JP6752203B2 - 新規ＥｎｄｏＳ変異酵素 - Google Patents

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Description

本発明は、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼＳ（ＥｎｄｏＳ）の新規変異体、当該変異体をコードする遺伝子、組み換えプラスミド、該プラスミドにより形質転換された形質転換体、当該変異体を用いた抗体の糖鎖修飾方法に関する。
糖タンパク質は動植物の組織、真核微生物の細胞膜、壁などに広く存在している。近年、糖タンパク質の糖鎖が、細胞の分化、癌化、細胞間の認識などの機構に重要な役割を果たしていることが明らかになりつつあり、その機構解明のため糖鎖の構造と機能との相関について研究が進められている。培養細胞系において、糖タンパク質は、均一なアミノ酸配列からなるタンパク質として翻訳され、その後翻訳後修飾により糖鎖が付加されて、培養液中に生産される。この翻訳後修飾は、アミノ酸配列に対応して一義的に決定されるものではないため、同一の培養系に発現させた同一のタンパク質であっても付加される糖鎖の構造は多様である。
抗体は、重鎖分子中のＦｃ領域に位置する２９７番目のＡｓｎ側鎖に結合したＮ結合型糖鎖（Ｎ２９７結合糖鎖）を有する糖タンパク分子である。抗体は、基礎研究や医療分野において重要な分子であり、特に抗体医薬としての研究開発が盛んに進められており、糖鎖の様々な影響が明らかにされつつある（非特許文献１：J.N.Arnold et al., Annu.Rev.Immunol,2007,25,21050）。現在、主に使われている医療用抗体は、IgGクラスの分子であり、このような抗体は、一般的にCHO細胞やNS0細胞に代表される培養動物細胞を用いて産生され、これら動物細胞で産生される抗体のN２９７結合糖鎖はbiantennary複合型糖鎖であるが、コアフコースや末端のシアル基やガラクトシル基そしてbisecting GlcNＡcにおいて不均一なものが取得される（非特許文献２： R.Jerfferis, Biotechnol.Prog.,2005,21-11-6）。抗体のN２９７結合糖鎖が、ADCC(Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity)やCDCを含むエフェクター活性に大きく影響することが明らかになっており(非特許文献３：Nimmerjahn, Nat. Rev. Immunol. 2008, 8, 34- 47、非特許文献４： Jefferis Nat. Rev. Drug Discovery 2009, 8, 226- 234）、血中半減期にも影響を及ぼす可能性が指摘されている（非特許文献５：D.Bumbaca, AAPSJ,2012,14,3)。また、Ｎ２９７結合糖鎖の非還元末端が2,6-sialyl化された抗体がIVIGにおける主要薬効成分であることが明らかになっている（非特許文献６： Wang, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110- 122）。また、ＩｇＧやＦｃ断片を含む医療用分子において、N２９７結合糖鎖の不均一性が有効成分としての性質や品質に大きな影響を与えると考えられており、不均一な糖鎖修飾分子の微量の混入が最終生産物の特性を大きく変えてしまう可能性を否定できない。
この様な現状から、医療用の抗体や抗体Ｆｃ領域を含む糖タンパク分子の製造において、糖鎖を均一化させる技術が開発されつつある。糖タンパク質に付加する糖鎖を均一にする方法としては、酵素を使った糖転移反応が知られている（非特許文献６：Wang, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110- 122、非特許文献７： Wang, Trends Glycosci. Glycotechnol. 2011, 23, 33- 52.）。これは、in vitro環境での糖鎖の切断（加水分解反応）と別の糖鎖の縮合（糖転移反応）からなる、多段階プロセスである。特にN型糖鎖の変換を目的とする場合、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼと呼ばれる一群の酵素ファミリーが用いられる。この酵素の特性として、１）基質特異性として複合型糖鎖に対する加水分解反応を行う能力を持つこと、及び、２）特定の構造に対する糖転移反応を行う能力を持つことが要求される。エンド-β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼは様々な種から分離されており、基質とする糖鎖の種類に応じて野生型や変異体が使い分けられる。ＥｎｄｏＡ (Arthrobacter protophormiae由来酵素)（非特許文献８：Takegawa, Biochem Int. 1991 Jul;24(5):849-55)、 ＥｎｄｏＤ(Streptococcus pneumoniae由来酵素)(非特許文献９：Fan, J Biol Chem. 2012 Mar 30;287(14):11272-81)、 ＥｎｄｏＭ(Mucor hiemalis由来酵素)(非特許文献１０： Umekawa, Biochem Biophys Res Commun. 1994 Aug 30;203(1):244-52)、ＥｎｄｏＨ （非特許文献１１：Robbins, J Biol Chem. 1984 Jun 25;259(12):7577-83)、ＥｎｄｏＦ２(Flavobacterium Meningosepticum由来酵素)(非特許文献１２：; Huang, Chembiochem. 2011 April 11; 12(6): 932-941)、 ＥｎｄｏＥ(Enterococcus faecalis由来酵素)( 非特許文献１３：Collin, JBC 2004, 279-21)およびＥｎｄｏＳ(Streptococcus pygenes由来酵素)(非特許文献１４：Collin, EMBO J. 2001 Jun 15;20(12):3046-55)などが糖鎖均一化の目的に使用されているが、中でもコアフコースを有する複合型のＮ２９７結合糖鎖を基質とし、加水分解活性と糖転移活性を併せ持つことが確認できている酵素はＥｎｄｏＳのみである(非特許文献１５： Allhorn, BMC Microbiol. 2008, 8, 3.;、非特許文献１６：Goodfellow, J. Am. Chem. Soc. 2012,134, 8030- 8033)。
さらにＥｎｄｏＳにおいては、２つの触媒残基である２３３番目のＡｓｐと２３５番目のＧｌｕのうち、求核触媒残基である２３３番目のＡｓｐをＧｌｎに置換する変異を導入したＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑにおいて、加水分解活性がある程度抑制されることが知られている。この変異体は反応系中に糖鎖の還元末端をオキサゾリン化した中間体が大量に存在する条件下で、糖転移反応が選択的に進行することが知られている（非特許文献１７：Huang, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308-12318、特許文献１：WO 2013/120066 Al、非特許文献１８：B. Trastoy et al., PNAS(2014)vol111,No.18, pp6714-6719））。また、ＥｎｄｏＳに分類される酵素の配列はpyogenes種の中でも異なるストレインから異なるセロタイプに由来する配列が多数報告されている。特にセロタイプＭ49由来のＥｎｄｏＳ２（非特許文献１９：Sjogren, Biochem J. 2013 Oct 1;455(1):107-18、ＥｎｄｏＳ４９と呼ばれる場合もある)は同様の基質特性を有すると報告されている。
しかし、これら既知のＥｎｄｏＳやＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ等の変異酵素の活性は、医療用抗体の糖鎖リモデリングを工業スケールで行うのに十分なものではなく、更に効率的な糖鎖リモデリングを可能とする技術改良が求められている。
WO 2013/120066 Alパンフレット
J.N.Arnold et al., Annu.Rev.Immunol,2007,25,21050 R.Jerfferis, Biotechnol.Prog.,2005,21-11-6 Nimmerjahn, Nat. Rev. Immunol. 2008, 8, 34- 47 Jefferis Nat. Rev. Drug Discovery 2009, 8, 226- 234 D.Bumbaca, AAPSJ,2012,14,3 Wang, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110- 122 Wang, Trends Glycosci. Glycotechnol. 2011, 23, 33- 52 Takegawa, Biochem Int. 1991 Jul;24(5):849-55 Fan, J Biol Chem. 2012 Mar 30;287(14):11272-81 Umekawa, Biochem Biophys Res Commun. 1994 Aug 30;203(1):244-52 Robbins, J Biol Chem. 1984 Jun 25;259(12):7577-83 Huang, Chembiochem. 2011 April 11; 12(6): 932-941 Collin, JBC 2004, 279-21 Collin, EMBO J. 2001 Jun 15;20(12):3046-55 Allhorn, BMC Microbiol. 2008, 8, 3.; Goodfellow, J. Am. Chem. Soc. 2012,134, 8030- 8033 Huang, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308-12318 B. Trastoy et al., PNAS(2014)vol111,No.18, pp6714-6719） Sjogren, Biochem J. 2013 Oct 1;455(1):107-18
本発明は、ＩｇＧのＦｃ領域の糖鎖に対する特異性を有したエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、ＥｎｄｏＳの加水分解活性が抑制された変異体として知られているＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑと比較して、その加水分解活性がより低減され、且つ、一定の糖転移活性を保持する新規な変異酵素を提供することを目的とする。
公知のＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑを用いた研究から、この変異体が一定の加水分解活性を保持するため、糖転移反応において、反応開始からの時間経過と共に、糖転移率が低下することを見出した。このため、ＥｎｄｏＳや既存の変異体を用いた糖鎖リモデリングにより、均一な糖鎖を有する抗体を高純度で取得することは困難であり、特に大容量での反応では、精製工程に進むまでに要する時間が長くなるため、最終的に酵素と分離した段階では、糖鎖が切断された抗体が必然的に混入してしまう。
