JP2020516656A - アルデヒドを含有する標的分子を標識する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
R4、R5、R6、R7およびR8は、独立して、H、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または−LMであり、R4、R5、R6、R7およびR8のうちの2つが連結して、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルを形成してもよく、
Lは、存在しないかまたはリンカーであり、Mは対象部分であり、Tは標的分子であり、ただし、R4、R5、R6、R7またはR8のうちの少なくとも1つが−LMである。]
の化合物(=コンジュゲート)を得ることを含む、方法に関する。
の化合物である。
R4、R5、R6およびR7は、独立して、H、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または−LMであり、
R8は、H、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
R4、R5、R6、R7およびR8のうちの2つが連結して、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルを形成してもよく、
Mは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、標識、細胞毒性剤、結合対のパートナーおよびマレイミドからなる群から選択される対象部分であり、
リンカーLは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンまたはトリアゾールを含んでもよく、
ただし、R4、R5、R6またはR7のうちの少なくとも1つは−LMである。]
の物質である。
R4、R5、R6、R7およびR8は、独立して、H、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または−LMであり、R4、R5、R6、R7およびR8のうちの2つが連結して、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルを形成してもよく、
Lは、存在しないかまたはリンカーであり、Mは対象部分であり、Tは標的分子であり、ただし、R4、R5、R6、R7またはR8のうちの少なくとも1つが−LMである。]
の化合物を得ることを含む、方法に関する。
「アルキル」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、特に明記しない限り、指定の炭素原子数を有する直鎖または分岐鎖、または環状炭化水素基、またはそれらの組み合わせを意味する(すなわち、C1〜C20は炭素数1〜20であることを意味する)。飽和炭化水素基の例には、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、シクロヘキシル、(シクロヘキシル)メチル、シクロプロピルメチル、同族体および、例えば、n−ペンチル、n−ヘキシルなどの異性体などの基が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、アルキルは、1〜20個の炭素原子の長さ、1〜10個の炭素原子の長さ、または1〜6個の炭素原子の長さの直鎖または分岐アルキル鎖である。一実施形態では、アルキルはメチルまたはエチルである。
「ヘテロアルケニル」という用語は、少なくとも1つの二重結合の存在を除いて、そうでなければ上記のヘテロアルキルの下で定義される化学基を表す。
一実施形態では、R1、R2およびR3はすべてHである。
当業者が理解するように、「リンカー」は、任意の所望の距離で2つの部分間の連結を提供する任意の適切な構造である。したがって、2つの部分は、互いに直接結合するのではなく、そのような連結構造またはリンカーを介して結合する。
一実施形態では、式Iまたは式IIの化合物それぞれに含まれるリンカーLは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキルまたはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンもしくはトリアゾールを含んでもよく、またはそれからなってもよい。一実施形態では、式Iまたは式IIの化合物それぞれに含まれるLは、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、アミド結合およびオリゴペプチドから選択される。
一実施形態では、Lに含まれ得るペプチドはオリゴペプチドであり、2〜20個のアミノ酸からなる。
一実施形態では、リンカーLまたは対象部分Mのいずれか一方のみがそれぞれオリゴペプチドまたはペプチドである。
