KR101150506B1 - 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 재조합베타-갈락토시다아제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 신규 베타-갈락토시다아제 및 상기 효소 활성을 나타내는 효소 BgaC 단백질과 그 이용방법에 관한 것으로, 상기 단백질은 당쇄의 변형 및 분석에 이용할 수 있으며 암 치료제로도 매우 적합하다.

스트렙토코커스 뉴모니애, 당쇄 수식, 갈락토즈-베타1,3-엔아세틸글루코사민 (Gal-β1,3-GlcNAc), 베타-1,3-갈락토시다아제, bgaC, BgaC

Description

스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 재조합 베타-갈락토시다아제 {Streptococcus pneumoniae beta-galactosidase and use thereof}

도 1은 스트렙토코커스 뉴모니애로부터 bgaC 유전자의 PCR 증폭(A)과 이를 클로닝한 발현 벡터(B) 및 발현과 분리, 정제(C)를 나타낸 그림이다.

도 2는 스트렙토코커스 뉴모니애 유래 BgaC 단백질과 인간 (Homo sapiens)의 갈락토시다아제, 그리고, 바실러스 세레우스 E33L (Bacillus cereus E33L), 카노박테리움 피스시콜라 BA (Carnobacterium piscicola BA), 및 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans)의 BgaC 단백질들의 아미노산 서열의 상동성과 유사성을 비교한 그림이다.

도 3은 BgaC 단백질의 갈락토시다아제 효소 활성을 측정한 그림들이다. (A)는 BgaC의 효소 활성을 측정하기 위한 기질로 ONPG (o-nitrophenyl-D-galactopyranoside) 또는 PNPG (p-nitrophenyl-D-galactopyranoside)를 사용하였을 때의 효소 활성과 정량적인 수치들을 보여주며, (B)는 최적 활성 수소 이온 농도를 나타내고, (C)는 최적의 활성온도를 나타낸 그림이다.

도 4는 스트렙토코커스 뉴모니애 유래 BgaC 단백질이 인식하는 당쇄의 특이성과 절단 활성을 측정한 실험 결과를 나타내는 것으로, 갈락토즈-베타1,3-엔아세 틸글루코사민 (Galactose-β1,3-GlcNAc) 당쇄를 특이적으로 인식하여 절단하는 (A) 반면, 갈락토즈가 연결된 당이 엔아세틸갈락토사민 (GalNAc)이거나 (B), 글라이코시딕 결합이 베타1,3가 아닌 베타1,4로 연결되면 비환원말단의 갈락토즈 당을 절단하지 못한다(C).

도 5는 BgaC 단백질의 암세포의 군집 형성에 관한 영향을 본 것이다. BgaC 단백질을 처리한 암세포는 BgaC 단백질을 처리하지 않은 암세포에 비해 암세포 군집 형성이 억제된 것으로 보아 BgaC 단백질이 암세포의 성장을 억제 할 수 있는 가능성을 나타낸 그림이다.

본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 베타-갈락토시다아제 (beta-galactosidase; EC 3.2.1.23) 활성을 갖는 효소 BgaC 단백질 및 그 이용 방법에 관한 것이다.

베타-갈락토시다아제는 당 가수분해효소(glycohydrolase) 35번 집합에 속하는 절단 효소로 식물, 동물 뿐 아니라 효모, 곰팡이, 박테리아 그리고 고세균 같은 매우 다양한 미생물에서 발견되는 효소이다. 베타-갈락토시다아제는 락토즈 및 이와 구조적으로 연관이 있는 화합물을 가수분해하며, 부가적으로 락토오즈를 포함한 다양한 베타-D-갈락토피라노사이드의 역갈락토실화 반응도 촉매한다. 베타-갈락토시다아제의 가수분해효소와 전이 효소로서의 활성은 산업적으로 유용하다 (Nkayama and Amachi, 1999; Hung and Lee, 2002). 우유나 유장 같은 식료품에 포함된 락토즈를 글루코즈와 갈락토즈로 가수분해하는 데에 널리 사용되는데, 이는 식료와 낙농 산업에서 락토즈 성분 함량 감소를 위한 가장 기본적인 방법이다 (Greenberg and Mahoney, Process Biochem. 16: 2-8, 1981; Gekas and Lopez-levia, 20: 2-12, 1985).

