反応混合物を７５℃で２４時間加熱撹拌した。溶液を冷却し、１Ｎ塩酸水溶液（５０ｍＬ）を加えた。反応混合物を酢酸エチルで２回（１５０ｍＬ、次いで５０ｍＬ）抽出した。酢酸エチル抽出層をあわせて水（７５ｍＬ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、１５０ｍＬまで濃縮した。酢酸エチル溶液を沸点まで加熱し、ヘキサン（１５０ｍＬ）を加えた。溶液を氷冷すると、結晶が形成された。結晶を濾取し、ヘキサンで洗浄し、減圧乾燥すると、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−４−アミノメチル−２−Ｏ−ベンジルサリチル酸５．９２ｇ（収率９０％）が得られた（ｍ．ｐ．１３９−１４０℃、オープンキャピラリー、未補正）。

Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−４−アミノメチル−２−Ｏ−ベンジルサリチル（Ｏ−メチル）ヒドロキサム酸
Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−４−アミノメチル−２−Ｏ−ベンジルサリチル酸（３．０７ｇ，７．８４ｍｍｏｌ）を乾燥窒素下に無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７５ｍＬ）に溶かした。溶液を氷／水浴で冷却後、トリエチルアミン（２．２０ｍＬ，１５．８ｍｍｏｌ）、次いでクロロギ酸イソブチル（１．１０ｍＬ，８．４８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を氷中で１．５時間撹拌した。塩酸メトキシルアミン（０．６７ｇ，８．０２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温まで昇温させた。３時間後に反応混合物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で希釈し、１Ｎ塩酸水溶液（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）及び飽和塩化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、約５０ｍＬまで濃縮した。この溶液を煮沸し、ヘキサン（１００ｍＬ）を加えた。氷浴中で冷却すると、すぐに結晶が形成された。結晶を濾取し、ヘキサンで洗浄すると、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−４−アミノメチル−２−Ｏ−ベンジルサリチル（Ｏ−メチル）ヒドロキサム酸２．８７ｇ（収率８７％）が得られた（ｍ．ｐ．１１６−１１７℃、オープンキャピラリー、未補正）。

塩酸４−アミノメチルサリチル（Ｏ−メチル）ヒドロキサム酸
Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−４−アミノメチル−２−Ｏ−ベンジルサリチル（Ｏ−メチル）ヒドロキサム酸（１．４２ｇ，３．３８ｍｍｏｌ）と炭素担持パラジウム（０．１０ｇ，１０％［ｗ／ｗ］）を乾燥窒素下に１Ｌ容水素化フラスコに入れた。エタノール（１５０ｍＬ）、次いで濃塩酸水溶液（０．３０ｍＬ）を加えた。フラスコをパール水素化装置に装着し、室温で３５ｐｓｉ水素下に７時間震盪した。次に反応混合物をセライトで濾過して触媒を除去し、沈殿が形成し始めるまで濾液を濃縮した。混合物を氷冷し、固形分を濾取し、ヘキサンで洗浄し、減圧乾燥すると、塩酸４−アミノメチルサリチル（Ｏ−メチル）ヒドロキサム酸０．６５ｇ（収率８３％）が得られた（ｍ．ｐ．＞２５０℃、オープンキャピラリー、未補正）。

４−グルタリルアミノメチルサリチル（Ｏ−メチル）ヒドロキサム酸スクシンイミジルエステル
塩酸４−アミノメチルサリチル（Ｏ−メチル）ヒドロキサム酸（０．５７ｇ，１．８２ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶かし、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３５ｍＬ，２．０１ｍｍｏｌ）と無水グルタル酸（０．２３ｇ，２．０２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２６時間撹拌した後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．２３ｇ，２．００ｍｍｏｌ）と１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．４２ｇ，２．０１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で更に２４時間撹拌した。次に混合物を濾過し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈した。酢酸エチル溶液を１Ｎ塩酸水溶液（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）及び飽和塩化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。次いで溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸した。粗ガム状生成物を酢酸エチルとジエチルエーテルの混合物下に摩砕し、得られた固体を濾過及び減圧乾燥すると、４−グルタリルアミノメチルサリチル（Ｏ−メチル）ヒドロキサム酸スクシンイミジルエステル０．１５ｇ（収率２０％）が得られた（ｍ．ｐ．１２１−１２４℃、オープンキャピラリー、未補正）。