さらに、糖鎖ドナーとして用いられる化学合成される糖鎖オキサゾリン体は高価であることが多く、大量に消費することは、生産コストの増大につながる。そのため、均一な糖鎖を有する抗体を高純度で製造するには、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑと比較して、加水分解活性がより抑えられ、かつ 一定以上の糖鎖転移活性を有する酵素が必要である。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑのアミノ酸配列情報と立体構造を参考に、多数の変異体を設計・作製し、Ｄ２３３Ｑに加えて特定のアミノ酸に追加変異を有する新規な変異酵素が目的とする活性を有することを見出し、さらに研究を進めることにより、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の発明を提供する。
（１） 配列番号２のアミノ酸番号３７〜９９５のアミノ酸配列において、１２２番目（Ｈ１２２）、１８４番目（Ｐ１８４）、２７９番目（Ｄ２７９）、２８２番目（Ｙ２８２）、３０３番目（Ｑ３０３）、３４８番目（Ｙ３４８）、３５０番目（Ｅ３５０）、４０２番目（Ｙ４０２）、４０５番目（Ｄ４０５）、及び、４０６番目（Ｒ４０６）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む箇所に追加変異を有し、且つ、ＩｇＧの２９７番目のＡｓｎに結合するＮ結合型糖鎖（Ｎ２９７結合糖鎖）に対する活性として、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑの活性と比較して低減された加水分解活性を示すことを特徴とする、ＥｎｄｏＳ変異酵素。
（２） 追加変異が、Ｈ１２２、Ｐ１８４、Ｄ２７９、Ｙ２８２、Ｑ３０３、Ｙ３４８、Ｅ３５０、Ｙ４０２、Ｄ４０５、及び、Ｒ４０６からなる群から選択される１〜４アミノ酸からなる部位であることを特徴とする、（１）のＥｎｄｏＳ変異酵素。
（３） 追加変異の箇所が、Ｑ３０３、Ｅ３５０及びＤ４０５からなる群から選択される１アミノ酸における変異を含むことを特徴とする、（１）のＥｎｄｏＳ変異酵素。
（４） 追加変異が以下の群から選択される少なくとも一つである、（１）〜（３）のＥｎｄｏＳ変異酵素、
Ｈ１２２の変異後のアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ又はＰｈｅ；
Ｐ１８４の変異後のアミノ酸がＧｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｎ又はＡｓｎ；
Ｄ２７９の変異後のアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｌａ又はＧｌｎ；
Ｙ２８２の変異後のアミノ酸は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓ；
Ｑ３０３の変異後アミノ酸は、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ又はＬｅｕ；
Ｙ３４８の変異後アミノ酸は、Ｈｉｓ又はＴｒｐ；
Ｅ３５０の変異後アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ又はＡｌａ；
Ｙ４０２の変異後のアミノ酸は、Ｐｈｅ又はＴｒｐ；
Ｄ４０５の変異後アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ又はＡｌａ；、及び、
Ｒ４０６の変異後アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ又はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ又はＡｓｎ。
（５） 追加変異が以下の群から選択される少なくとも一つである、（４）のＥｎｄｏＳ変異酵素、
Ｈ１２２がＡｌａ（Ｈ１２２Ａ）又はＰｈｅ（Ｈ１２２Ｆ）；
Ｐ１８４がＧｌｎ（Ｐ１８４Ｑ）；
Ｄ２７９がＳｅｒ（Ｄ２７９Ｓ）又はＧｌｎ（Ｄ２７９Ｑ）；
Ｙ２８２がＡｒｇ（Ｙ２８２Ｒ）；
Ｑ３０３がＬｅｕ（Ｑ３０３Ｌ）；
Ｙ３４８がＨｉｓ（Ｙ３４８Ｈ）；
Ｅ３５０がＡｌａ（Ｅ３５０Ａ）、Ａｓｎ（Ｅ３５０Ｎ）、Ａｓｐ（Ｅ３５０Ｄ）又はＧｌｎ（Ｅ３５０Ｑ）；
Ｙ４０２がＰｈｅ（Ｙ４０２Ｆ）またはＴｒｐ（Ｙ４０２Ｗ）；
Ｄ４０５がＡｌａ（Ｄ４０５Ａ）；、及び、
Ｒ４０６がＧｌｎ（Ｒ４０６Ｑ）。
（６） 追加変異として、Ｑ３０３L、Ｅ３５０Ａ、Ｅ３５０Ｎ、Ｅ３５０Ｄ、Ｅ３５０Ｑ及びＤ４０５Ａからなる群から選択される少なくとも一つの変異を含むことを特徴とする、（５）のＥｎｄｏＳ変異酵素。
（７） 追加変異が、Ｑ３０３Ｌ、Ｅ３５０Ａ、Ｅ３５０Ｎ、Ｅ３５０Ｄ、Ｅ３５０Ｑ、Ｄ４０５Ａ、
Ｈ１２２Ａ／Ｑ３０３Ｌ、Ｈ１２２Ｆ/Ｑ３０３Ｌ、Ｐ１８４Ｑ／Ｑ３０３Ｌ、Ｄ２７９Ｑ／Ｑ３０３Ｌ、Ｄ２７９Ｓ／Ｑ３０３Ｌ、Ｙ２８２Ｒ／Ｑ３０３Ｌ、Ｑ３０３Ｌ／Ｙ３４８Ｈ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ａ、Ｑ３０３Ｌ/Ｅ３５０Ｎ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｄ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｑ、Ｑ３０３Ｌ／Ｙ４０２Ｆ、Ｑ３０３Ｌ／Ｙ４０２Ｗ、Ｑ３０３Ｌ／Ｄ４０５Ａ、Ｑ３０３Ｌ／Ｒ４０６Ｑ、
Ｈ１２２Ａ／Ｅ３５０Ａ、Ｈ１２２Ｆ/Ｅ３５０Ａ、Ｐ１８４Ｑ／Ｅ３５０Ａ、Ｄ２７９Ｑ／Ｅ３５０Ａ、Ｄ２７９Ｓ／Ｅ３５０Ａ、Ｙ２８２Ｒ／Ｅ３５０Ａ、Ｙ３４８Ｈ／Ｅ３５０Ａ、Ｅ３５０Ａ／Ｙ４０２Ｆ、Ｅ３５０Ａ／Ｙ４０２Ｗ、Ｅ３５０Ａ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ａ／Ｒ４０６Ｑ、
Ｈ１２２Ａ／Ｅ３５０Ｎ、Ｈ１２２Ｆ/Ｅ３５０Ｎ、Ｐ１８４Ｑ／Ｅ３５０Ｎ、Ｄ２７９Ｑ／Ｅ３５０Ｎ、Ｄ２７９Ｓ／Ｅ３５０Ｎ、Ｙ２８２Ｒ／Ｅ３５０Ｎ、Ｙ３４８Ｈ／Ｅ３５０Ｎ、Ｅ３５０Ｎ／Ｙ４０２Ｆ、Ｅ３５０Ｎ／Ｙ４０２Ｗ、Ｅ３５０Ｎ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ｎ／Ｒ４０６Ｑ、
Ｈ１２２Ａ／Ｅ３５０Ｄ、Ｈ１２２Ｆ/Ｅ３５０Ｄ、Ｐ１８４Ｑ／Ｅ３５０Ｄ、Ｄ２７９Ｑ／Ｅ３５０Ｄ、Ｄ２７９Ｓ／Ｅ３５０Ｄ、Ｙ２８２Ｒ／Ｅ３５０Ｄ、Ｙ３４８Ｈ/Ｅ３５０Ｄ、Ｅ３５０Ｄ／Ｙ４０２Ｆ、Ｅ３５０Ｄ／Ｙ４０２Ｗ、Ｅ３５０Ｄ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ｄ／Ｒ４０６Ｑ、
Ｈ１２２Ａ／Ｅ３５０Ｑ、Ｈ１２２Ｆ/Ｅ３５０Ｑ、Ｐ１８４Ｑ／Ｅ３５０Ｑ、Ｄ２７９Ｑ／Ｅ３５０Ｑ、Ｄ２７９Ｓ／Ｅ３５０Ｑ、Ｙ２８２Ｒ／Ｅ３５０Ｑ、Ｅ３５０Ｑ／Ｙ３４８Ｈ、Ｅ３５０Ｑ／Ｙ４０２Ｆ、Ｅ３５０Ｑ／Ｙ４０２Ｗ、Ｅ３５０Ｑ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ｑ／Ｒ４０６Ｑ、
Ｈ１２２Ａ／Ｄ４０５Ａ、Ｈ１２２Ｆ/Ｄ４０５Ａ、Ｐ１８４Ｑ／Ｄ４０５Ａ、Ｄ２７９Ｑ／Ｄ４０５Ａ、Ｄ２７９Ｓ／Ｄ４０５Ａ、Ｙ２８２Ｒ／Ｄ４０５Ａ、Ｙ３４８Ｈ／Ｄ４０５Ａ、又は、Ｄ４０５Ａ／Ｒ４０６Ｑ、であることを特徴とする、（６）のＥｎｄｏＳ変異酵素。
（８） 追加変異が、Ｑ３０３Ｌ、Ｅ３５０Ａ、Ｅ３５０Ｎ、Ｅ３５０Ｄ、Ｅ３５０Ｑ、Ｄ４０５Ａ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ａ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｎ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｄ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｑ、Ｑ３０３Ｌ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ａ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ｎ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ｄ／Ｄ４０５Ａ、又は、Ｅ３５０Ｑ／Ｄ４０５Ａである、（７）のＥｎｄｏＳ変異酵素。
（９） 追加変異が、Ｈ１２２Ａ、Ｈ１２２Ｆ、Ｐ１８４Ｑ、Ｄ２７９Ｑ、Ｄ２７９Ｓ、Ｙ２８２Ｒ、Ｙ３４８Ｈ、Ｙ４０２Ｆ、Ｙ４０２Ｗ、又はＲ４０６Ｑである、（４）のＥｎｄｏＳ変異酵素。
（１０） Ｎ２９７結合糖鎖に対する活性が、ｐＨ７．４の反応液中での加水分解反応において、２４時間後まで、５０％以下の加水分解率を維持することを特徴とする、（１）のＥｎｄｏＳ変異酵素。
（１１） Ｎ２９７結合糖鎖に対する活性として、さらに、ｐＨ７．４の反応液中での、５等量の糖鎖ドナーを用いた糖転移反応において４８時間後の糖転移率が約６０％以上である活性を示すことを特徴とする、（１）のＥｎｄｏＳ変異酵素。
（１２） （１）〜（１１）のいずれかのＥｎｄｏＳ変異酵素をコードするポリヌクレオチド。
（１３） （１２）のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含むベクター。
（１４） （１３）のベクターで形質転換された宿主細胞。
（１５） （１）〜（１１）のいずれかのＥｎｄｏＳ変異酵素の存在下で、Ｎ２９７結合糖鎖として、フコース付加していても良いコアＧｌｃＮＡｃを有するＩｇＧのＦｃ領域を含む分子とオキサゾリン化されたＧｌｃＮＡｃを含む構造を有する糖鎖ドナーを反応させ、当該Ｆｃ領域含有分子のＮ２９７結合糖鎖の当該コアＧｌｃＮＡｃに、当該糖鎖ドナーの有する糖鎖が転移した構造を有するＦｃ領域含有分子を産生させることを特徴とする、糖鎖リモデリングされたＦｃ領域含有分子の製造方法。
（１６） Ｆｃ領域含有分子が、ＩｇＧモノクローナル抗体である、（１５）の製造方法。
本発明の新規なＥｎｄｏＳ変異酵素は、加水分解活性が低減された変異体として知られるＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑと比較して、加水分解活性がさらに低減され、且つ、一定以上の糖転移活性を保持するため、糖鎖リモデリングにより、均一な糖鎖を有する抗体を、より効率よく、より高純度で取得することが可能である。また、糖鎖リモデリングにおいて用いる糖鎖ドナーの量も低減できるため、糖鎖リモデリングされた抗体の製造コストの低減につながる。
