JP7068186B2 - 新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ - Google Patents
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Description
(A)配列番号1に記載のアミノ酸配列と75%以上の同一性及び95%以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号7のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列である;
(B)複合糖鎖に対する加水分解活性及び/又は糖転移活性が、45~60℃のいずれかの温度で最大活性値の40%以上を示す。
(A)配列番号1に記載のアミノ酸配列と75%以上の同一性及び95%以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号1のアミノ酸番号191~195のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列が、Leu-Ala-Lys-Leu-Leu(LAKLL)である;
(B)複合糖鎖に対する加水分解活性が、45~60℃のいずれかの温度で最大活性値の40%以上を示す。
N172がGln、Asp、Gly、Ala、Phe、Cys、His、Ile、Ser、Thr、Val又はMetに置換された変異、D176がArgに置換された変異、Y214がPheに置換された変異、S216がValに置換された変異、、L245がSerに置換された変異、N246がAspに置換された変異、T275がIleに置換された変異、F283がSerに置換された変異、L306がIleに置換された変異、F307がTyrに置換された変異、A310がAspに置換された変異、及び、E314がGlnに置換された変異。
(A)配列番号1《Endo-Rpアミノ酸配列》に記載のアミノ酸配列と75%以上の同一性及び95%以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号7のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列である;
(B)複合型糖鎖に対する加水分解活性及び/又は糖転移活性が、45~60℃の範囲で最大活性値の40%以上を示す;
を有するポリペプチドであるエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを提供する。
本発明の酵素は、上記の特性を有するものであれば、実施例で取得された具体的な配列の酵素に限定されるものではなく、天然から分離された酵素であっても、本発明の酵素の配列情報に基づき人為的に作製又は改変された酵素であっても良い。天然から分離する場合、その分離源とする生物種は特に限定されないが、好ましくは真菌であり、より好ましくは好熱性真菌であり、更に好ましくはRhizomucor属の真菌であり、さらにより好ましくはRhizomucor pusillus又はRhizomucor mieheiに属する真菌である。
本発明の酵素は、複合型糖鎖を加水分解及び/又は糖転移する活性を有し、その活性は、45~60℃のいずれかの温度において最大活性値の40%以上を示すとの特性を有する。
MS装置:6130 Quadrupole LC-MS (Agilent Technologies社)
イオン化:ESI
モード:Positive
HPLC:1260 Infinity LC (Agilent Technologies社)
カラム:Inertsil ODS-3 3 μm φ3.0×50 mm(GLサイエンス社)
カラム温度:40℃
移動相A:H2O+0.1% HCOOH
移動相B:アセトニトリル+0.1% HCOOH
グラジエント(移動相B%):0%(0分)、10%(5分)、30%(7分)
流速:0.6 mL/min
加水分解率は、以下の式で算出される。
加水分解率(%)=反応後のSG(10)濃度(M)/blankのSGP濃度(M)x100
比活性は、以下の式で算出される。
比活性(μmol/min/μg)= 生成したSG(10)量(μmol)/反応時間(min)/酵素量(μg)
MS装置:6130 Quadrupole LC-MS (Agilent Technologies社)
イオン化:ESI
モード:Positive
HPLC:1260 Infinity LC (Agilent Technologies社)
カラム:Inertsil ODS-3 2 μm φ2.1×50 mm(GLサイエンス社)
カラム温度:40℃
移動相A:H2O+0.1% HCOOH
移動相B:アセトニトリル+0.1% HCOOH
グラジエント(移動相B%):0.8%(0分)、8%(0.1分)、8%(5分)
流速:0.7 mL/min
転移率は、以下の式で算出される。
転移率(%)=反応後のSG-A濃度(M)/blankのSGP濃度(M)x100
比活性は、以下の式で算出される。
比活性(μmol/min/mg)= 生成したSG-A量(μmol)/反応時間(min)/酵素量(mg)
