JP4270522B2 - ホウ素化合物錯化試薬及び高度に安定な錯体 - Google Patents
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Description
本発明は生物結合体製造分野、より詳細には生物高分子の結合に有用なホウ素化合物錯化試薬の類と、前記試薬の製造及び使用方法に関する。
発明の背景
生物結合とは、少なくとも1種が生物高分子である2種以上の異なる分子種を化学的又は生物学的手段により結合することを意味する用語である。生物結合の非限定的な例としては、タンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム及び細胞の相互結合又は有用な性質を付加する他の任意分子種(非限定的な例として薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、発色団、蛍光団、リガンド等)との結合が挙げられる。生物高分子の固定化も、高分子が可逆的又は不可逆的に不溶性支持体に結合した生物結合の特殊な例とみなされる。生物結合は生化学、免疫化学及び分子生物学研究で広く利用されている。生物結合の主要用途としては、遺伝子プローブの検出、ELISA、モノクローナル抗体薬剤ターゲティング及び医療イメージングが挙げられる。
生物結合体は一般に直接結合体と間接結合体に分類される。直接結合体は、2種以上の成分が直接共有化学結合により結合しているものを指す。他方、間接結合体は、2種以上の成分が生物高分子を含む中間複合体を介して結合しているものを指す。本明細書に記載する系は、中間生物高分子によらずに間接結合体の形成を可能にした最初のものである。
アビジン−ビオチン系
間接生物結合体製造方法は多数のものが記載されているが、文献に報告されているものの大半はアビジン−ビオチン系を利用して製造されており、補因子ビオチン(ビタミンH)に対するタンパク質アビジン(卵白から精製)又はストレプトアビジン(細菌Streptomycesavidiniiから精製)の結合特異性を利用してアビジンに結合した高分子をビオチン化高分子と架橋している。アビジンとストレプトアビジンはいずれも4個の非常に高親和性(K=1015mol-1)のビオチン結合部位をもつ。
アビジン−ビオチン系はELISAに広く利用されており、まず固定化抗原又はハプテンに抗体を結合した後に、(酵素基質との反応により着色又は化学発光産物を生じることにより検出に有用な)酵素−アビジン結合体を利用してビオチン化抗体の存在を検出している。アビジン−ビオチン系の適用例は数百を数え、最近の文献に記載されている(Wilchek,M.とBayer,I.A.,(1990)Methods in Enzymology,184)。
アビジン−ビオチン系は広く利用されているにも拘わらず、一般にアビジン分子の塩基性に起因すると考えられる非特異的結合や、アビジン分子上の炭水化物残基の存在に起因すると考えられる非特異的結合や、真核細胞と原核細胞の両者に遍在する内因性ビオチンの存在に結び付けられるバックグラウンド干渉等の点でいくつかの制約を伴うことが知られている。
ジゴキシゲニンα−ジゴキシゲニン
アビジン−ビオチン系に伴う制約の一部を解消するように構成された代替間接生物結合系がELISAによる遺伝子プローブの検出用として最近開発された(Kessler,C.,Holtke,H.−J.,Seibl,R.,Burg,J.及びMuhlegger,K.,(1990)Biol.Chem.Hoppe−Seyler,371,917−965)。この系はDigitalis植物に広く存在するアルカロイドであるステロイドハプテンジゴキシゲニンと、ジゴキシゲニンに対するポリクローナルヒツジ抗体(α−ジゴキシゲニン)から誘導されるFabフラグメントを使用している。各種α−ジゴキシゲニン抗体は特異性が高いため、バックグラウンドが低く、アビジン−ビオチン系で認められる非特異的結合がない。ジゴキシゲニン標識DNA及びRNAプローブはヒトゲノムサザンブロットで単一コピー配列を検出することができる。ジゴキシゲニンα−ジゴキシゲニン系の開発は最近の文献に記載されている(Kessler,C.(1990)in Advances in Mutagenesis Research (Obe,G.編)105−152頁,Springer−Verlag,Berlin/Heidelberg)。ジゴキシゲニンα−ジゴキシゲニン系は生物結合に現在使用されている数種のハプテン−抗体系のうちで最新のものである。
固定化フェニルボロン酸
フェニルボロン酸は所定の必須官能基をもつ広範な極性分子と相互作用することが知られている。1,2−ジオール、1,3−ジオール、1,2−ヒドロキシ酸、1,3−ヒドロキシ酸、1,2−ヒドロキシルアミン、1,3−ヒドロキシルアミン、1,2−ジケトン及び1,3−ジケトンを含む様々の安定性の錯体が中性フェニルボロン酸又はフェニルボロン酸アニオンと形成されることは知られている。従って、固定化フェニルボロン酸は種々の生物試料から必須官能基をもつ分子種を選択的に保持するためのクロマトグラフィー支持休として利用されている。炭水化物、カテコールアミン、プロスタグランジン、リボヌクレオシド及びステロイド等の多数の主要生物分子は必須官能基を含み、この方法で分析又は精製されている。フェニルボロン酸クロマトグラフィー媒体を生物分子の単離及び分離に使用することは数件の文献に記載されている(Singhal,R.P.とDeSilva,S.S.M.(1992)Adv.Chromatog.,31,293−335;Mazzeo,J.R.とKrull,I.S.(1989)BioChromatog.,4,124−130;及びBergold,A.とScouten,W.H.(1983)in Solid Phase Biochemistry(Scouten,W.H.編)149−187頁,John Wiley & Sons,New York)。
ホウ酸等のフェニルボロン酸はルイス酸であり、直接脱プロトン化でなく水和によりイオン化し、四面体フェニルボロン酸アニオン(pKa=8.86)を与える。フェニルボロン酸は硼酸としての酸の3倍の強度である。ホウ素はイオン化すると
三方配位から
四面体配位アニオンに変化するので、フェニルボロン酸のイオン化は錯形成における重要な因子である。
シス又は共軸1,2−ジオール及び1,3−ジオール官能基をもつ分子種、特に炭水化物は固定化フェニルボロン酸アニオンと錯化し、アルカリ水性条件下で環状エステルを形成することが知られている(Lorand,J.P,とEdwards,J.O.(1959)J.Org.Chem.,24,769)。
1,2−ジオール及び1,3−ジオール錯体は中性pHまで酸化するとジオール含有種を放出することが知られているが、これは環状エステルの加水分解によると予想される。1,8−ジヒドロキシナフタレン等の共面芳香族1,3−ジオールは6員環ボロン酸エステルの加水分解安定性により酸性条件下でも錯化することが知られている(Sienkiewicz,P.A.とRoberts,D.C.(1980)J.Inorg.Nucl.Chem.,42,1559−1571)。ジオール含有種の保持に関連する分子種と同様に、側基1,2−ヒドロキシルアミン、1,3−ヒドロキシルアミン、1,2−ヒドロキシルアミド、1,3−ヒドロキシルアミド、1,2−ヒドロキシオキシム及び1,3−ヒドロキシオキシム官能基をもつ分子種もアルカリ水性条件下でフェニルボロン酸と可逆的に錯化することが知られている(Tanner,D.W.とBruice,T.C.(1967).J,Amer.Chem.Soc.,89,6954)。
フェニルボロン酸生物結合体
オルト置換アセトアミドフェニルボロン酸は糖タンパク質に関達する炭水化物残基の隣接ジオール部分を介する選択的生物結合の潜在的リンカーであると示唆されている(Cai,S.X.とKeana,J.F.W.(1991)Bioconjugate Chem.,2,317−322)。3−イソチオシアナトフェニルボロン酸から誘導されるフェニルボロン酸生物結合体は放射性テクネチウムジオキシム錯体を医療イメージング用モノクローナル抗体に結合するために使用され、成果をあげている(Linder,K.E.,Wen,M.D.,Nowotnik,D.P.,Malley,M.F.,Gougoutas,J.Z.,Nunn,A.D.及びEckelman,W.C.(1991)Bioconjugate Chem.,2,160−170;Linder,K.E.,Wen,M.D.,Nowotnik,D,P.,Ramalingam,K.,Sharkey,R.M.,Yost,F.,Narra,R.K.及びEckelman,W,C.(1991)Bioconjugate Chem.,2,407−414)。
3−アミノフェニルボロン酸は種々の化学的方法によりタンパク質に共有結合されており、得られたフェニルボロン酸生物結合体はD−ソルビトール、D−マンノース及びグリコヘモグロビン(GHh)結合について試験されている。相互作用は可逆的であり、親和性が非常に低いため、生物結合体の実用は非常に限られていることが分かっている。また、アルカリホスファターゼフェニルボロン酸生物結合体を酵素アッセイで使用してGHbを検出しようと試みたが、グリコプロテインの存在を検出することはできなかった(Frantzen,F.,Grimsrud,K.,Heggli,D.及びSundrehagen,E.(1995)Journal of Chromatography B,670,37−45)。
必須官能基をもつ生物分子のクロマトグラフィー分離には固定化フェニルボロン酸が使用されているが、相当量の生物結合研究とこの分野の相当量の投資にも拘わらず、フェニルボロン酸の選択性はまだ十分に利用されておらず、生物高分子を相互間又は有用な性質を付加する他の分子種と結合するには至っていない。
発明の要約
本発明は生物結合体の製造に有用な新規類のホウ素化合物錯化試薬と、このような試薬の製造及び使用方法に関する。1態様において、ホウ素化合物は本発明の錯化試薬と錯化するフェニルボロン酸又はその誘導体である。特に指定しない限り、フェニルボロン酸錯化試薬なる用語は本明細書では広義類のホウ素化合物錯化試薬の意味で使用し、フェニルボロン酸なる用語は本明細書ではホウ素化合物錯化試薬と錯化する広義類のホウ素化合物の意味で使用する。本発明では、従来技術のアビジン−ビオチン及びジゴキシゲニンα−ジゴキシゲニン系の代わりに、ホウ素化合物錯化試薬を(多くは従来技術で公知の)フェニルボロン酸試薬等のホウ素化合物と併用し、中間生物高分子を使用せずに化学結合を助長する。生物結合体の製造では多くの場合、非限定的な例として例えばタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム及び細胞等の数種の成分を相互に又は非限定的な例として例えば薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、固相支持体及びホウ素化合物錯化試薬等の有用な性質を付加する他の任意生物種と結合する。生物結合体の製造に使用されるこれらの種々の成分を総称して各々生物学的活性種又は生物活性種と呼ぶ。
側基フェニルボロン酸部分をもつ別の(又は同一)生物活性種との後期結合のためにフェニルボロン酸錯化部分を組み込む目的で生物活性種を修飾するのに利用可能な試薬は、一般式I:
で表され、式中、R1基は推定フェニルボロン酸錯化試薬と生物活性種の反応に利用可能な反応性求電子又は求核部分であり、Z基は鎖長約0〜6炭素当量の飽和又は不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ鎖長約6〜18炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約3〜12炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、R2基はアルキル(例えばメチル、エチル等)及び電気陰性置換基をもつメチレンから選択される。
一般式Iの試薬と生物活性種の反応により、一般式II:
の(1個以上の)側基推定フェニルボロン酸錯化部分をもつ結合体が得られる。尚、上記式中、BASは生物学的活性種(即ち生物活性種)を表し、この生物活性種を試薬に結合するために使用される(それ自体スペーサーをもっていてもよい)反応性部分の一部を含んでいてもいなくてもよい。多くの態様では、一般式Iの数個の同一試薬が単一BAS分子と反応することが理解されよう。例えば、BASがタンパク質である場合には、多数のフェニルボロン酸錯化試薬がこのタンパク質と反応し、各々タンパク質上の数個のR1基反応性部位の1つで反応する。一般式IIにおけるZ基は鎖長約0〜6炭素当量の飽和又は不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ鎖長約6〜18炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約3〜12炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーである。R2基はアルキル(例えばメチル、エチル等)及び電気陰性置換基をもつメチレンから選択される。
一般式IIの試薬を更に反応させると、一般式IV:
のホウ素化合物錯化試薬、例えば1個以上の側基フェニルボロン酸錯化部分をもつ試薬の類の結合体が得られる。
一般式IVの結合体に関して、Z基は鎖長約0〜6炭素当量の飽和又は不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ鎖長約6〜18炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約3〜12炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサである。R3基はH、アルキル及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレンの1種から選択される。最後に、BASは生物活性種を表し、この生物活性種を結合するために使用される反応性部分の一部を含んでいてもいなくてもよい。
本明細書に記載する一般式III及び一般式IVの組成物とその製造方法は、参考資料として本明細書の一部とする本願出願人名義の米国同時係属出願(発明の名称「Boronic Compound Complexing Reagents and Highly Stable Complexes」、出願日1996年8月5日、発明者Mark L.Stolowitz,Roert J.Kaiser及びKevin P.Lund)の主題である。
フェニルボロン酸試薬は多くのものが従来技術で公知であり、参考資料として本明細書の一部とする本願出願人名義の米国同時係属出願(発明の名称「Phenylboronic Ald Complexes for Bioconjugate Preparation」、出願日1994年1月28日、出願番号第08/188,958号)に詳細に記載されており、生物活性種に結合すると、一般式V:
(式中、BAS*は第2の生物活性種を表し、この生物活性種はリンカー部分を含んでいてもよいし、生物活性種BASと異なるものでもよい)の(1個以上の)側基フェニルボロン酸部分をもつ結合体が得られる。BAS*は、生物活性種をフェニルボロン酸試薬に結合するために使用される反応性部分の一部を含んでいてもよい。
少なくとも1種の生物活性種と(1個以上の)側基フェニルボロン酸、錯化部分をもつ一般式IVの結合体を、第2の生物活性種BAS*から製造した(1個以上の)側基フェニルボロン酸部分をもつ一般式Vの結合体と錯化すると、一般式VI:
(式中、BAS及びBAS*とZ及びR3基は上記と同義である)の生物結合体が得られる。このように、生物高分子を相互に又は有用な性質を付加する他の官能基と結合することができる。
一般式VIの生物結合体は水性緩衝液又は有機溶剤中で製造することができる。生物結合体は約4℃〜70℃の温度範囲で数分以内に形成される。所与pH及び温度の水溶液中の生物結合体の安定性は置換基R3にかなり影響される。一般式VIの生物結合体は約3.5<pH<10.5の水溶液中で安定である。
生物結合反応(フェニルボロン酸錯化)はイオン強度の有意変化、有機溶剤の存在、界面活性剤の存在及びカオトロピック剤(タンパク変性剤)の存在に非感受性であり、これに対して従来技術の間接標識系では必要な結合性を保存するために生物高分子の構造を維持する必要があるのでカオトロピック剤は不適合である。殆どの場合、本明細書に記載する系で生物結合体の形成に付随する制約は、生物活性種の生存性を維持するために必要な条件により加えられるものに限られる。
要約すると、本発明はホウ素化合物錯化試薬、前記試薬の中間試薬及び試薬の合成方法に関する。一般式I及びIIとして示すものを含むこれらの試薬を使用すると、本明細書に記載する別の反応後にフェニルボロン酸又はその誘導体等のホウ素化合物と錯化することができる。