図1は、糖鎖リモデリングにおいて糖鎖ドナーとして使用することができるSG-Oxaの化学構造式（左）及びその糖鎖を記号化した表示（右）を示す図である。 図２は、ＥｎｄｏＳ又はＥｎｄｏＳ変異酵素を用いた、抗体のＮ２９７結合糖鎖に対する加水分解反応の模式図である。 図３は、ＥｎｄｏＳ又はＥｎｄｏＳ変異酵素を用いた糖転移反応を模式的に示した図である。 図４は、各種ＥｎｄｏＳ変異酵素（ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｑ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ／Ｄ４０５Ａ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｑ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｄ４０５Ａ及びＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｙ４０２Ｆ）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アミノ酸番号はシグナル配列（１〜３６）を含むコード領域全長を基準に付番されている。図４−１には、各変異酵素のアミノ酸番号３７〜１７６のアラインメントを示す。 図４−２は、図４−１の続きであり、各変異酵素のアミノ酸番号１７７〜３１６のアラインメントを示す。 図４−３は、図４−２の続きであり、各変異酵素のアミノ酸番号３１７〜４５６のアラインメントを示す。 図４−４は、図４−３の続きであり、各変異酵素のアミノ酸番号４６７〜５９６のアラインメントを示す。 図４−５は、図４−４の続きであり、各変異酵素のアミノ酸番号５９７〜７３６のアラインメントを示す。 図４−６は、図４−５の続きであり、各変異酵素のアミノ酸番号７３７〜８７６のアラインメントを示す。 図４−７は、図４−６の続きであり、各変異酵素のアミノ酸番号８７７〜９９５のアラインメントを示す。
以下に、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、分子中に含まれるアミノ酸の表記法は、本分野の慣例に従い、変異箇所を示す場合は野生型のアミノ酸（又は核酸）の一文字表記とその番号（例えば、２３３番目のＡｓｐであれば「Ｄ２３３」）により表す。また、変異については、野生型のアミノ酸（又は核酸）の一文字表記、その番号及び変異後のアミノ酸（又は核酸）の一文字表記（例えば、２３３番目のＡｓｐがＧｌｎに置換された変異は「Ｄ２３３Ｑ」）により表す。また、変異を有する特定の変異体は、分子名と変異（例えば、ＥｎｄｏＳの２３３番目ＡｓｐがＧｌｎに置換された変異体は、「ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ」）により表し、複数の変異を有する場合は、変異の間を「／」で区切る形（例えば、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑにおいて、３０３番目のＧｌｎがＬｅｕに置換された追加変異を有する変異体は、「ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ」）と表す。
本発明において、「Ｎ２９７結合糖鎖」とは、ＩｇＧ重鎖の２９７番目Ａｓｎの側鎖に結合する糖鎖を意味する。ＩｇＧを断片化した場合、当該Ａｓｎを含むペプチド断片において、対応するＡｓｎに結合する糖鎖であっても、Ｎ２９７結合糖鎖に含まれる。通常、動物等で産生されたＩｇＧにおけるＮ２９７結合糖鎖は、下記式の構造からなる基本構造を有しており、その非還元末端には、さらにＧａｌやシアル酸が付加していてもよい。
Figure 0006752203
Figure 0006752203
細胞が産生するＩｇＧのＮ２９７結合糖鎖の多くは、この基本構造において、その還元末端のＧｌｃＮＡｃ（コアＧｌｃＮＡｃ）、非還元末端、分岐糖などにおいてさらに糖鎖が結合したものを含む、糖鎖構造の多様性を有している。コアＧｌｃＮＡｃの６位にはフコースがα1,6結合したコアフコースを有する構造（(Fucα1,6)ＧｌｃＮＡｃ）に修飾されていてもよい。分岐糖であるＭａｎにおいては、その5位にさらにＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖が結合した3分岐型の糖鎖を形成している場合もある。非還元末端のＧｌｃＮＡｃにおいては、Ｇａｌやシアル酸を含む糖鎖がさらに結合している場合もある。
本発明において、「糖鎖ドナー」とは、糖鎖の還元末端に、オキサゾリン化されたＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖含有分子であり、多様な糖鎖構造の分子を用いることができる。
創薬を目的とした糖鎖リモデリングに用いる場合、ヒトへ適用した際に問題の少ないヒト型糖鎖、又は、ヒト適合型糖鎖を有する糖鎖ドナーを採用することが好ましい。このような糖鎖は、ヒトの体内で抗原性を示さないことが知られている糖鎖であり、Ｎ結合型糖鎖では，高マンノース型、混成（ハイブリッド）型、複合（コンプレックス）型などが知られている。これら３つには共通の基本構造がある。高マンノース型は、還元末端に近い位置にあるマンノース（βマンノース）から枝分かれした２つの分岐鎖(1-3鎖、1-6鎖)に、複数のマンノースが連続したマンノースリッチ構造を有する糖鎖である。混成型とは、還元末端に近い位置にあるマンノース（βマンノース）から枝分かれした２つの分岐鎖(1-3鎖、1-6鎖)のうち、一方にGlcNAcを有する構造となったものである。複合型とは、還元末端に近い位置にあるマンノース（βマンノース）から枝分かれした２つの分岐鎖(1-3鎖、1-6鎖)にGlcNAcを有する構造となっており、ガラクトースの有無、シアルの有無、さらにこれらの結合異性や位置異性を含む多彩な構造を有するものである。（表１参照）。代表的な糖鎖ドナーは実施例２で製造されたSG-Oxa（図１）である。
Figure 0006752203
本発明において、「アクセプター分子」とは、非還元末端にＧｌｃＮＡｃを有する糖構造を含む分子であり、ＥｎｄｏＳ又はその変異酵素存在下で、糖鎖ドナー分子と反応させることにより、当該非還元末端のＧｌｃＮＡｃの4位に糖鎖ドナー分子のオキサゾリン環が反応し、キトビオース構造を形成することができる。アクセプター分子として典型的なものは、モノクローナル抗体に由来する、コアＦｕｃが結合していてもよいコアＧｌｃＮＡｃのみからなるＮ２９７結合糖鎖を有するＩｇＧ又はそのＦｃ断片である。コアＧｌｃＮＡｃには、その由来となる抗体又はその産生方法に応じて、コアＦｕｃが結合していてもよく、結合していなくても良い。アクセプター分子の由来としては様々なモノクローナル抗体又はＦｃ領域含有分子（Ｆｃ、重鎖から可変領域を欠失させた定常領域のみからなるＣＨと軽鎖の定常領域のみからなるＣＬと組み合わせたＣＬＣＨなど）を利用することができるが、好ましくは(Fucα1,6)-GlcNＡc-ＩｇＧ、(Fucα1,6)-GlcNＡc-Ｆｃ、(Fucα1,6)-GlcNＡc-ＣＬＣＨなどが挙げられ、代表例としては、実施例３で製造された(Fucα1,6)-GlcNＡc-Trastuzumabを挙げることができる。
本発明において、「ＥｎｄｏＳ」とは、Streptococcus pyogenesに由来するエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）の一種であり、配列番号１のアミノ酸番号３７〜９９５（１〜３６番目のアミノ酸はシグナル配列を示す）のアミノ酸配列において、２３３番目のアミノ酸がＡｓｐであるアミノ酸配列からなる酵素（EC 3.2.1.96、ＧＨ１８）である。ＥｎｄｏＳは、ＩｇＧに由来するＦｃ部位のＮ２９７結合糖鎖を特異的に認識し、加水分解活性と糖転移活性を併せ持つ。ＥｎｄｏＳの加水分解活性は上記の基本構造を有するＮ２９７結合糖鎖のコアキトビオースに含まれるβ1,4グリコシド結合を特異的に加水分解する活性（本明細書において、特に言及が無い限り、「加水分解活性」とは、この活性を意味する。反応模式図を図２に示す。）である。ＥｎｄｏＳの糖転移活性は、Ｎ２９７にコアＧｌｃＮＡｃ（コアフコースが付加していても、付加していなくても良い）のみを有するＦｃ部位を含むアクセプター分子に、還元末端にオキサゾリン化されたＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖ドナーに由来する糖鎖の還元末端をグリコシド結合させる活性（以下、「糖転移活性」という。反応模式図を図３に示す。）である。
ＥｎｄｏＳの構造は、endoglycosidase enzymatic domain（触媒ドメイン：配列番号１のアミノ酸番号９８〜４４５）、Leucine-rich repeat domain（配列番号１のアミノ酸番号４４６〜６３１）、hybrid Ｉｇ domain（配列番号１のアミノ酸番号６３２〜７６４）、Carbohydrate-binding module（ＣＢＭ：配列番号１のアミノ酸番号７６５〜９２３）、及び、three helix-bundle domain（配列番号１のアミノ酸番号９２４〜９９５）の5つのドメイン構造を有することが報告されており（B. Trastoy et al., PNAS(2014)vol111,No.18, pp6714-6719）、そのうち抗体との相互作用に重要な部位は、触媒ドメインとＣＢＭの２つと考えられている。
ＥｎｄｏＳは、Group A Streptococcus（ＧＡＳ）においてよく保存された酵素であるが、ＧＡＳのセロタイプＭ４９に属するＮＺ１３１から見出されたＥｎｄｏＳ２（ＥｎｄｏＳ４９と呼ばれることもある。Sjogren, Biochem J. 2013 Oct 1;455(1):107-18、US 2014/0302519 A1））は、配列同一性は３７％であるものの、触媒ドメインを構成するアミノ酸のうち重要なものがよく保存されており、ＥｎｄｏＳと類似の基質特異性を示す。本明細書において、このようなＥｎｄｏＳの活性領域のアミノ酸相同性/同一性を保持する酵素を、「ＥｎｄｏＳ類縁酵素」という。ＥｎｄｏＳの重要な変異部位である、Ｈ１２２、Ｄ２３３、Ｄ２７９、Ｑ３０３、Ｅ３５０、Ｙ４０２、Ｄ４０５、及び、Ｒ４０６は、それぞれＥｎｄｏＳ２においては、Ｈ７５、Ｄ１８４、Ｄ２２６、Ｑ２５０、Ｅ２８９、Ｙ３３９、Ｄ３４２、及び、Ｒ３４３に対応している。ＥｎｄｏＳ２のような類縁酵素において、対応するアミノ酸が変異した変異酵素も本発明の変異酵素に含まれるものとする。
本発明において、「ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ」とは、野生型ＥｎｄｏＳの２３３番目のＡｓｐがＧｌｎに置換された配列（配列番号１のアミノ酸番号３７〜９９５のアミノ酸配列）からなる酵素であり、ＥｎｄｏＳの有する加水分解活性が一定程度抑制され、且つ、野生型と同程度の糖転移活性を保持する変異酵素である。
＜本発明の変異酵素＞
本発明は、配列番号２のアミノ酸番号３７〜９９５のアミノ酸配列において糖転移活性に必要な領域を含有するＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑの変異酵素であって、Ｄ２３３Ｑに加えてさらに、特定の必須追加変異箇所群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む箇所に追加変異を有し、且つ、ＩｇＧのＮ２９７結合糖鎖に対する活性として、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑと比較して加水分解活性が低減されていることを特徴とする、ＥｎｄｏＳの変異酵素を提供する。
