ES2911522T3

ES2911522T3 - Novedosa endo-ß-n-acetilglucosaminidasa

Info

Publication number: ES2911522T3
Application number: ES17876284T
Authority: ES
Inventors: Hanako Ito; Yasunori Ono; Kensuke Nakamura
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2016-12-02
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2022-05-19
Anticipated expiration: 2037-12-01
Also published as: WO2018101454A1; TW201827454A; CA3045596C; CA3045596A1; CN110036109A; EP3550018B1; US11208442B2; EP3550018A1; JPWO2018101454A1; KR20190088483A; AU2017368597B2; EP3550018A4; AU2017368597A2; KR102399639B1; JP7068186B2; AU2017368597A1; TWI777992B; US20190309028A1; AU2017368597C1

Abstract

Un polipéptido que tiene las siguientes propiedades (A) y (B): (A) el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 75 % o más de identidad y un 95 % o más de similitud con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y es una secuencia de aminoácidos diferente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y (B) el polipéptido presenta, a cualquier temperatura entre 45 y 60 °C, un 40 % o más del valor máximo de actividad hidrolítica y/o de transglicosilación sobre cadenas de azúcares complejas.

Description

DESCRIPCIÓN

Novedosa endo-13-n-acetilglucosaminidasa

Campo técnico

La presente invención se refiere a una endo-p-N-acetilglucosaminidasa que es activa en condiciones de alta temperatura, un gen que codifica la enzima, un plásmido recombinante, un transformante transformado con el plásmido, y similares.

Técnica antecedente

Las glicoproteínas se encuentran ampliamente en los tejidos de los animales y de las plantas, en las membranas celulares y en las paredes de los microorganismos eucariotas, entre otros. Recientemente se ha revelado que las cadenas de azúcares de las glicoproteínas tienen importantes funciones en mecanismos como la diferenciación celular, la carcinogénesis y el reconocimiento intercelular. Para dilucidar estos mecanismos, se han realizado estudios sobre la correlación entre la estructura y la función de las cadenas de azúcar. En los estudios de descubrimiento de fármacos, se han llevado a cabo intentos como la remodelación de las cadenas de azúcar, en la que las cadenas de azúcar de las glicoproteínas, incluidos los anticuerpos, están sustituidos por una estructura uniforme de cadena de azúcar, y la glicosilación de péptidos o moléculas pequeñas. Estos estudios de descubrimiento de fármacos suelen utilizar cadenas de azúcar escindidas de glicoproteínas/glicopéptidos naturales con una cadena de azúcar uniforme, utilizando una enzima como la endo-p-N-acetilglucosaminidasa.

Las cadenas de azúcar representativas de las glicoproteínas animales incluyen cadenas de azúcar ligadas al N, unidas a cadenas laterales de asparagina. Las cadenas de azúcares ligadas al N se clasifican en tipos de alta manosa, híbridos y complejos, dependiendo de su estructura, pero tienen como estructura común una estructura de quitobiosa que tiene dos residuos de GlcNAc unidos al extremo reductor. La endo-p-N-acetilglucosaminidasa es una enzima que tiene tanto una actividad que hidroliza el enlace glicosídico en las estructuras de la quitobiosa, como una actividad de transglicosilación que transfiere la cadena de azúcar escindida a un aceptor que tiene una estructura específica. Las endo-p-N-acetilglucosaminidasas, que han sido aisladas de diversas especies biológicas, tienen respectivamente diferentes especificidades de sustrato. Se han utilizado diferentes endo-p-N-acetilglucosaminidasas para distintos fines. Entre ellas, se ha reportado que las endo-p-N-acetilglucosaminidasas que utilizan cadenas de azúcares de tipo complejo como sustratos, incluyen las que se describen a continuación.

Endo-M, que es una enzima derivada de Mucorhiemalis, tiene una especificidad de sustrato que es una actividad del 4,4 % sobre una cadena de azúcares biantenarios de tipo complejo (azúcar PA agalacto biantenario) cuando la actividad sobre el Man8GlcNAc2 de tipo alto en manosa se fijó en el 100 % (Literatura 1 no relacionada con patentes: Fujita et al., (2004) Arch Biochem Biophy. 432: p 41-49: En la misma literatura se informa de que la Endo-M se expresó como un agregado insoluble en todas las inducciones de expresión a 37 °C en Escherichia coli y que al cambiar la temperatura de inducción a 20 °C se produjo una baja actividad enzimática en una fracción soluble, por lo que se intentó la expresión de la Endo-M en levadura. Por ello, se cree que es difícil expresar Endo-M adecuadamente en E. coli. También se sabe que Endo-M se inactiva a 40 °C o más. Endo-M también es divulgada en "KR1020007012943-A/3 Endo-beta-N-acetylglucosaminidase gene" de registro EBI no. KPOP:DI522624, yen el documento WO2016/136984.

Se ha informado que Endo-Om, que es una enzima derivada de la levadura Ogataea minuta (Literatura 1 de Patente: WO2013/051608 o US2014-0313246), utiliza cadenas de azúcar de tipo complejo como sustratos y tiene una temperatura óptima de 50 °C en una reacción hidrolítica. Se desconoce la expresión de Endo-Om en los organismos, excepto en las levaduras.

Endo-F2 y Endo-F3 son enzimas derivadas de Elizabethkingia miricola (Literatura 2 no relacionada con patentes: Tarentino AL et al., (1993) J Biol Chem. 268: p 9702-9708). La Endo-F2 hidroliza las cadenas de azúcar de tipo alto en manosa y de tipo complejo biantenario y no tiene actividad hidrolítica en las cadenas de azúcar de tipo híbrido. Por otro lado, Endo-F3 hidroliza las cadenas de azúcar de tipo complejo biantenario o triantenario y no tiene actividad hidrolítica en las cadenas de azúcar de tipo alto en manosa e híbrido.

La Endo-S, que es una enzima derivada de Streptococcus pyogenes, hidroliza únicamente las cadenas de azúcar de tipo complejo biantenario y no tiene actividad hidrolítica en las cadenas de azúcar de tipo alto en manosa e híbrido (Literatura 3 no relacionada con patentes: Goodfellow JJ et al., (2012) J Am Chem Sci. 134: p 9702-9708).

La Endo-CE, que es una enzima derivada de Caenorhabditis elegans, hidroliza cadenas de azúcar de tipo alto en manosa y de tipo complejo biantenario y se desconoce si Endo-CE puede escindir las cadenas de azúcar de tipo híbrido (Literatura 4 no relacionada con patentes: Kato T et al., (2002) Glycobiology 12: p 581-587). Se ha informado de que la Endo-CE tiene una temperatura óptima de 20 °C en una reacción hidrolítica.

A diferencia de la Endo-M y la Endo-Om conocidas hasta ahora, la Endo-CC es una enzima que supuestamente puede expresarse en E. coli. La literatura 5 no relacionada con las patentes (Y. Eshima et al., (2015) PLoS One. 21; 10(7): e0132859) describe que Endo-CC se expresó en E. coli en una cantidad de 0,1 mg/250 ml de cultivo (= 0,4 mg/l de cultivo). Se ha informado de que la Endo-CC tiene una temperatura óptima de 35 °C en una reacción hidrolítica.

Con el fin de mejorar la eficacia de la reacción y evitar la contaminación, se desean enzimas que sean activas a una temperatura elevada de alrededor de 50 °C, cuando las cadenas de azúcares escindidas se utilizan como materias primas de productos farmacéuticos. También se dice que cuando se utiliza una pluralidad de materiales recombinantes como materia prima de productos farmacéuticos, se deberían utilizar la misma especie huésped para reducir los problemas de inocuidad en los productos farmacéuticos. Es deseable tener la capacidad de producir en una cantidad superior a la habitual en E. coli, ya que ésta suele ser seleccionada como huésped para fabricar dichas materias primas. Sin embargo, entre las endo-p-N-acetilglucosaminidasas conocidas que utilizan cadenas de azúcares de tipo complejo como sustratos, sigue sin descubrirse una enzima que sea activa a alta temperatura y que pueda producirse con un alto rendimiento en E. coli.

Rhizomucor pusillus (R. pusillus), que es una especie de hongos termofílicos, tiene una temperatura óptima de crecimiento de 35-45 °C y es conocido por ser un hongo que produce cuajo para la producción de queso. La secuencia genómica de R. pusillus, incluida la información de la secuencia de la cepa CBS 183.67 de R. pusillus, está publicada en la base de datos proporcionada por The Genozymes Project (Universidad de Concordia ). Esta base de datos incluye un gen que tiene un 41,56 % de homología con Endo-M y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) codificado por el gen, pero no incluye la anotación sobre la actividad de la secuencia de aminoácidos. Hasta ahora no se ha informado de la obtención de endo-p-N-acetilglucosaminidasa derivada de R. pusillus. La secuencia de aminoácidos de las posiciones 191-198 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (en lo sucesivo denominada "secuencia putativa conocida") que se supone que es endo-p-N-acetilglucosaminidasa en la base de datos, es Leu-Ala-Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg (LANTYYIR).

Listado de citaciones

Literatura de patentes

Literatura 1 no relacionada con patentes: documentos WO2013/051608 o US2014-0313246

Literatura no relacionada con patentes

Bibliografía 1 no relacionada con Patente Fujita et al., (2004) Arch Biochem Biophy. 432: p 41-49 Bibliografía 2 no relacionada con Patente Tarentino AL et al., (1993) J Biol Chem. 268: p9702-9708 Bibliografía 3 no relacionada con Patente Goodfellow JJ et al., (2012) J Am Chem Sci.134: p 8030-8033 Bibliografía 4 no relacionada con Patente Kato T et al., (2002) Glycobiology 12: p581-587

Bibliografía 5 no relacionada con Patente Y. Eshima et al., (2015) PLoS One. 21; 10(7): e0132859

Sumario de la invención

Problema Técnico

La presente invención pretende proporcionar una novedosa endo-p-N-acetilglucosaminidasa que puede ser producida por E. coli y que tiene actividad hidrolítica sobre cadenas de azúcar de tipo complejo en condiciones de alta temperatura.

Solución al problema

Los presentes inventores han llevado a cabo intensos estudios dirigidos a lograr el objeto mencionado. Como resultado, los inventores han encontrado que los sobrenadantes de cultivo de una pluralidad de cepas pertenecientes a Rhizomucor pusillus tienen una buena actividad hidrolítica sobre cadenas de azúcares complejas en condiciones de alta temperatura y que la endo-p-N-acetilglucosaminidasa clonada a partir de las cepas presenta una buena eficiencia de expresión en un sistema de producción de E. coli y la enzima producida tiene la mencionada actividad hidrolítica. Los presentes inventores han llevado a cabo otros estudios y, en consecuencia, han completado la presente invención.