実施例ＸＩ
一般式ＩＩＩの試薬４−（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル）アミノメチルサリチル（Ｏ−メチル）ヒドロキサム酸の製造

４−（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル）アミノメチルサリチル（Ｏ−メチル）ヒドロキサム酸
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１００ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）に溶かし、Ｎ，Ｎ−イソプロピルエチルアミン（６５μＬ，０．３６ｍｍｏｌ）、次いで塩酸４−アミノメチルサリチル（Ｏ−メチル）ヒドロキサム酸（８２ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で６時間撹拌した。溶剤を減圧蒸発させ、ジクロロメタン／メタノール／酢酸（９５：５：１［ｖ／ｖ／ｖ］）を溶離溶媒として残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにかけた。所望生成物を含むフラクションをプールし、油状物まで蒸発させると、４−（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル）アミノメチルサリチル（Ｏ−メチル）ヒドロキサム酸４４ｍｇ（収率３５％）が得られた。

実施例ＸＩＩ
一般式ＩＶの結合体の製造
５’−ＰＢＡ標識オリゴデオキシリボヌクレオチド結合体の合成
標準自動ホスホロアミダイト化学（Ｂｅｃｋｍｋａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｏｌｉｇｏ １０００及び関連試薬）を使用して１μｍｏｌ規模でオリゴデオキシリボヌクレオチド７１７２（配列５’−ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＴＴＧＴＡＣＧＧＡＣ−３’）を合成した。同一装置で保護アミン含有ホスホロアミダイト（Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ ２，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ又はＵｎｉＬｉｎｋ Ａｍｉｎｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、標準化学を使用してオリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端に１〜４個の反応性第１級アミンを導入した。次に、完成したオリゴデオキシリボヌクレオチドを支持体から分離し、ＵｌｔｒａＦａｓｔ Ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）と製造業者によるプロトコールを使用してヌクレオ塩基を脱保議した。
アミノオリゴヌクレオチドをエタノール沈殿により精製し、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃０．８ｍＬに溶かし、反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分をもつフェニルボロン酸試薬（ＰＢＡ−Ｚ−ＮＨＳ）（無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド０．２ｍＬ中でアミノオリゴヌクレオチド上に第１級アミノ基１ｍｍｏｌ当たり５ｍｇ）と室温で２〜１８時間縮合した。
粗ＰＢＡ修飾オリゴヌクレオチドを０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ６．５）中ＫｗｉｋＳｅｐ Ｄｅｘｔｒａｎカラム（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）でゲル濾過により反応混合物から分離した。次にＰＢＡ修飾オリゴヌクレオチドを真空遠心機で１ｍＬまで濃縮し、酢酸トリエチルアンモニウム−アセトニトリル勾配を使用して４．６ｍｍ×２５０ｍｍ Ｃ１８カラムで逆相ＨＰＬＣにより精製した。所望生成物ピークを集め、真空遠心機で蒸発させて小ペレットとし、水０．５ｍＬに溶かし、凍結保存した。
サリチルヒドロキサム酸磁気ビーズの製造
未修飾Ｍ２８０又はＭ４５０磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）１０ｍｌをアセトニトリルで徐々に脱水し、−７８℃ジクロロメタン中で塩化オキサリル活性化Ｎ，Ｎ−ジメチルスルホキシドとトリエチルアミンを使用してアルデヒド修飾ビーズに変換した。得られたアルデヒドをもつビーズを徐々に再水和し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）５ｍＬに懸濁した。１５〜２５ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルスルホキシド２００μＬに溶かして加え、結合反応混合物を室温で一晩回転させることにより、アルデヒド基を４−グルタリルアミノメチルサリチルヒドロキサム酸ヒドラジド（ＳＨＡ−Ｚ−ＮＨＮＨ₂）に結合した。次にビーズを十分に水洗し、１０％エタノール５ｍＬ中に保存した。
サリチルヒドロキサム酸（ＳＨＡ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂの製造