本発明において、「追加変異」とは、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑのアミノ酸配列において、Ｄ２３３以外のアミノ酸で生じる、追加のアミノ酸変異を意味する。本発明において、「必須追加変異箇所群」とは、本発明の変異酵素において、必ず追加変異される箇所の候補群であり、配列番号２のアミノ酸配列においてＸａａとして示される箇所、すなわち、Ｈ１２２、Ｐ１８４、Ｄ２７９、Ｙ２８２、Ｑ３０３、Ｙ３４８、Ｅ３５０、Ｙ４０２、Ｄ４０５、及び、Ｒ４０６からなる群であるが、好ましくは、Ｑ３０３、Ｅ３５０、及び、Ｄ４０５からなる群である。
本発明の変異酵素は、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑよりも低減された加水分解活性、及び、一定の糖転移活性を併せ持つ（以下、両方の活性を併せ持つことを「本酵素活性」を有する、という）ことを特徴とする。変異酵素が、本酵素活性を有するか否かは、後述の実施例４の方法により、その加水分解活性及び糖転移活性を評価することができる。
本発明の変異酵素が有する本酵素活性のうち、加水分解活性は、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑの加水分解活性と比較して抑制される、すなわち、実施例4に記載のｐＨ７．４の条件における加水分解率が、反応開始から１〜４８時間後までのいずれかの時間点において、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑの加水分解率よりも低い値を示すことであるが、好ましくは加水分解反応開始後２４時間後の加水分解率が５０％以下、又は、４８時間後の加水分解率が６０％以下であり、より好ましくは加水分解反応開始後２４時間までの加水分解率が４０％以下を維持するものであり、さらに好ましくは同時間まで３０％以下を維持するものであり、さらにより好ましくは２０％以下を維持するものであり、最も好ましくは、全ての時間点において加水分化率が０％を示し、加水分解活性を完全に消失したものである。
本発明の変異酵素が有する本酵素活性のうち、糖転移活性は、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑの糖転移活性と同程度、すなわち、実施例4に記載のｐＨ７．４、糖鎖ドナーがアクセプター分子の５等量の条件における糖転移率が、反応開始から１〜４８時間後までのいずれかの時間点以降において、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑの糖転移率と同等かそれ以上（例えば、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑの値の７０％以上）の糖転移率を示すことであるが、好ましくは反応開始後４８時間までに糖転移率が５０％を超えるものであり、より好ましくは反応開始後４８時間までに糖転移率が６０％を超えるものであり、さらに好ましくは反応開始後４８時間までに糖転移率が８０％を超えるものであり、さらにより好ましくは反応開始後４８時間までに糖転移率が９０％を超えるものである。
本発明の変異酵素は、配列番号２のアミノ酸番号３７〜９９５のアミノ酸配列において、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑの糖転移活性に重要な領域を保持していれば、その全長配列である必要はない。ＥｎｄｏＳのドメイン解析から、触媒ドメイン（配列番号２のアミノ酸番号９８〜４４５）、及び、ＣＲＭ（配列番号２のアミノ酸番号７６５〜９２３）が重要であることが知られており、これらを含む限り、本発明の変異酵素として使用できる。また、ＥｎｄｏＳ２のような類縁酵素であっても、これらのドメイン領域に対応する領域を含み、対応する箇所のアミノ酸（ＥｎｄｏＳのＨ１２２、Ｄ２３３、Ｄ２７９、Ｑ３０３、Ｅ３５０、Ｙ４０２、Ｄ４０５、及び、Ｒ４０６は、それぞれＥｎｄｏＳ２においては、Ｈ７５、Ｄ１８４、Ｄ２２６、Ｑ２５０、Ｅ２８９、Ｙ３３９、Ｄ３４２、及び、Ｒ３４３に対応している）に適宜変異を有し、且つ、本酵素活性を有する限り本発明に含まれるものとする。好ましくは、配列番号２のアミノ酸番号９８〜９２３を含むポリペプチドであり、より好ましくは配列番号２のアミノ酸番号９８〜９９５を含むポリペプチドであり、さらに好ましくは配列番号２のアミノ酸番号３７〜９９５を含むポリペプチドである。
本発明の変異酵素のアミノ酸配列において、本酵素活性に影響しない範囲で、後述の必須変異箇所以外の箇所で、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は、付加していてもよい。このようなアミノ酸改変の箇所としては、本酵素活性に影響しない限り、全部位を選択しても良いが、好ましくは、触媒ドメイン（配列番号２のアミノ酸番号９８〜４４５）、及び、ＣＲＭ（配列番号２のアミノ酸番号７６５〜９２３）以外の箇所であり、より好ましくは、配列番号２のアミノ酸番号３７〜９７又はアミノ酸番号９２４〜９９５の領域に含まれる部位である。本発明において、数個とは、２０個以下であり、好ましくは１０個以下であり、さらに好ましくは５個以下であり、最も好ましくは４個、３個、２個又は一個である。
本発明の変異酵素において、Ｄ２３３Ｑ以外の追加変異箇所は、必須追加変異箇所群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む箇所である。この追加変異箇所の個数は、最終的な変異体が本変異酵素が本酵素活性を有する限り特に限定されないが、好ましくは１０箇所以下であり、より好ましくは５箇所以下であり、さらに好ましくは、４箇所、３箇所、２箇所又は一箇所である。複数個所に追加変異を有する場合、必須追加変異箇所群の少なくとも一つにおいて変異があれば、その他の変異箇所は、最終的な変異酵素が本酵素活性を有する限り特に限定されないが、全ての追加変異が必須追加変異箇所群であることが好ましい。必須追加変異箇所以外に追加変異を有する場合、必須追加変異箇所以外の追加変異が含まれる領域としては、酵素活性に関連する触媒ドメイン（配列番号２のアミノ酸番号９８〜４４５）以外アミノ酸であることが好ましく、より好ましくは配列番号２のアミノ酸番号３７〜９７、４４６〜７６４、及び９２４〜９９５の領域であり、さらに好ましくは、配列番号２のアミノ酸番号３７〜９７、及び９２４〜９９５の領域である。
本発明において、追加変異による置換後のアミノ酸は、最終的に得られる変異酵素が本酵素活性を有する限り特に限定されるものではなく、天然に存在するアミノ酸、人工的に合成されたアミノ酸、それらの修飾アミノ酸等、様々なアミノ酸を採用することができるが、好ましくは天然に存在するアミノ酸であり、より好ましくは天然に存在するＬ−アミノ酸であり、さらに好ましくは必須アミノ酸である。以下に、必須追加変異箇所における、好ましい変異後アミノ酸を示す。
Ｈ１２２の変異後のアミノ酸は、当該部位と周囲のアミノ酸との相互作用が解消されるような、小さな側鎖構造を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｌａ）、側鎖に負電価を有するアミノ酸（ＧｌｕまたはＡｓｐ）または、側鎖に反応性の高い官能基を持たないアミノ酸（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ）が好ましく、より好ましくは、Ａｌａ又はＰｈｅである。
Ｐ１８４の変異後のアミノ酸は、小さな側鎖構造を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｌａ）又は、側鎖にアミド基を有するアミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ）が好ましく、より好ましくはＧｌｎである。
Ｄ２７９の変異後のアミノ酸は、小さな側鎖構造を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｌａ）又はＧｌｎが好ましく、より好ましくはＳｅｒ又はＧｌｎである。
Ｙ２８２の変異後のアミノ酸は、側鎖が塩基性のアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）が好ましく、より好ましくはＡｒｇである。
Ｑ３０３の変異後アミノ酸は、疎水性のアミノ酸（Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ）が好ましく、より好ましくはＬｅｕである。
Ｙ３４８の変異後アミノ酸は、側鎖に環構造を有するアミノ酸（Ｈｉｓ，Ｔｒｐ）が好ましく、より好ましくはＨｉｓである。
Ｅ３５０の変異後アミノ酸は、水素結合をし得る大きな側鎖を有するアミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ）又は、当該部位と周囲のアミノ酸との相互作用が解消されるような、小さな側鎖構造を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｌａ）が好ましく、より好ましくは、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ又はＧｌｎである。
Ｙ４０２の変異後のアミノ酸は、側鎖に芳香環を持つ大きなアミノ酸、Ｐｈｅ又はＴｒｐが好ましい。
Ｄ４０５の変異後アミノ酸は、当該部位と周囲のアミノ酸との相互作用が解消されるような、小さな側鎖構造を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｌａ）が好ましく、より好ましくはＡｌａである。
Ｒ４０６の変異後アミノ酸は、当該部位と周囲のアミノ酸との相互作用が解消されるような、小さな側鎖構造を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｌａ）又は側鎖に負電荷を有するアミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、又は、側鎖にアミド基を有するアミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ）が好ましく、より好ましくは、Ａｌａ又はＧｌｎである。
上記のような必須追加変異箇所における変異は、単独であっても、他の必須追加変異箇所の変異及び/又はその他箇所の変異と組み合わされてもよい。必須追加変異箇所における変異の組み合わせとしては、どのような組み合わせでも良いが、好ましくは、少なくともＱ３０３、Ｅ３５０又はＤ４０５における変異を含む組み合わせであり、より好ましくは、少なくともＱ３０３Ｌ、Ｅ３５０Ａ，Ｅ３５０Ｎ、Ｅ３５０Ｑ又はＤ４０５Ａを含む組み合わせである。
Ｑ３０３Ｌを含む追加変異の組み合わせとしては、例えば、Ｈ１２２Ａ／Ｑ３０３Ｌ、Ｈ１２２Ｆ/Ｑ３０３Ｌ、Ｐ１８４Ｑ／Ｑ３０３Ｌ、Ｄ２７９Ｑ／Ｑ３０３Ｌ、Ｄ２７９Ｓ／Ｑ３０３Ｌ、Ｙ２８２Ｒ／Ｑ３０３Ｌ、Ｑ３０３Ｌ／Ｙ３４８Ｈ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ａ、Ｑ３０３Ｌ/Ｅ３５０Ｎ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｄ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｑ、Ｑ３０３Ｌ／Ｙ４０２Ｆ、Ｑ３０３Ｌ／Ｙ４０２Ｗ、Ｑ３０３Ｌ／Ｄ４０５Ａ、Ｑ３０３Ｌ／Ｒ４０６Ｑ、等を挙げることができる。