側基フェニルボロン酸部分をもつ別の(又は同一)生物活性種との後期結合のためにフェニルボロン酸錯化部分を組み込む目的で生物活性種を修飾するのに利用可能な試薬は、一般式III:
で表され、式中、R1基はフェニルボロン酸錯化試薬と生物活性種の反応に利用可能な反応性求電子又は求核部分であり、Z基は鎖長約0〜6炭素当量の飽和又は不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ鎖長約6〜18炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約3〜12炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、R3基はH、アルキル及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレン部分の1種から選択される。
R3基はH、CH3、CH2CN、CH2COOH、CH2CONH2、CH2CH2OH及びCH2OCH3の1種から選択すると好ましい。R3がHであるとき、R1基はアクリルアミド、アミノ、ジチオピリジル、ヒドラジド、イミド酸エステル、マレイミド及びチオール部分の1個から選択すると好ましい。Z基は一般式(CH2)n(式中、n=1〜6)の非分枝アルキル鎖が好ましい。
一般式IIIの試薬と生物活性種の反応により、一般式IV:
の(1個以上の)側基フェニルボロン酸錯化部分をもつ結合体が得られる。尚、上記式中、BASは生物学的活性種(即ち生物活性種)を表し、生物活性種を試薬に結合するために使用される(それ自体スペーサーをもっていてもよい)反応性部分の一部を含んでいてもいなくてもよい。多くの態様では、一般式IIIの数個の同一試薬が単一BAS分子と反応することが理解されよう。例えば、BASがタンパク質である場合には、多数のフェニルボロン酸錯化試薬がこのタンパク質と反応し、各々タンパク質上の数個のR1基反応性部位の1つで反応する。一般式IVにおけるZ基は鎖長約0〜6炭素当量の飽和又は不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ鎖長約6〜18炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約3〜12炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーである。R3基はH、アルキル及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレン部分の1種から選択される。
本明細書に記載する一般式I及び一般式IIの組成物とその製造方法は、参考資料として本明細書の一部とする本願出願人名義の米国同時係属出願(発明の名称「Boronic Compound Complexing Reagents and Highly Stable Complexes」、出願日1996年8月5日、発明者Mark L.Stolowitz,Robert J,Kaiser及びKevin P.Lund)の主題である。
フェニルボロン酸試薬は多くのものが従来技術で公知であり、参考資料として本明細書の一部とする本出願人名義の米国同時係属出願(発明の名称「Phenylboroni Ald Complexes For Bioconjugate Preparation」、出願日1994年1月28日、出願番号第08/188,958号)に詳細に記載されており、生物活性種に結合すると、一般式V:
(式中、BAS*は第2の生物活性種を表し、この生物活性種はリンカー部分を含んでいてもよいし、生物活性種BASと異なるものでもよい)の(1個以上の)側基フェニルボロン酸部分をもつ結合体が得られる。BAS*は、生物活性種をフェニルボロン酸試薬に結合するために使用される反応性部分の一部を含んでいてもよい。
少なくとも1種の生物活性種と(1個以上の)側基フェニルボロン酸錯化部分をもつ一般式IVの結合体を、第2の生物活性種BAS*から製造した(1個以上の)側基フェニルボロン酸部分をもつ一般式Vの結合体と錯化すると、一般式VI:
(式中、BAS及びBAS*とZ及びR3基は上記と同義である)の生物結合体が得られる。このように、図1’に示すように生物高分子を相互結合又は有用な性質を付加する他の官能基と結合することができる。
要約すると、本発明はホウ素化合物錯化試薬、前記試薬の中間試薬、ホウ素化合物錯体、並びに前記試薬及び錯体の合成方法に関する。これらの試薬及び錯体を一般式III、IV及びVIに示す。1態様では、一般式IIIの試薬を使用すると、生物活性種(BAS)と縮合後に一般式IVの試薬を生成することができる。一般式IVの試薬を使用すると、一般式VIに示す錯体のようにホウ素化合物と錯体を形成することができる。
一般式VIの生物結合休は水性緩衝液又は有機溶剤中で製造することができる。生物結合体は約4℃〜70℃の温度範囲で数分以内に形成される。所与pH及び温度の水溶液中の生物結合体の安定性は置換基R3にかなり影響される。一般式VIの生物結合体は約3.5<pH<10.5の水溶液中で安定である。生物結合反応(フェニルボロン酸錯化)はイオン強度の有意変化、有機溶剤の存在、界面活性剤の存在及びカオトロピック剤(タンパク変性剤)の存在に非感受性であり、これに対して従来技術の間接標識系では必要な結合性を保存するために生物高分子の構造を維持する必要があるのでカオトロピック剤は不適合である。殆どの場合、本明細書に記載する系で生物結合体の形成に付随する制約は、生物活性種の生存性を維持するために必要な条件により加えられるものに限られる。
【図面の簡単な説明】
図1は一般式VIの生物結合体を製造するために使用可能な一般式IVの結合体を製造するための、一般式Iの推定フェニルボロン酸錯化試薬と一般式IIIのフェニルボロン酸錯化試薬の使用を示す。
図2はR2がアルキル基(例えばメチル、エチル、プロピル等)である一般式Iの試薬の合成中間体である4−及び5−アミノメチルサリチル酸アルキルの製造を要約する。4−及び5−アミノメチルサリチル酸アルキルは一般式IIIの試薬の生成にも有用な合成中間体である。
図3はR2が電気陰性部分をもつメチレン基(例えばカルボキシメチル、シアノメチル、メトキシメチル等)である一般式Iの試薬の合成中間体である4−及び5−アミノメチルサリチル酸アルキルの製造を要約する。
図4はR3がアルキル基又は電気陰性部分をもつメチレンもしくはエチレン基の1種である一般式IIIの試薬の合成中間体である4−及び5−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸の製造を要約する。
図5はR2がアルキル基又は電気陰性部分をもつメチレン基の1種であり、R1がイミダゾリド、ヒドラジド及びN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分から選択される一般式I及びIIIの試薬の合成を要約する。
図6はR2がアルキル基又は電気陰性部分をもつメチレン基の1種であり、R1がブロモ、クロロ、ヨード、マレイミド、ジチオピリジル及びイミド酸エステル部分から選択される一般式I及びIIIの試薬の合成を要約する。
図7はR1がN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルであり、Zが中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ鎖長約6〜18炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式I及びIIIの試薬の合成を要約する。
発明の詳細な説明
生物結合体の製造に一般式Iの試薬を利用する3段法を図1に要約する。まず、所望の生物活性種との反応に利用可能な適当な反応性求電子又は求核基R1を含む一般式Iの試薬を選択する。
R1基は推定フェニルボロン酸錯化試薬と生物活性種の反応に利用可能な反応性求電子又は求核部分である。R1基は非限定的な例として、アクリルアミド、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド、アミノ及びチオール部分から選択することが好ましい。
Z基は鎖長約0〜6炭素当量の飽和又は不飽和鎖、好ましくは不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ鎖長約6〜18炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約3〜12炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーである。Z基は一般式(CH2)n(式中、n=1〜6)の非分枝アルキル鎖から選択することが好ましい。
R2基はアルキル(例えばメチル、エチル等)及び電気陰性置換基をもつメチレンから選択される。電気陰性置換基は陰性双極子モーメントをもつ置換基であり、例えばCN、COOH等である。R2基はCH3、CH2CH3、CH2CN、CH2COOH、CH2CONH2及びCH2OCH3の1種から選択すると好ましい。
3段法による生物結合体製造の次段階では適当な試薬を生物活性種と縮合し、一般式II:
の結合体を得る。一般式II中、Z及びR2は上記と同義であり、BASは生物学的活性種を表し、生物活性種を試薬に結合するために使用される反応性部分の一部(及びスペーサー)を含んでいてもいなくてもよい。
次に、結合体を一般式NH2OR3(式中、R3はH、アルキル(例えばメチル、エチル等)又は電気陰性部分をもつメチレンもしくはエチレンから選択される)のヒドロキシルアミン誘導体と反応させる。利用可能なヒドロキシルアミン誘導体の非限定的な例としては、NH2OH、NH2OCH3、NH2OCH2CN、NH2OCH2COOH、NH2OCH2CONH2及びNH2OCH2CH2OHを挙げることができる。得られる結合体は一般式IV:
をもつ。一般式IV中、Z及びBAS基は上記と同義であり、R3基はH、アルキル及び電気陰性置換基をもつメチレン部分の1種から選択される。
次に、一般式IVの結合体を、一般式V:
(式中、BAS*は第2の生物活性種を表し、この生物活性種はリンカー部分を含んでいてもよいし、錯化試薬の生物活性種BASと異なるものでもよい)のフェニルボロン酸と錯化する。BAS*は、生物活性種をフェニルボロン酸試薬に結合するために使用される反応性部分の一部を含んでいてもよい。錯化により、一般式VI:
の(四面体ホウ素を中心とする)立休異性錯体が得られる。
生物結合体の製造に一般式IIIの試薬を使用する2段法を図1に要約する。まず、所望の生物活性種との反応に利用可能な適当な反応性求電子又は求核基R1を含む一般式III:
の試薬を選択する。
R1基はフェニルボロン酸錯化試薬と生物活性種との反応に利用可能な反応性求電子又は求核部分である。R1基は非限定的な例として、アクリルアミド、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド、アミノ及びチオール部分から選択することが好ましい。
Z基は鎖長約0〜6炭素当量の飽和又は不飽和鎖、好ましくは不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ鎖艮約6〜18炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約3〜12炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーである。Z基は一般式(CH2)n(式中、n=1〜6)の非分枝アルキル鎖から選択することが好ましい。
R3基はH、アルキル及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレン部分の1種から選択される。電気陰性置換基とは、陰性双極子モーメント部分、例えば、CN,COOH等を有する置換基である。
R3基はH、CH3、CH2CN、CH2COOH、CH2CONH2、CH2CH2OH及びCH2OCH3の1種から選択すると好ましい。R3基がHであるときには、R1基はアクリルアミド、アミノ、ジチオピリジル、ヒドラジド、イミド酸エステル、マレイミド及びチオール部分の1種から選択することが好ましい。
一般式IIIの試薬を生物活性種と縮合し、一般式IV:
(式中、Z及びBASは上記と同義であり、R3はH、アルキル及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレン部分の1種から選択される)の結合体を得る。
次に、一般式IVの結合体を、一般式V:
(式中、BAS*は第2の生物活性種を表し、この生物活性種はリンカー部分を含んでいてもよいし、錯化試薬の生物活性種BASと異なるものでもよい)をもつフェニルボロン酸結合体と錯化する。BAS*は、生物活性種をフェニルボロン酸試薬に結合するために使用される反応性部分の一部を含んでいてもよい。錯化により、一般式VI:
の(四面体ホウ素を中心とする)立体異性錯体が得られる。
生物結合体の製造に一般式Iの試薬を使用する代替3段法も図1に要約した。まず、所望の生物活性種との反応に利用可能な適当な反応性求電子又は求核基R1を含む一般式I:
の試薬を選択する。
R1基は推定フェニルボロン酸錯化試薬と生物活性種との反応に利用可能な適当な反応性求電子又は求核部分である。R1基は非限定的な例として、アクリルアミド、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド、アミノ及びチオール部分から選択することが好ましい。
Z基は鎖長約0〜6炭素当量の飽和又は不飽和鎖、好ましくは不飽和鎖、中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ鎖長約6〜18炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖、及び鎖長約3〜12炭素当量のポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーである。Z基は一般式(CH2)n(式中、n=1〜6)の非分枝アルキル鎖から選択することが好ましい。
R2基はアルキル(例えばメチル、エチル等)及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレンから選択される。電気陰性置換基は陰性双極子モーメントをもつ置換基であり、例えばCN、COOH等である。R2基はCH3、CH2CH3、CH2CN、CH2COOH、CH2CONH2及びCH2OCH3から選択すると好ましい。
3段法による生物結合体製造の次段階では適当な試薬を生物活性種と縮合し、一般式II:
の結合体を得る。一般式II中、Z、及びR2は上記と同義であり、BASは生物学的活性種を表し、生物活性種を試薬に結合するために使用される反応性部分の一部(及びスペーサー)を含んでいてもいなくてもよい。
次に、結合体を一般式NH2OR3(式中、R3はH、アルキル(例えばメチル、エチル等)又は電気陰性置換基をもつメチレンもしくはエチレンから選択される)のヒドロキシルアミン誘導体と反応させる。利用可能なヒドロキシルアミン誘導体の非限定的な例としては、NH2OH、NH2OCH3、NH2OCH2CN、NH2OCH2COOH、NH2OCH2CONH2及びNH2OCH2CH2OHを挙げることができる。得られる結合体は一段式IV:
(式中、Z及びBAS基は上記と同義であり、R3基はH、アルキル及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレン部分の1種から選択される)をもつ。
次に、一般式IVの結合体を、一段式V:
(式中、BAS*は第2の生物活性種を表し、この生物活性種はリンカー部分を含んでいてもよいし、錯化試薬の生物活性種BASと異なるものでもよい)のフェニルボロン酸と錯化する。BAS*は、生物活性種をフェニルボロン酸試薬に結合するために使用される反応性部分の一部を含んでいてもよい。錯化により、一般式VI:
の(四面体ホウ素を中心とする)立体異性錯体が得られる。
一般式Iの推定フェニルボロン酸錯化試薬の合成
一般式Iの試薬は4−又は5−メチルサリチル酸から誘導される。いずれの場合も試薬は最終的に4−又は5−アミノメチル安息香酸アルキルである合成中間体から製造される。図2はR2がアルキル基(例えばメチル、エチル等)である一般式Iの試薬の合成中間体である4−及び5−アミノメチル安息香酸アルキルの製造を要約する。図2はR2がメチル基である例を示す。まずステップ1では4−又は5−メチルサリチル酸をエステル化し、対応する4−又は5−メチルサリチル酸アルキルを得る。ステップ2ではエステルをN−ブロモスクシンイミドとベンゾイルペルオキシド触媒で臭素化し、対応する臭化ベンジルを得る。ステップ3では、臭化ベンジルをナトリウムアジドでアルキル化し、対応するベンジルアジドを得る。最後にステップ4でベンジルアジドをHClの存在下にパラジウム触媒水素化すると、対応する塩酸ベンジルアミンが得られる。