（６−アミノヘキサノイル）−４−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸（ＳＨＡ−Ｚ−ＮＨ₂）１３０ｍｇを０．２Ｍ ＮａＨＣＯ₃３０ｍＬに溶かし、ＨＣｌ洗浄ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｌａ）６．５ｇと室温で一晩混合することにより、ＳＨＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂを調製した。結合反応後、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）２ｍＬを加え、ゲルスラリーを室温で１時間混合し、水、０．５Ｍ ＮａＣｌ、更に再び水で洗浄した。得られたＳＨＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂを２０％エタノール３０ｍＬに懸濁し、４℃で保存した。
フェニルボロン酸−α−ビオチン抗体結合体の製造
α−ビオチンモノクローナルＩｇＧ₁抗体（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃中６．５ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬをＰＢＡ−Ｚ−ＮＨＳ（６０ｍＭ ＰＢＡ−Ｚ−ＮＨＳ ７．４μｌをＮ，Ｎ−ジメチルスルホキシドに溶解）４４０ｎｍｏｌと室温で１時間結合させた。未結合ＰＢＡ−Ｚ−ＮＨＳとその水解物を透析により除去した。得られた結合体（Ｐ８Ａ−α−ビオチン）の紫外線吸収スペクトルはＡ₂₈₀に対してＡ₂₆₀の増加を示し、フェニルボロン酸修飾に一致した。
フェニルボロン酸−アルカリホスファターゼ結合体の製造
アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ，６ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃１Ｌで透析し、氷上でＰＢＡ−Ｚ−ＮＨＳ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中７０ｍＭストック１０μＬ）７００ｎｍｏｌと２時間結合させた。未結合ＰＢＡ−Ｚ−ＮＨＳとその水解物を０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃で透析により除去した。得られた結合体（ＰＢＡ−ＡＰ）の紫外線吸収スペクトルはＡ₂₈₀に対してＡ₂₆₀の増加を示し、フェニルボロン酸修飾に一致した。結合体を４℃で保存した。
サリチルヒドロキサム酸−ヤギα−マウス抗体結合体の製造
ヤギα−マウス抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃中８．８ｍｇ／ｍＬ）２ｍＬを４−グルタリルアミノメチルサリチル酸メチルスクシンイミジルエステル［ＳＡ（ＯＭｅ）−Ｚ−ＮＨＳ］２．３５μｍｏｌと室温で１時間結合させた。２Ｍ ＮＨ₂ＯＨ（ｐＨ１０）２ｍＬを加え、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを１０に調整し、反応混合物を室温で３日間インキュベートすることにより、結合体のメチルエステルをヒドロキサム酸に変換した。ＮＨ₂ＯＨ及び未結合ＳＡ（ＯＭｅ）−Ｚ−ＮＨＳとその水解物を０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃中でＧ−２５ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（Ｐｈａｒｍａｌａ）でゲル濾過により除去し、結合体（ＳＨＡ−ヤギα−マウス）を４℃で保存した。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコール
λＤＮＡの１領域（８０１ｂｐ）をポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。ＰＣＲ反応は、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中１μＭのビオチン及びＰＢＡ修飾オリゴヌクレオチドプライマー、λＤＮＡ（１ｎｇ／μＬ）及びＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ１Ｕ以外に、２００μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを用いた。反応混合物を９２℃で１分間変性させ、９５℃１０秒間、６２℃２０秒間及び７２℃３０秒間と７２℃で５分間の最終延長からなる３５ＰＣＲサイクルにより増幅した。反応により増幅産物（８０１ｂｐ）５０〜１００ｎｇが生成され、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１００ｍＭ硼酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．３）中１％アガロースゲル上で電気泳動中に未修飾ＰＣＲ産物よりも遅い移動度を示した。
実施例ＸＩＩＩ
一般式ＶＩの生物結合体の製造
ＰＢＡ標識ＰＣＲ産物の検出
ＳＨＡ−磁気ビーズ上のＰＢＡ標識ＰＣＲ産物の検出
ＰＢＡ標識ＰＣＲ産物（０．０２μＬ〜５μＬ）を１．５Ｍ ＮａＣｌ，１５０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７（１０×ＳＳＣ）２５〜１００μＬで希釈し、ＳＨＡ磁気粒子（１０〜５０μｌ）を入れたポリプロピレンマイクロタイタープレートウェルに加えた。粒子とＰＣＲ産物を室温で３０〜６０分間ときどき混合した。磁気プレートでウェルの底に磁気粒子を集め、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０，ｐＨ８（ＥＬＩＳＡ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ）で５回洗浄した。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ，ＮａＣｌ，Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８中０．２Ｕ／ｍＬ）１００μｌを加え、室温で３０分間磁気粒子と混合した。磁気プレートでウェルの底に磁気粒子を集め、ＥＬＩＳＡ Ｗａｓｈで５回洗浄した。アルカリホスファターゼ基質（１Ｍジエタノールアミン緩衝液，１ｍＭ ＭｇＣｌ₂，０．１ｍＭ ＺｎＣｌ₂，ｐＨ１０．４中１ｍｇ／ｍＬ ｐ−ニトロフェニルホスフェート）を加え、３７℃で１０〜６０分間発色させた。検出下限はＰＣＲ産物５０ｐｇであった。