한편, 당쇄들의 구조와 기능간의 상관관계에 관한 연구들이 생물학적인 의미와 역할 규명을 위해서 그 중요성이 크게 부각되고 있는데, 이러한 연구를 위해서는 각 당쇄의 구조를 연결고리 특이적 수준으로 분석할 필요가 제기되고 있다. 종래부터 당쇄의 성분이나 서열 분석에는 HPLC나 질량분석기와 같은 장비가 널리 사용되고 있었으나, 연결 결합 특이적인 구조 분석을 위해서는 위치 특이적인 당 절단 효소를 이용한 분석이 필수적이다. 따라서 위치 특이적인 당 절단 활성을 가지는 베타-갈락토시다아제를 당쇄 구조 분석에 사용하고자 하는 시도가 있다.

또한 암 치료와 관련하여, 암 치료 방법으로서 각종 항암제를 투여하는 화학 요법, 암세포에 대한 항체 산출을 촉진시키는 면역 요법, 암세포를 제거하는 외과적 요법, 방사선을 조사하여 암세포를 죽이는 방사선 요법 등이 사용되고 있으나, 원발암이 완전히 치유된 경우에도 여전히 문제가 남아있는 경우가 있다. 즉, 암이 악성 종양인 이유는 암이 전이된다는 특성에 있으며, 암세포 전이에 의해 야기되는 전이암에 의해 죽음에 이르는 경우도 많다. 이러한 암세포 전이를 억제하는 방법은 아직 확립되어 있다고는 할 수 없으며, 암세포 전이 억제 효과를 갖는 의약품은 아직 시판되고 있지 않은 것이 현실이다. 한편, 전이 메카니즘으로서 몇 단계가 고려되고 있으며, 최근 학회 등에서 암 전이와 당쇄와의 인과 관계가 논의되고 있다. 암 세포의 전이에 있어서는, 처음 암이 생긴 부위로부터 유리된 암세포가 혈류를 타고 체내로 이동한다. 혈관 내피 세포 표면에는 세포 부착 분자 중 하나인 E-셀렉틴이 몇 가지 요인에 의해 발현되는데, 이 E-셀렉틴과 혈류를 타고 체내로 이동하는 유리 암세포와의 상호 작용에 의해 유리 암세포는 혈관 내피 세피 표면에서 구르며 혈류 중에서의 이동 속도를 감속시키는, 이른바 롤링(rolling)이라는 현상을 거쳐, 유리 암세포가 혈관 내피 세포에 부착된다. 그리고, 암세포는 혈관 내피 세포 사이를 빠져 나와 조직 내로 들어가 새로운 전이암 세포소를 형성한다.

이러한 일련의 단계 중 암세포와 혈관 내피 세포와의 부착 초기 과정에서, 혈관 내피 세포의 표면에서 발현되는 세포 부착 분자의 하나인 E-셀렉틴과 암세포의 표면에 존재하는 당쇄 사이에서의 부착이 매우 중요한 역할을 하고 있다. E-셀렉틴과 상호 작용하는 암세포의 표면 당쇄 항원으로서는 시알산화 루이스 엑스(sLe^x)와 시알산화 루이스 에이(sLe^a)라는 시알산을 함유하는 복합 당쇄가 동정되고 있다. 즉, 상기 당쇄는 암세포의 전이에 리간드로 작용한다는 보고가 있다 (Takada et al., Cancer Res. 53: 354-361, 1993). 이러한 상기 당쇄에서, 갈락토즈-베타1,3-엔아세틸글루코사민 (Gal-β1,3-GlcNAc)은 sLe^a의 핵심 다당이고 갈락토 즈-베타1,3-엔아세틸글루코사민과 갈락토즈-베타1,3-엔아세틸갈락토사민 (Gal-β1,3-GalNAc)은 뮤우신 형과 복합형 당 단백질의 중요 구성 요소이다. 따라서 암의 전이를 막기 위해서는, 베타1,3 결합 특이적 말단의 갈락토즈를 절단할 수 있는 갈락토시다아제의 발견이 요구된다.