図3はR2基が電気陰性部分をもつメチレン基である一般式Iの試薬の合成中間体(例えば4−又は5−アミノメチルサリチル酸カルボキシメチル、アセトアミドメチル及びシアノメチル)の製造を要約する。R2基を他の予想される置換基に変えても同様の合成により製造できると考えられる。まず、図3のステップ1では、図2に要約するように製造した4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルをメタノール中ジ−tert−ブチルジカーボネート及びトリエチルアミンと反応させ、対応する保護N−(tert−ブトキシカルボニル)アミノメチル安息香酸メチルを得る。ステップ2では、トリメチルシラノール酸カリウムとの反応によりメチルエステルを開製し、酸水溶液中で処理し、対応する安息香酸を得る。ステップ3では、α−ハロ酸、α−ハロアセトアミド又はα−ハロアセトニトリル及びトリエチルアミンとの反応により安息香酸をアルキル化し、夫々対応するカルボキシメチル、アセトアミドメチル又はシアノメチルエステルを得る。最後に、ステップ4でテトラヒドロフラン中無水HClとの反応によりN−(tert−ブトキシカルボニル)保護基を脱離すると、対応する塩酸ベンジルアミンが得られる。
図3の終産物を使用して無水アクリル酸又は塩化アクリロイルをサリチル酸アミノメチルと縮合することにより、別の試薬であるサリチル酸アミノメチルのアクリル酸アミドを単段階で製造することができる。
図5はR2基がアルキル又は電気陰性部分をもつメチレンの1種であり、R1がイミダゾリド、ヒドラジド及びN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分から選択される一般式Iの試薬の合成を要約する。これらの試薬は各々無水脂肪酸を第1段階で使用する2段法で製造される。まず、図2又は3に要約するように製造した4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルを非極性有機溶剤中で好ましくは非限定的な例として無水コハク酸、無水グルタル酸、無水マレイン酸及び無水グリコール酸から選択される無水脂肪酸と縮合し、遊離末端カルボン酸部分をもつスペーサー(Z基)を導入する。この縮合反応で無水脂肪酸が無水マレイン酸である場合には、得られるZ基はアルケン基を含んでいるので不飽和である。その後、カルボン酸部分をN,N−カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸イソブチル及びtert−ブチルカルバゼート又はN,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド及びN−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により更に官能化すると、夫々対応するイミダゾリド、保護ヒドラジド及びN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルが得られる。保護ヒドラジドの場合には、試薬を無水塩酸と接触させることによりN−(tert−ブトキシカルボニル)保護基を脱離する。
図6はR2基がアルキル又は電気陰性部分をもつメチレンの1種であり、R1基がブロモ、クロロ、マレイミド、ジチオピリジル及びイミド酸エステル部分から選択される一般式Iの試薬の合成を要約する。R1基がブロモ及びクロロ部分から選択される一般式Iの試薬は、図2又は3に要約するように製造した4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルを夫々無水ブロモ酢酸又はクロロ酢酸と縮合することにより製造される。同様のヨード試薬は、クロロ試薬とヨウ化ナトリウムのハロゲン交換により製造される。非保護ヒドロキサム酸の分子内アルキル化の可能性により、R3がHであるときには、R1がブロモ、クロロ、ヨード、ブロモアセトアミド、クロロアセトアミド及びヨードアセトアミド部分から選択される一般式Iの試薬は簡便に製造することができない。R1基がマレイミド又はジチオピリジル部分から選択される一般式Iの試薬は、図2又は3に要約するように製造した4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルを、末端マレイミド又はジチオピリジル部分をもつ脂肪族カルボン酸エステルのN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと縮合することにより製造される。R1がイミド酸エステル部分である一般式Iの試薬は2段法で製造され、まず図2又は3に要約するように製造した4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルを、末端ニトリル部分をもつ脂肪族カルボン酸エステルのN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと縮合する。次いで、0℃でメタノール中無水塩化水素との反応によりニトリル部分をイミド酸メチルエステルに変換する。
R1基がN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル及びジチオピリジル部分から選択される一般式Iの試薬は、Z基が中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Iの試薬を製造するための合成中間体として使用することができる。
R1基がN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分である一般式Iの試薬を一般式R1−Z2−NH2(式中、Z2は好ましくは鎖長約1〜5炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である)の第1級脂肪族アミン部分をもつ化合物と縮合すると、Z基が中間アミド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Iの試薬が得られる。
あるいは、好ましくはコハク酸、マレイン酸、フマル酸、アセチレンジカルボン酸及びグルタル酸から選択されるジカルボン酸から誘導される一般式IのN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル試薬を、好ましくは非限定的な例としてグリシン、β−アラニン、アミノプロピオル酸、4−アミノ酪酸及び6−アミノカプロン酸から選択される一般式HO2C−Z2−NH2(式中、Z2は好ましくは鎖長約1〜5炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である)の第1級脂肪族アミン部分をもつ化合物と縮合すると、遊離末端カルボン酸部分をもつ化合物が得られ、これを図5に従って更に官能化すると、Zが中間アミド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Iの試薬が得られる。R1がN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分であり、Zが中間アミド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Iの試薬の合成について、この方法を図7に要約する。
R1がジチオピリジルである一般式Iの試薬を、一般式R1−Z2−SH(式中、Z2は好ましくは鎖長約1〜5炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である)の末端チオール部分をもつ化合物と縮合すると、Z基が中間ジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Iの試薬が得られる。
あるいは、好ましくはメルカプト酢酸、β−メルカプトプロピオン酸、メルカプトプロピオル酸、4−メルカプト酪酸及び6−メルカプトカプロン酸から選択されるメルカプトカルボン酸から誘導される一般式Iのジチオピリジル試薬を、好ましくはメルカプト酢酸、β−メルカプトプロピオン酸、メルカプトプロピオル酸、4−メルカプト酪酸及び6−メルカプトカプロン酸から選択される一般式HO2C−Z2−SH(式中、Z2は好ましくは鎖長約1〜5炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である)のチオール部分をもつ化合物と縮合すると、遊離末端カルボン酸部分をもつ化合物が得られ、これを図5に従って更に官能化すると、Zが中間ジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Iの試薬が得られる。R1がN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分であり、Zが中間ジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Iの試薬の合成について、この方法を図7に要約する。
Zが鎖長約3〜12炭素当量のポリエチレングリコール鎖である一般式Iの試薬は、図2又は3に要約するように製造した4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルを、多数のものが市販されているN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分と反応性求電子又は求核部分(又はその保護前駆物質)の両者をもつポリエチレングリコール試薬と縮合し、Z基が鎖長約3〜12炭素当量のポリエチレングリコール鎖である一般式Iの試薬を得ることにより製造される。
一般式IIIのフェニルボロン酸錯化試薬の合成
図4はR3基がアルキル又は電気陰性部分をもつメチレンの1種である一般式IIIの試薬の合成中間体である4−及び5−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸の製造を要約する。まずステップ1では、図2に要約したように製造した4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルをN−(ベンジルオキシカルボニル)オキシスクシンイミドと縮合し、N−ベンジルオキシカルボニル保護4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルを得る。ステップ2ではフェノールヒドロキシル部分を臭化ベンジルと縮合し、付加保護ベンジルエーテル中間体を得る。ステップ3では、アルキルエステルをLiOHとの反応により選択的に開製し、対応する安息香酸を得る。ステップ4では安息香酸をクロロギ酸イソブチルとの反応により活性化させ、混合無水酸を形成した後、これを好ましくは非限定的な例としてNH2OH、NH2OCH3、NH2OCH2CN、NH2OCH2COOH、NH2OCH2CONH2、NH2OCH2CH2OH及びNH2OCH2OCH3から選択されるヒドロキシルアミン誘導体と反応させ、対応する保護ヒドロキサム酸を得る。最後に、ステップ5でアミンとフェノールヒドロキシル部分の両者をHClの存在下にパラジウム触媒水素化により同時に脱保護すると、対応する塩酸4−又は5−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸が得られる。対応する4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルに構造的に関連するこれらの合成中間体を図5又は6に従って更に官能化すると、一般式IIIの試薬が得られる。
一般式IVのフェニルボロン酸錯化結合体の製造
この時点で一般式Iの推定フェニルボロン酸錯化試薬を適当な生物活性種と反応させると、一般式II:
の結合体が得られる。
次に一般式IIの結合体をヒドロキシルアミン誘導体と縮合すると、一般式IV:
の対応するフェニルボロン酸錯化結合体が得られる。
利用可能なヒドロキシルアミン誘導体は、非限定的な例としてNH2OH、NH2OCH3、NH2OCH2CN、NH2OCH2COOH、NH2OCH2CONH2、NH2OCH2CH2OH、NH2OCH2OCH3から選択すると好ましい。一般式IIにおけるR2基がアルキル基である場合には、NH2OHを使用して一般式IIから一般式IVへの相互変換を実施すると好ましい。
あるいは、一般式III:
の試薬を使用して図1に記載した経路により一般式IVの結合体を製造することもできる。
一般式IIIのフェニルボロン酸錯化試薬を適当な生物活性種と反応させると、一般式IV:
の結合体が得られる。
一般式VIの生物結合体の製造
一般式VIの生物結合体は水性緩衝液又は有機溶剤中で製造することができる。好ましい緩衝液としては酢酸、クエン酸、リン酸、炭酸及びジグリシンが挙げられる。硼酸緩衝液はフェニルボロン酸錯化部分と錯化する可能性があるので避けるべきである。トリス、β−ヒドロキシアミン及びβ−ヒドロキシ酸緩衝液はフェニルボロン酸と錯化する可能性があるので避けるべきである。生物結合体は約4℃〜70℃の温度範囲で数分以内に形成される。所与pH及び温度の水溶液中の生物結合体の安定性は置換基R3によりある程度影響される。一般式VIの生物結合体は約3.5<pH<10.5の水溶液中で安定である。生物結合反応(フェニルボロン酸錯化)は0.01〜1Mの範囲のイオン強度の有意変化、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、N,N−ジメチルホルムアミド及びジメチルスルホキシド等の有機溶剤の存在、界面活性剤の存在、並びに尿素、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン及びホルムアミド等のカオトロピック剤(タンパク変性剤)の存在に非感受性であるが、これに対して従来技術の間接標識系では必要な結合性を保存するために生物高分子の構造を維持する必要があるのでカオトロピック剤は不適合である。一旦形成されると、生物結合体は水を除去しても安定であり、凍結乾燥保存することができる。
所与pHの生物結合体の安定性はある程度まで置換基R3により決定される。R3基がHである一般式VIのフェニルボロン酸錯体は約3.5〜10.5のpH範囲の水性緩衝液中で安定である。R3基がCH3である一般式VIのフェニルボロン酸錯体は約4.5〜10.5のpH範囲の水性緩衝液中で安定である。R3基が電気陰性部分を含む一般式VIのフェニルボロン酸錯体は約3.5〜10.5のpH範囲の水性緩衝液中で安定である。
酸触媒加水分解に対するフェニルボロン酸錯体の安定性は、錯体に関与するヒドロキサム酸のpKaに関係する。ヒドロキサム酸部分のpKaが低いほど、錯体は安定である。従って、R3基が電気陰性部分を含む一般式VIのフェニルボロン酸錯体は、R3基がH又はCH3であるものよりも酸触媒加水分解に対して高い安定性を示す。
一般式IIIのフェニルボロン酸錯化試薬の合成
一般式IIIの試薬は4−又は5−メチルサリチル酸から誘導される。いずれの場合も試薬は最終的に4−又は5−アミノメチル安息香酸アルキルである合成中間体から製造される。
図2はR2がアルキル基(例えばメチル、エチル等)である一般式IIIの試薬の合成中間体である4−及び5−アミノメチルサリチル酸アルキルの製造を要約する。図2はR2がメチル基である例を示す。まずステップ1では4−又は5−メチルサリチル酸をエステル化し、対応する4−又は5−メチルサリチル酸アルキルを得る。ステップ2ではエステルをN−ブロモスクシンイミドとベンゾイルペルオキシド触媒で臭素化し、対応する臭化ベンジルを得る。ステップ3では、臭化ベンジルをナトリウムアジドでアルキル化し、対応するベンジルアジドを得る。最後にステップ4でベンジルアジドをHClの存在下にパラジウム触媒水素化すると、対応する塩酸ベンジルアミンが得られる。
図4はR3基がアルキル又は電気陰性置換基をもつメチレンもしくはエチレンの1種である一般式IIIの試薬の合成中間体である4−及び5−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸の製造を要約する。まずステップ1では、図2に要約したように製造した4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルをN−(ベンジルオキシカルボニル)オキシスクシンイミドと縮合し、N−ベンジルオキシカルボニル保護4−及び5−アミノメチルサリチル酸アルキルを得る。ステップ2ではフェノールヒドロキシル部分を臭化ベンジルと縮合し、付加保護ベンジルエーテル中間体を得る。ステップ3では、アルキルエステルをLiOHとの反応により選択的に開裂し、対応する安息香酸を得る。ステップ4では安息香酸をクロロギ酸イソブチルとの反応により活性化し、混合無水酸を形成した後、これを好ましくは非限定的な例としてNH2OH、NH2OCH3、NH2OCH2CN、NH2OCH2COOH、NH2OCH2CONH2、NH2OCH2CH2OH及びNH2OCH2OCH3から選択されるヒドロキシルアミン誘導体と反応させ、対応する保護ヒドロキサム酸を得る。最後に、ステップ5でアミンとフェノールヒドロキシル部分の両者をHClの存在下にパラジウム触媒水素化により同時に脱保護すると、対応する塩酸4−又は5−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸が得られる。