実施例ＸＩＶ
一般式ＶＩの生物結合体の製造
ＰＢＡ標識オリゴヌクレオチドハイブリッドの検出
ビオチン標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたＰＢＡ標識オリゴヌクレオチドの検出
１．５Ｍ ＮａＣｌ、１５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）中５’−ＰＢＡ及びビオチンラベルをもつ２種の２１量体オリゴヌクレオチドと４２量体オリゴヌクレオチドを４５℃で１０分間ハイブリダイズした。ポリプロピレンマイクロタイタープレートウェルでハイブリダイゼーション混合物２５μＬをＳＨＡ−磁気粒子（Ｄｙｎａｌ，Ｍ４５０）１〜５０μＬと混合した。３０分後に磁気粒子を磁気プレートでウェルの底に集め、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ８）で５回洗浄した。
ＳＨＡ−ＡＰ（１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８中１μｇ／ｍＬ）１００μＬを磁気粒子に加え、よく混合した。３０分後に磁気粒子を磁気プレートでウェルの底に集め、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ８で６回洗浄した。粒子をアルカリホスファターゼ基質（１Ｍジエタノールアミン緩衝液、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂，０．１ｍＭ ＺｎＣｌ₂，ｐＨ１０．４中１ｍｇ／ｍＬ ｐ−ニトロフェニルホスフェート）と混合し、３７℃で９０分間インキュベートした。Ａ₄₀₅をＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。４５ｐｇ程度の少量のオリゴヌクレオチド４２量体が検出された。４２量体又はＰＢＡ又はビオチン標識オリゴヌクレオチドを含まない実験対照は有意Ａ₄₀₅を生じなかった。
実施例ＸＶ
一般式ＶＩの生物結合体の製造
ＳＨＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＢへのＰＢＡ−α−ビオチン結合体の固定化
Ｔｒｉｓ塩類緩衝液で１ｍＬまで希釈したＰＢＡ−α−ビオチン１ｍｇをＳＨＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂの小カラム（１．０×２．０ｃｍ）に加え、Ｔｒｉｓ塩類緩衝液で十分に洗浄した。カラムに結合していない材料のＡ₂₈₀ピークのサイズによると、ＰＢＡ結合体のほぼ全部がカラムに固定化されていると判断された。
５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＴｒｉｓ塩類緩衝液中１μｇ／ｍＬビオチン化アルカリホスファターゼ５ｍＬをカラムに加えることにより、カラムのビオチン結合活性を調べた。カラムに加えたアルカリホスファターゼ希釈液の試料と酵素活性を比較するために、カラムを流れる材料のピークの試料を集めた。試料の添加後、カラムを緩衝液２０ｍＬで洗浄した。洗浄後、カラム材料の非常に小さい試料（ゲル約１μＬを含む液体２５μＬ）を集め、固定化α−ビオチン抗体による捕獲の結果としてゲルに結合した酵素活性を測定した。
１Ｍジエタノールアミン緩衝液，１ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び０．１ｍＭ ＺｎＣｌ₂，ｐＨ１０．４中１ｍｇ／ｍＬ ｐ−ニ卜ロフェニルホスフェート２５０μＬ中で酵素試料２５μＬをインキュベートした後、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃，１０ｍＭ ＥＤＴＡ ６５０μＬを加えることにより、アルカリホスファターゼ活性を測定した。緩衝液ブランクを基準にすると、カラムに添加した試料のＡ₄₀₅は１．５７であったが、カラムにより保持されなかった材料のピークのＡ₄₀₅は０．０４２でしかなく、実質的に全酵素結合体がカラムに捕獲されたことを示した。少量のゲルで試験した処、Ａ₄₀₅は１．３０であり、酵素が実際にカラムに捕獲されたことを示した。
実施例ＸＶＩ
一般式ＶＩの生物結合体の製造
ＳＨＡ−磁気ビーズへのＰＢＡ−アルカリホスファターゼ結合体の固定化
５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含むＴｒｉｓ塩類緩衝液で５μｇ／ｍＬまでＰＢＡ結合アルカリホスファターゼを希釈した。希釈したＰＢＡ結合酵素２００μｇをＳＨＡ−磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｍ２８０）と混合した。対照として酵素を未修飾ビーズ４０μＬとも混合した。ビーズを１０分間氷上で静かに混合した後、ビーズを希土類磁石で集め、Ｔｒｉｓ塩類緩衝液で４回洗浄した。次に１Ｍジエタノールアミン緩衝液，１ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び０．１ｍＭ ＺｎＣｌ₂，ｐＨ１０．４中１ｍｇ／ｍＬ ｐ−ニトロフェニルホスフェート２５０μＬにビーズを懸濁し、３７℃で１０分間ときどき混合した。Ｔｒｉｓ塩類緩衝液，５ｍＭ ＥＤＴＡ ７５０μＬで反応を終了した。緩衝液ブランクに対するＡ₄₀₅を測定し、磁気ビーズに結合したアルカリホスファターゼ活性を調べた。対照ビーズは僅か０．１５のＡ₄₀₅しか生じなかったが、ＳＨＡ−磁気ビーズはビーズ５、１０及び２０μＬで夫々０．６２、０．９７及び１．３３のＡ₄₀₅を生じ、有意量のＰＢＡ−ＡＰ結合体がビーズの表面に固定化していることを示した。