La presente invención proporciona los siguientes aspectos de la invención:

(1) Un polipéptido que tiene las siguientes propiedades (A) y (B):

(A) el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 75 % o más de identidad y un 95 % o más de similitud con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y es una secuencia de aminoácidos diferente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y (B) el polipéptido presenta, a cualquier temperatura entre 45 y 60 °C, un 40 % o más del valor máximo de actividad hidrolítica y/o de transglicosilación sobre cadenas de azúcares complejas.

(2) El polipéptido de acuerdo con (1), que tiene las siguientes propiedades (A) y (B):

(A) el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 75 % o más de identidad y un 95 % o más de similitud con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de las posiciones 191 a 195 de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, que es Leu-Ala-Lys-Leu-Leu (LAKLL);

(B) el polipéptido presenta, a cualquier temperatura entre 45 y 60 °C, un 40 % o más del valor máximo de actividad hidrolítica sobre cadenas de azúcares complejas.

(3) El polipéptido de acuerdo con (1), en el que la actividad hidrolítica sobre cadenas de azúcares complejas a 50 °C es del 60 % o más del valor de la actividad máxima.

(4) El polipéptido de acuerdo con cualquiera de (1) a (3), en el que, además de tener las propiedades (A) y (B), (C) el polipéptido se produce en una cantidad de 10 mg/l de cultivo o más, en expresión recombinante en E. coli.

(5) El polipéptido de acuerdo con cualquiera de (1) a (4), en el que el polipéptido tiene un 85 % o más de identidad de secuencia con la región de las posiciones 54 a 341 de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

(6) El polipéptido de acuerdo con cualquiera de (1) a (5), en el que al menos uno de los aminoácidos D276, V223, W225, Y247 y W248 permanece sin cambios y preferentemente al menos D276 permanece sin cambios.

(7) El polipéptido de acuerdo con cualquiera de (1) a (3), en el que el polipéptido es un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en A128T, D333G, I434L, V460A, I527V, K569T, F610S, y H626R en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

(8) El polipéptido de acuerdo con (1), en el que el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOS: 1 a 6.

(9) El polipéptido de acuerdo con cualquiera de (1) a (6), en el que el polipéptido tiene al menos una de las mutaciones contenidas en SEQ ID NO: 23.

(10) El polipéptido de acuerdo con (9), en el que el polipéptido tiene una mutación en al menos un aminoácido seleccionado entre N172, D176, Y214, S216, L245, N246, T275, L306, F307, y A310 y tiene una actividad de transglicosilación aumentada.

(11) El polipéptido de acuerdo con (9) o (10), en el que el polipéptido tiene al menos una mutación seleccionada del grupo de:

una mutación en la que N172 está sustituido por Gln, Asp, Gly, Ala, Phe, Cys, His, Ile, Ser, Thr, Val, Met, Glu, Lys, Leu, Pro, Arg, Trp, o Tyr; una mutación en la que D176 está sustituido por Arg; una mutación en la que Y214 está sustituido por Phe; una mutación en la que S216 está sustituido por Val; una mutación en la que L245 está sustituido por Ser; una mutación en la que N246 está sustituido por Asp; una mutación en la que T275 está sustituido por Ile; una mutación en la que F283 está sustituido por Ser; una mutación en la que L306 está sustituido por Ile; una mutación en la que F307 está sustituido por Tyr; una mutación en la que A310 está sustituido por Asp; y una mutación en la que E314 está sustituido por Gln.

(12) El polipéptido de acuerdo con cualquiera de (9) a (11), en el que el polipéptido tiene una mutación en la que W278 está sustituido por Phe o Tyr. El polipéptido de acuerdo con (11), en el que, más específicamente, el polipéptido tiene la mutación N172Q, N172D, W278F, N172Q/W278F, N172D/W278F, o Y214/L306I/L307Y en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 6.

(13) Un polinucleótido que codifica el polipéptido de acuerdo con cualquiera de (1) a (12).

(14) El polinucleótido de acuerdo con (13), que tiene una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las secuencias de nucleótidos de las posiciones 1 a 2088 de nucleótidos de SEQ ID NOS: 8 a 17 y las secuencias de nucleótidos de las posiciones 1 a 2091 de nucleótidos de SEQ ID NOS: 18 to 19.

(15) Un plásmido de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con (13) o (14).

(16) Una célula huésped transformada con el plásmido de acuerdo con (15).

(17) La célula huésped de acuerdo con (16), en la que la célula huésped es E. coli transformada con un plásmido que comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de las posiciones 1 a 2088 de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 o 17 o la secuencia de nucleótidos de las posiciones 1 a 2091 de nucleótidos de SEQ ID NO: 19.

(18) Un procedimiento para producir el polipéptido de acuerdo con cualquiera de (1) a (12), que comprende cultivar las células huésped de acuerdo con (16) o (17) y recoger el polipéptido de acuerdo con cualquiera de (1 ) a (12 ) del cultivo resultante.

(19) Un reactivo que comprende el polipéptido de acuerdo con cualquiera de (1) a (12).

Efectos ventajosos de la invención

Las novedosas endo-p-N-acetilglucosaminidasas de la presente invención tienen una buena actividad hidrolítica sobre cadenas de azúcar de tipo complejo en condiciones de reacción a alta temperatura de 50 °C o más, de modo que pueden proporcionar de forma segura y eficiente cadenas de azúcar en condiciones de alta temperatura, lo que puede evitar el crecimiento bacteriano, en la fabricación de productos farmacéuticos que utilizan estas enzimas y puede conducir a una alta eficiencia de reacción. Las enzimas de la presente invención pueden producirse en un sistema de expresión heteróloga utilizando E. coli con un alto rendimiento. En los casos en que las materias primas biológicas (como un péptido/proteína bioactiva y otras enzimas) distintas de las presentes enzimas son producidas por E. coli en la fabricación de productos farmacéuticos, el uso de la misma especie huésped en la producción de las presentes enzimas puede facilitar la evaluación del efecto de la especie huésped, de la que proceden las materias primas biológicas, sobre la inocuidad del producto final.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1] La figura 1 es una representación esquemática que muestra una reacción hidrolítica en la que el Endo-Rp utiliza el SGP como un sustrato.

[Figura 2] La figura 2 representa gráficos que muestran los resultados del análisis LC-MS de la solución de SGP antes del tratamiento enzimático (panel superior) y de la solución cruda después del tratamiento enzimático (panel inferior) bajo la condición de análisis A. El pico grande detectado a los 3 o 4 minutos representa el SGP y los picos detectados alrededor de los 4,5 a 5 minutos representan el SG(10).

[Figura 3] La figura 3 es un gráfico que muestra la dependencia frente a la temperatura de las actividades hidrolíticas de las enzimas crudas derivadas de diferentes cepas de R. pusillus (NBRC 9740 (triángulo abierto), NBRC 9741 (triángulo relleno), NBRC 9742 (cuadrado abierto) y NBRC 9743 (cuadrado relleno)) y Endo-M (círculo relleno) sobre el SGP. El eje X representa la temperatura de reacción (°C) y el eje Y representa la velocidad de hidrólisis.

[Figura 4] La figura 4 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de Endo-Rp y diferentes homólogos de la misma, Endo-Rm y la secuencia putativa conocida.

[Figura 5] La figura 5 es un gráfico que muestra el cambio dependiente del tiempo de las actividades hidrolíticas de Endo-Rp (círculo abierto), Endo-M (círculo relleno), Endo-S (cuadrado relleno) y Endo-Om (triángulo relleno) sobre SGP. El eje X representa la duración tras el inicio de la reacción y el eje Y representa la tasa de hidrólisis.

[Figura 6] La figura 6 es un gráfico que muestra la dependencia frente a la temperatura de la actividad hidrolítica del Endo-Rp sobre el SGP. El eje X representa la temperatura de reacción (°C) y el eje Y representa la velocidad de hidrólisis.

[Figura 7] La figura 7 es un gráfico que muestra la dependencia frente al pH de la actividad hidrolítica del Endo-Rp sobre el SGP. El eje X representa el valor del pH de las soluciones de reacción y el eje Y representa la tasa de hidrólisis.

[Figura 8] La figura 8 representa gráficos que muestran los resultados del análisis LC-MS de la solución de reacción de Endo-Rp en presencia de SGP solo (panel superior) o SGP aceptor ((GlcNAc-)Asn) (panel inferior). El gran pico detectado cerca de 1 minuto representa el SGP, y los picos detectados alrededor de 4 a 5 minutos representan el SG(10), y el pico detectado alrededor de 3 minutos representa el (SG-)Asn. [Figura 9] La figura 9 es un gráfico que muestra el cambio dependiente del tiempo de las actividades de transglicosilación de Endo-Rp (círculo abierto) y Endo-Rp N172Q (cuadrado relleno). El eje X representa la duración (hora) tras el inicio de la reacción y el eje Y representa la tasa de transglicosilación ( %).

Descripción de realizaciones

A continuación, se describirá en detalle la presente invención.

La presente invención proporciona una endo-p-N-acetilglucosaminidasa que es un polipéptido que tiene las propiedades (A) y (B):

(A) el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 75 % o más de identidad y un 95 % o más de similitud con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 (secuencia de aminoácidos de Endo-Rp) y es una secuencia de aminoácidos diferente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y

(B) el polipéptido presenta un 40 % o más del valor máximo de actividad de la actividad hidrolítica y/o actividad de transglicosilación sobre cadenas de azúcares de tipo complejo a una temperatura que varía entre 45 y 60 °C.