一実施形態では、対象部分Mはヌクレオチドを含む。
(a)蛍光染料
蛍光染料は、例えば、Briggsらによる「Synthesis of Functionalized Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids」、J. Chem. Soc.、Perkin−Trans. 1 (1997年)、1051〜1058頁)で説明されている。
(b発光染料)
発光染料または標識は、化学発光染料と電気化学発光染料とにさらに分類できる。
(c)3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211Atまたは131Biなどの放射性同位体(放射性核種)を使用する放射性標識
(d)画像化および治療目的の標識として適切な金属キレート錯体は、当技術分野で周知である(米国特許出願公開第2010/0111856号、米国特許第5,342,606号、米国特許第5,428,155号、米国特許第5,316,757号、米国特許第5,480,990号、米国特許第5,462,725号、米国特許第5,428,139号、米国特許第5,385,893号、米国特許第5,739,294号、米国特許第5,750,660号、米国特許第5,834,456、Hnatowichら、J. Immunol. Methods 65(1983年)、147〜157頁、Mearesら、Anal. Biochem. 142(1984年)、68〜78頁、Mirzadehら、Bioconjugate Chem. 1(1990年)、59〜65頁、Mearesら、J. Cancer (1990年)、Suppl. 10:21〜26頁、Izardら、Bioconjugate Chem. 3(1992年)、346〜350頁、Nikulaら、Nucl. Med. Biol. 22(1995年)、387〜90頁、Cameraら、Nucl. Med. Biol. 20(1993年)、955〜62頁、Kukisら、J. Nucl. Med. 39(1998年)、2105〜2110頁、Verelら、J. Nucl. Med. 44(2003年)、1663〜1670頁、Cameraら、J. Nucl. Med. 21(1994年)、640〜646頁、Rueggら、Cancer Res. 50(1990年)、4221〜4226頁、Verelら、J. Nucl. Med. 44 (2003年)、1663〜1670頁、Leeら、Cancer Res. 61(2001年)、4474〜4482頁、Mitchelら、J. Nucl. Med. 44(2003年)、1105〜1112頁、Kobayashiら、Bioconjugate Chem. 10 (1999年)、103〜111頁、Miedererら、J. Nucl. Med. 45 (2004年)、129〜137頁、DeNardoら、Clinical Cancer Research 4(1998年)、2483〜90頁、Blendら、Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18(2003年)、355〜363頁、Nikulaら、J. Nucl. Med. 40(1999年)、166〜76頁、Kobayashiら、J. Nucl. Med. 39(1998年)、829〜36頁、Mardirossianら、Nucl. Med. Biol. 20(1993年)、65〜74頁、Roselliら、Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14(1999年)、209〜20頁)。
本明細書で使用される結合対は、高い親和性で、すなわち1ナノモル以上の親和性で互いに結合する2つのパートナーからなる。当業者が容易に理解するように、式Iまたは式IIの化合物それぞれに含まれるMは、2つの可能なパートナー要素のうちの1つは、例えばハプテン/抗ハプテン結合対のハプテンを表す。結合対の実施形態は、例えば、受容体およびリガンド、ハプテンおよび抗ハプテン抗体からなる結合対、および天然に存在する高親和性結合対ベースの結合対である。特定の実施形態では、結合対のパートナーはリガンドまたはハプテンであるか、または天然に存在する高親和性結合対のパートナーである。
一実施形態では、結合対のパートナーはハプテンであるか、または天然に存在する高親和性結合対のパートナーである。
一実施形態では、式Iまたは式IIの化合物それぞれに含まれる対象部分Mは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、蛍光または発光標識、細胞毒性剤、ビオチンまたはビオチン類似体、ジゴキシンまたはジゴキシン類似体、およびマレイミドからなる群から選択される。