Ｅ３５０Ａを含む追加変異の組み合わせとしては、例えば、Ｈ１２２Ａ／Ｅ３５０Ａ、Ｈ１２２Ｆ/Ｅ３５０Ａ、Ｐ１８４Ｑ／Ｅ３５０Ａ、Ｄ２７９Ｑ／Ｅ３５０Ａ、Ｄ２７９Ｓ／Ｅ３５０Ａ、Ｙ２８２Ｒ／Ｅ３５０Ａ、Ｙ３４８Ｈ／Ｅ３５０Ａ、Ｅ３５０Ａ／Ｙ４０２Ｆ、Ｅ３５０Ａ／Ｙ４０２Ｗ、Ｅ３５０Ａ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ａ／Ｒ４０６Ｑ、等を挙げることができる。
Ｅ３５０Ｎを含む追加変異の組み合わせとしては、例えば、Ｈ１２２Ａ／Ｅ３５０Ｎ、Ｈ１２２Ｆ/Ｅ３５０Ｎ、Ｐ１８４Ｑ／Ｅ３５０Ｎ、Ｄ２７９Ｑ／Ｅ３５０Ｎ、Ｄ２７９Ｓ／Ｅ３５０Ｎ、Ｙ２８２Ｒ／Ｅ３５０Ｎ、Ｙ３４８Ｈ/Ｅ３５０Ｎ、Ｅ３５０Ｎ／Ｙ４０２Ｆ、Ｅ３５０Ｎ／Ｙ４０２Ｗ、Ｅ３５０Ｎ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ｎ／Ｒ４０６Ｑ、等を挙げることができる。
Ｅ３５０Ｄを含む追加変異の組み合わせとしては、例えば、Ｈ１２２Ａ／Ｅ３５０Ｄ、Ｈ１２２Ｆ/Ｅ３５０Ｄ、Ｐ１８４Ｑ／Ｅ３５０Ｄ、Ｄ２７９Ｑ／Ｅ３５０Ｄ、Ｄ２７９Ｓ／Ｅ３５０Ｄ、Ｙ２８２Ｒ／Ｅ３５０Ｄ、Ｙ３４８Ｈ／Ｅ３５０Ｄ、Ｅ３５０Ｄ／Ｙ４０２Ｆ、Ｅ３５０Ｄ／Ｙ４０２Ｗ、Ｅ３５０Ｄ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ｄ／Ｒ４０６Ｑ、等を挙げることができる。
Ｅ３５０Ｑを含む追加変異の組み合わせとしては、例えば、Ｈ１２２Ａ／Ｅ３５０Ｑ、Ｈ１２２Ｆ/Ｅ３５０Ｑ、Ｐ１８４Ｑ／Ｅ３５０Ｑ、Ｄ２７９Ｑ／Ｅ３５０Ｑ、Ｄ２７９Ｓ／Ｅ３５０Ｑ、Ｙ２８２Ｒ／Ｅ３５０Ｑ、Ｙ３４８Ｈ／Ｅ３５０Ｑ、Ｅ３５０Ｑ／Ｙ４０２Ｆ、Ｅ３５０Ｑ／Ｙ４０２Ｗ、Ｅ３５０Ｑ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ｑ／Ｒ４０６Ｑ、等を挙げることができる。
Ｄ４０５Ａを含む追加変異の組み合わせとしては、例えば、Ｈ１２２Ａ／Ｄ４０５Ａ、Ｈ１２２Ｆ/Ｄ４０５Ａ、Ｐ１８４Ｑ／Ｄ４０５Ａ、Ｄ２７９Ｑ／Ｄ４０５Ａ、Ｄ２７９Ｓ／Ｄ４０５Ａ、Ｙ２８２Ｒ／Ｄ４０５Ａ、Ｙ３４８Ｈ／Ｄ４０５Ａ、Ｙ４０２Ｆ／Ｄ４０５Ａ、Ｙ４０２Ｗ／Ｄ４０５Ａ、又は、Ｄ４０５Ａ／Ｒ４０６Ｑ、等を挙げることができる。
本発明の変異酵素として好ましいものは、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ａ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｎ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｄ，ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｑ，ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｄ４０５Ａ，ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ａ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｎ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｄ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｑ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ／Ｄ４０５Ａ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ａ／Ｄ４０５Ａ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｎ／Ｄ４０５Ａ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｄ／Ｄ４０５Ａ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｑ／Ｄ４０５Ａ、又は、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｙ４０２Ｆであり、より好ましくはＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｑ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ／Ｄ４０５Ａ、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ａ、又は、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｙ４０２Ｆである。
＜遺伝子、宿主細胞、酵素産生方法＞
本発明は、さらに上記のＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑに追加変異を有する変異酵素をコードする組み換え遺伝子、当該組み換え遺伝子を含むプラスミドや発現ベクター等の遺伝子構築物、当該遺伝子構築物により形質転換された宿主細胞、当該宿主細胞の培養物から本発明の変異酵素を回収する工程を含む、本発明の変異酵素の製造方法などを提供する。これらの組み換え遺伝子、遺伝子構築物、宿主細胞糖は、本発明の変異酵素のアミノ酸配列に基づき、公知の遺伝子工学的手法に従って作成することができる。
本発明の変異酵素をコードする組み換え遺伝子は、配列番号３のヌクレオチド番号１０９〜２９８５（１〜１０８はシグナルペプチドをコードする領域）に記載のＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑのヌクレオチド配列に基づき、目的とする追加変異を含むアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡなどのポリヌクレオチドを作成することができる。例えば、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド番号１０９〜２９８５のヌクレオチド配列において、９０７〜９０９番目のヌクレオチドをCAGからCTGに置換したヌクレオチド配列である。また、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ａ（Ｎ、Ｑ）をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド番号１０９〜２９８５のヌクレオチド配列において、１０４８〜１０５０番目のヌクレオチドをGAAからGCAに置換したヌクレオチド配列である（Ｅ３５０ＮではAAT、Ｅ３５０ＱではCAG）。また、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ／Ｄ４０５Ａをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド番号１０９〜２９８５のヌクレオチド配列において、１２１３〜１２１５番目のヌクレオチドをGATからGCAに置換したヌクレオチド配列である。
本発明の変異酵素をコードする遺伝子の導入により形質転換された宿主細胞（動物細胞、植物細胞、大腸菌、酵母など、タンパク質産生に通常用いられる細胞等を適宜選択できる）は、細胞の種類に応じて適切な条件下で培養され、その培養物からから本発明の変異酵素を回収することができる。変異酵素の回収は、当該酵素の物性を利用して、通常の精製手法を適宜組み合わせ手行うが、簡便に回収するために、予めＧＳＴ等のタグペプチドを変異酵素に連結させた形で発現させるように、遺伝子構築物を設計しておくことにより、当該タグペプチドの親和性を利用した回収を行うことができる。タグペプチドは、精製後に除去してもよいが、酵素活性に影響ない場合は、タグペプヂドを連結させたままの変異酵素を、糖鎖リモデリング等の反応に使用してもよい。本発明の変異酵素には、このようなタグペプチドが連結したアミノ酸配列を有する酵素を含む。
＜糖鎖リモデリング＞
本発明は、本発明のＥｎｄｏＳ変異酵素を使用した、ＩｇＧ又はＦｃ領域含有分子におけるＮ２９７結合糖鎖の糖鎖リモデリング方法、及び、当該糖鎖リモデリングにより製造された実質的に均一な構造からなるＮ２９７結合糖鎖を有するＩｇＧ又はＦｃ領域含有分子、を提供する。
「糖鎖リモデリング」とは、まず、特定のモノクローナル抗体のＩｇＧ又はＩｇＧのＦｃ断片や定常領域のみからなるＣＬＣＨ等のＦｃ領域含有分子のＮ２９７結合糖鎖をコアＧｌｃＮＡｃ（コアフコースが付加していてもよい）を残して切除したアクセプター分子を作製し、次いで、当該アクセプター分子のコアＧｌｃＮＡｃに対して、本発明のＥｎｄｏＳ変異酵素の糖転移活性を利用して、糖鎖ドナーに由来する糖鎖を転移させることにより、Ｎ２９７ 結合糖鎖が糖鎖ドナーに由来する均一な糖鎖構造であるＩｇＧ又はＦｃ領域含有分子を製造する方法を意味する。
糖鎖リモデリングに用いられるＩｇＧ又はＦｃ領域含有分子は、同一のアミノ酸配列からなるＩｇＧ重鎖に由来し、Ｎ２９７結合糖鎖を有する形で産生されたものであればよく、その産生方法は限定されるものではなく、通常知られたモノクローナル抗体の生産方法により産生されたＩｇＧ、ＩｇＧのＣＬＣＨ、又は、それを酵素処理して得られたＦｃ断片などを利用することができる。また、このようなＩｇＧ又はＦｃ断片は、異なる生産方法や異なるロットで得られたサンプルの混合物を採用してもよい。
糖鎖リモデリングに用いるアクセプター分子の調製方法としては、上述のＩｇＧ又はＦｃ領域含有分子を、Ｎ２９７結合糖鎖のコアキトビオース構造におけるＧｌｃＮＡｃ間の1.4-グリコシド結合を特異的に加水分解する活性を保持したＥＮＧaseで処理することにより調整することができる。この場合、ＥＮＧaseとしては、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＤ、ＥｎｄｏＥ、ＥｎｄｏＳをはじめ様々なものを採用することができるが、好ましくは、野生型ＥｎｄｏＳである。
糖鎖リモデリングに用いる糖鎖ドナーとしては、様々な糖鎖構造のものを採用することができるが、リモデリング後の抗体を抗体医薬とすることを目的とした場合、ヒトが保有する糖鎖構造と類似した、又は、同一の、ヒト型糖鎖、又は、ヒト適合型糖鎖構造を有する糖鎖ドナーを採用することが好ましい。このような糖鎖ドナーの代表的なものとして、上記のＮ結合型糖鎖の基本構造において、コアＧｌｃＮＡｃが除かれ、還元末端から2番目のＧｌｃＮＡｃがオキサゾリン化された分子を挙げることができ、好ましくは図１に示される構造からなるSG-Oxaである。