En la presente invención, "cadena de azúcar de tipo complejo" significa una cadena de azúcar que se encuentra entre las cadenas de azúcar humanas ligadas a N, y tiene una estructura básica que consiste en las fórmulas (I) o (II) como se describen a continuación. La cadena de azúcares de tipo complejo tiene una estructura en la que cada una de las dos cadenas ramificadas (cadena 1-3 y cadena 1-6), ramificada a partir de la manosa (p manosa) cerca del extremo reductor, tiene GlcNAc. La estructura variará en función de la presencia o ausencia de galactosa y ácido siálico en el extremo no reductor, así como de su isomería de valencia y e isomería de posición. Mientras la cadena de azúcares de tipo complejo tenga esta estructura básica, también puede tener otra estructura ramificada o una estructura que haya sido modificada químicamente en alguno de los grupos hidroxilo de un carbohidrato o un grupo carbonilo del ácido siálico en el extremo no reductor. Se ha informado que, como ejemplo de una cadena de azúcar de tipo complejo químicamente modificada, el SGP modificado por oximación tras la escisión oxidativa del diol en el ácido siálico del SGP, puede utilizarse como sustrato de Endo-M (Org. Biomol. Chem, 2016, 14, 9501-9518)

[Fórmula (X)]

( I )

[Fórmula (II)]

GlcNAc()1-2Mana1__

Man |51 -4GlcNAc(i 1 -4GlcNAc[i 1 -(Asn)

GlcN/'c|}l-2Manctl-'" 3

( I I )

Las cadenas de azúcar de tipo complejo pueden incluir típicamente un sialilglicano (SG) incluido en el sialilglicopéptido (SGP: fórmulas (III) y (IV) a continuación) extraído de la yema de huevo de gallina. El SGP puede purificarse a partir de la yema de huevo de ave, pero el SGP purificado está disponible comercialmente y puede adquirirse, por ejemplo, en Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. o similares

[Fórmula (IV)]

NH2

I

Lys

I

Val

I

Neu5Aca2-6Gal(31 -4GlcNAcp 1 -2Mana Ala

6 I

Manp 1 -4GlcNAcp 1 -4GlcNAc|l 1 - Asn

Neu5Aca2-6Gaipi-4GlcNAcp1-2Mana1 — 3 I

Lys

I

Thr

I COOH

( I V )

En la presente invención, la "endo-p-N-acetilglucosaminidasa" es una enzima que reconoce una cadena de azúcares como su sustrato y tiene tanto actividad hidrolítica como actividad de transglicosilación. La secuencia de aminoácidos de la endo-P-N-acetilglucosaminidasa de origen natural, que tiene ambas actividades, puede modificarse para generar un mutante ajustado para potenciar o reducir cualquiera de las actividades, y una enzima que sólo tenga actividad hidrolítica o de transglicosilación permitiendo la desaparición de cualquiera de las actividades. La presente invención incluye no sólo las enzimas de origen natural, sino también dichas enzimas mutantes.

La actividad hidrolítica de las enzimas de la presente invención es una actividad que hidroliza específicamente un enlace glicosídico p1,4 en la quitobiosa del núcleo, que consiste en dos unidades GlcNAc consecutivas en el extremo reductor de la cadena de azúcares de tipo complejo descrita anteriormente (tal como se utiliza en la presente memoria, "actividad hidrolítica" significa esta actividad a menos que se indique de otro modo). Por ejemplo, como se muestra en la Figura 1, en una reacción hidrolítica en la que la endo-p-N-acetilglucosaminidasa utiliza SGP como sustrato, se produce SG(10) (estructuras de fórmula (V) y (VI) a continuación) que consiste en una estructura sin un GlcNAc en el extremo reductor de SG.

[Fórmula 6]

Neu5Aca2-6Gal|31-4GlcNAcpi-2Mana1-^.g

Manpi-4GlcNAc

Neu5Aca2-6Galp1 -4GlcNAcpi -2Mana1 — 3

(V I )

La actividad de transglicosilación de las presentes enzimas es una actividad (en lo sucesivo denominada "actividad de transglicosilación") que forma el enlace (31,4 glicosídico mediante la unión del extremo reductor de la cadena de azúcar derivada de un donador de la cadena de azúcar, en el que el extremo reductor tiene GlcNAc, a una molécula que sólo tiene GlcNAc como una unidad de carbohidrato o a una molécula que comprende una cadena de azúcar que tiene GlcNAc en el extremo no reductor (en lo sucesivo denominada "molécula aceptora"). Por ejemplo, en una reacción de transglicosilación que utiliza (GlcNAc-)Asn con la estructura representada por la fórmula (VII) a continuación, como molécula aceptora y SGP como molécula donadora, la SG(10) derivada de la SGP se transfiere a la unidad GIcNAc de la molécula aceptora para producir (SG-)Asn representada por la fórmula (VIII) a continuación. Del mismo modo, en una reacción de transglicosilación que utiliza GlcNAc-AcA con la estructura representada por la fórmula (IX) a continuación como molécula aceptora y SGP como molécula donadora, se produce SG-A representada por la fórmula (X) a continuación.

Enzimas y secuencias de aminoácidos

Las enzimas de la presente invención no se limitan a las enzimas que fueron obtenidas en los Ejemplos y que tienen secuencias específicas, en tanto tengan las propiedades descritas anteriormente. Las enzimas de la presente invención pueden aislarse de fuentes naturales o producirse artificialmente o modificarse en base a la información de la secuencia de las enzimas de la presente invención. Para el aislamiento a partir de fuentes naturales, las especies biológicas que se utilizan como fuentes de aislamiento incluyen preferentemente, pero no están particularmente limitadas a, hongos, más preferentemente hongos termofílicos, aún más preferentemente hongos pertenecientes al género Rhizomucor, aún más preferentemente hongos pertenecientes a Rhizomucor pusillus o Rhizomucor miehei.

En la presente invención, las endo-p-N-acetilglucosaminidasas que tienen las presentes propiedades se clonan a partir de una pluralidad de cepas pertenecientes a Rhizomucor pusillus (R. pusillus) que son hongos termofílicos. La enzima derivada de la cepa NBRC 9742 de R. pusillus se denomina Endo-Rp (secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 1, secuencia de ácido nucleico derivada de la cepa: SEQ ID NO: 8); la enzima derivada de la cepa NBRC 9740 se denomina Endo-Rp2 (secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 2, secuencia de ácido nucleico derivada de la cepa: SEQ ID NO: 10); la enzima derivada de la cepa NBRC 9741 se denomina Endo-Rp3 (secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 3, secuencia de ácido nucleico derivada de la cepa: SEQ ID NO: 12); y la enzima derivada de la cepa NBRC 9743 se denomina Endo-Rp4 (secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 4, secuencia de ácido nucleico derivada de la cepa: SEQ ID NO: 14. Todas las cepas de R. pusillus descritas anteriormente están disponibles en el NBRC. El lugar de origen de cada una de las cepas es Japón.

La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (siendo su secuencia putativa de ácido nucleico : SEQ ID NO: 20) se publica como la secuencia putativa de aminoácidos de la endo-p-N-acetilglucosaminidasa en base a la información de la secuencia de la cepa de R. pusillus con su genoma publicado. La optimización de la secuencia de ácido nucleico para un sistema de expresión de E. coli para expresarla en E. coli, dio como resultado una escasa expresión y una actividad enzimática muy baja de la enzima (Ejemplo 3). En la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, el aminoácido correspondiente a la Lys en la posición 193 de SEQ ID NO: 1 está sustituido por los aminoácidos Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg (véase la figura 4). Una enzima que consiste en la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) en el que el Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg de las posiciones 193 a 198 en SEQ ID NO: 7 ha sido sustituido por Lys como en SEQ ID NO: 1 mostró una adecuada expresión y actividad hidrolítica en E. coli y la enzima que tiene esta secuencia de aminoácidos se denomina Endo-Rp5. En conclusión, la secuencia correspondiente a las posiciones 191 a 195 de SEQ ID NO: 1 se identifica como una región muy importante para las propiedades de las enzimas de la presente invención.

Basándose en la información de la secuencia de Endo-Rp identificada en la presente invención, también se identificó una secuencia relacionada a partir de la información genómica publicada^ cepa R. miehei CAU432) de Rhizomucor miehei (R. miehei), una especie relacionada con R. pusillus. La optimización de la secuencia de ácido nucleico para la expresión de E. coli para expresar la proteína en cuestión en E. coli, dio como resultado la producción de la enzima que tiene la actividad enzimática de la presente invención en cierto grado. Esta enzima se denominó Endo-Rm (secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 6, secuencia de ácido nucleico derivada del hongo: SEQ ID NO: 18.

La identidad de secuencia de aminoácidos entre Endo-Rp y sus homólogos, Endo-Rp2, Endo-Rp3, Endo-Rp4 y Endo-Rp5 es del 99 % o más. Endo-Rp2 es un homólogo que tiene las mutaciones A128T y K569T en SEQ ID NO: 1. Endo-Rp3 es un homólogo que tiene las mutaciones D333G, I434L, I527V, K569T, F610S, y H626R en SEQ ID NO: 1. Endo-Rp4 es un homólogo que tiene las mutaciones V460A y K569T en SEQ ID NO: 1. Endo-Rp5 es un homólogo que tiene la mutación K569T en SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de Endo-Rm tiene un 96 % de similitud y un 77 % de identidad frente a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. La región comprendida entre las posiciones 54 y 340 de esta secuencia tiene un alto nivel de identidad (identidad: 89 %, similitud: 97 %)) y la región de las posiciones 190 a 195, His-Leu-Ala-Lys-Leu-Leu (HLAKLL) es completamente idéntica, lo que satisface la propiedad (A) de las enzimas de la presente invención.

Cuando la enzima de la presente invención es una enzima derivada de hongos, la proteína puede aislarse de sobrenadantes de cultivo de hongos o de homogeneizados de hongos o expresarse utilizando un sistema de expresión heteróloga como E. coli o levadura. Se sabe que muchas endo-p-N-acetilglucosaminidasas conocidas se producen en un bajo rendimiento utilizando un sistema de expresión heteróloga en E. coli, mientras la secuencia de aminoácidos de la enzima de la presente invención tiene la propiedad de mostrar una excelente eficiencia de producción en un sistema de expresión de E. coli. Las secuencias de ácido nucleico de las proteínas derivadas de los hongos suelen optimizarse para la expresión en E. coli, si las proteínas van a expresarse en E. coli. Incluso cuando se llevó a cabo dicha optimización, por ejemplo, Endo-M N175Q (mutante de aminoácido individual) se produjo en E. coli con un rendimiento de sólo 3,7 mg/l de cultivo. También se ha informado de que se produjo Endo-Cc con un rendimiento de 0,4 mg/l de cultivo. En contraste con esto, la enzima de la presente invención se expresa en E. coli en una cantidad de 10 mg/l de cultivo o más (preferentemente 12 mg/l de cultivo o más, y más preferentemente 15 mg/l de cultivo o más) y muestra una buena eficiencia de producción en E. coli, en comparación con las enzimas convencionales. Como se muestra en el Ejemplo 4, a partir de los resultados de las eficiencias de producción de la secuencia putativa conocida (SEQ ID NO: 7) y Endo-Rp5 (SEQ ID NO: 5) en E. coli, esta propiedad parece ser una propiedad impartida por una determinada secuencia de aminoácidos (en particular, una región que comprende las posiciones de aminoácidos 191 a 195 de SEQ ID NO: 1, entre otras, la secuencia de las posiciones 192 a 194, y más particularmente, la Lys en la posición 193).