Claims (39)

1. 一般式Ｉ：
   

   

   一般式Ｉ
   （式中、Ｚ基は、１〜６個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも１個をもつ６〜１８個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに３〜１２個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、Ｒ₁基は、タンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種との反応に利用可能な求電子又は求核基であって、アクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択され、Ｒ₂基はアルキル又は電気陰性基をもつメチレン基の１種である）をもつ試薬。
2. Ｒ₂基がＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂及びＣＨ₂ＯＣＨ₃の１種から選択される請求項１に記載の試薬。
3. Ｚ基が一般式（ＣＨ₂）_n（式中、ｎ＝１〜６）の非分枝アルキル鎖である請求項１に記載の試薬。
4. 式：
   

   

   （式中、Ｒ₂基はアルキル又は電気陰性基をもつメチレンの１種である）をもつ試薬。
5. Ｒ₁基がアクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択される請求項１に記載の試薬。
6. 一般式ＩＩ：
   

   

   （式中、Ｚ基は、１〜６個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも１個をもつ６〜１８個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに３〜１２個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、Ｒ₂基はアルキル又は電気陰性基をもつメチレンの１種であり、ＢＡＳはタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種であり、請求項１記載のＲ ₁ 基の一部を含み得る）をもつ生物活性種と試薬の結合体。
7. Ｒ₂基がＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂及びＣＨ₂ＯＣＨ₃の１種から選択される請求項６に記載の結合体。
8. Ｚ基が一般式（ＣＨ₂）_n（式中、ｎ＝１〜６）の非分枝アルキル鎖である請求項６に記載の結合体。
9. 一般式：
   

   

   （式中、Ｒ₂基はＣＨ₃である）をもつ請求項６に記載の結合体。
10. 請求項１に記載の試薬と生物活性種を縮合することから成る、一般式ＩＩ：
    

    

    （式中、Ｚ基は、１〜６個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも１個をもつ６〜１８個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに３〜１２個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、Ｒ₂基はアルキル又は電気陰性基をもつメチレンの１種であり、ＢＡＳはタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種であり、請求項１記載のＲ ₁ 基の一部を含み得る）の製造方法。
11. 一般式Ｉ：
    

    

    （式中、Ｚ基は、１〜６個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも１個をもつ６〜１８個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに３〜１２個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、Ｒ₁基は、タンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種との反応に利用可能な求電子又は求核基であって、アクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択され、Ｒ₂基は炭素原子数１〜３の非分枝アルキルである）の製造方法であり、
    ４−メチルサリチル酸及び５−メチルサリチル酸のひとつをエステル化し、４−メチルサリチル酸アルキル又は５−メチルサリチル酸アルキル：
    