図5はR3基が好ましくはH、CH3及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレン部分の1種から選択され、R1基がイミダゾリド、ヒドラジド及びN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分から選択される一般式IIIの試薬の合成を要約する。これらの試薬は各々無水脂肪酸を第1段階で使用する2段法で製造される。まず、図4に要約するように製造した4−又は5−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸を非極性有機溶剤中で好ましくは非限定的な例として無水コハク酸、無水グルタル酸、無水マレイン酸及び無水グリコール酸から選択される無水脂肪酸と縮合し、遊離末端カルボン酸部分をもつスペーサー(Z基)を導入する。この縮合反応で無水脂肪酸が無水マレイン酸である場合には、得られるZ基はアルケン基を含んでいるので不飽和である。その後、カルボン酸部分をN,N−カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸イソブチル及びtert−ブチルカルバゼート又はN,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド及びN−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により更に官能化すると、夫々対応するイミダゾリド、保護ヒドラジド及びN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルが得られる。保護ヒドラジドの場合には、試薬を無水塩酸と接触させることによりN−(tert−ブトキシカルボニル)保護基を脱離する。
図6はR3基が好ましくはH、CH3及び電気陰性置換基をもつメチレン又はエチレン部分の1種から選択され、R1基がブロモ、クロロ、マレイミド、ジチオピリジル及びイミド酸エステル部分から選択される一般式IIIの試薬の合成を要約する。R1基がブロモ及びクロロ部分から選択される一般式IIIの試薬は、図4に要約するように製造した4−及び5−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸を夫々無水ブロモ酢酸又はクロロ酢酸と縮合することにより製造される。同様のヨード試薬は、クロロ試薬とヨウ化ナトリウムのハロゲン交換により製造される。非保護ヒドロキサム酸の分子内アルキル化の可能性により、R3がHであるときには、R1がブロモ、クロロ、ヨード、ブロモアセトアミド、クロロアセトアミド及びヨードアセトアミド部分から選択される一般式IIIの試薬は簡便に製造することができない。R1基がマレイミド又はジチオピリジル部分から選択される一般式IIIの試薬は、図4に要約するように製造した4−又は5−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸を、末端マレイミド又はジチオピリジル部分をもつ脂肪族カルボン酸エステルのN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと縮合することにより製造される。R1がイミド酸エステル部分である一般式IIIの試薬は2段法で製造され、まず図4に要約するように製造した4−又は5−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸を、末端ニトリル部分をもつ脂肪族カルボン酸エステルのN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと縮合する。次いで、0℃でメタノール中無水塩酸との反応によりニトリル部分をイミド酸メチルエステルに変換する。
R3がH以外のものであるという条件で図4の終産物を使用して無水アクリル酸又は塩化アクリロイルをアミノメチルサリチルヒドロキサム酸と縮合することにより、別の試薬であるアミノメチルサリチルヒドロキサム酸のアクリル酸アミドを単段階で製造することができる。
R1基がN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル及びジチオピリジル部分から選択される一般式IIIの試薬は、Z基が中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式IIIの試薬を製造するための合成中間体として使用することができる。
R1基がN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分である一般式IIIの試薬を一般式R1−Z2−NH2(式中、Z2は好ましくは鎖長約1〜5炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である)の第1級脂肪族アミン部分をもつ化合物と縮合すると、Z基が中間アミド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式IIIの試薬が得られる。
あるいは、好ましくはコハク酸、マレイン酸、フマル酸、アセチレンジカルボン酸及びグルタル酸から選択されるジカルボン酸から誘導される一般式IIIのN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル試薬を、好ましくはグリシン、β−アラニン、アミノプロピオル酸、4−アミノ酪酸及び6−アミノカプロン酸から選択される一般式HO2C−Z2−NH2(式中、Z2は好ましくは鎖長約1〜5炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である)の第1級脂肪族アミン部分をもつ化合物と縮合すると、遊離末端カルボン酸部分をもつ化合物が得られ、これを図5に従って更に官能化すると、Zが中間アミド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式IIIの試薬が得られる。R1がN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルであり、Zが中間アミド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式IIIの試薬の合成について、この方法を図7に要約する。
R1がジチオピリジル部分である一般式IIIの試薬を、一般式R1−Z2−SH(式中、Z2は好ましくは鎖長約1〜5炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である)の末端チオール部分をもつ化合物と縮合すると、Z基が中間ジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式IIIの試薬が得られる。
あるいは、好ましくはメルカプト酢酸、β−メルカプトプロピオン酸、メルカプトプロピオル酸、4−メルカプト酪酸及び6−メルカプトカプロン酸から選択されるメルカプトカルボン酸から誘導される一般式IIIのジチオピリジル試薬を、好ましくはメルカプト酢酸、β−メルカプトプロピオン酸、メルカプトプロピオル酸、4−メルカプト酪酸及び6−メルカプトカプロン酸から選択される一般式HO2C−Z2−SH(式中、Z2は好ましくは鎖長約1〜5炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である)の末端チオール部分をもつ化合物と縮合すると、遊離末端カルボン酸部分をもつ化合物が得られ、これを図5に従って更に官能化すると、Zが中間ジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式IIIの試薬が得られる。R1がN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルであり、Zが中間ジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式IIIの試薬の合成について、この方法を図7に要約する。
Zが鎖長約3〜12炭素当量のポリエチレングリコール鎖である一般式IIIの試薬は、図2及び図3に要約するように製造した4−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸を、多数のものが市販されているN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分と反応性求電子又は求核部分(又はその前駆物質)の両者をもつポリエチレングリコール試薬と縮合し、Z基が鎖長約3〜12炭素当量のポリエチレングリコール鎖である一般式IIIの試薬を得ることにより製造される。
一般式Iの推定フェニルボロン酸錯化試薬の合成
一般式Iの試薬は4−又は5−メチルサリチル酸から誘導される。いずれの場合も試薬は最終的に4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルである合成中間体から製造される。図2はR2がアルキル基(例えばメチル、エチル等)である一般式Iの試薬の合成中間体である4−及び5−アミノメチルサリチル酸アルキルの製造を要約する。図2はR2がメチル基である例を示す。まずステップ1では4−又は5−メチルサリチル酸をエステル化し、対応する4−又は5−メチルサリチル酸アルキルを得る。ステップ2ではエステルをN−ブロモスクシンイミドとベンゾイルペルオキシド触媒で臭素化し、対応する臭化ベンジルを得る。ステップ3では、臭化ベンジルをナトリウムアジドでアルキル化し、対応するベンジルアジドを得る。最後にステップ4でベンジルアジドをHClの存在下にパラジウム触媒水素化すると、対応する塩酸ベンジルアミンが得られる。
図3はR2基が電気陰性部分をもつメチレン又はエチレンである一般式Iの試薬の合成中間体(例えば4−又は5−アミノメチルサリチル酸カルボキシメチル、アセトアミドメチル及びシアノメチル)の製造を要約する。R2基を他の予想される置換基に変えても同様の合成により製造できると考えられる。まず、図3のステップ1では、図2に要約するように製造した4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルをメタノール中ジ−tert−ブチルジカーボネート及びトリエチルアミンと反応させ、対応する保護N−(tert−ブトキシカルボニル)アミノメチル安息香酸メチルを得る。ステップ2では、トリメチルシラノール酸カリウムとの反応によりメチルエステルを開製し、酸水溶液中で処理し、対応する安息香酸を得る。ステップ3では、α−ハロ酸、α−ハロアセトアミド又はα−ハロアセトニトリル及びトリエチルアミンとの反応により安息香酸をアルキル化し、夫々対応するカルボキシメチル、アセトアミドメチル又はシアノメチルエステルを得る。最後に、ステップ4でテトラヒドロフラン中無水HClとの反応によりN−(tert−ブトキシカルボニル)保護基を脱離すると、対応する塩酸ベンジルアミンが得られる。
図5はR2基がアルキル又は電気陰性置換基をもつメチレンもしくはエチレンの1種であり、R1基がイミダゾリド、ヒドラジド及びN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分から選択される一般式Iの試薬の合成を要約する。これらの試薬は各々無水脂肪酸を第1段階で使用する2段法で製造される。まず、図2又は3に要約するように製造した4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルを非極性有機溶剤中で好ましくは非限定的な例として無水コハク酸、無水グルタル酸、無水マレイン酸及び無水グリコール酸から選択される無水脂肪酸と縮合し、遊離末端カルボン酸部分をもつスペーサー(Z基)を導入する。その後、カルボン酸部分をN,N−カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸イソブチル及びtert−ブチルカルバゼート又はN,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド及びN−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により更に官能化すると、夫々対応するイミダゾリド、保護ヒドラジド及びN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルが得られる。保護ヒドラジドの場合には、試薬を無水塩酸と接触させることによりN−(tert−ブトキシカルボニル)保護基を脱離する。
図6はR2基がアルキル又は電気陰性置換基をもつメチレンもしくはエチレンの1種であり、R1基がブロモ、クロロ、マレイミド、ジチオピリジル及びイミド酸エステル部分から選択される一般式Iの試薬の合成を要約する。R1基がブロモ及びクロロ部分から選択される一般式Iの試薬は、図2又は3に要約するように製造した4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルを夫々無水ブロモ酢酸又はクロロ酢酸と縮合することにより製造される。同様のヨード試薬は、クロロ試薬とヨウ化ナトリウムのハロゲン交換により製造される。非保護ヒドロキサム酸の分子内アルキル化の可能性により、R3がHであるときには、R1がブロモ、クロロ、ヨード、ブロモアセトアミド、クロロアセトアミド及びヨードアセトアミド部分から選択される一般式IIIの試薬は簡便に製造することができない。R1基がマレイミド又はジチオピリジル部分から選択される一般式Iの試薬は、図2又は3に要約するように製造した4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルを、末端マレイミド又はジチオピリジル部分をもつ脂肪族カルボン酸エステルのN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと縮合することにより製造される。R1がイミド酸エステル部分である一般式Iの試薬は2段法で製造され、まず図2又は3に要約するように製造した4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルを、末端ニトリル部分をもつ脂肪族カルボン酸のN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと縮合する。次いで、0℃でメタノール中無水塩化水素との反応によりニトリル部分をイミド酸メチルエステルに変換する。
R1基がジチオピリジル(図6)、イミダゾリド(図5)及びN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(図5)部分から選択される一般式Iの試薬は、Z基が中間アミド又はジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である延長スペーサーをもつ一般式Iの試薬を製造するための合成中間体として使用することができる。
R1基がイミダゾリド及びN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分から選択される一般式Iの試薬を一般式R1−Z’−NH2(式中、Z’は好ましくは鎖長約1〜5炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である)の第1級脂肪族アミン部分をもつ化合物と縮合すると、Z基が中間アミド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Iの試薬が得られる。図7ではZ’をZ2として示す。
あるいは、R1基がイミダゾリド及びN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分から選択される一般式Iの試薬を、好ましくは非限定的な例としてグリシン、β−アラニン、4−アミノ酪酸及び6−アミノカプロン酸から選択される一般式H2N−Z’−COOH(式中、Z’は好ましくは鎖長約1〜5炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である)の第1級脂肪族アミン部分をもつ化合物と縮合すると、遊離末端カルボン酸部分をもつ化合物が得られ、これを図5に従って更に官能化すると、Zが中間アミド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Iの試薬が得られる。