Las secuencias de aminoácidos de las enzimas de la presente invención son cada una una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 75 % o más de identidad y un 95 % o más de similitud, en comparación con la secuencia de aminoácidos de longitud completa de SEQ ID NO: 1 y es diferente de SEQ ID NO: 7 (preferentemente el aminoácido correspondiente a la posición del aminoácido 193 de SEQ ID NO: 1 es Lys; preferentemente la secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de las posiciones 192 a 194 de aminoácidos es Ala-Lys-Leu (AKL); más preferentemente la secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de las posiciones 191 a 195 de aminoácidos es Leu-Ala-Lys-Leu-Leu (LAKLL)).

La identidad de la secuencia de aminoácidos se refiere a un valor numérico cuantificado a partir del índice de coincidencia de aminoácidos, en el que si un aminoácido coincide exactamente con el aminoácido presente en la posición correspondiente en la secuencia de longitud completa, se considera que estos aminoácidos son el mismo aminoácido. Por otro lado, la similitud de secuencia de aminoácidos se refiere a un valor numérico cuantificado a partir de la relación entre dos secuencias de aminoácidos, en el que si un aminoácido tiene una propiedad similar a la del aminoácido presente en la posición correspondiente, se considera que estos aminoácidos tienen similitud. La identidad y la similitud de secuencias en la presente invención se calculan mediante el software de análisis de secuencias GENETYX-SV/RC (fabricado por GENETYX CORPORATION). Este algoritmo es de uso común en la técnica.

Se espera que el dominio activo de Endo-Rp sea una región desde las posiciones 1 a 374 de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en base a el alineamiento con Endo-A que ha sido analizado para su estructura cristalina (Zhenlian Ling et al, Journal of Molecular Biology (2009), Vol. 389, No.1, Páginas 1-9). De hecho, las secuencias de aminoácidos de las enzimas de la presente invención (Endo-Rp1 a 5 y Endo-Rm) tienen una identidad de secuencia del 75 % o más con la SEQ ID NO: 1 para el alineamiento completo. La secuencia de las posiciones 54 a 341 de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en la región que se espera que sea el dominio activo tiene una identidad muy alta del 89 %. La secuencia de aminoácidos de longitud completa tiene una identidad preferentemente del 80 % o más, más preferentemente del 90 % o más, aún más preferentemente del 95 % o más, y más preferentemente del 99 % o más. La región de las posiciones 54 a 341 de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 tiene una identidad preferentemente del 85 % o más, más preferentemente del 90 % o más, más preferentemente del 95 % o más, incluso más preferentemente del 98 % o más, y más preferentemente es completamente idéntica a la secuencia de aminoácidos de esta región.

En la especificación, la notación de los aminoácidos incluidos en una molécula sigue la práctica de la técnica. Un sitio de mutación se representa utilizando la notación de una letra del aminoácido (o ácido nucleico) de tipo silvestre y la posición de la mutación (por ejemplo, el Asn en la posición 172 se denomina "N172"). Una mutación también se representa utilizando la notación de una letra del aminoácido (o ácido nucleico) de tipo silvestre, la posición de la mutación y la notación de una letra del aminoácido (o ácido nucleico) después de la mutación (por ejemplo, la mutación en la que el Asn en la posición 172 está sustituido por Gln, se denomina "N172Q"). Un mutante con una mutación particular se representa utilizando el nombre de la molécula y la mutación (por ejemplo, el mutante que tiene Asn en la posición 172 de Endo-Rp sustituido por Gln, se denomina "Endo-Rp N172Q"). Un mutante que tiene una pluralidad de mutaciones se representa con la expresión delimitada por "/' entre la pluralidad de mutaciones (por ejemplo, el mutante Endo-Rp N172Q que tiene una mutación adicional en la que la Trp en la posición 278 está sustituido por Phe, se denomina "Endo-Rp N172Q/W278F").

Las enzimas de la presente invención pueden incluir una mutación (sustitución) de aminoácidos, una supresión, una inserción y/o una adición, con la condición de que tengan un cierto nivel o más de identidad o similitud con la SEQ ID NO: 1, con la condición de que, al menos en SEQ ID NO: 1, la secuencia correspondiente a las posiciones 193 a 198 de SEQ ID NO: 7 sea una secuencia diferente de Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg y preferentemente el sitio correspondiente al aminoácido en la posición 193 (preferentemente las posiciones 192 a 194, más preferentemente las posiciones 191 a 195) de SEQ ID NO: 1 tenga una secuencia de aminoácidos completamente idéntica a SEQ ID NO: 1. Los resultados del Ejemplo 8 mostraron que tanto la actividad hidrolítica como la actividad de transglicosilación casi desaparecieron cuando el aminoácido D276 de la SEQ ID NO: 1 estaba mutado y que cada uno de los mutantes E126A, V223R, W225H, Y247F y W248N redujo en gran medida ambas actividades. Esto indica que estos aminoácidos en la enzima de la presente invención son preferentemente aminoácidos similares o idénticos a los de SEQ ID NO: 1. Así, la región de la enzima de la presente invención que tiene la secuencia de aminoácidos completamente idéntica a SEQ ID NO: 1 es preferentemente la región de las posiciones 118 a 332 de aminoácidos, más preferentemente la región de las posiciones 54 a 341, y más preferentemente la región de las posiciones 1 a 374.

Las enzimas de la presente invención pueden incluir la sustitución, supresión, inserción y/o adición de algunos (preferentemente 10 o menos, más preferentemente 7 o menos, y aún más preferentemente 5, 4, 3, 2, o 1) aminoácidos por sitio en algunos sitios (preferentemente 5 sitios o menos, más preferentemente 3, 2, o 1 sitio) en cualquier región en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 1 a 6, excepto las regiones completamente idénticas descritas anteriormente, con la condición de que tengan la identidad/similitud de secuencia descrita anteriormente. Dicha supresión de aminoácidos puede proporcionar polipéptidos que tengan las propiedades de las enzimas de la presente invención incluso cuando, por ejemplo, se suprimen varios aminoácidos de los extremos N y/o C de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 1 a 6. En particular, la región que va desde la posición 375 hasta el extremo C de la SEQ ID NO: 1 no es un dominio activo y, por lo tanto, acepta muchas modificaciones de aminoácidos (sustitución, supresión, inserción y/o adición). Los polipéptidos con una adición de aminoácidos incluyen aquellos que tienen aminoácidos o péptidos de los que se sabe que no afectan a las actividades mencionadas anteriormente añadidos a los extremos N y/o al C de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 1 a 6. Dichos péptidos que se añaden incluyen un péptido etiqueta (como una etiqueta His y una etiqueta GST) que se añade para la purificación de la proteína.

Para la posición de una mutación de aminoácido en las enzimas de la presente invención, se ha confirmado que una enzima que tiene una mutación en al menos una posición representada por Xaa en SEQ ID NO: 23 conserva la actividad hidrolítica y/o la actividad de transglicosilación. Se espera que las presentes enzimas tengan el dominio activo en las posiciones 1 a 374 de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Se pueden diseñar mutantes que mantengan las actividades originales o que se diseñen para tener las actividades deseadas, haciendo mutaciones en el dominio activo en base a los hallazgos de las relaciones estructura-actividad en endoenzimas conocidas y a la divulgación de la presente invención.

Los resultados de diferentes homólogos indican que las enzimas de la presente invención aceptan sustituciones de aminoácidos en A128, D333, 1434, V460, 1527, K569, F610, y H626 en SEQ ID NO: 1. También, como se muestra en el Ejemplo 8, se generaron muchos mutantes con sustitución de aminoácidos en el dominio activo. Se confirmó que muchos de estos mutantes reducen las actividades aparentes en comparación con la Endo-Rp de tipo silvestre, pero que tienen un cierto nivel de actividad hidrolítica y/o de actividad de transglicosilación, suficiente para estar disponibles para la transglicosilación (el valor de la actividad específica de cualquiera de las actividades es de al menos el 0,5 % o más del de la Endo-Rp de tipo silvestre). También se confirmó que ciertas sustituciones de aminoácidos son aceptables en esta región. Específicamente, las mutaciones de aminoácidos descritas a continuación son aceptables.

Aunque N172 parece ser un residuo activo que contacta con el sustrato, la sustitución con cualquier aminoácido excepto Trp, Arg y Tyr permite mantener las actividades y por lo tanto la sustitución con cualquier aminoácido, excepto aminoácidos con cadenas laterales voluminosas, es ampliamente aceptable. Se ha confirmado que la sustitución con un aminoácido que tenga una cadena lateral altamente polar, como Gln y Asp; y Gly, Ala, Phe, Cys, His, Ile, Ser, Thr, Val, Met, o similares, puede aumentar la relación de actividad de transglicosilación (valor de actividad de transglicosilación / valor de actividad hidrolítica).

La sustitución de D176 por Arg permitió mantener las actividades, y por lo tanto la sustitución con muchos aminoácidos puede ser aceptable. La sustitución de D176 por Arg también es útil para generar mutantes con un aumento en la relación de actividad de transglicosilación.

La sustitución de Y214 con un aminoácido que tenga una cadena lateral pequeña como Ala reduce en gran medida ambas actividades, y por lo tanto Y214 aceptará la sustitución con aminoácidos que tengan una cadena lateral relativamente grande. La sustitución de Y214 por Phe es útil para generar mutantes con un aumento en la relación de actividad de transglicosilación.

La sustitución de S216 por un aminoácido con una cadena lateral pequeña (preferentemente Ala o Val) permite mantener la actividad de transglicosilación y reducir la actividad hidrolítica. Esta mutación es útil para generar mutantes con un incremento en la relación de actividad de transglicosilación.

La sustitución de L245 por Ser mantuvo las actividades y por lo tanto la sustitución de L245 por muchos aminoácidos puede ser aceptable. La sustitución de L245 por Ser también es útil para generar mutantes con un incremento en la relación de actividad de transglicosilación.