一実施形態では、式Iまたは式IIの化合物それぞれに含まれる対象部分Mは、ハプテン、ビオチン、またはアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンなどのビオチン類似体、FimG、リガンドおよびオリゴヌクレオチドから選択される。
一実施形態では、式Iまたは式IIの化合物それぞれに含まれる対象部分Mはビオチンである。
当業者が理解するように、ヌクレオチドは、プリンまたはピリミジン塩基およびリン酸基に結合したリボースまたはデオキシリボース糖からなる化合物であり、これは、例えば、核酸の基本構造単位(RNAおよびDNAなど)である。ヌクレオチドは、糖、塩基、またはリン酸部分で修飾されてもよく、例えば、ピリミジン塩基のC5位で修飾されてもよい。好ましい例は、2’−デオキシアデノシン、2’−デオキシグアノシン、2’−デオキシシチジンおよび2’−デオキシチミジンの5’−リン酸またはポリリン酸である。他のヌクレオチド類似体または誘導体は、オリゴヌクレオチド(核酸)に関する詳細な説明で以下にさらに説明されている。
一実施形態では、式Iまたは式IIの化合物それぞれに含まれ、本明細書に開示される方法で使用される対象部分Mは、20000ダルトン未満の分子量を有し、官能基、結合対のパートナー、細胞毒性剤、または標識である。
一実施形態では、標的分子Tは、固相、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチドおよび核酸からなる群から選択される。
「炭水化物」とは、炭素(C)、水素(H)、および酸素(O)原子で構成され、通常は水素と酸素の原子比が2:1(水など)、つまり、経験式Cm(H2O)n(ここで、mは通常nと同じである)による生体分子である。いくつかの例外(mがnとは異なる)が存在し、例えば、DNAの糖成分であるデオキシリボースは経験式C5H10O4を有する。炭水化物は、技術的には炭素の水和物であり、構造的には、それらをポリヒドロキシアルデヒドおよびケトンと見なす方がより正確である。
一実施形態では、標的分子Tは、タンパク質および核酸からなる群から選択される。
「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、当業者に知られており、本明細書で以下にさらに定義されている。
「ポリペプチド」という用語は、少なくとも21個のアミノ酸を含むペプチドに使用される。天然のポリペプチドは、天然のアミノ酸で構成されている。さらに、例えばβ−アラニン、フェニルグリシン、または/およびホモアルギニンなどの非天然アミノ酸を含むポリペプチドを合成することができる。ポリペプチドは、リン酸化やグリコシル化などのいわゆる二次修飾を受ける場合がある。そのような修飾されたポリペプチドもまた、本発明によるポリペプチドである。一実施形態では、本開示による方法で使用されるポリペプチドは、21〜1000個のアミノ酸残基を有する。
例えば、結合対のポリペプチドパートナーは、受容体リガンド結合対の受容体、ビオチンアビジンまたはストレプトアビジン結合対のアビジンまたはストレプトアビジン、またはFimG/DsF結合対のFimGである。
一実施形態では、本開示による方法で使用される標的分子Tは、アビジン、ストレプトアビジンおよび抗体から選択されるポリペプチドまたはタンパク質である。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」または「核酸」という用語は、一般に、少なくとも2ヌクレオチドおよび最大約1000ヌクレオチドを含む短い、一般的に一本鎖のポリヌクレオチドを指す。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも9、10、11、12、15、18、21、24、27または30ヌクレオチドの長さを有することになる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35または30ヌクレオチド以下の長さを有することになる。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然のヌクレオシド2’−デオキシアデノシン(dA)、2’−デオキシグアノシン(dG)、2’−デオキシシチジン(dC)、2’−デオキシチミジン(dT)、アデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジン、および2’−デオキシウリジン(dU)を含む。別の実施形態では、核酸は二本鎖であってもよい。
オリゴヌクレオチドは、例えば、2’−メトキシ、2’−フルオロ、2’−メチルセレノ、2’−アリルオキシ、4’−メチルdNのような置換デオキシリボースを含むヌクレオチドを含有してもよい(ここで、Nは核酸塩基、例えば、A、G、C、TまたはUである)。
一実施形態では、本開示は、式II
の化合物(またはコンジュゲート)に関する。
R8はH、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