R1基がジチオピリジル部分である一般式Iの試薬を、一般式R1−Z’−SH(式中、Z’は好ましくは鎖長約1〜5炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である)の末端チオール部分をもつ化合物と縮合すると、Z基が中間ジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Iの試薬が得られる。
あるいは、R1基がジチオピリジル部分である一般式Iの試薬を、一般式HS−Z’−COOH(式中、Z’は好ましくは鎖長約1〜5炭素当量の非分枝飽和又は不飽和鎖である)の末端チオール部分をもつ化合物と縮合すると、遊離末端カルボン酸部分をもつ化合物が得られ、これを図5に従って更に官能化すると、Zが中間ジスルフィド部分の少なくとも1個をもつ非分枝飽和又は不飽和鎖である一般式Iの試薬が得られる。
Zが鎖長約3〜12炭素当量のポリエチレングリコール鎖である一般式Iの試薬は、図2又は3に要約するように製造した4−又は5−アミノメチルサリチル酸アルキルを、多数のものが市販されているN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分と反応性求電子又は求核部分(又はその前駆物質)の両者をもつポリエチレングリコール試薬と縮合し、Z基が鎖長約3〜12炭素当量のポリエチレングリコール鎖である一般式Iの試薬を得ることにより製造される。
一般式IVのフェニルボロン酸錯化結合体の製造
この時点で一般式IIIのフェニルボロン酸錯化試薬を適当な生物活性種と反応させると、一般式IV:
の結合体が得られる。
あるいは、一般式I:
の試薬を利用した図1に記載の方法によっても、一般式IVの結合体が得られる。
一般式Iの推定フェニルボロン酸錯化試薬を適当な生物活性種と反応させると、一般式II:
の結合体が得られる。
次に一般式IIの結合体をヒドロキシルアミン誘導体と縮合すると、一般式IV:
の対応するフェニルボロン酸錯化結合体が得られる。
利用可能なヒドロキシルアミン誘導体は、非限定的な例としてNH2OH、NH2OCH3、NH2OCH2CN、NH2OCH2COOH、NH2OCH2CONH2、NH2OCH2CH2OH、NH2OCH2OCH3から選択すると好ましい。一般式IIにおけるR2基がアルキル基である場合には、NH2OHを使用して一般式IIから一般式IVへの相互変換を実施すると好ましい。
一般式VIの生物結合体の製造
一般式VIの生物結合体は水性緩衝液又は有機溶剤中で製造することができる。好ましい緩衝液としては酢酸、クエン酸、リン酸、炭酸及びジグリシンが挙げられる。硼酸緩衝液はフェニルボロン酸錯化部分と錯化する可能性があるので避けるべきである。トリス、β−ヒドロキシアミン及びβ−ヒドロキシ酸緩衝液はフェニルボロン酸と錯化する可能性があるので避けるべきである。生物結合体は約4℃〜70℃の温度範囲で数分以内に形成される。所与pH及び温度の水溶液中の生物結合体の安定性は置換基R3によりある程度影響される。一般式VIの生物結合体は約3.5<pH<10.5の水溶液中で安定である。生物結合反応(フェニルボロン酸錯化)は0.01〜1Mの範囲のイオン強度の有意変化、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、N,N−ジメチルホルムアミド及びジメチルスルホキシド等の有機溶剤の存在、界面活性剤の存在、並びに尿素、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン及びホルムアミド等のカオトロピック剤(タンパク変性剤)の存在に非感受性であるが、これに対して従来技術の間接標識系では必要な結合性を保存するために生物高分子の構造を維持する必要があるのでカオトロピック剤は不適合である。一旦形成されると、生物結合体は水を除去しても安定であり、凍結乾燥保存することができる。
所与pHの生物結合体の安定性はある程度まで置換基R3により決定される。R3基がHである一般式VIのフェニルボロン酸錯体は約3.5〜10.5のpH範囲の水性緩衝液中で安定である。R3基がCH3である一般式VIのフェニルボロン酸錯体は約4.5〜10.5のpH範囲の水性緩衝液中で安定である。R3基が電気陰性部分を含む一般式VIのフェニルボロン酸錯体は約3.5〜10.5のpH範囲の水性緩衝液中で安定である。
酸触媒加水分解に対するフェニルボロン酸錯体の安定性は、錯体に関与するヒドロキサム酸のpKaに関係する。ヒドロキサム酸部分のpKaが低いほど、錯体は安定である。従って、R3基が電気陰性部分を含む一般式VIのフェニルボロン酸錯体は、R3基がH又はCH3であるものよりも酸触媒加水分解に対して高い安定性を示す。
以下、実施例により一般式I及び一般式IIIの試薬の合成を詳細に説明する。
実施例I
塩酸4−アミノメチルサリチル酸エチルの製造
4−メチルサリチル酸エチル
4−メチルサリチル酸(20.0g,131mmol)をエタノール(300mL)に溶かし、濃硫酸(2.0mL)を加えた。混合物を40時間還流した。反応混合物の容量を100mLにし、分液漏斗に移し、クロロホルム(250mL)と水(200mL)で希釈した。水層のpHが約8(pH試験紙)になるまで固体重炭酸ナトリウムを少量ずつ加えた。漏斗内の混合物を十分に震盪し、層分離させた。有機層をまず水(150mL)、次いで飽和塩化ナトリウム水溶液(150mL)で洗浄した。最後に、有機溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶剤を蒸発させると、液体4−メチルサリチル酸エチル14.0g(収率59%)が得られた。
4−ブロモメチルサリチル酸エチル
4−メチルサリチル酸エチル(13.1g,72.5mmol)を四塩化炭素(150mL)に溶かし、N−ブロモスクシンイミド(13.1g,73.2mmol)とベンゾイルペルオキシド(0.2g,0.8mmol)を加えた。混合物を3.5時間還流した後、室温まで放冷させた。固形分を濾去し、濾液を蒸発乾涸した。粗固体生成物をヘキサン(100mL)から結晶させると、4−ブロモメチルサリチル酸エチル5.0g(収率27%)が得られた(m.p.64−66℃)。
塩酸4−アミノメチルサリチル酸エチル
4−ブロモメチルサリチル酸エチル(4.8g,18.6mmol)を無水N,N−ジメチルホルムアミド(50mL)に溶かし、ナトリウムアジド(1.2g,18.9mmol)を加えた。懸濁液を室温で2時間撹拌した。次いで反応混合物をジクロロメタン(150mL)で希釈し、1N塩酸水溶液(100mL)、水(100mL)及び飽和塩化ナトリウム水溶液(50mL)で抽出した。最後に、溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸すると、4−アジドメチルサリチル酸エチルが油状物として得られた。
炭素担持パラジウム(0.5g,10%[w/w])を窒素雰囲気下に1L容水素化フラスコに加えた。粗4−アジドメチルサリチル酸エチルをエタノール(200mL)に溶かし、水素化フラスコに移した。次いで濃塩酸水溶液(2mL)を加え、フラスコをパール水素化装置に装着した。反応混合物を室温で35psi水素下に4時間震盪した。次に混合物をセライトで濾過して触媒を除去し、濾液を蒸発乾涸すると、オフホワイトの固体が得られた。最後に、固体をEtOHから結晶させると、塩酸4−アミノメチルサリチル酸エチル3.1g(収率71%)が得られた(m.p.240−241℃)。
実施例II
一般式Iの試薬N−ヨードアセチル−4−アミノメチルサリチル酸エチルの製造
N−クロロアセチル−4−アミノメチルサリチル酸エチル
塩酸4−アミノメチルサリチル酸エチル(0.50g,2.17mmol)を無水N,N−ジメチルホルムアミド(25ml)に懸濁し、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.38mL,2.18mmol)を加えた。アミン塩が溶解したら、無水クロロ酢酸(0.39g,2.25mmol)を加え、反応混合物を室温で4.5時間撹拌した。次に反応混合物を酢酸エチル(100mL)で希釈し、この溶液を1N塩酸水溶液(100mL)、水(50mL)及び飽和塩化ナトリウム水溶液(50mL)で抽出した。酢酸エチル溶液を無水硫酸マゲネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸すると、白色固体が得られた。最後にこの固体を酢酸エチル:ヘキサン(8:2,10mL)から結晶させると、N−クロロアセチル−4−アミノメチルサリチル酸エチル0.13g(収率22%)が得られた(m.p.120−121℃)。
N−ヨードアセチル−4−アミノメチルサリチル酸エチル
N−クロロアセチル−4−アミノメチルサリチル酸エチル(0.11g,0.40mmol)をアセトン(5mL)に溶かし、ヨウ化ナトリウム(0.06g,0.40mmol)を加えた。溶液を2.5時間還流した後、室温まで冷却し、濾過した。濾液を蒸発乾涸すると、N−ヨードアセチル−4−アミノメチルサリチル酸エチルの白色固体が得られた(0.19g,収率100%)(m.p.105−108℃)。
実施例III
一般式Iの試薬トリフルオロ酢酸(6−アミノヘキサノイル)アミノメチルサリチル酸エチルの製造
(N−tert−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル)アミノメチルサリチル酸エチル
塩酸4−アミノメチルサリチル酸エチル(0.52g,1.28mmol)を無水N,N−ジメチルホルムアミド(25ml)に懸濁し、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.79mL,4.53mmol)、次いでN−tert−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサン酸スクシンイミジルエステル(0.74g,2.26mmol)を加えた。混合物を乾燥窒素下に18時間撹拌すると、この間に全固形分が溶解した。反応混合物を酢酸エチル(100mL)で希釈し、1N塩酸水溶液(100mL)で抽出した。層を分離し、酢酸エチル溶液を水(100mL)及び飽和塩化ナトリウム水溶液(500mL)で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発させると、非晶質オフホワイト固体が得られた。最後にこの固体を酢酸エチルから結晶させ、濾過し、減圧乾燥すると、(N−tert−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル)アミノメチルサリチル酸エチル0.67g(収率73%)が得られた(m.p.120−121℃、オープンキャピラリー、未補正)。
トリフルオロ酢酸(6−アミノヘキサノイル)アミノメチルサリチル酸エチル
(N−tert−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル)アミノメチルサリチル酸エチル(0.58g,1.41mmol)をジクロロメタン(5mL)に溶かし、溶液を氷/水浴で冷却した。トリフルオロ酢酸(5mL)を加え、反応混合物を室温まで昇温させた。2時間後に反応混合物を蒸発乾涸すると油状生成物が得られ、これを水酸化カリウムペレットで減圧乾燥すると、トリフルオロ酢酸(6−アミノヘキサノイル)アミノメチルサリチル酸エチル0.59g(収率99%)が得られた。
実施例IV
一般式Iの試薬4−スクシニルアミノメチルサリチル酸メチルスクシンイミジルエステルの製造
4−メチルサリチル酸メチル
4−メチルサリチル酸(100g,658mmol)を水性メタノール(500mL)に溶かし、濃硫酸(25mL)を慎重に加えた。溶液を18時間還流した後、室温まで冷却した。反応混合物を約150mLまで濃縮し、酢酸エチル(250mL)を加えた。酢酸エチル溶液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液で2回(各250mL)、次いで飽和塩化ナトリウム水溶液(100mL)で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させ、透明赤茶色液体を得た。この粗生成物を減圧蒸留(オイルポンプ)し、得られた透明粘性液体を放置すると、凝固し、4−メチルサリチル酸メチル98.1g(収率90%)が得られた。
4−ブロモメチルサリチル酸メチル
4−メチルサリチル酸メチル(98.1g,590mmol)を四塩化炭素(600mL)に溶かし、N−ブロモスクシンイミド(105.0g,590mmol)とベンゾイルペルオキシド(0.7g,3mmol)を加えた。混合物を窒素下に還流した。2時間後、付加量(0.7g)のN−ブロモスクシンイミドを加えた。還流を16時間続けた。反応混合物室温まで冷却し、固形分を濾去した。黄色い濾液を蒸発乾涸すると、粘稠な黄色いシロップが得られ、放置すると凝固した。固体にヘキサン(500mL)を加え、ほぼ全固形分が溶解するまで混合物を煮沸した。熱ヘキサン溶液を濾過し、固体が沈殿し始めるまで濃縮した。混合物を加熱して固形分を溶解させ、溶液を室温までゆっくりと放冷させた。薄黄色結晶がゆっくり形成された。次いで混合物を2時間氷冷し、結晶化を完了した。最後に固体を濾過し、冷ヘキサン(100mL)で洗浄し、減圧乾燥すると、4−ブロモメチルサリチル酸メチル83.5g(収率58%)が得られた(m.p.73−75℃、オープンキャピラリー、未補正)。
4−アジドメチルサリチル酸メチル
4−ブロモメチルサリチル酸メチル(83.5g,341mmol)を無水N,N−ジメチルホルムアミド(150mL)に溶かし、ナトリウムアジド(925.0g,380mmol)を加えた。黄色い懸濁液を室温で撹拌すると、固形分は迅速に溶解した。溶液は茶変し、臭化ナトリウムの沈殿が形成された。反応混合物を16時間撹拌後、濾過した。濾液を蒸発させて茶色い油状物を得、ヘキサンと酢酸エチルの混合物(1:1[v/v],100mL)に溶かした。シリカゲル(25g,フラッシュクロマトグラフィーグレード)を茶色い溶液に加え、混合物をよくかき混ぜた。シリカをガラスフリット上で濾去し、ヘキサン:酢酸エチル(1:1[v/v],各50mL)で3回洗浄した。シリカゲルをフリット上で乾燥し、濾液をあわせて蒸発乾涸すると、暗黄色液体が得られた。粗生成物(次の反応で使用)は多少の残留N,N−ジメチルホルムアミドを含有していることが判明した。
塩酸4−アミノメチルサリチル酸メチル
2L容パール水素化フラスコで粗4−アジドメチルサリチル酸メチルをメタノール(750mL)に溶かした。水(25mL)中炭素担持パラジウム触媒(10%[w/w],3.8g)、次いで濃塩酸(35mL)を加えた。フラスコをパール水素化装置に装着し、混合物を室温で40psi水素下に16時間震盪した。次に反応混合物を0.45mmナイロンフィルターで濾過した。次いで保持固形分をメタノール(150mL)、水(100mL)及び再びメタノール(150mL)で洗浄した。濾液をあわせて蒸発乾涸すると、褐色の固体が得られた。この固体を熱変性エタノール(150mL)に溶かし、溶液を室温まで放冷させた。すぐに白色結晶が形成された。最後に、混合物を16〜18時間4℃に冷却し、結晶化を完了した。固形分を濾過紙、少量の冷エタノール(50mL)、次いでジエチルエーテル(150mL)で洗浄し、水酸化カリウムペレットで減圧乾燥すると、塩酸4−アミノメチルサリチル酸メチル51.5g(4−ブロモメチルサリチル酸メチルに対する収率65%)が得られた(m.p.225−227℃、オープンキャピラリー、未補正)。
4−スクシニルアミノメチルサリチル酸メチル
塩酸4−アミノメチルサリチル酸メチル(3.00g,13.8mmol)を無水ピリジン(25mL)に懸濁し、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(2.7mL,15.5mmol)を加えた。懸濁液を氷/水浴中で15分間撹拌した後、無水コハク酸(1.36g,13.6mmol)を加えた。混合物を室温まで昇温させると、この間に出発固形分は溶解した。2時間撹拌後、混合物を蒸発乾涸し、得られた固体を酢酸エチル(300mL)と1M塩酸水溶液(100mL)に分配した。層を分離し、酢酸エチル溶液を1M塩酸(100mL)と飽和塩化ナトリウム水溶液(100mL)で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸すると、白色固体が得られた。最後に、固体を酢酸エチル/ヘキサンから結晶させ、濾過し、減圧乾燥すると、4−スクシニルアミノメチルサリチル酸メチル3.02g(収率87%)が得られた(m.p.161−163℃)。
4−スクシニルアミノメチルサリチル酸メチルスクシンイミジルエステル