Aunque N246 parece resistir la aceptación de un cambio importante, la sustitución de N246 por Asp redujo en gran medida la actividad hidrolítica, manteniendo al mismo tiempo la actividad de transglicosilación. Dicha mutación es útil para generar mutantes con un aumento en la relación de actividad de transglicosilación.

La sustitución de T275 con Ile mantuvo las actividades y por lo tanto la sustitución de T275 por muchos aminoácidos puede ser aceptable. La sustitución de T275 por Ile también es útil para generar mutantes con un incremento en la relación de actividad de transglicosilación.

Se cree que la interacción hidrófoba entre W278 y la cadena de azúcares del sustrato contribuye a las actividades. W278 puede aceptar aminoácidos con una cadena lateral altamente hidrófoba, como Tyr, Phe, Ala, Leu e Ile.

La sustitución de F283 por Ser permitió mantener las actividades y, por tanto, F283 puede aceptar la sustitución por muchos aminoácidos. La sustitución de F283 por Ser también es útil para generar mutantes con un incremento en la relación de actividad de transglicosilación.

La sustitución de L306 por Ile provoca cambios menos significativos en las actividades, pero tiende a mantener la actividad de transglicosilación y a reducir la actividad hidrolítica y, por lo tanto, la sustitución puede ser útil para generar mutantes con una mayor relación de actividad de transglicosilación. La conformación predicha del producto de sustitución indica que la sustitución por un aminoácido con una cadena lateral voluminosa o cadena lateral cargada, puede ser desfavorable.

F307 puede aceptar diferentes aminoácidos como His y Tyr. La sustitución de F307 por His o Tyr reduce en gran medida la actividad hidrolítica, en lugar de la actividad de transglicosilación, y es útil para generar mutantes con un incremento en la relación de actividad de transglicosilación.

La sustitución de A310 por un aminoácido que tenga una cadena lateral con un residuo polar o un residuo cargado (preferentemente Asp, Glu, Lys, Ser o similares) reduce en gran medida la actividad hidrolítica, en lugar de la actividad de transglicosilación. Estas mutaciones son útiles para generar mutantes con un incremento en la relación de actividad de transglicosilación.

La sustitución de E314 por Gln no causa una gran variación de las actividades y puede ser aceptable.

En lo que respecta a la sustitución/mutación de aminoácidos, las enzimas de la presente invención incluyen una secuencia de aminoácidos que preferentemente tiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre las mutaciones mostradas en SEQ ID NO: 23 (A128, N172, D176, Y214, S216, L245, N246, T275, W278, F283, L306, F307, A310, E314, D333, 1434, V460, 1527, K569, F610, y H626 en SEQ ID NO: 1); más preferentemente una secuencia de aminoácidos que tenga al menos una mutación seleccionada entre A128T (Rp2), D333G (Rp3), I434L (Rp3), V460A (Rp4), I527V (Rp3), K569T (Rp2-4), F610S (Rp3) y H626R (Rp3) en SEQ ID NO: 1; o una secuencia de aminoácidos que además tiene una mutación en al menos un aminoácido de N172, D176, Y214, S216, L245, N246, T275, W278, F283, L306, F307, A310, y E314 en la secuencia de aminoácidos, en la que pueden ocurrir simultáneamente una pluralidad de mutaciones y pueden ocurrir todas las mutaciones.

Las endo-p-N-acetilglucosaminidasas tienen tanto actividad hidrolítica como actividad de transglicosilación. Las enzimas que tienen una alta actividad hidrolítica también hidrolizan, como sustratos, la cadena de azúcares que ha sido transferida a la molécula aceptora, debido a su actividad de transglicosilación. Esto puede impedir que dichas enzimas produzcan adecuadamente la molécula transglicosilada deseada. Por esta razón, estas enzimas mutadas para la transglicosilación también son importantes en la síntesis de compuestos glicosilados.

Como se ha mencionado anteriormente, se ha confirmado que algunas mutaciones en N172, D176, Y214, S216, L245, N246, T275, F283, L306, F307, A310, y E314 en SEQ ID NO: 1 aumentan la actividad de transglicosilación de las enzimas de la presente invención o reducen considerablemente la actividad hidrolítica, en relación con la actividad de transglicosilación. Por lo tanto, estas mutaciones son útiles para diseñar una enzima mutada para la transglicosilación, con un aumento en la relación de actividad de transglicosilación (actividad de transglicosilación/actividad hidrolítica). La presente invención también proporciona una enzima mutada de este tipo para la transglicosilación. Las mutaciones específicas en la enzima mutada para la transglicosilación incluyen una mutación en la que N172 está sustituido por Gln o Asp; una mutación en la que D176 está sustituido por Arg; una mutación en la que Y214 está sustituido por Phe; una mutación en la que S216 está sustituido por Val; una mutación en la que L245 está sustituido por Ser; una mutación en la que T275 está sustituido por Ile; una mutación en la que W278 está sustituido por Phe o Tyr; una mutación en la que f283 está sustituido por Ser; una mutación en la que L306 está sustituido por Ile; una mutación en la que F307 está sustituido por Tyr; una mutación en la que A310 está sustituido por Asp; y una mutación en la que E314 está sustituido por Gln en SEQ ID NO: 1. Las mutaciones introducidas en las enzimas mutadas para la transglicosilación de la presente invención pueden ser al menos una de estas mutaciones. Las mutaciones pueden ser mutaciones individuales o múltiples que comprenden algunas de estas mutaciones. Las mutaciones preferibles son N172Q, N172D, W278F, N172Q/W278F, N172D/W278F, o Y214/L306I/F307Y.

Actividad hidrolítica y actividad de transglicosilación

Las enzimas de la presente invención tienen actividad hidrolítica y/o actividad de transglicosilación en cadenas de azúcar de tipo complejo. Las actividades representan una propiedad que exhibe, a cualquier temperatura entre 45 y 60 °C, un 40 % o más del valor de la actividad máxima.

Las enzimas de la presente invención tienen una actividad de hidrólisis de diferentes cadenas de azúcar de tipo complejo como sustratos. Las enzimas se identifican evaluando la actividad de hidrólisis de SGP como sustrato, para proporcionar SG (10) de acuerdo con el procedimiento descrito a continuación.

En una reacción hidrolítica, se prepara una solución de reacción (volumen total 100 pl) que contiene un amortiguador de fosfato de potasio 200 mM (pH 6,25), SGP 69 mM y 0,02 pM de enzima (para el blanco, un volumen igual de un amortiguador en lugar de la enzima) (todas las concentraciones indicadas representan la concentración final en la solución de reacción) y se incuba a una temperatura predeterminada durante 18 horas. La solución de reacción resultante y la solución blanco se analizaron por LC-MS para cuantificar la SGP y la SG (10) y calcular la tasa de hidrólisis y la actividad específica, de acuerdo con las fórmulas descritas a continuación.

Condición A de análisis LC-MS

Aparato de MS: 6130 Quadrupole LC/MS (Agilent Technologies, Inc.)

Ionización: ESI

Modo: Positivo

HPLC: 1260 Infinity LC (Agilent Technologies, Inc.)

Columna: Inertsil ODS-33 pm 93.0 x 50 mm (GL Sciences Inc.)

Temperatura de la columna: 40 °C

Fase móvil A: H2O 0,1 % HCOOH

Fase móvil B: Acetonitrilo 0,1 % HCOOH

Gradiente (fase móvil B %): 0 % (0 min), 10 % (5 min), 30 % (7 min)

Caudal: 200 ml/min).

Tasa de hidrólisis

La tasa de hidrólisis se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula

Tasa de hidrólisis (%) = La concentración de SG (10) después de la reacción (M) / la concentración de SGP en el blanco (M) x 100

Actividad específica

La actividad específica se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula

Actividad específica (jm ol/m in/jg) = la cantidad de SG (10) producida (|jmol) / la duración de la reacción (min) / la cantidad de enzima (jg )

Las enzimas de la presente invención tienen la actividad de reconocimiento de diferentes moléculas donadoras y aceptoras de cadena de azúcar y de transferencia de cadenas de azúcar. Las enzimas se identifican evaluando la actividad de transferencia de la cadena de azúcares del SGP utilizado como sustrato, para proporcionar SG-A de acuerdo con el procedimiento descrito a continuación.

En una reacción de transferencia, se prepara una solución de reacción (volumen total: 30 j l ) que contiene un amortiguador de fosfato de potasio 1,6 M (pH 6,25), 69 mM de SGP, 690 mM de GlcNAc-AcA y 1,0 jM de enzima (para el blanco, un volumen igual de un amortiguador en lugar de la enzima) (todas las concentraciones indicadas representan la concentración final en la solución de reacción) y se incuba a una temperatura predeterminada. Se analizaron las soluciones de reacción después de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 24 horas, 48 horas y 96 horas y la solución blanco, por LC-MS para cuantificar SGP, SG(10) y SG-A y calcular la tasa de hidrólisis y la actividad específica de acuerdo con las fórmulas descritas a continuación.

Condición B de análisis LC-MS

Aparato de MS: 6130 Quadrupole LC/MS (Agilent Technologies, Inc.)

Ionización: ESI

Modo: Positivo

HPLC: 1260 Infinity LC (Agilent Technologies, Inc.)

Columna: Inertsil ODS-33 jm 92.1 x 50 mm (GL Sciences Inc.)

Temperatura de la columna: 40 °C

Fase móvil A: H2O 0,1 % HCOOH

Fase móvil B: Acetonitrilo 0,1 % HCOOH

Gradiente (fase móvil B %): 0,8 % (0 min), 8 % (0,1 min), 8 % (5 min)

Caudal: 0,7 ml/min).

Tasa de transferencia

La tasa de transferencia se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula

Tasa de transferencia (%) = la concentración de SG-A después de la reacción (M) / la concentración de SGP en el blanco (M) x 100

Actividad específica

La actividad específica se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula

Actividad específica (jmol/min/mg) = la cantidad de SG-A producida (jm ol) / la duración de la reacción (min) / la cantidad de enzima (mg)

Cuando la actividad hidrolítica y/o la actividad de transglicosilación se determinan de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente a temperaturas que varían adecuadamente, por ejemplo, de 10 °C a 70 °C (por ejemplo, en incrementos de 2, 3, 5 o 10 °C) y el máximo de los valores de actividad calculados a partir de todas las condiciones de temperatura, se fija en el 100 %, las enzimas de la presente invención presentan, en cualquier condición de temperatura de 45 °C a 60 °C (preferentemente a 50 °C), un valor de actividad relativa del 40 % o más, preferentemente del 50 % o más, más preferentemente del 60 % o más, aún más preferentemente del 80 % o más y más preferentemente el valor máximo de actividad en el intervalo de temperaturas.