R4、R5、R6、R7、およびR8のうちの2つが連結して、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルを形成してもよく、
Mは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、標識、細胞毒性剤、結合対のパートナー、およびマレイミドからなる群から選択される対象部分であり、
リンカーLは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンまたはトリアゾールを含んでもよく、
ただし、R4、R5、R6またはR7のうちの少なくとも1つは−LMである。]
の物質である。
一実施形態では、式IIIの物質中のR1、R2およびR3は、独立して、Hまたはメチルである。
上記のように、式IIIの物質に含まれるリンカーLは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンまたはトリアゾールを含んでもよい。これらの制限を除いて、式IIIの物質に含まれるリンカーLは、それぞれ式Iおよび式IIの化合物に含まれるリンカーLについて上述した定義を満たす。
一実施形態では、式IIIの物質に含まれるLは、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択される。
式IIIの物質に含まれる「対象部分」(M)は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、標識、細胞毒性剤、結合対のパートナーおよび官能基からなる群から選択される。これらの制限を除いて、式IIIの物質に含まれる対象部分Mは、式Iおよび式IIの化合物それぞれに含まれる対象部分Mについて上述した定義を満たす。
一実施形態では、式IIIの物質に含まれる対象部分は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。
(1):Boc−N−ピロロ−アラニン(2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−(1H−ピロール−1−イル)プロパン酸)の合成
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 12.93 - 12.78 (m, 1H), 7.18 - 7.07 (m, 1H), 6.74 - 6.66 (m, 2H), 6.06 - 5.84 (m, 2H), 4.31 - 3.91 (m, 3H), 1.32 (s, 9H)
実施例2
(2):Fmoc−N−ピロロ−アラニン−OHの合成
MS(ESI):実測値 377.1[M+H]+、計算値 377.1[M+H]+
実施例3
(3):Boc−N−ピロロ−アラニン−ペンタフルオロフェニルエステルの合成
(4):Fmoc−N−ピロロ−アラニン−ペンタフルオロフェニルエステルの合成
MS(ESI):実測値 543.1[M+H]+、計算値 543.13[M+H]+
実施例5
(5):N−ピロロ−アラニン−PEG2−ビオチンの合成
MS(ESI):実測値 583.4[M+H]+、292.3[M/2+H]+、計算値 583.8[M+H]+
実施例6
(6):N−ピロロ−アラニン−(PEG10)2−PEG2−ビオチンの合成
MS(ESI):実測値 536.1[M/3+H]+、803.7[M/2+H]+、計算値 1606.9[M+H]+
実施例7
(7):α−ピロロ−アラニン−PEG2−ビオチンの合成
MS(ESI):実測値 511.2[M+H]+、計算値 511.6[M+H]+
実施例8
(8):Boc−N−ピロロ−アラニン−PEG7−NH2の合成
MS(ESI):605.5[M+H]+
実施例9
(9):N−ピロロ−アラニン−PEG7−NH−CO(CH2)5−マレイミドの合成
MS(ESI):実測値 798.5[M+H]+、計算値 798.9[M+H]+
2)得られた物質をCH2Cl2(1mL)およびTFA(500μL)に溶解し、室温で30分間撹拌した。減圧下で溶媒を除去することにより、無色の樹脂として所望の生成物(8mg、定量)を得た。
MS(ESI):実測値 698.5[M+H]+、計算値 698.8[M+H]+
実施例10
(10):SulfoBiPyRu−PEG2−N−ピロロ−アラニンの合成
MS(ESI):実測値 656.8[M/2+H]+、1310.8[M+H]+、計算値 1311.2[M+H]+
実施例11
(11):ホルミルグリシン含有ペプチドの合成
MS(ESI):実測値 774.3[M/2+H]+、517.0[M/3+H]+
実施例12
(12):5’−ピロロ−アラニン−アミノヘキサノ−ル−T10−3’の合成
MS(ESI):実測値 1097.3[(M−3H)/3]−
実施例13