4−スクシニルアミノメチルサリチル酸メチル(2.60g,10.2mmol)を無水テトラヒドロフラン(100mL)に溶かし、N−ヒドロキシスクシンイミド(1.29g,11.2mmol)と1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミド(2.10g,10.2mmol)を加えた。混合物を乾燥窒素下に室温で撹拌すると、固形分は迅速に溶解した。約20分後に白色沈殿が形成された。反応混合物を16〜18時間撹拌後、−20℃で数時間冷却した。混合物を冷濾過し、固形分を少量のテトラヒドロフラン(25mL)で洗浄した。濾液をあわせて蒸発乾涸し、残渣を酢酸エチル/ヘキサンから結晶させ、濾過し、減圧乾燥すると、4−スクシニルアミノメチルサリチル酸メチルスクシンイミジルエステル2.39g(収率62%)が得られた(m.p.133−135℃)。
実施例V
一般式Iの試薬塩酸(6−アミノヘキサノイル)アミノメチルサリチル酸メチルの製造
(N−tert−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル)アミノメチルサリチル酸メチル
塩酸4−アミノメチルサリチル酸メチル(2.25g,10.3mmol)を無水N,N−ジメチルホルムアミド(30ml)に懸濁し、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(3.6mL,20.7mmol)、次いでN−tert−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサン酸スクシンイミジルエステル(3.38g,10.3mmol)を加えた。混合物を乾燥窒素下に18時間撹拌すると、この間に全固形分は溶解した。次に溶剤を蒸発させると、薄茶色のシロップが残り、これを酢酸エチル(100mL)と1M塩酸水溶液(100mL)に分配した。層を分離し、酢酸エチル溶液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液(100mL)と飽和塩化ナトリウム水溶液(100mL)で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸すると、非晶質オフホワイト固体が得られた。この固体を酢酸エチル/ヘキサンから結晶させ、濾過し、減圧乾燥すると、(N−tert−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル)アミノメチルサリチル酸メチル3.25g(収率80%)が得られた(m.p.120−121℃、オープンキャピラリー、未補正)。
塩酸(6−アミノヘキサノイル)アミノメチルサリチル酸メチル
(N−tert−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル)アミノメチルサリチル酸メチル(3.00g,7.60mmol)を酢酸エチル(100mL)に溶かし、溶液に無水塩化水素をゆっくりとバブリングした。ガスが溶解するにつれて反応混合物は昇温した。5分後にガスを遮断し、溶液を室温で撹拌した。溶液中に自色沈殿が形成された。30分後に反応混合物を2時間氷冷却した後、固形分を濾過し、ジエチルエーテル(50mL)で洗浄し、水酸化カリウムペレットで減圧乾燥すると、塩酸(6−アミノヘキサノイル)アミノメチルサリチル酸メチル2.50g(収率99%)が得られた(158−160℃で発泡分解、オープンキャピラリー、未補正)。
実施例VI
一般式Iの試薬4−グルタリルアミノメチルサリチル酸シアノメチルスクシンイミジルエステルの製造
N−tert−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸メチル
塩酸4−アミノメチルサリチル酸メチル(10.9g,50mmol)を無水メタノール(200mL)に懸濁し、ジ−tert−ブチルジカーボネート(10.9g,50mmol)とトリエチルアミン(7.0mL,50mmol)を加えた。固形分はすぐに溶解し、ゆっくりとガスが発生した。反応混合物を乾燥窒素下に室温で18時間撹拌後、蒸発乾涸すると、白色非晶質体が得られた。この非晶質体を酢酸エチル(200mL)と水(100mL)に分配した。層を分離し、酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶液を濾過し、蒸発させると、白色固体が得られた。この固体を酢酸エチル/ヘキサンから結晶させ、濾過し、減圧乾燥すると、N−tert−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸メチル13.7g(収率97%)が得られた(m.p.95−96℃、オープンキャピラリー、未補正)。
N−tert−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸
N−tert−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸メチル(8.7g,30.9mmol)を無水テトラヒドロフラン(100mL)に溶かし、トリメチルシラノール酸カリウム(4.4g,30.9mmol,純度90%)を加えた。黄色い溶液を24時間還流すると、この間に褐色の沈殿が形成され、溶剤は薄茶色になった。混合物を蒸発乾涸し、固形分を冷水(100mL)に溶かした。茶色い溶液を氷浴で冷却し、溶液を撹拌しながら飽和硫酸水素カリウム水溶液でpH2〜3に滴定した。滴定中にオフホワイトの固体が沈殿した。固体を濾過し、冷水で洗浄し、水酸化カリウムで減圧乾燥すると、粗N−tert−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸6.7g(収率81%)が得られた(m.p.141−144℃、融点で発泡しながら分解、オープンキャピラリー、未補正)。
N−tert−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸シアノメチル
N−tert−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸(8.2g,30.6mmol)をクロロアセトニトリル(25mL)に懸濁し、トリエチルアミン(4.3mL,30.6mmol)を加えた。混合物を50℃で乾燥窒素下に撹拌し、固形分を溶解させた。溶液を18時間撹拌後、室温まで冷却した。溶剤を蒸発させ、残渣を酢酸エチル(250mL)と水(250mL)に分配した。層を分離し、酢酸エチル層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液(100mL)と飽和塩化ナトリウム水溶液(100mL)で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸した。残留している淡褐色固形分を酢酸エチル(100mL)に溶かし、シリカゲル(10g,フラッシュクロマトグラフィーグレード)を加えた。混合物をよくかき混ぜ、室温で5分間放置した。シリカをガラスフリット上で濾去し、酢酸エチル(100mL)で洗浄した。濾液を蒸発乾涸した。固体残渣を酢酸エチル/ヘキサンから結晶させると、N−tert−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸シアノメチル7.9g(収率88%)が得られた(m.p.144−146℃、オープンキャピラリー、未補正)。
塩酸アミノメチルサリチル酸シアノメチル
N−tert−ブトキシカルボニルアミノメチルサリチル酸シアノメチル(7.7g,26.2mmol)をテトラヒドロフラン(150mL)に溶かし、無水塩化水素を溶液にゆっくりとバブリングした。ガスが溶解するにつれて反応混合物は昇温した。5分後にガスを遮断し、溶液を室温で撹拌した。粘稠クリーム状白色沈殿が溶液中に形成された。30分後に反応混合物を2時間氷冷した後、固形分を濾過し、ジエチルエーテル(100mL)で洗浄し、水酸化カリウムペレットで減圧乾燥すると、塩酸アミノメチルサリチル酸シアノメチル5.8g(収率91%)が得られた(m.p.210℃で暗色化、228℃で分解、オープンキャピラリー、未補正)。
4−グルタリルアミノメチルサリチル酸シアノメチル
塩酸4−アミノメチルサリチル酸シアノメチル(1.22g,5.04mmol)を無水ジクロロメタン(100mL)に懸濁し、懸濁液を氷/水浴中で撹拌した。次に、無水グルタル酸(0.57g,5.0mmol)とトリエチルアミン(0.7mL,5.0mmol)の無水ジクロロメタン(25mL)溶液を15分間かけて滴下した。混合物を室温まで昇温させ、反応混合物を18時間撹拌した。混合物を蒸発乾涸し、得られた固体を冷0.1M塩酸水溶液(50mL)下に摩砕した。固形分を濾取し、冷水で洗浄し、水酸化カリウムペレットで減圧乾燥すると、4−グルタリルアミノメチルサリチル酸シアノメチル1.43g(収率89%)が得られた(m.p.125−126℃)。
4−グルタリルアミノメチルサリチル酸シアノメチルスクシンイミジルエステル
4−グルタリルアミノメチルサリチル酸シアノメチル(1.00g,3.1mmol)を無水テトラヒドロフラン(50mL)に溶かし、N−ヒドロキシスクシンイミド(0.36g,3.1mmol)と1,3−ジクロロヘキシルカルボジイミド(0.64g,3.1mmol)を加えた。混合物を乾燥窒素下に室温で撹拌すると、固形分はすぐに溶解した。約60分後に自色沈殿が形成された。反応混合物を24時間撹拌後、−20℃で数時間冷却した。混合物を冷濾過し、固形分を少量のテトラヒドロフラン(10mL)で洗浄した。濾液をあわせて蒸発乾涸し、残渣を酢酸エチル/ヘキサンから結晶させ、濾過し、減圧乾燥すると、4−グルタリルアミノメチルサリチル酸シアノメチルスクシンイミジルエステル1.04g(収率80%)が得られた(m.p.116−119℃)。
実施例VII
一般式Iの試薬4−(6−マレイミドヘキサノイル)アミノメチルサリチル酸シアノメチルの製造
4−(6−マレイミドヘキサノイル)アミノメチルサリチル酸シアノメチル
塩酸4−アミノメチルサリチル酸シアノメチル(79mg,0.32mmol)と6−マレイミドカプロン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(100mg,0.32mmol)を無水N,N−ジメチルホルムアミド(5.0mL)に懸濁し、懸濁液を室温で撹拌した。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(87μL,0.50mmol)を加えた。固形分はすぐに溶解し、透明な薄黄色溶液が得られた。30分後に混合物を蒸発乾涸し、残渣を酢酸エチル(25mL)と冷0.1M塩酸水溶液(25mL)に分配した。層を分離し、酢酸エチル溶液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液(25mL)と飽和塩化ナトリウム水溶液(25mL)で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させると、白色固体が得られた。固体を酢酸エチル/ヘキサンから結晶させると、4−(6−マレイミドヘキサノイル)アミノメチルサリチル酸シアノメチル108mg(収率84%)が得られた(m.p.141−144℃)。
実施例VIII
一般式Iの試薬4−(3−(2−ピリジルジチオ)プロピオニル)アミノメチルサリチル酸シアノメチルの製造
4−(3−(2−ピリジルジチオ)プロピオニル)アミノメチルサリチル酸シアノメチル
塩酸4−アミノメチルサリチル酸シアノメチル(79mg,0.32mmol)と(3−(2−ピリジルジチオ)プロピオン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(100mg,0.32mmol)を無水N,N−ジメチルホルムアミド(5.0mL)に懸濁し、懸濁液を室温で撹拌した。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(87μL,0.50mmol)を加えた。固形分はすぐに溶解し、透明な淡褐色溶液が得られた。30分後に混合物を蒸発乾涸し、残渣を酢酸エチル(25mL)と冷0.1M塩酸水溶液(25mL)に分配した。層を分離し、酢酸エチル溶液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液(25mL)と飽和塩化ナトリウム水溶液(25mL)で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させると、透明油状物が得られた。冷ヘキサン下に摩砕すると、4−(3−(2−ピリジルジチオ)プロピオニル)アミノメチルサリチル酸シアノメチルのガム64mg(収率48%)が得られた。
実施例IX
一般式IIIの試薬4−グルタリルアミノメチルサリチルヒドロキサム酸ヒドラジドの製造
4−グルタリルアミノメチルサリチル酸メチルN−tert−ブチルオキシカルボニルヒドラジド
[無水コハク酸の代わりに無水グルタル酸を使用して上記スクシニル誘導体と同様に製造した]4−グルタリルアミノメチルサリチル酸メチルスクシンイミジルエステル(2.57g,6.8mmol)を無水テトラヒドロフラン(100mL)に溶かし、tert−ブチルカルバゼート(0.90g,6.8mmol)を加えた。反応混合物を室温で60時間撹拌した。次いで、溶液を蒸発乾涸し、残渣を酢酸エチル(100mL)に溶かした。酢酸エチル溶液を飽和重炭酸カリウム水溶液(100mL)と飽和塩化ナトリウム水溶液(100mL)で洗浄した。次いで、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸した。残渣を温和に昇温しながら酢酸エチル(50mL)に溶かし、温溶液にヘキサン(50mL)を加え、−20℃に冷却することにより結晶させた。結晶化が開始したら、更にヘキサン(50mL)を加え、混合物を−20℃に18時間冷却した。最後に、固形分を濾過し、ヘキサン:酢酸エチル(2:1[v/v],90mL)で洗浄し、減圧乾燥すると、4−グルタリルアミノメチルサリチル酸メチルN−tert−ブチルオキシカルボニルヒドラジド2.51g(収率90%)が得られた(m.p.68−72℃、オープンキャピラリー、未補正)。
4−グルタリルアミノメチルサリチルヒドロキサム酸N−tert−ブチルオキシカルボニルヒドラジド
硫酸ヒドロキシルアミン(0.82g,5.0mmol)、水酸化ナトリウム(1.00g,25.0mmol)及び亜硫酸ナトリウム(0.20g,mmol)の冷(氷/水浴)水(25mL)溶液に4−グルタリルアミノメチルサリチル酸メチルN−tert−ブチルオキシカルボニルヒドラジド(2.00g,4.9mmol)を加えた。懸濁液を暗所で18時間撹拌し、室温まで昇温させた。次いで溶液を濾過し、多少の不溶分を除去し、薄黄色溶液を氷/水浴で冷却した。冷反応混合物を冷硫酸(25%[v/v]水溶液)でpH3〜4までゆっくりと滴定すると、この間にガム状物質が沈殿した。次いで混合物を数時間氷冷し、液体をデカントした。残留非晶質固体をメタノール(25mL)に溶かし、濾過し、蒸発させると、白色泡状物が得られた。泡状物を減圧乾燥すると、粗4−グルタリルアミノメチルサリチルヒドロキサム酸N−tert−ブチルオキシカルボニルヒドラジド1.86g(収率94%)が得られた。
塩酸4−グルタリルアミノメチルサリチルヒドロキサム酸ヒドラジド
4−グルタリルアミノメチルサリチルヒドロキサム酸N−tert−ブチルオキシカルボニルヒドラジド(1.86g,4.6mmol)を無水テトラヒドロフラン(100mL)に溶かし、無水塩化水素を溶液にゆっくりとバブリングした。ガスが溶解するにつれて反応混合物は昇温した。5分後にガスを遮断し、溶液を室温で撹拌した。溶液中に白色沈殿が形成された。30分後に反応混合物を2時間氷冷した後、固形分を濾過し、ジエチルエーテル(50mL)で洗浄し、水酸化カリウムペレットで減圧乾燥すると、塩酸4−グルタリルアミノメチルサリチルヒドロキサム酸ヒドラジド1.51g(収率95%)が得られた(m.p.65℃で減量、100℃で発泡分解、オープンキャピラリー、未補正)。
実施例X
一般式IIIの試薬4−グルタリルアミノメチルサリチル(O−メチル)ヒドロキサム酸スクシンイミジルエステルの製造
N−(ベンジルオキシカルボニル)−4−アミノメチルサリチル酸メチル
塩酸4−アミノメチルサリチル酸メチル(5.04g,23.2mmol)をクロロホルム(80mL)に懸濁し、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(4.10mL,23.5mmol)とN−(ベンジルオキシカルボニルオキシ)スクシンイミド(6.48g,26.0mmol)を加えた。反応混合物を室温で4時間撹拌すると、この間に全固形分が溶解した。次に反応混合物を1N塩酸水溶液(100mL)、水(75mL)及び飽和塩化ナトリウム水溶液(50mL)で抽出した。クロロホルム溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸すると、白色固体が得られた。生成物を酢酸エチル:ヘキサンから結晶させると、N−(ベンジルオキシカルボニル)−4−アミノメチルサリチル酸メチル61.7g(収率84%)が得られた(m.p.91−92℃、オープンキャピラリー、未補正)。