    

    （式中、Ｒ₂基は炭素原子数１〜３の非分枝アルキルである。）を得る段階と、４−メチルサリチル酸アルキル又は５−メチルサリチル酸アルキルをハロゲン化し、ベンジルハライド：
    

    

    （式中、Ｙはハロゲンである。）を得る段階と、
    ベンジルハライドをアジド塩と反応させ、ベンジルアジド：
    

    

    を得る段階と、
    ベンジルアジドを水素化し、ベンジルアミン：
    

    

    を得る段階と、
    ベンジルアミンを活性化カルボン酸と縮合する段階を含む前記方法。
12. Ｒ₁基がアクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択される請求項１１に記載の方法。
13. 一般式Ｉ：
    

    

    （式中、Ｚ基は、１〜６個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも１個をもつ６〜１８個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに３〜１２個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、Ｒ₁基は、タンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種との反応に利用可能な求電子又は求核基であって、アクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択され、Ｒ₂基は電気陰性基をもつメチレン基である）の製造方法であり、
    ４−メチルサリチル酸及び５−メチルサリチル酸のひとつをエステル化し、４−メチルサリチル酸アルキル又は５−メチルサリチル酸アルキル：
    

    

    （式中、Ｘ基は炭素原子数１〜３の非分枝アルキルである。）を得る段階と、
    ４−メチルサリチル酸アルキル又は５−メチルサリチル酸アルキルをハロゲン化し、ベンジルハライド：
    

    

    （式中、Ｙはハロゲンである。）を得る段階と、
    ベンジルハライドをアジド塩と反応させ、ベンジルアジド：
    

    

    を得る段階と、
    ベンジルアジドを水素化し、ベンジルアミン：
    

    

    を得る段階と、
    ベンジルアミンを適当な保護基Ｑと縮合し、アミンを保護し、保護アミノメチル安息香酸アルキル：
    

    

    を得る段階と、
    アルキルエステルを開裂し、安息香酸：
    

    

    を得る段階と、
    安息香酸をアルキル化し、活性化アルキルエステル：
    

    

    （式中、Ｒ₂基は電気陰性基をもつメチレン基である。）を得る段階と、
    保護基Ｑを脱離し、ベンジルアミン：
    

    

    を得る段階と、
    ベンジルアミンを活性化カルボン酸と縮合する段階を含む前記方法。
14. Ｒ₁基がアクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択される請求項１３に記載の方法。
15. Ｒ₂基がＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂及びＣＨ₂ＯＣＨ₃の１種から選択される請求項１３に記載の方法。
16. 一般式Ｉの試薬を生物活性種と縮合し、一般式ＩＩ：
    

    

    （式中、ＢＡＳはタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種であり、請求項１記載のＲ ₁ 基の一部を含み得る）の試薬を得る段階を更に含む請求項１３に記載の方法。
17. 一般式ＩＩＩ：
    

    

    （式中、Ｚ基は、１〜６個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも１個をもつ６〜１８個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに３〜１２個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、Ｒ₃基はＨ、アルキル、又は電気陰性置換基をもつメチレン若しくはエチレン基の１種から選択され、Ｒ₁は、タンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種との反応に利用可能な求電子又は求核基であって、アクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択され、更に、Ｒ₃基がＨのときは、Ｒ₁はアクリルアミド、アミノ、ジチオピリジル、ヒドラジド、イミド酸エステル、マレイミド及びチオール基の１種から選択される）をもつ試薬。
18. Ｒ₃基がＨ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ及びＣＨ₂ＯＣＨ₃の１種から選択される請求項１７に記載の試薬。
19. Ｚ基が一般式（ＣＨ₂）_n（式中、ｎ＝１〜６）の非分枝アルキル鎖である請求項１７に記載の試薬。
20. 一般式：
    

    

    （式中、Ｒ₃はＨ、アルキル、又は電気陰性置換基をもつメチレン若しくはエチレン基の１種である）をもつ試薬。
21. Ｒ₃基がＨ以外のときは、Ｒ₁基がアクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択される請求項１７に記載の試薬。
22. 一般式ＩＶ：
    

    