(13):4−ホルミルベンゾエートNHS−エステルの合成
1H NMR (クロロホルム-d, 400 MHz): δ = 10.13 (s, 1H), 8.21-8.37 (m, 3H), 7.96-8.07 (m, 3H), 2.93 ppm (d, J = 8.7 Hz, 6H)
実施例14
(14):4−ホルミルベンズアミド−ウンデカノール−ヘキサホスフェート−シチジンの合成
MS(ESI):実測値 522.2[(M−2H)/2+38]−、1045.3 2 [M−H+38]−
実施例15〜21は、ピロロ誘導体(式Iの化合物)とアルデヒド基を含有するモデル化合物、ならびにホルミルグリシン含有ペプチドおよび抗体とのコンジュゲーション実験を示す。
2−(1H−ピロール−1−イル)エタン−1−アミンのモデルのピクテ−スペングラー反応
Rf(EtOAc+2%TEA):0.38
1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ = 7.39 - 7.33 (m, 4H), 7.33 - 7.27 (m, 1H), 6.56 (dt, J=0.9, 1.8 Hz, 1H), 6.13 (dd, J=2.8, 3.5 Hz, 1H), 5.87 - 5.83 (m, 1H), 4.63 - 4.56 (m, 3H), 4.26 (dd, J=3.5, 8.7 Hz, 1H), 4.01 - 3.89 (m, 2H), 3.88 - 3.82 (m, 1H), 3.60 (dd, J=8.8, 9.4 Hz, 1H), 3.35 - 3.27 (m, 1H), 3.17 - 3.08 (m, 1H), 2.36 - 2.26 (m, 1H)
説明:2−(1H−ピロール−1−イル)エタン−1−アミンは、「タンパク質適合性」条件でアルデヒドと反応する。1H NMRは、これらの条件下でピクテ−スペングラー反応(イミン形成とその後のC−C閉環)が起こることを証明し、安定した二環式生成物(15)を提供する。
ホルミルグリシン含有ペプチドと反応させたときの、α−、β−およびN−(2−アミノエチル)ピロールそれぞれの変換率の比較:
α−、β−およびN−(2−アミノエチル)ピロールを同一条件下でホルミルグリシン含有ペプチド(11)(配列番号1)と反応させた。反応条件は、ペプチド(11)(配列番号1)(10mM水溶液)10μLおよびアミン(α−、β−およびN−(2−アミノエチル)ピロールのそれぞれ、各アミン50mM水溶液として)20μLを、酢酸塩緩衝液170μL(0.05M、pH=5.4)、37℃、に加えた。この反応を図1Aに模式的に示す。
ホルミルグリシン含有ペプチド(11)とN−ピロロ−アラニン−PEG2−ビオチン(5)とのコンジュゲーション
4−ホルミルベンズアミド−ウンデカノ−ル−ヘキサホスフェート−シチジン(14)と5’−ピロロ−アラニン−アミノヘキサノール−T10−3’(12)とのコンジュゲーション
(17):MS(ESI):実測値 1439.7[(M−3H)/3]− +38
この例では、オリゴヌクレオチド/ヌクレオチドビルディングブロックのコンジュゲーションのためのピロロピクテ−スペングラー反応の実行可能性が実証されている。0.4mMのLCMSの濃度での化学量論的1:1反応では、16時間以内に基質のコンジュゲーション生成物へのほぼ定量的な変換が示される。
ビオチン−PEG3−N−PyrAla標識と抗体を含むホルミルグリシンとのバイオコンジュゲーション
抗体の発現と精製
TSHに対するマウスモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖を、標準的なクローニング技術を使用して、重鎖C末端に13アミノ酸アルデヒドタグ(LCTPSRAALLTGR;配列番号2)を含む哺乳動物発現ベクターにクローニングした。重鎖および軽鎖をコードするプラスミドと、SUMF1を過剰発現するプラスミド(pRECEIVER−SUMF1、GeneCopoeiaから購入)の両方をHEK293F細胞に同時トランスフェクトした。SUMF1は、アルデヒドタグ配列に含まれるシステインをホルミルグリシンに変換し、したがってLCTPSRAALLTGR(配列番号2)をL*ホルミルグリシン*TPSRAALLTGR(配列番号3)に変換する。IgGを、供給元の指示に従って、一段階プロテインAアフィニティー精製(HiTrap MabSelect SuRe、GE)を介して培養上清から精製した。
L*ホルミルグリシン*TPSRAALLTGR(200μM)で各重鎖のC末端にタグ付けされたTSHに対するマウスモノクローナル抗体を37℃で、5倍で24時間、または3倍過剰のピロロ−アラニン−PEG2−ビオチン(5)で48時間コンジュゲートした。すべてのコンジュゲートを、Zebaスピンカラム(40K)(Thermo Scientificから購入)を介して精製して、酵素と非コンジュゲート標識を除去した。