N−(ベンジルオキシカルボニル)−4−アミノメチル−2−O−ベンジルサリチル酸メチル
N−(ベンジルオキシカルボニル)−4−アミノメチルサリチル酸メチル(6.06g,19.2mmol)をアセトン(150mL)に溶かし、臭化ベンジル(2.60mL,21.9mmol)と無水炭酸カリウム(13.28g,96.1mmol)を加えた。混合物を撹拌し、22時間加熱還流した。混合物を濃縮し、アセトンの大部分を除去し、酢酸エチル(100mL)を加えた。頻繁にかき混ぜながら塩酸水溶液(1N,200mL)をゆっくり加え、固形炭酸塩を溶解させた。層を分離し、水層を酢酸エチル(50mL)で抽出した。酢酸エチル溶液をあわせ、水(100mL)と飽和塩化ナトリウム水溶液(50mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、約50mLまで濃縮した。この溶液を沸点まで加熱し、ヘキサン(150mL)を加えた。溶液を氷冷すると、結晶がゆっくりと形成された。結晶を濾取し、ヘキサンで洗浄し、減圧乾燥すると、N−(ベンジルオキシカルボニル)−4−アミノメチル−2−O−ベンジルサリチル酸メチル6.97g(収率89%)が得られた(m.p.106−107℃、オープンキャピラリー、未補正)。
N−(ベンジルオキシカルボニル)−4−アミノメチル−2−O−ベンジルサリチル酸
N−(ベンジルオキシカルボニル)−4−アミノメチル−2−O−ベンジルサリチル酸メチル(6.81g,16.8mmol)をテトラヒドロフラン(50mL)に溶かした。水酸化リチウム・1水和物(0.78g,18.5mmol)の水(25mL)溶液を加え、反応混合物を75℃で24時間加熱撹拌した。溶液を冷却し、1N塩酸水溶液(50mL)を加えた。反応混合物を酢酸エチルで2回(150mL、次いで50mL)抽出した。酢酸エチル抽出層をあわせて水(75mL)と飽和塩化ナトリウム水溶液(50mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、150mLまで濃縮した。酢酸エチル溶液を沸点まで加熱し、ヘキサン(150mL)を加えた。溶液を氷冷すると、結晶が形成された。結晶を濾取し、ヘキサンで洗浄し、減圧乾燥すると、N−(ベンジルオキシカルボニル)−4−アミノメチル−2−O−ベンジルサリチル酸5.92g(収率90%)が得られた(m.p.139−140℃、オープンキャピラリー、未補正)。
N−(ベンジルオキシカルボニル)−4−アミノメチル−2−O−ベンジルサリチル(O−メチル)ヒドロキサム酸
N−(ベンジルオキシカルボニル)−4−アミノメチル−2−O−ベンジルサリチル酸(3.07g,7.84mmol)を乾燥窒素下に無水N,N−ジメチルホルムアミド(75mL)に溶かした。溶液を氷/水浴で冷却後、トリエチルアミン(2.20mL,15.8mmol)、次いでクロロギ酸イソブチル(1.10mL,8.48mmol)を加えた。反応混合物を氷中で1.5時間撹拌した。塩酸メトキシルアミン(0.67g,8.02mmol)を加え、反応混合物を室温まで昇温させた。3時間後に反応混合物を酢酸エチル(150mL)で希釈し、1N塩酸水溶液(100mL)、水(100mL)及び飽和塩化ナトリウム水溶液(50mL)で抽出した。酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、約50mLまで濃縮した。この溶液を煮沸し、ヘキサン(100mL)を加えた。氷浴中で冷却すると、すぐに結晶が形成された。結晶を濾取し、ヘキサンで洗浄すると、N−(ベンジルオキシカルボニル)−4−アミノメチル−2−O−ベンジルサリチル(O−メチル)ヒドロキサム酸2.87g(収率87%)が得られた(m.p.116−117℃、オープンキャピラリー、未補正)。
塩酸4−アミノメチルサリチル(O−メチル)ヒドロキサム酸
N−(ベンジルオキシカルボニル)−4−アミノメチル−2−O−ベンジルサリチル(O−メチル)ヒドロキサム酸(1.42g,3.38mmol)と炭素担持パラジウム(0.10g,10%[w/w])を乾燥窒素下に1L容水素化フラスコに入れた。エタノール(150mL)、次いで濃塩酸水溶液(0.30mL)を加えた。フラスコをパール水素化装置に装着し、室温で35psi水素下に7時間震盪した。次に反応混合物をセライトで濾過して触媒を除去し、沈殿が形成し始めるまで濾液を濃縮した。混合物を氷冷し、固形分を濾取し、ヘキサンで洗浄し、減圧乾燥すると、塩酸4−アミノメチルサリチル(O−メチル)ヒドロキサム酸0.65g(収率83%)が得られた(m.p.>250℃、オープンキャピラリー、未補正)。
4−グルタリルアミノメチルサリチル(O−メチル)ヒドロキサム酸スクシンイミジルエステル
塩酸4−アミノメチルサリチル(O−メチル)ヒドロキサム酸(0.57g,1.82mmol)を無水N,N−ジメチルホルムアミド(10mL)に溶かし、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.35mL,2.01mmol)と無水グルタル酸(0.23g,2.02mmol)を加えた。混合物を室温で26時間撹拌した後、N−ヒドロキシスクシンイミド(0.23g,2.00mmol)と1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミド(0.42g,2.01mmol)を加えた。反応混合物を室温で更に24時間撹拌した。次に混合物を濾過し、酢酸エチル(100mL)で希釈した。酢酸エチル溶液を1N塩酸水溶液(100mL)、水(100mL)及び飽和塩化ナトリウム水溶液(50mL)で洗浄した。次いで溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾涸した。粗ガム状生成物を酢酸エチルとジエチルエーテルの混合物下に摩砕し、得られた固体を濾過及び減圧乾燥すると、4−グルタリルアミノメチルサリチル(O−メチル)ヒドロキサム酸スクシンイミジルエステル0.15g(収率20%)が得られた(m.p.121−124℃、オープンキャピラリー、未補正)。
実施例XI
一般式IIIの試薬4−(3−(2−ピリジルジチオ)プロピオニル)アミノメチルサリチル(O−メチル)ヒドロキサム酸の製造
4−(3−(2−ピリジルジチオ)プロピオニル)アミノメチルサリチル(O−メチル)ヒドロキサム酸
3−(2−ピリジルジチオ)プロピオン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(100mg,0.32mmol)を無水N,N−ジメチルホルムアミド(5.0mL)に溶かし、N,N−イソプロピルエチルアミン(65μL,0.36mmol)、次いで塩酸4−アミノメチルサリチル(O−メチル)ヒドロキサム酸(82mg,0.35mmol)を加えた。反応混合物を室温で6時間撹拌した。溶剤を減圧蒸発させ、ジクロロメタン/メタノール/酢酸(95:5:1[v/v/v])を溶離溶媒として残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにかけた。所望生成物を含むフラクションをプールし、油状物まで蒸発させると、4−(3−(2−ピリジルジチオ)プロピオニル)アミノメチルサリチル(O−メチル)ヒドロキサム酸44mg(収率35%)が得られた。
実施例XII
一般式IVの結合体の製造
5’−PBA標識オリゴデオキシリボヌクレオチド結合体の合成
標準自動ホスホロアミダイト化学(Beckmkan Instruments Oligo 1000及び関連試薬)を使用して1μmol規模でオリゴデオキシリボヌクレオチド7172(配列5’−GATTACGCCAGTTGTACGGAC−3’)を合成した。同一装置で保護アミン含有ホスホロアミダイト(Aminolink 2,Applied Biosystems又はUniLink Amino Modifier,Clontech)を使用し、標準化学を使用してオリゴデオキシリボヌクレオチドの5’末端に1〜4個の反応性第1級アミンを導入した。次に、完成したオリゴデオキシリボヌクレオチドを支持体から分離し、UltraFast Deprotectionキット(Beckman Instruments)と製造業者によるプロトコールを使用してヌクレオ塩基を脱保議した。
アミノオリゴヌクレオチドをエタノール沈殿により精製し、0.1M NaHCO30.8mLに溶かし、反応性N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分をもつフェニルボロン酸試薬(PBA−Z−NHS)(無水N,N−ジメチルホルムアミド0.2mL中でアミノオリゴヌクレオチド上に第1級アミノ基1mmol当たり5mg)と室温で2〜18時間縮合した。
粗PBA修飾オリゴヌクレオチドを0.1M酢酸トリエチルアンモニウム水溶液(pH6.5)中KwikSep Dextranカラム(Pierce Chemical)でゲル濾過により反応混合物から分離した。次にPBA修飾オリゴヌクレオチドを真空遠心機で1mLまで濃縮し、酢酸トリエチルアンモニウム−アセトニトリル勾配を使用して4.6mm×250mm C18カラムで逆相HPLCにより精製した。所望生成物ピークを集め、真空遠心機で蒸発させて小ペレットとし、水0.5mLに溶かし、凍結保存した。
サリチルヒドロキサム酸磁気ビーズの製造
未修飾M280又はM450磁気ビーズ(Dynal)10mlをアセトニトリルで徐々に脱水し、−78℃ジクロロメタン中で塩化オキサリル活性化N,N−ジメチルスルホキシドとトリエチルアミンを使用してアルデヒド修飾ビーズに変換した。得られたアルデヒドをもつビーズを徐々に再水和し、0.1M酢酸ナトリウム(pH5.5)5mLに懸濁した。15〜25mgをN,N−ジメチルスルホキシド200μLに溶かして加え、結合反応混合物を室温で一晩回転させることにより、アルデヒド基を4−グルタリルアミノメチルサリチルヒドロキサム酸ヒドラジド(SHA−Z−NHNH2)に結合した。次にビーズを十分に水洗し、10%エタノール5mL中に保存した。
サリチルヒドロキサム酸(SHA)Sepharose 4Bの製造
(6−アミノヘキサノイル)−4−アミノメチルサリチルヒドロキサム酸(SHA−Z−NH2)130mgを0.2M NaHCO330mLに溶かし、HCl洗浄CNBr活性化Sepharose 4B(Pharmala)6.5gと室温で一晩混合することにより、SHA−Sepharose 4Bを調製した。結合反応後、0.5M Tris(pH8.5)2mLを加え、ゲルスラリーを室温で1時間混合し、水、0.5M NaCl、更に再び水で洗浄した。得られたSHA−Sepharose 4Bを20%エタノール30mLに懸濁し、4℃で保存した。
フェニルボロン酸−α−ビオチン抗体結合体の製造
α−ビオチンモノクローナルIgG1抗体(0.1M NaHCO3中6.5mg/mL)1mLをPBA−Z−NHS(60mM PBA−Z−NHS 7.4μlをN,N−ジメチルスルホキシドに溶解)440nmolと室温で1時間結合させた。未結合PBA−Z−NHSとその水解物を透析により除去した。得られた結合体(P8A−α−ビオチン)の紫外線吸収スペクトルはA280に対してA260の増加を示し、フェニルボロン酸修飾に一致した。
フェニルボロン酸−アルカリホスファターゼ結合体の製造
アルカリホスファターゼ(Sigma,6mg/mL)1mLを0.1M NaHCO31Lで透析し、氷上でPBA−Z−NHS(N,N−ジメチルホルムアミド中70mMストック10μL)700nmolと2時間結合させた。未結合PBA−Z−NHSとその水解物を0.1M NaHCO3で透析により除去した。得られた結合体(PBA−AP)の紫外線吸収スペクトルはA280に対してA260の増加を示し、フェニルボロン酸修飾に一致した。結合体を4℃で保存した。
サリチルヒドロキサム酸−ヤギα−マウス抗体結合体の製造
ヤギα−マウス抗体(Rockland,0.1M NaHCO3中8.8mg/mL)2mLを4−グルタリルアミノメチルサリチル酸メチルスクシンイミジルエステル[SA(OMe)−Z−NHS]2.35μmolと室温で1時間結合させた。2M NH2OH(pH10)2mLを加え、1N NaOHでpHを10に調整し、反応混合物を室温で3日間インキュベートすることにより、結合体のメチルエステルをヒドロキサム酸に変換した。NH2OH及び未結合SA(OMe)−Z−NHSとその水解物を0.1M NaHCO3中でG−25 Sephadexカラム(Pharmala)でゲル濾過により除去し、結合体(SHA−ヤギα−マウス)を4℃で保存した。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プロトコール
λDNAの1領域(801bp)をポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。PCR反応は、1×PCR Buffer II(Perkin Elmer)中1μMのビオチン及びPBA修飾オリゴヌクレオチドプライマー、λDNA(1ng/μL)及びThermus aquaticus DNAポリメラーゼ1U以外に、200μM dATP、dCTP、dGTP及びdTTPを用いた。反応混合物を92℃で1分間変性させ、95℃10秒間、62℃20秒間及び72℃30秒間と72℃で5分間の最終延長からなる35PCRサイクルにより増幅した。反応により増幅産物(801bp)50〜100ngが生成され、50mM Tris,100mM硼酸、2mM EDTA(pH8.3)中1%アガロースゲル上で電気泳動中に未修飾PCR産物よりも遅い移動度を示した。
実施例XIII
一般式VIの生物結合体の製造
PBA標識PCR産物の検出
SHA−磁気ビーズ上のPBA標識PCR産物の検出
PBA標識PCR産物(0.02μL〜5μL)を1.5M NaCl,150mMクエン酸ナトリウム,pH7(10×SSC)25〜100μLで希釈し、SHA磁気粒子(10〜50μl)を入れたポリプロピレンマイクロタイタープレートウェルに加えた。粒子とPCR産物を室温で30〜60分間ときどき混合した。磁気プレートでウェルの底に磁気粒子を集め、150mM NaCl,20mM Tris−HCl,0.02% Tween 20,pH8(ELISA Wash Buffer)で5回洗浄した。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ(Boehringher Mannheim,1mg/mL BSA,NaCl,Tris−HCl,pH8中0.2U/mL)100μlを加え、室温で30分間磁気粒子と混合した。磁気プレートでウェルの底に磁気粒子を集め、ELISA Washで5回洗浄した。アルカリホスファターゼ基質(1Mジエタノールアミン緩衝液,1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,pH10.4中1mg/mL p−ニトロフェニルホスフェート)を加え、37℃で10〜60分間発色させた。検出下限はPCR産物50pgであった。
実施例XIV
一般式VIの生物結合体の製造
PBA標識オリゴヌクレオチドハイブリッドの検出
ビオチン標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたPBA標識オリゴヌクレオチドの検出
1.5M NaCl、150mMクエン酸ナトリウム(pH7)中5’−PBA及びビオチンラベルをもつ2種の21量体オリゴヌクレオチドと42量体オリゴヌクレオチドを45℃で10分間ハイブリダイズした。ポリプロピレンマイクロタイタープレートウェルでハイブリダイゼーション混合物25μLをSHA−磁気粒子(Dynal,M450)1〜50μLと混合した。30分後に磁気粒子を磁気プレートでウェルの底に集め、150mM NaCl、20mM Tris−HCl、0.02% Tween20(pH8)で5回洗浄した。
SHA−AP(1mg/mL BSA,140mM NaCl,10mM Tris−HCl,pH8中1μg/mL)100μLを磁気粒子に加え、よく混合した。30分後に磁気粒子を磁気プレートでウェルの底に集め、150mM NaCl,20mM Tris−HCl,0.02% Tween20,pH8で6回洗浄した。粒子をアルカリホスファターゼ基質(1Mジエタノールアミン緩衝液、1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,pH10.4中1mg/mL p−ニトロフェニルホスフェート)と混合し、37℃で90分間インキュベートした。A405をELISAプレートリーダー(Molecular Devices)で測定した。45pg程度の少量のオリゴヌクレオチド42量体が検出された。42量体又はPBA又はビオチン標識オリゴヌクレオチドを含まない実験対照は有意A405を生じなかった。
実施例XV
一般式VIの生物結合体の製造