本発明は、さらに上記の本発明の酵素をコードする核酸配列を有する遺伝子を提供する。
本発明は、さらに上記の本発明の酵素をコードする組み換え遺伝子を含むプラスミドや発現ベクター等の遺伝子構築物、当該遺伝子構築物により形質転換された宿主細胞、当該宿主細胞の培養物から本発明の酵素を回収する工程を含む、本発明の酵素の製造方法などを提供する。本発明の酵素をコードする遺伝子の導入により形質転換された宿主細胞(動物細胞、植物細胞、大腸菌、酵母など、タンパク質産生に通常用いられる細胞等を適宜選択できる)は、細胞の種類に応じて適切なプラスミド/発現ベクターに導入され、当該プラスミド/発現ベクターにより対象細胞を形質転換し、当該形質転換細胞を適切な条件下で培養し、その培養物から本発明の酵素を回収することができる。
R. pusillus NBRC 9740、NBRC 9741、NBRC 9742、およびNBRC 9743株をGSYFeスラント(5% Glucose, 2% Soytone, 1% Yeast extract, 0.05% FeSO4・7H2O, 1.5% agar)に植菌し、40℃で5日間培養した。菌体を採取し、ガラス製ホモジナイザーを用いて2 mLの100 mM カリウムリン酸バッファー(pH 6.25)中で破砕後、フィルター滅菌したものを粗酵素液とした。
以下の方法により、R. pusillus NBRC 9742株からエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子のクローニング及びゲノム公開配列からの関連配列の抽出を行った。
まず、R. pusillus NBRC 9742株をGSYFeスラントに植菌し、40℃で5日間培養した。菌体を採取し、メタルコーンと一緒にスクリューキャップ付き2 mLマイクロチューブに入れ、-80℃で凍結した。凍結したサンプルをマルチビーズショッカー(安井器機械社)で4℃に冷却しながら、2,000rpm、オンタイム30秒、オフタイム30秒で5サイクル繰り返し菌体を破砕した。このサンプルから、NucleoSpin RNA Plant(マッハライ・ナーゲル社)およびOligotex-dT30<Super> mRNA Purification Kit(タカラバイオ社)を用いてmRNA溶液を得た。
Endo-Rp、Endo-Rp2、Endo-Rp3、およびEndo-Rp4の配列とGenozymes Projectのデータベースで公開されている推定配列を比較したところ、配列番号1の193番目のLysに相当するアミノ酸が、配列番号7ではAsn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Argに置換され、タンパクの長さが異なっていた(図4)。R. pusillus NBRC 9742株からゲノムDNAを抽出し、Endo-Rp遺伝子のORF全長配列をPCR増幅して解析したところ、ゲノム公開株の推定配列ではイントロンの予測位置が異なっていることが示唆され、このために上記のアミノ酸配列の相違が発生していると考えられた。
実施例2で得た真菌由来のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子に対してThermo Fisher Scientific社のGeneArt Strings DNA Fragmentsを利用し、大腸菌での異種発現用に最適化した核酸配列(配列番号15)を設計し、当該配列を用いてEndo-RpのC末端に6×Hisタグを付加したポリペプチドをコードする遺伝子を作製した。これをpET24b(+)ベクターにクローニングし、E. coli BL21(DE3)に形質転換した。形質転換後の菌液を100 mLフラスコ中の25 mL TB培地(50 μg/mL Kanamycin)に接種し、37℃で一晩振とう培養を行った(160 rpm, O/N)。この前培養液20 mLを2.5 Lバッフル付きフラスコ中の1 L TB培地(50 μg/mL Kanamycin、0.01% antifoam 204、2 mM MgSO4)に植菌し、37℃で振とう培養した(200 rpm、2時間)。インキュベーターの温度を16℃に下げて3時間培養した後、終濃度0.2 mMとなるようにIPTGを添加し、引き続き24時間培養した。
実施例3で取得した酵素について、上述の方法により加水分解活性を測定した。この際、Endo-M(東京化成工業(株)製)、EndoSおよびEndo-Omを比較対象に用いた。
Endo-Rpの至適反応温度およびpHを検討した。
反応pHの検討は、終濃度200 mMの酢酸ナトリウムバッファーもしくはカリウムリン酸バッファー、69 mM SGP、および0.02 μMの酵素を含む、pH4.5、5.0、5.5、5.8,6.0、6.2、6.5、7.0、及び、7.5の反応液(容量 100 μL)を調製し、50℃で23時間インキュベートし、加水分解率を算出した。結果を図7に示す。
Endo-Rpが糖転移活性を有するか、以下のように検討した。
MS装置:6130 Quadrupole LC-MS (Agilent Technologies社)
イオン化:ESI
モード:Positive
HPLC:1260 Infinity LC (Agilent Technologies社)