    （式中、Ｚ基は、１〜６個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも１個をもつ６〜１８個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに３〜１２個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、Ｒ₃基はＨ、アルキル、又は電気陰性置換基をもつメチレン若しくはエチレン基の１種から選択され、ＢＡＳはタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種であり、請求項１記載のＲ ₁ 基の一部を含み得る）をもつ生物活性種と試薬の結合体。
23. Ｒ₃基がＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ及びＣＨ₂ＯＣＨ₃の１種から選択される請求項２２に記載の結合体。
24. Ｚ基が一般式（ＣＨ₂）_n（式中、ｎ＝１〜６）の非分枝アルキル鎖である請求項２８に記載の結合体。
25. 一般式：
    

    

    （式中、Ｒ₃基はＨである）をもつ請求項２２に記載の結合体。
26. 一般式ＶＩ：
    

    

    （式中、Ｚ基は、１〜６個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも１個をもつ６〜１８個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに３〜１２個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、Ｒ₃基はＨ、アルキル、又は電気陰性基をもつメチレン若しくはエチレンの１種から選択され、ＢＡＳ及びＢＡＳ＊はタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種であり、請求項１記載のＲ ₁ 基の一部を含み得る）をもつ生物結合体。
27. Ｒ₃基がＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ及びＣＨ₂ＯＣＨ₃の１種から選択される請求項２６に記載の生物結合体。
28. Ｚ基が一般式（ＣＨ₂）_n（式中、ｎ＝１〜６）の非分枝アルキル鎖である請求項２６に記載の生物結合体。
29. ＢＡＳとＢＡＳ＊が異なる生物活性種である請求項２６に記載の生物結合体。
30. 一般式ＩＩＩの試薬を生物活性種と縮合し、一般式ＩＶ：
    

    

    （式中、Ｚ基は、１〜６個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも１個をもつ６〜１８個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに３〜１２個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、Ｒ₃基はＨ、アルキル、又は電気陰性置換基をもつメチレン若しくはエチレン基の１種から選択され、ＢＡＳはタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種であり、請求項１記載のＲ ₁ 基の一部を含み得る）の試薬を得る段階を含む一般式ＩＶの試薬の製造方法。
31. Ｒ₃基がＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ及びＣＨ₂ＯＣＨ₃の１種から選択される請求項３０に記載の方法。
32. Ｚ基が一般式（ＣＨ₂）_n（式中、ｎ＝１〜６）の非分枝アルキル鎖である請求項３０に記載の方法。
33. 一般式ＶＩ：
    

    

    （式中、Ｚ基は、１〜６個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも１個をもつ６〜１８個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに３〜１２個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、Ｒ₃基はＨ、アルキル、又は電気陰性基をもつメチレン若しくはエチレンの１種から選択され、ＢＡＳ及びＢＡＳ＊はタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種であり、請求項１記載のＲ ₁ 基の一部を含み得る）の生物結合体の製造方法であって、第２の生物活性種とフェニルボロン酸を含む第２の結合体と請求項６に記載の結合体を錯化する段階を含む前記方法。
34. Ｒ₃基がＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ及びＣＨ₂ＯＣＨ₃の１種から選択される請求項３３に記載の方法。
35. Ｚ基が一般式（ＣＨ₂）_n（式中、ｎ＝１〜６）の非分枝アルキル鎖である請求項３３に記載の方法。
36. ＢＡＳとＢＡＳ＊が異なる生物活性種である請求項３３に記載の方法。
37. 一般式ＩＶ：
    

    

    （式中、Ｚ基は、１〜６個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも１個をもつ６〜１８個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに３〜１２個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、Ｒ₃基はＨ、アルキル、又は電気陰性基をもつメチレン若しくはエチレンの１種から選択され、ＢＡＳはタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種であり、請求項１記載のＲ ₁ 基の一部を含み得る）の結合体の製造方法であって、一般式：
    

    

    の試薬を一般式ＮＨ₂ＯＲ₃（式中、Ｒ₃基はＨ、アルキル、又は電気陰性基をもつメチレン若しくはエチレンの１種から選択される）のヒドロキシルアミン誘導体と縮合する段階を含む前記方法。
38. Ｒ₃基がＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ及びＣＨ₂ＯＣＨ₃の１種から選択される請求項３７に記載の方法。
39. Ｚ基が一般式（ＣＨ₂）_n（式中、ｎ＝１〜６）の非分枝アルキル鎖である請求項３７に記載の方法。

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