糖鎖リモデリングにおける加水分解反応の反応条件はＥｎｄｏＳに関して通常知られた方法を採用することができる。反応は緩衝液中で行うが、クエン酸緩衝液(ｐＨ３．５〜５．５)、酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜６．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜７．５）、MOPS-NaOH緩衝液（ｐＨ６．５〜８．０）、Tris-HCl緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）など通常の酵素反応で用いられる緩衝液から適宜選ぶことが可能である。好ましくは、Tris-HCl緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）である。反応液には、酵素を安定化させる目的で、酵素反応を阻害しない添加剤を加えてもよいが、加えなくてもよい。
反応温度は、１０℃から５０℃の間で、適宜選択できるが、好ましくは、２５℃〜３８℃である。
反応時間は、１０分から９６時間の間で、適宜選択できるが、反応液の少量を経時的に採取し、加水分解の進行度を確認しながら反応の終了を判断してもよい。一般に、糖鎖加水分解反応の進行度は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、全自動電気泳動システム、あるいは液体クロマトグラフィ質量分析(LC-MS)などによりモニタリングすることができる。本特許では、市販抗体あるいは糖鎖リモデリング抗体を重鎖と軽鎖にフラグメント化した後、全自動電気泳動システムを用いて、Ｎ２９７結合糖鎖が付加している重鎖側のみ保持時間が変化することで確認した。
糖鎖リモデリングにおける糖転移反応の反応条件は、他の酵素において知られている条件に準じて適宜選択することができる。
反応は、緩衝液中で行うが、ＳＧ−Ｏｘａの分解を促進しないものが望ましく、りん酸緩衝液（ｐＨ６．０〜７．５）、MOPS-NaOH緩衝液（ｐＨ６．５〜８．０）、Tris-HCl緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）などから適宜選ぶことが可能である。好ましくは、Tris-HCl緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）である。酵素を安定化させる目的で、反応液中に酵素反応を阻害しない添加剤を加えてもよいが、加えなくてもよい。
反応温度は、１０℃から５０℃の間で、適宜選択できるが、好ましくは２５℃〜３８℃である。
反応時間は、１０分から９６時間の間で、適宜選択できるが、反応液の少量を経時的に採取し、糖転移反応の進行度を確認しながら反応の終了を判断してもよい。一般に、糖鎖転移反応の進行度は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、全自動電気泳動システム、あるいは液体クロマトグラフィ質量分析(LC-MS)などによりモニタリングすることができる。本特許では、市販抗体あるいは糖鎖リモデリング抗体を重鎖と軽鎖にフラグメント化した後、全自動電気泳動システムを用いて、Ｎ２９７結合糖鎖が付加している重鎖側のみ保持時間が変化することで確認した。
以下、実施例を用いて、本発明を具体的に説明する。実施例に示されたものは、本発明の実施形態の一例であり、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１は、本発明に使用したＥｎｄｏＳ変異酵素の調製例である。実施例２は、本発明に使用した糖鎖ドナーの製造例である。実施例３は、糖鎖転移活性を測定する際に使用したアクセプター分子の調製例である。実施例４は、本発明のＥｎｄｏＳ変異酵素の加水分解率の測定例と本発明のＥｎｄｏＳ変異酵素の糖鎖転移活率の測定例である。
本明細書に記載されているタンパク濃度は、超微量分光光度計NanoDrop1000(Thermo Fisher Scientific製)あるいはNanoDrop2000（Thermo Fisher Scientific製）を用いて定量した。
糖鎖リモデリング抗体((Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab及び、SG-Trastuzumab)の質量は、次の方法で確認した。糖鎖リモデリング抗体を重鎖と軽鎖にフラグメント化した後に、それぞれのピークを分析カラムで分離し、質量分析した。装置には、ACUITY UPLC(Waters製)、SYNAPT G2-S(Waters)およびBEH Phenyl カラム(1.7 μm、1.0x50 mm)を使用し、移動相には0.05％トリフルオロ酢酸添加アセトニトリルを、３分間で２５％から３５％に変化するグラジェントにて使用し、流速0.34 μL/min、80℃にて分析した。
＜実施例１＞ ＥｎｄｏＳ変異酵素の反応液調製
（１−１） ＥｎｄｏＳ変異酵素のデザイン
ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑに変異を導入することで、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑの糖転移活性を維持しながら、加水分解活性を抑制することが達成されると考えられる変異型ＥｎｄｏＳを設計した。ＥｎｄｏＳの立体構造情報（ＰＤＢ ＩＤ:４ＮＵＹ）に基づいて、ＥｎｄｏＳの触媒ドメインを、糖鎖の認識に関与することが予測される部位、活性中心付近、抗体の認識に関与することが予測される部位の３部位に区別し、それぞれ変異導入の対象とした。糖鎖の認識に関与することが予測される部位としては、Ｈ１２２、Ｙ３４８、Ｅ３５０、Ｙ４０２、Ｄ４０５、及びＲ４０６の６残基を設定し、糖鎖の結合と解離の回転を効率化するために、上記のアミノ酸残基が形成する相互作用を切断するべく、あるいは上記のアミノ酸のうち大きな側鎖を持つアミノ酸残基を小さい側鎖を持つアミノ酸残基に置換するべく酵素をデザインした。活性中心付近としては、Ｐ１８４、Ｄ２７９、及びＱ３０３を設定し、野生型のアミノ酸残基と類似した性質を持つアミノ酸、あるいは異なる性質を持つアミノ酸へ幅広く置換する変異をデザインした。抗体の認識に関与することが予測される部位としてはＹ２８２を設定し、抗体糖鎖が結合するＡｓｎ２９７付近の負電荷との相互作用を強めるべく、塩基性のアミノ酸へ置換する変異をデザインした。上記の３部位内、あるいは３部位間での組合せ変異も考慮し、表２の各変異酵素をデザインした。
（１−２） ＥｎｄｏＳ変異酵素の発現
コンピテンシーが10７cfu /μLの氷冷された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、50 μLに対して、上記（１−１）に基づいてデザインした各ＥｎｄｏＳ変異酵素のアミノ酸配列をコードした遺伝子を含むタンパク質発現用プラスミド（ｐＧＥＸ４Ｔ３、50 μg/μL）を3 μL添加し、３７℃で４０秒間加熱することで、大腸菌を形質転換した。これら大腸菌を100 μg/mLのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養し、翌日得られたコロニーを採取して100 μg/mLのアンピシリンを含む1 LのＴＢ培地でＯ.Ｄ.６００が０．８となるまで３７℃で振とう培養した。Ｏ.Ｄ.６００が上昇した後、培養温度を１６℃に下げ、1時間後に終濃度が0.1 mMとなるようにＩｓｏｐｒｏｐｙｌ β-Ｄ-１-ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を添加することで、ＥｎｄｏＳ変異酵素の発現を一晩誘導した。翌日、培養液を５，０００×Ｇで１０分間遠心分離することで菌体を回収し、40 U/mLのＤＮａｓｅＩ、および0.5 mg/mL Ｌｙｓｏｚｙｍｅを含むＰＢＳ バッファーを50 mL加え、菌体を再懸濁した。得られた菌液に対して超音波処理することで菌体を破砕し、２０，０００×ｇで３０分間遠心分離することで可溶性画分に目的とするＥｎｄｏＳ変異酵素を得た。
（１−３） ＥｎｄｏＳ変異酵素の精製
上記（１−２）で得られたＥｎｄｏＳ変異酵素の可溶性画分について孔径が0.45 μmのＰＶＤＦ膜を通し、通過後の溶液をグルタチオンアフィニティークロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーの二段階工程で精製した。
まず、ＰＢＳで平衡化したグルタチオンセファロース４ＢカラムにＰＶＤＦ膜通過膜を通じたＥｎｄｏＳ変異酵素の可溶性画分を全量供じ、カラム容量の３倍以上のＰＢＳバッファーでカラムを洗浄した。続いて10 mMの還元型グルタチオンを含むＰＢＳ バッファーでＧＳＴ融合ＥｎｄｏＳ変異酵素を溶出し、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ３０Ｋ）により濃縮した。濃縮後、ＰＢＳで平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６/６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を通し、溶出に用いたグルタチオンを除去するとともに最終精製サンプルを得た。このように調製した各種ＥｎｄｏＳ変異酵素の収量を表２に示す。
得られたＥｎｄｏＳ変異酵素溶液は、2 mg/mLとなるように調製して、これらを加水分解活性測定及び糖鎖転移活性測定に用いた。
Figure 0006752203
＜実施例２＞ SG-Oxa （図１の構造からなる化合物）の反応液調製
以降の実施例で糖鎖ドナーとして使用するSG-Oxaは、以下の方法で製造した。
ジシアロオクタサッカリド（東京化成工業（株）, 100 mg, 49.5 μmol）に対して、2-クロロ-1,3-ジメチル-1H-ベンズイミダゾール-3-イウム クロリド(CDMBI)((株)伏見製薬所製)(53.7 mg, 245 μmol）の水溶液(520 μl)を加えた。氷冷後の反応液にりん酸三カリウム（158 mg, 743 μmol）の水溶液(520 μl)を加え、氷冷下で２時間攪拌した。得られた反応液を、アミコンウルトラ(ウルトラセル30K、 Merck Millipore製)を用いて限外ろ過し、固形物を除去した。その通過液を、ゲルろ過クロマトグラフィーにて精製した。装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはHiPrep 26/10 Desalting（GEヘルスケア製）を使用し、移動相に0.03%- NH3水溶液を使用し、流速を10 ml/min、分画容量を10 mlとした。溶出中にUV検出（220 nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、0.1Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（100 μl）を加えて凍結乾燥し、目的とするSG-Oxaを無色固体（87.0 mg, 43.4 μmol, 収率８８％）として得た。
得られた化合物のＮＭＲチャートから、目的物（HELVETICA CHIMICA ACTA, 2012, 95, 1928-1936）であることを確認した。
得られたSG-Oxa(1.19 mg)に50 mMトリス緩衝液(pH7.4)(23.8 μl)を加え、50 mg/ml SG-Oxa溶液(50 mMトリス緩衝液pH7.4)を調製した。これを糖鎖転移活性測定に用いた。
＜実施例３＞ (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumabの調製