La actividad específica se determina generalmente bajo la condición de temperatura óptima para la enzima. Las enzimas de la presente invención presentan una elevada actividad específica. Por ejemplo, Endo-Rp presenta una actividad específica de 0,21 jm ol/m in/jg cuando utiliza 69 mM de SGP como sustrato a 50 °C. Esta actividad específica es una actividad excelente que es 30 veces más que la actividad específica de Endo-M a 37 °C (0,0071 jmol/m in/jg).

Las enzimas de la presente invención no se limitan a las enzimas y los mutantes descritos específicamente en los Ejemplos de la presente memoria. Las enzimas de la presente invención incluyen diferentes polipéptidos, con la condición de que satisfagan las propiedades (A) y (B). Las enzimas de la presente invención pueden ser aquellas que presentan al menos una de sus actividades hidrolíticas y de transglicosilación a un nivel determinado o superior, cuyo nivel es preferentemente del 0,5 % o más, más preferentemente del 1 % o más, aún más preferentemente del 5 % o más, incluso más preferentemente del 10 % o más, y más preferentemente del 30 % o más de la actividad de la enzima que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en las condiciones de temperatura descritas anteriormente.

Genes

La presente invención proporciona además genes que tienen secuencias de ácido nucleico que codifican las enzimas de la presente invención, como se ha descrito anteriormente.

Los genes pueden clonarse a partir de la naturaleza (por ejemplo, hongos termofílicos, preferentemente hongos pertenecientes al género Rhizomucor, y más preferentemente R. pusillus o R. miehei) como gen que codifica la presente enzima, en base a la información genética de R. pusillus o R. miehei. Los genes también pueden generarse como un gen recombinante en base a la secuencia de aminoácidos de las enzimas de acuerdo con las técnicas de ingeniería genética conocidas.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican las enzimas de la presente invención codifican un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 75 % o más de identidad y un 95 % o más de similitud con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y es una secuencia de aminoácidos diferente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Los ejemplos de las secuencias de ácido nucleico pueden incluir, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que ocurren de forma natural en los hongos como se muestra en la SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16 o 18 (incluido el codón de terminación). Los ácidos nucleicos que tienen secuencias de ácido nucleico optimizadas para la expresión en E. coli pueden generarse utilizando, por ejemplo, fragmentos de ADN GeneArt Strings (fabricados por Thermo Fisher Scientific, Inc.) en base a en las secuencias de aminoácidos de las enzimas. Las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NOS: 9, 11, 13, 15, 17 y 19 son secuencias de ácido nucleico diseñadas en base a las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (Endo-Rp), 2 (Endo-Rp2), 3 (Endo-Rp3), 4 (Endo-Rp4), 5 (Endo-Rp5), and 6 (Endo-Rm), respectivamente. Estas secuencias de ácido nucleico están optimizadas para la expresión en E. coli de la enzima con una etiqueta His (His x 6) añadida al extremo C. Al referirse a estas secuencias de ácido nucleico, puede diseñarse una secuencia de ácido nucleico que expresa eficazmente un polipéptido que tiene varios aminoácidos modificados, como por ejemplo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, en E. coli.

Ejemplos específicos de las secuencias de ácido nucleico que codifican las enzimas de la presente invención pueden incluir secuencias de ácido nucleico que tengan un 80 % o más, preferentemente un 95 % o más, más preferentemente un 95 %, incluso más preferentemente un 98 % o más de identidad con la secuencia de ácido nucleico mostrada en cualquiera de las posiciones 1 a 2088 nucleotídicas de SEQ ID NOs: 8 a 17 y las posiciones 1 a 2091 de nucleótidos de ^sE^qID NOs: 18 a 19 (preferentemente las posiciones 1 a 2088 de nucleótidos de SEQ ID NOs: 8 a 17 que codifican la Endo-Rp u homólogos de la misma) y ácidos nucleicos que codifican la Leu-Ala-Lys-Leu-Leu en una región de las posiciones 570 a 585 de cada secuencia de ácido nucleico.

Producción y purificación de la enzima

La presente invención proporciona además una construcción genética que incluye un plásmido y un vector de expresión que comprende un gen recombinante que codifica una enzima de la presente invención; una célula huésped transformada con la construcción genética; y un procedimiento de producción de la enzima de la presente invención, que comprende la recolección de la enzima de la presente invención a partir del cultivo de las células huésped. El gen que codifica la enzima de la presente invención se introduce en un plásmido/vector de expresión adecuado, en función del tipo de célula huésped (incluidas las células animales, las células vegetales, E. coli y levadura; puede seleccionarse adecuadamente cualquier célula utilizada habitualmente en la producción de proteínas u otras células) que sea transformado con el plásmido/vector de expresión. Las células transformadas se cultivan en condiciones adecuadas. La enzima de la presente invención puede recolectarse del cultivo.

Las construcciones genéticas para la transformación pueden generarse de acuerdo con técnicas conocidas, utilizando un vector o plásmido generalmente conocido en la técnica de la ingeniería genética y que se selecciona en función del tipo de célula en la que se expresan el vector o plásmido. Por ejemplo, los vectores que pueden utilizarse para la expresión en E. coli incluyen, pero no se limitan a, el vector pET, el vector pCold, el vector pFLAG y similares.

Los ejemplos de E. coli pueden incluir BL21 (DE3) y Origami (DE3).

Los ejemplos de las condiciones de cultivo de E. coli para producir la enzima de la presente invención incluyen un procedimiento en el que el cultivo bacteriano transformado se inocula en 25 ml de medio TB (50 pg/ml de Kanamicina) en un matraz de 100 ml y se cultiva con agitación a 37 °C durante la noche (160 rpm, O/N). Otro procedimiento que también puede utilizarse, pero que no es limitante, consiste en inocular 20 ml del medio de precultivo en 1 l de medio TB (50 pg/ml de Kanamicina, 0,01 % de antiespumante 204, 2 mM de MgSO4) en un matraz de 2.5 l con deflectores; cultivar con agitación a 37 °C (200 rpm, 2 horas); bajar la temperatura de la incubadora a 16 °C y cultivar durante 3 horas, y después añadir IPTG a una concentración final de 0,2 mM; y continuar el cultivo durante 24 horas. Los medios que pueden utilizarse incluyen medios comunes como el medio LB y el medio M9, además del medio TB.

La enzima de la presente invención puede recogerse utilizando adecuadamente las propiedades físicas de la enzima, en combinación con cualquier técnica de purificación común. Para la recolección conveniente, la construcción de gen se diseña previamente para expresar la enzima unida a un péptido etiqueta, como una etiqueta His o una etiqueta GST, para recoger la enzima utilizando la afinidad del péptido etiqueta. El péptido etiqueta puede eliminarse después de la purificación, pero la enzima unida al péptido etiqueta puede utilizarse directamente para reacciones que incluyan la hidrólisis, si el péptido etiqueta no tiene efecto sobre la actividad enzimática. Las enzimas de la presente invención incluyen una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos unida a dicho péptido etiqueta. Los ejemplos específicos de la enzima incluyen secuencias de aminoácidos que tienen una etiqueta His (His x 6) unida al extremo C de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 1 a 6.

Las enzimas de la presente invención tienen una excelente eficiencia de producción en E. coli, debido a las propiedades de las secuencias de aminoácidos. Las enzimas de la presente invención presentan una eficiencia de expresión de 2 mg o más por 1 l de cultivo, preferentemente 4 mg o más, más preferentemente 8 mg o más, más preferentemente 12 mg o más, y aún más preferentemente 15 mg o más por 1 l de cultivo, cuando se producen en E. coli en las condiciones de cultivo descritas anteriormente.

Ejemplos

En lo sucesivo, la presente invención se describirá específicamente con referencia a los siguientes Ejemplos. La descripción de los Ejemplos es un ejemplo de una realización de la presente invención. Estos ejemplos no pretenden limitar la presente invención.

La concentración de proteínas, tal como se describe en la presente memoria, se cuantificó utilizando un espectrofotómetro de microvolumen NanoDrop 1000 (fabricado por Thermo Fisher Scientific, Inc.) o NanoDrop 2000 (fabricado por Thermo Fisher Scientific, Inc.).

En los Ejemplos, cuando se determinó la actividad hidrolítica de la enzima endo-p-N-acetilglucosaminidasa, se detectaron SGP y SG (10) en las soluciones de reacción utilizando la condición A de análisis LC-MS mencionada anteriormente. La tasa de hidrólisis y la actividad específica se calcularon de acuerdo con las fórmulas de cálculo mencionadas anteriormente.

Ejemplo 1 Descubrimiento de la endo-p-N-acetilglucosaminidasa derivada de R. pusillus

Las cepas NBRC 9740, NBRC 9741, NBRC 9742, y NBRC 9743 de R. pusillus se inocularon en un sesgo GSYFe (5 % de glucosa, 2 % de Soytone, 1 % de extracto de levadura, 0,05 % de FeSO4-7H2O, 1,5 % de agar) y se cultivaron a 40 °C durante 5 días. Las células fúngicas se recogieron y disolvieron en 2 ml de un amortiguador de fosfato de potasio 100 mM (pH 6,25), utilizando un homogeneizador de vidrio, seguido de una esterilización por filtro para obtener una solución enzimática cruda.

A 50 pl de la solución enzimática cruda se añadieron 3 mg de SGP (hasta una concentración final de 21 mM) y se incubaron a 50°C. La solución de reacción se analizó por LC-MS y se observó la desaparición de SGP y la producción de SG (10) (Figura 2). Así, consideramos que R. pusillus NBRC 9742 tiene una endo-p-N-acetilglucosaminidasa.

Además, las reacciones hidrolíticas se realizaron a diferentes temperaturas de reacción. En cada muestra, la actividad relativa se calculó de forma que la actividad a la temperatura a la que la reacción progresaba de forma más eficiente, se estableció como el 100 %. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Se puede confirmar que la temperatura óptima de la enzima cruda derivada de R. pusillus es de 55 °C o más, aunque la Endo-M (fabricada por Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) utilizada como control comparativo, se inactivó a 45 °C.

Ejemplo 2 Clonación del gen de la endo-p-N-acetilglucosaminidasa derivado de R. pusillus

Se utilizó el procedimiento descrito a continuación para clonar un gen de endo-p-N-acetilglucosaminidasa de la cepa NBRC 9742 de R. pusillus, y extraer la secuencia relacionada en base a la secuencia genómica publicada.