SHA−Sepharose 4BへのPBA−α−ビオチン結合体の固定化
Tris塩類緩衝液で1mLまで希釈したPBA−α−ビオチン1mgをSHA−Sepharose 4Bの小カラム(1.0×2.0cm)に加え、Tris塩類緩衝液で十分に洗浄した。カラムに結合していない材料のA280ピークのサイズによると、PBA結合体のほぼ全部がカラムに固定化されていると判断された。
5mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)を含むTris塩類緩衝液中1μg/mLビオチン化アルカリホスファターゼ5mLをカラムに加えることにより、カラムのビオチン結合活性を調べた。カラムに加えたアルカリホスファターゼ希釈液の試料と酵素活性を比較するために、カラムを流れる材料のピークの試料を集めた。試料の添加後、カラムを緩衝液20mLで洗浄した。洗浄後、カラム材料の非常に小さい試料(ゲル約1μLを含む液体25μL)を集め、固定化α−ビオチン抗体による捕獲の結果としてゲルに結合した酵素活性を測定した。
1Mジエタノールアミン緩衝液,1mM MgCl2及び0.1mM ZnCl2,pH10.4中1mg/mL p−ニ卜ロフェニルホスフェート250μL中で酵素試料25μLをインキュベートした後、0.1M NaHCO3,10mM EDTA 650μLを加えることにより、アルカリホスファターゼ活性を測定した。緩衝液ブランクを基準にすると、カラムに添加した試料のA405は1.57であったが、カラムにより保持されなかった材料のピークのA405は0.042でしかなく、実質的に全酵素結合体がカラムに捕獲されたことを示した。少量のゲルで試験した処、A405は1.30であり、酵素が実際にカラムに捕獲されたことを示した。
実施例XVI
一般式VIの生物結合体の製造
SHA−磁気ビーズへのPBA−アルカリホスファターゼ結合体の固定化
5mg/mLウシ血清アルブミンを含むTris塩類緩衝液で5μg/mLまでPBA結合アルカリホスファターゼを希釈した。希釈したPBA結合酵素200μgをSHA−磁気ビーズ(Dynal,M280)と混合した。対照として酵素を未修飾ビーズ40μLとも混合した。ビーズを10分間氷上で静かに混合した後、ビーズを希土類磁石で集め、Tris塩類緩衝液で4回洗浄した。次に1Mジエタノールアミン緩衝液,1mM MgCl2及び0.1mM ZnCl2,pH10.4中1mg/mL p−ニトロフェニルホスフェート250μLにビーズを懸濁し、37℃で10分間ときどき混合した。Tris塩類緩衝液,5mM EDTA 750μLで反応を終了した。緩衝液ブランクに対するA405を測定し、磁気ビーズに結合したアルカリホスファターゼ活性を調べた。対照ビーズは僅か0.15のA405しか生じなかったが、SHA−磁気ビーズはビーズ5、10及び20μLで夫々0.62、0.97及び1.33のA405を生じ、有意量のPBA−AP結合体がビーズの表面に固定化していることを示した。
Claims (39)
- 一般式I:
一般式I
(式中、Z基は、1〜6個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも1個をもつ6〜18個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに3〜12個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、R1基は、タンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種との反応に利用可能な求電子又は求核基であって、アクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択され、R2基はアルキル又は電気陰性基をもつメチレン基の1種である)をもつ試薬。 - R2基がCH3、CH2CH3、CH2CN、CH2COOH、CH2CONH2及びCH2OCH3の1種から選択される請求項1に記載の試薬。
- Z基が一般式(CH2)n(式中、n=1〜6)の非分枝アルキル鎖である請求項1に記載の試薬。
- R1基がアクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択される請求項1に記載の試薬。
- R2基がCH3、CH2CH3、CH2CN、CH2COOH、CH2CONH2及びCH2OCH3の1種から選択される請求項6に記載の結合体。
- Z基が一般式(CH2)n(式中、n=1〜6)の非分枝アルキル鎖である請求項6に記載の結合体。
- 請求項1に記載の試薬と生物活性種を縮合することから成る、一般式II:
(式中、Z基は、1〜6個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも1個をもつ6〜18個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに3〜12個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、R2基はアルキル又は電気陰性基をもつメチレンの1種であり、BASはタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種であり、請求項1記載のR 1 基の一部を含み得る)の製造方法。 - 一般式I:
(式中、Z基は、1〜6個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも1個をもつ6〜18個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに3〜12個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、R1基は、タンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種との反応に利用可能な求電子又は求核基であって、アクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択され、R2基は炭素原子数1〜3の非分枝アルキルである)の製造方法であり、
4−メチルサリチル酸及び5−メチルサリチル酸のひとつをエステル化し、4−メチルサリチル酸アルキル又は5−メチルサリチル酸アルキル:
(式中、R2基は炭素原子数1〜3の非分枝アルキルである。)を得る段階と、4−メチルサリチル酸アルキル又は5−メチルサリチル酸アルキルをハロゲン化し、ベンジルハライド:
(式中、Yはハロゲンである。)を得る段階と、
ベンジルハライドをアジド塩と反応させ、ベンジルアジド:
を得る段階と、
ベンジルアジドを水素化し、ベンジルアミン:
を得る段階と、
ベンジルアミンを活性化カルボン酸と縮合する段階を含む前記方法。 - R1基がアクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択される請求項11に記載の方法。
- 一般式I:
(式中、Z基は、1〜6個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも1個をもつ6〜18個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに3〜12個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、R1基は、タンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種との反応に利用可能な求電子又は求核基であって、アクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択され、R2基は電気陰性基をもつメチレン基である)の製造方法であり、
4−メチルサリチル酸及び5−メチルサリチル酸のひとつをエステル化し、4−メチルサリチル酸アルキル又は5−メチルサリチル酸アルキル:
(式中、X基は炭素原子数1〜3の非分枝アルキルである。)を得る段階と、
4−メチルサリチル酸アルキル又は5−メチルサリチル酸アルキルをハロゲン化し、ベンジルハライド:
(式中、Yはハロゲンである。)を得る段階と、
ベンジルハライドをアジド塩と反応させ、ベンジルアジド:
を得る段階と、
ベンジルアジドを水素化し、ベンジルアミン:
を得る段階と、
ベンジルアミンを適当な保護基Qと縮合し、アミンを保護し、保護アミノメチル安息香酸アルキル:
を得る段階と、
アルキルエステルを開裂し、安息香酸:
を得る段階と、
安息香酸をアルキル化し、活性化アルキルエステル:
(式中、R2基は電気陰性基をもつメチレン基である。)を得る段階と、
保護基Qを脱離し、ベンジルアミン:
を得る段階と、
ベンジルアミンを活性化カルボン酸と縮合する段階を含む前記方法。 - R1基がアクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択される請求項13に記載の方法。
- R2基がCH2CN、CH2COOH、CH2CONH2及びCH2OCH3の1種から選択される請求項13に記載の方法。
- 一般式III:
(式中、Z基は、1〜6個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも1個をもつ6〜18個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに3〜12個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、R3基はH、アルキル、又は電気陰性置換基をもつメチレン若しくはエチレン基の1種から選択され、R1は、タンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種との反応に利用可能な求電子又は求核基であって、アクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択され、更に、R3基がHのときは、R1はアクリルアミド、アミノ、ジチオピリジル、ヒドラジド、イミド酸エステル、マレイミド及びチオール基の1種から選択される)をもつ試薬。 - R3基がH、CH3、CH2CN、CH2COOH、CH2CONH2、CH2CH2OH及びCH2OCH3の1種から選択される請求項17に記載の試薬。
- Z基が一般式(CH2)n(式中、n=1〜6)の非分枝アルキル鎖である請求項17に記載の試薬。
- R3基がH以外のときは、R1基がアクリルアミド、アミノ、ブロモ、ジチオピリジル、ブロモアセトアミド、ヒドラジド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミド酸エステル、イミダゾリド、ヨード、ヨードアセトアミド、マレイミド及びチオール基から構成される群から選択される請求項17に記載の試薬。
- 一般式IV:
(式中、Z基は、1〜6個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも1個をもつ6〜18個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに3〜12個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、R3基はH、アルキル、又は電気陰性置換基をもつメチレン若しくはエチレン基の1種から選択され、BASはタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種であり、請求項1記載のR 1 基の一部を含み得る)をもつ生物活性種と試薬の結合体。 - R3基がCH3、CH2CN、CH2COOH、CH2CONH2、CH2CH2OH及びCH2OCH3の1種から選択される請求項22に記載の結合体。
- Z基が一般式(CH2)n(式中、n=1〜6)の非分枝アルキル鎖である請求項28に記載の結合体。
- 一般式VI:
(式中、Z基は、1〜6個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも1個をもつ6〜18個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに3〜12個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、R3基はH、アルキル、又は電気陰性基をもつメチレン若しくはエチレンの1種から選択され、BAS及びBAS*はタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種であり、請求項1記載のR 1 基の一部を含み得る)をもつ生物結合体。 - R3基がCH3、CH2CN、CH2COOH、CH2CONH2、CH2CH2OH及びCH2OCH3の1種から選択される請求項26に記載の生物結合体。
- Z基が一般式(CH2)n(式中、n=1〜6)の非分枝アルキル鎖である請求項26に記載の生物結合体。
- BASとBAS*が異なる生物活性種である請求項26に記載の生物結合体。
- 一般式IIIの試薬を生物活性種と縮合し、一般式IV:
(式中、Z基は、1〜6個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも1個をもつ6〜18個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに3〜12個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、R3基はH、アルキル、又は電気陰性置換基をもつメチレン若しくはエチレン基の1種から選択され、BASはタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種であり、請求項1記載のR 1 基の一部を含み得る)の試薬を得る段階を含む一般式IVの試薬の製造方法。 - R3基がCH3、CH2CN、CH2COOH、CH2CONH2、CH2CH2OH及びCH2OCH3の1種から選択される請求項30に記載の方法。
- Z基が一般式(CH2)n(式中、n=1〜6)の非分枝アルキル鎖である請求項30に記載の方法。
- 一般式VI:
(式中、Z基は、1〜6個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも1個をもつ6〜18個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに3〜12個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、R3基はH、アルキル、又は電気陰性基をもつメチレン若しくはエチレンの1種から選択され、BAS及びBAS*はタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種であり、請求項1記載のR 1 基の一部を含み得る)の生物結合体の製造方法であって、第2の生物活性種とフェニルボロン酸を含む第2の結合体と請求項6に記載の結合体を錯化する段階を含む前記方法。 - R3基がCH3、CH2CN、CH2COOH、CH2CONH2、CH2CH2OH及びCH2OCH3の1種から選択される請求項33に記載の方法。
- Z基が一般式(CH2)n(式中、n=1〜6)の非分枝アルキル鎖である請求項33に記載の方法。
- BASとBAS*が異なる生物活性種である請求項33に記載の方法。
- 一般式IV:
(式中、Z基は、1〜6個の炭素を有する飽和又は不飽和鎖、中間にアミド及びジスルフィド基の少なくとも1個をもつ6〜18個の炭素を有する非分枝飽和又は不飽和鎖、並びに3〜12個の炭素を有するポリエチレングリコール鎖から選択されるスペーサーであり、R3基はH、アルキル、又は電気陰性基をもつメチレン若しくはエチレンの1種から選択され、BASはタンパク質、ペプチド、多糖類、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、薬剤、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、蛍光団、リガンド、及び、固相支持体から成る群から選択される生物活性種であり、請求項1記載のR 1 基の一部を含み得る)の結合体の製造方法であって、一般式:
の試薬を一般式NH2OR3(式中、R3基はH、アルキル、又は電気陰性基をもつメチレン若しくはエチレンの1種から選択される)のヒドロキシルアミン誘導体と縮合する段階を含む前記方法。 - R3基がCH3、CH2CH3、CH2CN、CH2COOH、CH2CONH2、CH2CH2OH及びCH2OCH3の1種から選択される請求項37に記載の方法。
- Z基が一般式(CH2)n(式中、n=1〜6)の非分枝アルキル鎖である請求項37に記載の方法。
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