糖転移反応に使用するアクセプター分子として使用する(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumabを、以下の方法で作製した。
11.3 mg/ml Trastuzumab（Genentech社製）溶液 (50 mMトリス緩衝液pH8.0)(2 ml)に1.18 mg/ml 野生型ＥｎｄｏＳ溶液(PBS)(10 μl)を加えて、３０℃で５時間インキュベートした。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーションを用いて確認した。反応終了後、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトカラムによる精製を行った。
（１）アフィニティーカラムによる精製
精製装置：AKTA avant25(GE ヘルスケア製)
カラム：HiTrap Protein A HPカラム(5ml)(GE ヘルスケア製)
流速：5ml/min(チャージ時は1ml/min)
カラムへの結合時は、上記で得た反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー（20 mMりん酸緩衝液(pH7.0)）を1 ml/minで1CV流し、更に5 ml/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液（20 mM りん酸緩衝液(pH7.0)、0.5 M 塩化ナトリウム溶液）を15CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Eution buffer,PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1 M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。溶出中にＵＶ検出(280 nm)されたフラクションについて、超微量分光光度計NanoDrop1000(Thermo Fisher Scientific製)、及びExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。
目的物を含むフラクションをアミコンウルトラ(ウルトラセル30K、 Merck Millipore製)を用いて濃縮し、緩衝液(5 mM りん酸緩衝液、50 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液、pH6.8)交換を行った。
（２）ハイドロキシアパタイトカラムによる精製
精製装置：AKTA avant25(GE ヘルスケア製)
カラム：Bio-Scale Mini CHT Type Iカートリッジ(5ml)(BIO-RAD製)
流速：5ml/min(チャージ時は1ml/min)
上記（１）で得られた溶液をカラムの上部へ添加し、Ａ液(5 mM りん酸緩衝液、50 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)、pH6.8)を4CV流した。その後、Ａ液とＢ液(5 mM りん酸緩衝液、50 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)、pH6.8、2 M塩化ナトリウム溶液)を用いて、溶出した。溶出条件は、Ａ液：Ｂ液 = 100:0 〜 0:100 (15CV)である。
溶出中にＵＶ検出(280 nm)されたフラクションについて、超微量分光光度計NanoDrop1000(Thermo Fisher Scientific製)、及びExperionTM電気泳動ステーション(BIO-RAD)を用いて確認した。
目的物を含むフラクションをアミコンウルトラ(ウルトラセル30K、 Merck Millipore製)を用いて濃縮し、50 mM りん酸緩衝液（pH6.0）へ緩衝液交換を行い、9.83 mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液(りん酸緩衝液、pH6.0)(1.8 ml)が得られた。
LC-MS:
calculated for the heavy chain of (Fucα1, 6)GlcNAc-Trastuzumab, M = 49497.86 found(m/z), 49497 (deconvolution data).
calculated for the light chain of (Fucα1, 6)GlcNAc-Trastuzumab, M = 23439.1, found(m/z), 23439.1 (deconvolution data).
＜実施例４＞ ＥｎｄｏＳ変異酵素の加水分解活性及び糖鎖転移活性の測定（pH7.4）
（４−１） 加水分解活性の測定
各種ＥｎｄｏＳ変異酵素の、市販のTrastuzumabのＮ２９７結合糖鎖に対する加水分解活性を、以下のように測定した。当該加水分解反応の模式図を図２に示す。
加水分解反応の基質溶液として用いる20 mg/ml Trastuzumab溶液を、次のように調製した。100 mMトリス緩衝液(pH7.4,CALBIOCHEM製)(10 ml)に、大塚蒸留水(10 ml)を加えて、50 mMトリス緩衝液(pH7.4)(40 ml)を調製した。市販のTrastuzumab(440 mg/vial、Genentech製)に付属の溶解液(20 ml)を加え、Trastuzumab(ca.21 mg/ml)溶液とした。Trastuzumab(ca.21 mg/ml)溶液(2 ml)に対して、アミコンウルトラ(ウルトラセル30K、Merck Millipore製)を用いた限外ろ過を行い、上記で調整した50 mMトリス緩衝液pH7.4で溶媒置換し、20 mg/ml Trastuzumab溶液 (50 mMトリス緩衝液pH7.4)を得た。
上記で調製した基質溶液 (25 μl)に対して、実施例１で調製した2.0 mg/ml ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ溶液(5 μl)を加え、３０℃で４８時間インキュベーションした。反応開始の１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、２４時間後、及び、４８時間後に、この反応液の一部を採取し、反応の進行度をExperionTM電気泳動ステーション(BIO-RAD)を用いて測定した。測定に当っては、機器に付随している手順書に従って、測定サンプルを調製した。この過程で、採取した反応液をジチオトレイトールを含む溶液にさらして、９５℃で５分間加熱する操作がある為、加水分解反応は即座に停止される。
得られた測定サンプルをExperionTM Pro260 Chipsに移して、ExperionTM電気泳動ステーション(BIO-RAD)に付随している手順書に従って測定した。得られたクロマトグラムより、未反応物と加水分解体が分離したピークとして確認される。未反応物と加水分解体のピーク面積比から加水分解率を、以下の算出式により算出した。
加水分解率(％ = [(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab由来のＨ鎖のピーク面積] /{[市販のTrastuzumab由来のＨ鎖ピーク面積 + [(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab由来のＨ鎖のピーク面積]｝×100
同様にして、実施例１で調製した他のＥｎｄｏＳ変異酵素の、各反応時間における加水分解率を算出した（表３）。
（４−２） 糖鎖転移活性の測定
実施例１で作製した各種ＥｎｄｏＳ変異酵素の糖転移活性を以下の方法で測定した。糖鎖ドナーとしては、実施例２で調整したSG-Oxaを、アクセプター分子としては実施例３で調製した、(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumabを、それぞれ用いた。糖転移反応の模式図を図３に示す。
実施例３で調製した9.83 mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液(りん酸緩衝液、pH6.0)から、（４−１）の基質溶液調整と同様の手法に従って、20 mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液 (50 mMトリス緩衝液pH7.4)を調製した。20 mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液 (50 mMトリス緩衝液pH7.4)(40 μl)に対して、実施例２で調製した50 mg/ml SG-Oxa溶液(50 mMトリス緩衝液pH7.4)(1.07 μl)、及び、実施例１で調製した2.0 mg/ml ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ溶液(8 μl)を加え、３０℃で４８時間インキュベーションした。反応開始から、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、２４時間後及び４８時間後の各時点で、この反応液の一部を採取し、反応の進行度をExperionTM電気泳動ステーションを用いて測定した。測定に当っては、機器に付随している手順書に従って、測定サンプルを調製した。この過程で、採取した反応液をジチオトレイトールを含む溶液にさらして、９５℃で５分間加熱する操作がある為、糖鎖転移反応は即座に停止される。
得られた測定サンプルをExperionTM Pro260 Chipsに移して、ExperionTM電気泳動ステーション(BIO-RAD)に付随している手順書に従って測定した。得られたクロマトグラムより、未反応物と糖鎖転移体が分離したピークとして確認される。未反応物と糖鎖転移体のピーク面積比から糖鎖転移率を下記算出式により算出した。
糖鎖転移率(％) = [SG-Trastuzumab由来のＨ鎖のピーク面積] /{[(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab由来のＨ鎖ピーク面積 + [SG-Trastuzumab由来のＨ鎖のピーク面積]｝×100
同様にして、実施例１で調製した他のＥｎｄｏＳ変異酵素の、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表３）。
糖鎖転移生成物であるSG-Trastuzumabは、実施例３における(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumabの精製と同様の方法で精製した。得られたSG-TrastuzumabのLC-MS分析データを以下に示す。
calculated for the heavy chain of SG-Trastuzumab, M = 51500.6 Da; found (m/z), 51501 (deconvolution data).
calculated for the light chain of SG-Trastuzumab, M = 23439.1 Da, found(m/z), 23439 (deconvolution data).