(1) Clonación de genes de microorganismos

En primer lugar, se inoculó la cepa NBRC 9742 de R. pusillus en un sesgo de GSYF y se cultivó a 40 °C durante 5 días. Las células fúngicas se recolectaron juntas, con un cono metálico en un microtubo con tapa de rosca de 2 ml y se congelaron a -80 °C. Las células fúngicas se desbarataron repetidamente utilizando un Multi-beads Shocker (Yasui Kikai Corporation) a 2.000 rpm a través de 5 ciclos de tiempo de encendido de 30 segundos y tiempo de apagado de 30 segundos, mientras se enfriaba la muestra congelada a 4 °C. Se obtuvo la solución de ARNm de esta muestra utilizando una planta de NucleoSpin RNA (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) y un kit de purificación de ARNm Oligotex-dT30<Super> (Takara Bio Inc.).

El ARNm resultante se utilizó como plantilla con el cebador 1 (SEQ ID NO: 22) y 3'-Full RACE Core Set (Takara Bio Inc.) para amplificar el gen que codifica la endo-p-N-acetilglucosaminidasa y el producto amplificado se clonó en un vector pUC19. Este gen consta de 2.091 bases, incluido el codón de terminación (SEQ iD NO: 8) y codifica una proteína con un peso molecular de 78.874 que consta de 696 residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 1. Esta proteína se denominó Endo-Rp.

Los homólogos de Endo-Rp, Endo-Rp2 (la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2), Endo-Rp3 (la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3), y Endo-Rp4 (la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4) también se clonaron a partir de las cepas NBRC 9740, 9741 y 9743 de R. pusillus de forma similar. La NBRC 9740 sólo tenía la secuencia Endo-Rp2, mientras que la NBRC 9741 tenía las secuencias Endo-Rp2 y Endo-Rp3 y la NBRC 9743 tenía las secuencias Endo-Rp3 y Endo-Rp4. Cada una de las secuencias tenía un 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de Endo-Rp.

(2) Comparación con la secuencia genómica publicada

Las secuencias de Endo-Rp, Endo-Rp2, Endo-Rp3 y Endo-Rp4 se compararon con secuencias putativas publicadas en la base de datos proporcionada por The Genozymes Project. El aminoácido correspondiente a la Lys en la posición 193 de SEQ ID NO: 1 fue sustituido por Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg en SEQ ID NO: 7, lo que conduce a la diferente longitud de la proteína (Figura 4). Se extrajo ADN genómico de la cepa NBRC 9742 de R. pusillus y se amplificó por PCR la secuencia ORF de longitud completa del gen Endo-Rp y se analizó. Los resultados del análisis indicaron que la secuencia putativa de la cepa con el genoma publicado tiene diferentes posiciones predichas de los intrones. Por lo tanto, esto podría dar lugar a la diferencia en las secuencias de aminoácidos descrita anteriormente.

La secuencia de aminoácidos de Endo-Rp también se utilizó para realizar una búsqueda BLAST en la base de datos proporcionada por NCBI. Los resultados de la búsqueda mostraron que la secuencia genómica de la cepa CAU432 de Rhizomucor miehei, que es una especie relacionada con R. pusillus, tiene la secuencia correspondiente a Endo-Rp. Esta información de la secuencia se utilizó para identificar la secuencia de ácido nucleico de la que se espera codifique una endo-p-N-acetilglucosaminidasa (SEQ ID NO: 18) y su secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6. La proteína formada por esta secuencia de aminoácidos se denominó Endo-Rm. Endo-Rm era un 67 % homóloga a Endo-Rp.

Ejemplo 3 Expresión de Endo-Rp en E. coli

Una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 15) optimizada para la expresión heteróloga en E. coli fue diseñada a partir del gen de la endo-p-N-acetilglucosaminidasa derivada del hongo y obtenida en el Ejemplo 2, utilizando fragmentos GeneArt Strings DNA proporcionados por Thermo Fisher Scientific, Inc. La secuencia se utilizó para generar un gen que codifica un polipéptido con etiqueta 6 x His añadidos al extremo C de la Endo-Rp. Este se clonó en un vector pET24b(+), que después se introdujo en E. coli BL21 (DE3) para ser transformado. Se inoculó el cultivo bacteriano tras la transformación, en 25 ml de medio TB (50 pg/ml de Kanamicina) en un matraz de 100 ml y se cultivó con agitación a 37 °C durante toda la noche (160 rpm, O/N). Se inocularon 20 ml del medio de precultivo en 1 l de medio TB (50 pg/ml de Kanamicina, 0,01 % de antiespumante 204, 2 mM de MgSO4) en un matraz de deflectores de 2,5 l y se cultivó con agitación a 37 °C (200 rpm, 2 horas). Tras bajar la temperatura de la incubadora a 16 °C y cultivar durante 3 horas, se añadió IPTG a una concentración final de 0,2 mM y se realizó un cultivo adicional durante 24 horas.

Las células bacterianas cosechadas se suspendieron en 100 ml de un amortiguador de unión (50 mM de HEPES (pH 8,0), 0,5 M de NaCl, 20 mM de Imidazol, 5 % de Glicerol), se les aplicó ultrasonido y se centrifugaron. El sobrenadante de la centrifugación se purificó con una Ni Sepharose 6 Fast Flow y una columna HiLoad 16/60 Superdex 200 pg (GE Healthcare). El rendimiento (calculado a partir de la A280 y del coeficiente de extinción) fue de 16,9 mg/l de caldo.

También se realizó una expresión heteróloga similar para los homólogos de Endo-Rp y para Endo-Rm. También se llevó a cabo la expresión de homólogos de Endo-Rp, incluyendo la enzima identificada en el Ejemplo 2 y la secuencia (Endo-Rp5, SEQ ID NO: 5) que tiene un residuo de Lys sustituido por Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg de las posiciones 193 a 198 en SEQ ID NO: 7 como en otros homólogos. La secuencia del gen Endo-Rm optimizada para E. coli (SEQ ID NO: 20) fue obtenida utilizando fragmentos de GeneArt Strings DNA (Thermo Fisher Scientific, Inc.) en base a en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Se obtuvieron otros genes introduciendo una mutación en un vector para la expresión de E. coli de Endo-Rp que comprendía la secuencia base de SEQ ID NO: 15 de acuerdo con el protocolo estándar del kit de mutagénesis basal PrimeSTAR (Takara Bio Inc.) (Endo-Rp2: SEQ ID NO: 16, Endo-Rp3: SEQ ID NO: 17, Endo-Rp4: SEQ ID NO: 18, Endo-Rp5: SEQ ID NO: 19.

La expresión fue inducida en las condiciones mencionadas anteriormente, excepto que el cultivo principal estaba en 100 ml de medio TB en un matraz de 500 ml con deflectores. Las células bacterianas cosechadas se suspendieron en 6 ml de un amortiguador de unión, se les aplicó ultrasonido y se centrifugaron. El sobrenadante de la centrifugación se purificó con una columna His GraviTrap (GE Healthcare).

Tras la purificación, se observaron las bandas de las proteínas expresadas, excepto la SEQ ID NO: 7, en SDS-PAGE. El rendimiento de cada proteína fue de 2,067 mg (20,67 mg/l de cultivo) para la Endo-Rp, 2,139 mg (21,39 mg/l de cultivo) para la Endo-Rp2, 2,765 mg (27,65 mg/l de cultivo) para la Endo-Rp3, 2,301 mg (23,01 mg/l de cultivo) para la Endo-Rp4, 2,187 mg (21,87 mg/l de cultivo) para la Endo-Rp5, y 1,650 mg (16,50 mg/l de cultivo) para la Endo-Rm.

Ejemplo 4 Actividad hidrolítica de Endo-Rp sobre cadenas de azúcar de tipo complejo

La actividad hidrolítica de las enzimas obtenidas en el Ejemplo 3 se determinó mediante el procedimiento mencionado anteriormente. Para esta determinación se utilizaron Endo-M (fabricado por Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), EndoS y Endo-Om, como un control comparativo.

Se prepararon soluciones de reacción (volumen total: 100 pl) que contenían un amortiguador de fosfato de potasio 200 mM (pH 6,25), 69 mM de SGP y 0,02 |jM de enzima (todas las concentraciones indicadas representan la concentración final en las soluciones de reacción). La solución de reacción que contenía Endo-Rp o Endo-Om se incubó a 50 °C, mientras la solución de reacción que contenía Endo-M o Endo-S se incubó a 37 °C. Se tomaron muestras de las soluciones de reacción después de 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas, 18 horas y 24 horas y se analizaron por LC-MS bajo la condición A de análisis mencionada anteriormente. En la figura 5 se muestra el cambio de las tasas de reacción en función del tiempo. Las actividades específicas fueron de 0,21 jm ol/m in/jg para Endo-Rp, 0,0071 jm ol/m in/jg para Endo-M, 0,0022 jm ol/m in/jg para Endo-S y 0,060 jm ol/m in/jg para Endo-Om. La actividad específica de Endo-Rp era 30 veces mayor que la de Endo-M, 100 veces mayor que la de Endo-S y 4 veces mayor que la de Endo-Om. Esto demuestra que la Endo-Rp tiene una actividad hidrolítica muy elevada sobre el SGP, en comparación con las enzimas conocidas.

También se determinaron las actividades de los homólogos de Endo-Rp expresados y purificados en el Ejemplo 3. Se prepararon las soluciones de reacción (volumen total: 30 pl) que contenían un amortiguador de fosfato de potasio 200 mM (pH 6,25), 69 mM de SGP y 0,2 jM de enzima (todas las concentraciones indicadas representan la concentración final en las soluciones de reacción), y se incubaron a 50 °C durante 1 hora. La tasa de hidrólisis después de 1 hora fue del 87 % para el Endo-Rp, del 91 % para el Endo-Rp2, del 84 % para el Endo-Rp3, del 79 % para el Endo-Rp4, del 94 % para el Endo-Rp5 y del 23 % para el Endo-Rm. Esto demuestra que las Endo-Rp2, Endo-Rp3, Endo-Rp4 y Endo-Rp5 tienen una actividad hidrolítica algo similar a la de la Endo-Rp sobre el SGP.

Ejemplo 5 Determinación de la condición óptima de reacción para la Endo-Rp

Se determinó la temperatura de reacción y el pH óptimos para la Endo-Rp.