IgGビオチン化を、フルオレセイン標識ストレプトアビジン(SA−FLUO)との錯体形成によって評価した。SA−FLUO−IgG−ビオチン−SA−FLUO錯体を、分析的サイズ排除クロマトグラフィー(TSK GFC300、TOSOH)によって分析した。詳細には、等量(50μl)のビオチン化IgG(c=0.6mg/ml)およびSA−FLUO(c=0.3mg/ml)を混合し、室温で5分間培養した。20μlの100mMビオチンを加えた。25μlの各試料をTSK GFC300 SW 7.8×150mmカラムに注入し、280および494nmで吸光プロファイルを監視した。280および494nmで吸光プロファイルを有するSA−FLUO−IgG−ビオチン錯体の存在により、ビオチン化の成功を監視する。
上記のように得られた、TSHに対するマウスモノクローナル抗体からの部位特異的に標識されたIgG−ビオチンコンジュゲートを、ビオチン化抗TSH抗体を含まない元来のTSH緩衝液中に2.5μg/mlの濃度で使用し、これにより、Elecsys(登録商標)免疫分析ラックパック(Roche Diagnostics)のR1コンパートメント内のビオチン化試薬を交換する。TSH CalSet(Roche Diagnostics)の2つのキャリブレーターであるCal1およびCal2を、Cobas(登録商標)E170モジュール上のTSH Elecsys(登録商標)免疫分析(Roche Diagnostics)で、製造元(Roche Diagnostics)が提供する標準分析プロトコルに従って分析した。
(A)他のアルデヒドタグ付けに適した条件下では、100倍過剰のN−ピロロ−アラニン−PEG2−ビオチン標識(5)は、配列番号4、すなわち、ホルミルグリシンを含まないポリペプチド配列(システインの代わりにアラニン;システインのみがホルミルグリシンに変換できる)を含む変異体抗体と非特異的に反応しない。
コンジュゲートの安定性試験
TSHに対するマウスモノクローナル抗体からの部位特異的に標識されたIgG−ビオチンコンジュゲート(実施例19に記載のように得られた)を、Cobas(登録商標)E170モジュール上のTSH Elecsys(登録商標)免疫分析(Roche Diagnostics)で分析した。新規のコンジュゲートおよび元来の(ori)または標準のビオチンコンジュゲートを、それぞれ2.5μg/mlの濃度で同じ緩衝液で希釈した。両方をElecsys(登録商標)免疫分析ラックパック(Roche Diagnostics)のR1コンパートメントに入れ、この市販のアッセイ(Roche Diagnostics)に指定された標準手順に従って分析を実施した。キャリブレーターの1つである安定性評価のために、元来のおよび新規のコンジュゲートの両方を使用して、TSH CalSet(Roche Diagnostics)のCal2を、Cobas(登録商標)E170モジュール上のTSH Elecsys(登録商標)免疫分析(Roche Diagnostics)で、t=0および7日後の35℃のそれぞれで測定した。
N−ピロロ−アラニンまたはα−ピロロ−アラニンのいずれかを使用して生成されたコンジュゲートの抗体コンジュゲーション効果と性能の比較
N−ピロロ−アラニン−PEG2−ビオチン(5)およびα−ピロロ−アラニン−PEG2−ビオチン(7)それぞれと、配列番号3(L*FormylGly*TPSRAALLTGR)のC末端アルデヒドタグを含む抗体とのコンジュゲーション効率の直接比較は、N−ピロロ−アラニン−PEG2−ビオチン標識が、ほぼ定量的に抗体を標識コンジュゲートに変換する(図5Aを参照)一方、α−ピロロ−アラニン−PEG2−ビオチンとの培養後、大量の非結合抗体が検出される(図5Bを参照)。TSH−Elecsys分析の性能と3週間後のコンジュゲートの安定性を、本質的に実施例20に記載されているように調査した。α−ピロロ−アラニン−PEG2−ビオチン抗体コンジュゲートは、N−ピロロ−アラニン−PEG2−ビオチン抗体コンジュゲートよりも安定性が低いため、使用した活性化α−ピロロ−アラニン−PEG2−ビオチン(7)の低い反応性および/またはこのカップリング試薬との不完全な環化反応を示す。それとは反対に、N−ピロロ−アラニン−PEG2−ビオチン抗体コンジュゲート、すなわち本明細書に開示される化合物および方法に基づくコンジュゲートは、高収率で生成することができ、免疫分析における良好な性能と良好な保存安定性の両方を実証する。
Claims (15)
- 式IIの化合物を生成する方法であって、
式Iの化合物を、以下に示すように、アルデヒド基を含む標的と反応させ、
Lは、存在しないかまたはリンカーであり、
Mは対象部分であり、
Tは、標的分子であり、
ただし、R4、R5、R6、R7またはR8のうちの少なくとも1つが−LMである。]
の化合物を得ることを含む、方法。 - 式Iまたは式IIの化合物それぞれにおいて、R1、R2およびR3が、独立して、Hまたはメチルである、請求項1に記載の方法。