Figure 0006752203

Claims (14)

  1. 配列番号２のアミノ酸番号３７〜９９５のアミノ酸配列からなるＥｎｄｏＳ変異酵素であって、当該アミノ酸配列においてＸａａで示される１２２番目（Ｈ１２２）、２７９番目（Ｄ２７９）、２８２番目（Ｙ２８２）、３０３番目（Ｑ３０３）、３４８番目（Ｙ３４８）、３５０番目（Ｅ３５０）、４０２番目（Ｙ４０２）、４０５番目（Ｄ４０５）、及び、４０６番目（Ｒ４０６）からなる群から選択される１〜４個のアミノ酸に追加変異を有し、当該追加変異したアミノ酸以外のＸａａは配列番号１における対応する箇所のアミノ酸であり；
    Ｈ１２２の変異後のアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ又はＰｈｅ；
    Ｄ２７９の変異後のアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｌａ又はＧｌｎ；
    Ｙ２８２の変異後のアミノ酸は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓ；
    Ｑ３０３の変異後アミノ酸は、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ又はＬｅｕ；
    Ｙ３４８の変異後アミノ酸は、Ｈｉｓ又はＴｒｐ；
    Ｅ３５０の変異後アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ又はＡｌａ：
    Ｙ４０２の変異後のアミノ酸は、Ｐｈｅ又はＴｒｐ；
    Ｄ４０５の変異後アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ又はＡｌａ；
    Ｒ４０６の変異後アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ又はＡｓｎ；
    であり、且つ、ＩｇＧの２９７番目のＡｓｎに結合するＮ結合型糖鎖（Ｎ２９７結合糖鎖）に対する活性として、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑの活性と比較して低減された加水分解活性を示すこと、及び、一定の糖転移活性を保持することを特徴とする、ＥｎｄｏＳ変異酵素。
  2. Ｎ２９７結合糖鎖に対する活性が、ｐＨ７．４の反応液中での加水分解反応において、２４時間後まで、５０％以下の加水分解率を維持することを特徴とする、請求項１のＥｎｄｏＳ変異酵素。
  3. Ｎ２９７結合糖鎖に対する活性として、さらに、ｐＨ７．４の反応液中での、５等量の糖鎖ドナーを用いた糖転移反応において４８時間後の糖転移率が約６０％以上である活性を示すことを特徴とする、請求項１のＥｎｄｏＳ変異酵素。
  4. 追加変異の箇所が、Ｑ３０３、Ｅ３５０及びＤ４０５からなる群から選択される１アミノ酸における変異を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つのＥｎｄｏＳ変異酵素。
  5. 追加変異が以下の群から選択される少なくとも一つである、請求項１〜４のいずれか一つのＥｎｄｏＳ変異酵素、
    Ｈ１２２がＡｌａ（Ｈ１２２Ａ）又はＰｈｅ（Ｈ１２２Ｆ）；
    Ｄ２７９がＳｅｒ（Ｄ２７９Ｓ）又はＧｌｎ（Ｄ２７９Ｑ）；
    Ｙ２８２がＡｒｇ（Ｙ２８２Ｒ）；
    Ｑ３０３がＬｅｕ（Ｑ３０３Ｌ）；
    Ｙ３４８がＨｉｓ（Ｙ３４８Ｈ）；
    Ｅ３５０がＡｌａ（Ｅ３５０Ａ）、Ａｓｎ（Ｅ３５０Ｎ）、Ａｓｐ（Ｅ３５０Ｄ）又はＧｌｎ（Ｅ３５０Ｑ）；
    Ｙ４０２がＰｈｅ（Ｙ４０２Ｆ）またはＴｒｐ（Ｙ４０２Ｗ）
    Ｄ４０５がＡｌａ（Ｄ４０５Ａ）；、及び、
    Ｒ４０６がＧｌｎ（Ｒ４０６Ｑ）。
  6. 追加変異として、Ｑ３０３L、Ｅ３５０Ａ、Ｅ３５０Ｎ、Ｅ３５０Ｄ、Ｅ３５０Ｑ及びＤ４０５Ａからなる群から選択される少なくとも一つの変異を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１つのＥｎｄｏＳ変異酵素。
  7. 追加変異が、Ｑ３０３Ｌ、Ｅ３５０Ａ、Ｅ３５０Ｎ、Ｅ３５０Ｄ、Ｅ３５０Ｑ、Ｄ４０５Ａ、Ｈ１２２Ａ／Ｑ３０３Ｌ、Ｈ１２２Ｆ/Ｑ３０３Ｌ、Ｄ２７９Ｑ／Ｑ３０３Ｌ、Ｄ２７９Ｓ／Ｑ３０３Ｌ、Ｙ２８２Ｒ／Ｑ３０３Ｌ、Ｑ３０３Ｌ／Ｙ３４８Ｈ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ａ、Ｑ３０３Ｌ/Ｅ３５０Ｎ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｄ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｑ、Ｑ３０３Ｌ／Ｙ４０２Ｆ、Ｑ３０３Ｌ／Ｙ４０２Ｗ、Ｑ３０３Ｌ／Ｄ４０５Ａ、Ｑ３０３Ｌ／Ｒ４０６Ｑ、Ｈ１２２Ａ／Ｅ３５０Ａ、Ｈ１２２Ｆ/Ｅ３５０Ａ、Ｄ２７９Ｑ／Ｅ３５０Ａ、Ｄ２７９Ｓ／Ｅ３５０Ａ、Ｙ２８２Ｒ／Ｅ３５０Ａ、Ｙ３４８Ｈ／Ｅ３５０Ａ、Ｅ３５０Ａ／Ｙ４０２Ｆ、Ｅ３５０Ａ／Ｙ４０２Ｗ、Ｅ３５０Ａ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ａ／Ｒ４０６Ｑ、Ｈ１２２Ａ／Ｅ３５０Ｎ、Ｈ１２２Ｆ/Ｅ３５０Ｎ、Ｄ２７９Ｑ／Ｅ３５０Ｎ、Ｄ２７９Ｓ／Ｅ３５０Ｎ、Ｙ２８２Ｒ／Ｅ３５０Ｎ、Ｙ３４８Ｈ／Ｅ３５０Ｎ、Ｅ３５０Ｎ／Ｙ４０２Ｆ、Ｅ３５０Ｎ／Ｙ４０２Ｗ、Ｅ３５０Ｎ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ｎ／Ｒ４０６Ｑ、Ｈ１２２Ａ／Ｅ３５０Ｄ、Ｈ１２２Ｆ/Ｅ３５０Ｄ、Ｄ２７９Ｑ／Ｅ３５０Ｄ、Ｄ２７９Ｓ／Ｅ３５０Ｄ、Ｙ２８２Ｒ／Ｅ３５０Ｄ、Ｙ３４８Ｈ/Ｅ３５０Ｄ、Ｅ３５０Ｄ／Ｙ４０２Ｆ、Ｅ３５０Ｄ／Ｙ４０２Ｗ、Ｅ３５０Ｄ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ｄ／Ｒ４０６Ｑ、Ｈ１２２Ａ／Ｅ３５０Ｑ、Ｈ１２２Ｆ/Ｅ３５０Ｑ、Ｄ２７９Ｑ／Ｅ３５０Ｑ、Ｄ２７９Ｓ／Ｅ３５０Ｑ、Ｙ２８２Ｒ／Ｅ３５０Ｑ、Ｅ３５０Ｑ／Ｙ３４８Ｈ、Ｅ３５０Ｑ／Ｙ４０２Ｆ、Ｅ３５０Ｑ／Ｙ４０２Ｗ、Ｅ３５０Ｑ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ｑ／Ｒ４０６Ｑ、Ｈ１２２Ａ／Ｄ４０５Ａ、Ｈ１２２Ｆ/Ｄ４０５Ａ、Ｄ２７９Ｑ／Ｄ４０５Ａ、Ｄ２７９Ｓ／Ｄ４０５Ａ、Ｙ２８２Ｒ／Ｄ４０５Ａ、Ｙ３４８Ｈ／Ｄ４０５Ａ、又は、Ｄ４０５Ａ／Ｒ４０６Ｑ、であることを特徴とする、請求項６のＥｎｄｏＳ変異酵素。
  8. 追加変異が、Ｑ３０３Ｌ、Ｅ３５０Ａ、Ｅ３５０Ｎ、Ｅ３５０Ｄ、Ｅ３５０Ｑ、Ｄ４０５Ａ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ａ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｎ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｄ、Ｑ３０３Ｌ／Ｅ３５０Ｑ、Ｑ３０３Ｌ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ａ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ｎ／Ｄ４０５Ａ、Ｅ３５０Ｄ／Ｄ４０５Ａ、又は、Ｅ３５０Ｑ／Ｄ４０５Ａである、請求項４のＥｎｄｏＳ変異酵素。
  9. 追加変異が、Ｈ１２２Ａ、Ｈ１２２Ｆ、Ｄ２７９Ｑ、Ｄ２７９Ｓ、Ｙ２８２Ｒ、Ｙ３４８Ｈ、Ｙ４０２Ｆ、Ｙ４０２Ｗ、又はＲ４０６Ｑである、請求項５のＥｎｄｏＳ変異酵素。
  10. 請求項１〜９のいずれかのＥｎｄｏＳ変異酵素をコードするポリヌクレオチド。
  11. 請求項１０のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含むベクター。
  12. 請求項１１のベクターで形質転換された宿主細胞。
  13. 請求項１〜９のいずれかのＥｎｄｏＳ変異酵素の存在下で、Ｎ２９７結合糖鎖として、フコース付加していても良いコアＧｌｃＮＡｃを有するＩｇＧのＦｃ領域を含む分子とオキサゾリン化されたＧｌｃＮＡｃを含む構造を有する糖鎖ドナーを反応させ、当該Ｆｃ領域含有分子のＮ２９７結合糖鎖の当該コアＧｌｃＮＡｃに、当該糖鎖ドナーの有する糖鎖が転移した構造を有するＦｃ領域含有分子を産生させることを特徴とする、糖鎖リモデリングされたＦｃ領域含有分子の製造方法。
  14. Ｆｃ領域含有分子が、ＩｇＧモノクローナル抗体である、請求項１３の製造方法。
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