Para la determinación de la temperatura de reacción, se prepararon las soluciones de reacción (volumen total 100 j l) que contenían un amortiguador de fosfato de potasio 200 mM (pH 6,25), 69 mM de SGP y 0,02 jM de enzima (todas las concentraciones indicadas representan la concentración final en las soluciones de reacción) y se incubaron a una temperatura de 45, 50, 52, 55, 57, 60 y 63 °C durante 18 horas, para calcular las tasas de hidrólisis. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Para la determinación del pH de la reacción, se prepararon las soluciones de reacción (volumen: 100 j l ) a pH 4,5, 5,0, 5,5, 5,8, 6,0, 6,2, 6,5, 7,0 y 7,5 que contenían un amortiguador 200 mM de acetato de sodio o de fosfato de potasio, 69 mM de SGP y 0,02 jM de enzima (todas las concentraciones indicadas representan la concentración final en las soluciones de reacción) y se incubaron a 50 °C durante 23 horas, para calcular las tasas de hidrólisis. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Los resultados de la determinación mostraron que la temperatura óptima de reacción para el Endo-Rp es de aproximadamente 55 °C y el pH óptimo de reacción es de aproximadamente 5,8.

Ejemplo 6 Actividad de transglicosilación de Endo-Rp

Se determinó si la Endo-Rp tiene actividad de transglicosilación, de la siguiente manera.

Se prepararon las soluciones de reacción (volumen total: 30 |jl) que contenían un amortiguador de fosfato de potasio 1,6 M (pH 6,25), 69 mM de SGP, 690 mM de (GlcNAc-)Asn (fabricado por WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) y 0,1 jM de enzima (todas las concentraciones indicadas representan la concentración final en las soluciones de reacción) y se incubaron a 50 °C durante 4 horas.

Las soluciones de reacción se analizaron por LC-MS en las condiciones descritas a continuación.

Aparato de MS: 6130 Quadrupole LC/MS (Agilent Technologies, Inc.)

Ionización: ESI

Modo: Positivo

HPLC: 1260 Infinity LC (Agilent Technologies, Inc.)

Columna: Inertsil OdS-32 jm 92.1 * 50 mm (GL Sciences Inc.)

Temperatura de la columna: 40 °C

Fase móvil A: H2O 0,1 % HCOOH

Fase móvil B: Acetonitrilo 0,1 % HCOOH

Gradiente (fase móvil B %): 0.8 % (0 min), 2 % (5 min), 2 % (6 min)

Caudal: 0,7 ml/min.

Los resultados se describen en la Figura 8. Los picos de SGP, que es un donador, y de SG (10), que es un hidrolizado, sólo se detectaron en una condición sin aceptador. Los picos de SG(10) y (SG-)Asn, que es un producto de la reacción de transglicosilación, se detectaron en las condiciones con (GlcNAc-)Asn añadido como un aceptador. Estos resultados demuestran que la Endo-Rp tiene actividad de transglicosilación.

Ejemplo 7 Generación de Endo-Rp N172Q

Para obtener una enzima con una actividad hidrolítica suprimida sobre las cadenas de azúcares, mientras se conserva la actividad de transglicosilación de la Endo-Rp, se sustituyó la asparagina (N) en la posición 172, que es el centro activo, por glutamina (Q) para generar una variante N172Q. La variante N172Q se preparó sustituyendo AAC de las posiciones 514 a 516 por CAA en la secuencia base que codifica la Endo-Rp mostrada en la SEQ ID NO: 9 utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3.

La actividad de transglicosilación se evaluó como sigue. Se preparó la solución de reacción (volumen total: 30 j l) que contenía un amortiguador de fosfato de potasio 1,6 M (pH 6,25), 69 mM de SGP, 690 mM de (GlcNAc-)Asn y 1,0 jM de enzima (todas las concentraciones indicadas representan la concentración final en la solución de reacción) y se incubó a 50 °C. Se tomaron muestras de la solución de reacción después de 20 minutos, 40 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 20 horas, 24 horas y 48 horas de reacción y se analizaron por LC-MS en las condiciones descritas en el Ejemplo 6.

En la figura 9 se muestra el cambio de las tasas de reacción en función del tiempo. La Endo-Rp WT hidrolizó rápidamente un producto de la reacción de transglicosilación (SG-)Asn, mientras la variante N172Q causó menos hidrólisis, lo que demostró que la variante N172Q produce (SG-)Asn en un alto rendimiento.

Ejemplo 8 Modificación de Endo-Rp

Para obtener una enzima con mayor actividad de transglicosilación en comparación con la de la variante Endo-Rp N172Q, se intentó la modificación. Se diseñaron diferentes mutantes enumerados en la Tabla 1 en base a las estructuras de Endo-A (PDB ID: 3FHQ) y Endo-D (PBD ID: 2W92) Se determinaron la actividad hidrolítica y la actividad de transglicosilación de estos mutantes sobre el SGP.

La actividad de transglicosilación se evaluó como sigue. Se preparó la solución de reacción (volumen total: 30 j l) que contenía un amortiguador de fosfato de potasio 1,6 M (pH 6,25), 69 mM de SGP, 690 mM de GlcNAc-AcA y 1,0 jM de enzima (todas las concentraciones indicadas representan la concentración final en la solución de reacción) y se incubó a 50 °C. Se tomaron muestras de la solución de reacción después de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 24 horas, 48 horas y 96 horas de reacción y se analizaron por LC-MS en la condición B de análisis LC-MS mencionada anteriormente.

La actividad hidrolítica se evaluó como sigue. Se preparó la solución de reacción (volumen total: 20 j l) que contenía un amortiguador de fosfato de potasio 1,6 M (pH 6,25), 69 mM de SG-A y 0,2 jM de enzima (todas las concentraciones indicadas representan la concentración final en la solución de reacción) y se incubó a 50 °C. Se tomaron muestras de la solución de reacción después de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 24 horas, 48 horas y 72 horas de reacción y se analizaron por LC-MS bajo la condición B de análisis LC-MS mencionada anteriormente.

La Tabla 1 muestra las actividades específicas relativas (hidrólisis y transglicosilación) de cada variante cuando las actividades específicas para la transferencia e hidrólisis de Endo-Rp se fijaron en 100. Los resultados mostraron que las variantes con las mutaciones N172A, N172C, N172D, N172E, N172G, N172H, N172I, N172M, N172S, N172T, N172V, D176R, Y214F, S216V, L245S, N246D, T275I, F283S, L306I, F307Y, F307H, A310D, y E314Q tenían una actividad hidrolítica suprimida con una actividad de transglicosilación mantenida y una relación de actividad de transglicosilación aumentada (actividad de transglicosilación/actividad hidrolítica; la relación de transferencia/hidrólisis en la tabla). Las variantes con las mutaciones W278F y W278Y tenían también un aumento de la actividad de transglicosilación y de la actividad hidrolítica, pero disminuían la relación de la actividad de transglicosilación.

[Tabla 1-1]

(Continuación)

[Tabla 1-3]

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que tiene las siguientes propiedades (A) y (B):

(A) el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 75 % o más de identidad y un 95 % o más de similitud con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y es una secuencia de aminoácidos diferente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y

(B) el polipéptido presenta, a cualquier temperatura entre 45 y 60 °C, un 40 % o más del valor máximo de actividad hidrolítica y/o de transglicosilación sobre cadenas de azúcares complejas.

2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene las siguientes propiedades (A) y (B):

(A) el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 75 % o más de identidad y un 95 % o más de similitud con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de las posiciones 191 a 195 de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 que es Leu-Ala-Lys-Leu-Leu (LAKLL);

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la actividad hidrolítica sobre cadenas de azúcares complejas a 50 °C es del 60 % o más del valor de la actividad máxima.

4. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que, además de tener las propiedades (A) y (B), (C) el polipéptido se produce en una cantidad de 10 mg/l de cultivo o más, en expresión recombinante en E. coli.

5. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polipéptido tiene un 85 % o más de identidad de secuencia con la región de las posiciones 54 a 341 de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

6. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que al menos uno de los aminoácidos D276, V223, W225, Y247 y W248 permanece sin cambios y, preferentemente, al menos D276 permanece sin cambios.

7. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido es un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en A128T, D333G, I434L, V460A, I527V, K569T, F610S, y H626R en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

8. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 6.

9. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido tiene al menos una de las mutaciones contenidas en SEQ ID NO: 23.

10. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el polipéptido tiene una mutación en al menos un aminoácido seleccionado entre N172, D176, Y214, S216, L245, N246, t 275, L306, F307, y A310 y tiene una actividad de transglicosilación aumentada.

11. El polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 9 o 10, en el que el polipéptido tiene al menos una mutación seleccionada del grupo de:

una mutación en la que N172 está sustituido por Gln, Asp, Gly, Ala, Phe, Cys, His, Ile, Ser, Thr, Val, Met, Glu, Lys, Leu, Pro, Arg, Trp, o Tyr;

una mutación en la que D176 está sustituido por Arg;

una mutación en la que Y214 está sustituido por Phe;

una mutación en la que S216 está sustituido por Val;

una mutación en la que L245 está sustituido por Ser;

una mutación en la que N246 está sustituido por Asp;

una mutación en la que T275 está sustituido por Ile;

una mutación en la que L245 está sustituido por Ser;

una mutación en la que T275 está sustituido por Ile;

una mutación en la que F307 está sustituido por Tyr;

una mutación en la que A310 está sustituido por Asp; y

una mutación en la que E314 está sustituido por Gln.

12. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el polipéptido tiene una mutación en la que w 278 está sustituido por Phe o Tyr.

13. Un polinucleótido que codifica el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 13, que tiene una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las secuencias de nucleótidos de las posiciones 1 a 2088 de nucleótidos de SEQ ID NOS: 8 a 17 y las secuencias de nucleótidos de las posiciones 1 a 2091 de nucleótidos de SEQ ID NOS: 18 a 19.

15. Un plásmido de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 13 o 14.

16. Una célula huésped transformada con el plásmido de acuerdo con la reivindicación 15.

17. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 16, en la que la célula huésped es E. coli transformada con un plásmido que comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de las posiciones 1 a 2088 de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 o 17 o la secuencia de nucleótidos de las posiciones 1 a 2091 de nucleótidos de SEQ ID NO: 19.

18. Un procedimiento para producir el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende cultivar las células huésped de acuerdo con las reivindicaciones 16 o 17 y recoger el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, del cultivo resultante.

19. Un reactivo que comprende el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.