- 式Iまたは式IIの化合物それぞれにおいて、対象部分Mが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、標識、細胞毒性剤、結合対のパートナーおよび官能基からなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 式Iまたは式IIの化合物それぞれにおいて、対象部分Mが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、蛍光または発光標識、細胞毒性剤、ビオチンまたはビオチン類似体、ジゴキシンまたはジゴキシン類似体、およびマレイミドからなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 式Iまたは式IIの化合物それぞれにおいて、標的分子Tが、固相、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチドおよび核酸からなる群から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 式Iまたは式IIの化合物それぞれにおいて、標的分子Tが、ポリペプチド、タンパク質または核酸である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 式Iまたは式IIの化合物それぞれにおいて、標的分子Tが抗体である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 式Iまたは式IIの化合物それぞれにおいて、リンカーLが、存在しないか、あるいは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンもしくはトリアゾールを含んでもよく、またはそれからなってもよい、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 式Iまたは式IIの化合物それぞれにおいて、リンカーLが、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキルまたはオリゴペプチドから選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 式Iまたは式IIの化合物それぞれにおいて、リンカーLが、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、ジスルフィド、カーボネート、カルバメート、アルケン、トリアゾール、ジヒドロピリダジンまたはホスホジエステル結合を介して、対象部分Mに結合している、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 式II
の化合物。 - 式III
R4、R5、R6およびR7は、独立して、H、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または−LMであり、
R8は、H、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
R4、R5、R6、R7およびR8のうちの2つが連結して、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルを形成してもよく、
Mは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、標識、細胞毒性剤、結合対のパートナーおよびマレイミドからなる群から選択される対象部分であり、
リンカーLは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンまたはトリアゾールを含んでもよく、
ただし、R4、R5、R6またはR7のうちの少なくとも1つは−LMである。]
の物質。 - Mが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、蛍光または発光標識、細胞毒性剤、ビオチンまたはビオチン類似体、ジゴキシンまたはジゴキシン類似体およびマレイミドからなる群から選択される、請求項12に記載の物質。
- Mが、発光標識、細胞毒性剤およびビオチンまたはビオチン類似体からなる群から選択される、請求項12または13に記載の物質。
- Mがオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドである、請求項12または13に記載の物質。
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EP17166237 | 2017-04-12 | ||
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