カラム:Inertsil ODS-3 2 μm φ2.1×50 mm(GLサイエンス社)
カラム温度:40℃
移動相A:H2O+0.1% HCOOH
移動相B:アセトニトリル+0.1% HCOOH
グラジエント(移動相B%):0.8%(0分)、2%(5分)、2%(6分)
流速:0.7 mL/min
Endo-Rpの糖鎖転移活性を維持したまま糖鎖加水分解活性を抑制した酵素を取得すべく、活性中心である172番目のアスパラギン(N)をグルタミン(Q)に置換したN172Q改変体を作製した。N172Q改変体は、配列番号9に示すEndo-Rpをコードする塩基配列において、514番目から516番目のAACをCAAに置換し、実施例3に記載した方法で調製した。
Endo-Rp N172Q改変体よりも糖鎖転移活性の高い酵素を取得すべく、改変検討を実施した。Endo-A(PDB ID:3FHQ)およびEndo-D(PBD ID:2W92)の構造に基づいて、表1に示す各種変異体をデザインし、そのSGPに対する加水分解活性及び糖転移活性を測定した。
Claims (15)
- 以下の(A)及び(B)の特性を有するポリペプチド;
(A)配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列又は配列番号6に記載のアミノ酸配列を含み、配列番号1のアミノ酸番号191~195のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列がLeu-Ala-Lys-Leu-Leu(LAKLL)であり、且つ、D276、V223、W225、Y247及びW248のアミノ酸が維持されている;
(B)複合糖鎖に対する加水分解活性及び/又は糖転移活性を有する。 - (A)及び(B)の特性に加えて、更に(C)大腸菌を用いた遺伝子組み換え発現において、10 mg/L培養以上を示すことを特徴とする、請求項1のポリペプチド。
- 配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号1のアミノ酸配列において、A128T、D333G、I434L、V460A、I527V、K569T、F610S及びH626Rからなる群から選択される少なくとも一つの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする、請求項1のポリペプチド。
- 配列番号1~6のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項1のポリペプチド。
- 特性(A)を充足するアミノ酸配列を有し、配列番号23に示される変異の少なくともひとつを有することを特徴とする、請求項1又は2のいずれかのポリペプチド。
- N172、D176,Y214、S216,L245、N246、T275、L306、F307及びA310から選択される少なくともひとつのアミノ酸に変異を有する、請求項5のポリペプチド。
- 以下の群から選択される少なくともひとつの変異を有することを特徴とする請求項5のポリペプチド;
N172がGln、Asp、Gly、Ala、Phe、Cys、His、Ile、Ser、Thr、Val、Met、Glu、Lys、Leu、Pro、Arg、Trp、又はTyrに置換された変異、D176がArgに置換された変異、Y214がPheに置換された変異、S216がValに置換された変異、、L245がSerに置換された変異、N246がAspに置換された変異、T275がIleに置換された変異、F283がSerに置換された変異、L306がIleに置換された変異、F307がTyrに置換された変異、A310がAspに置換された変異、及び、E314がGlnに置換された変異。 - W278がPhe又はTyrに置換された変異を有することを特徴とする請求項5~7のいずれかのポリペプチド。
- 請求項1~8のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号8~17のヌクレオチド番号1~2088のヌクレオチド配列、及び配列番号18~19のヌクレオチド番号1~2091のヌクレオチド配列のいずれかのヌクレオチド配列を有する、請求項9のポリヌクレオチド。
- 請求項9又は10のポリヌクレオチドを含む発現用プラスミド。
- 請求項11のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
- 配列番号9、11、13、15若しくは17のヌクレオチド番号1~2088のヌクレオチド配列、又は、配列番号19のヌクレオチド番号1~2091のヌクレオチド配列、を含むポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された大腸菌である、請求項12の宿主細胞。
- 請求項12又は13の宿主細胞を培養し、得られた培養物から請求項1~8のいずれかのポリペプチドを回収する工程を含む、請求項1~8のいずれかのポリペプチドの製造方法。
- 請求項1~8のいずれかのポリペプチドを含有する試薬。
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