BgaC 단백질은 베타1,3 글라이코시딕 결합으로 연결된 비환원말단의 갈락토즈를 분해하는 활성을 갖고 있다고 알려져 있다. 그러나, 아직까지 베타1,3-결합 특이적으로 연결된 갈락토즈를 절단할 수 있는 갈락토시다아제인 BgaC 단백질들은 많이 알려져 있지 않았고, 이 중에서도 갈락토즈가 연결되어 있는 선행당을 특이적으로 인식하여 갈락토즈를 절단할 수 있는 효소에 관해서는 아직 알려져 있지 않다.

한편 당 절단 효소들은 감염성 미생물이 숙주에 침입하는 과정 중 숙주세포 표면에 노출된 당쇄를 절단하는 역할을 수행하므로 병원성 미생물들에서 관련 유전자들이 발견되는 경우가 많다. 폐렴 유발균인 스트렙토코커스 뉴모니애의 경우, BgaA로 명명된 베타 1,4 결합을 절단하는 활성을 지닌 갈락토시다아제가 보고되어 있다. 스트렙토코커스 뉴모니애 BgaA는 2,235개의 아미노산으로 구성된 247.3 kDa의 분자량을 지닌 세포 표면에 존재하는 단백질로 추정되며 배양 배지로부터 분리되었다 (Zahner and Hakenberck, J. Bacteriol. 182: 5919-5921, 2000; Glasgow et al., J. Biol. Chem. 252: 8615-8623, 1977; Hughes and Jeanloz, Biochemistry, 10: 1535-1548, 1964).

본 발명자들은 이미 공개되어 있는 스트렙토코커스 뉴모니애의 유전체 정보(Hoskins et al., J. Bacteriol. 183: 5709-5712, 2001)를 분석한 결과, 갈락토시다아제 기능을 지닐 것으로 추정되는 또 다른 새로운 유전자가 존재함을 알게 되어, 그 유전자의 기능 분석을 수행한 결과, BgaA와는 상이한 당쇄 절단 특이성을 지닌 신규 효소를 발굴하게 되었다.

특히, 상기 신규 효소는 갈락토즈-베타1,3-엔아세틸글루코사민 결합을 갖는 당쇄만을 선별적으로 인식하여 갈락토즈를 가수분해시킴을 알게 되었는데, 이는 당쇄 구조 분석 및 수식에 유용하게 이용될 수 있다.

나아가, 상기 효소를 암세포에 처리시 암세포의 군집형성이 억제됨을 관찰함으로써, 상기 효소를 암세포 치료에 유용하게 이용할 수 있는 가능성을 제시함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 베타1,3-갈락토시다아제 효소 활성을 나타내는 단백질을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 DNA 유전자를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터가 도입되어 베타1,3-갈락토시다아제를 발현할 수 있는 형질전환체를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 베타1,3-갈락토시다아제를 이용하여 갈락토즈-베타1,3-엔아세틸글루코사민 구조의 비환원말단 갈락토즈를 선별적으로 절단하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 연결위치 특이적 당쇄 절단 방법을 이용하여 당쇄의 구조를 분석하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 연결위치 특이적 당쇄 절단 방법을 이용하여 암 등의 질병에 특이적으로 발생하는 상기 당쇄를 절단함으로써 질병의 치료 또는 진단에 이용할 수 있는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 이용하여 암세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae R6) 유래 신규 베타-갈락토시다아제 및 상기 효소를 당쇄의 변형 및 분석 등에 이용하는 방법에 관한 것이다

본 발명자는 신규의 유용한 당쇄수식 효소 유전자를 발굴하기 위하여, 병원성 미생물인 스트렙토코커스 뉴모니애 R6 균주의 공개된 유전체 정보를 이용하였 다. 인체 유래 당쇄에 대한 수식이 가능한 효소 유전자를 찾기 위하여, 폐렴을 일으키는 병원성 미생물인 스트렙토코커스 뉴모니애를 선별하였으며, R6 균주는 이미 유전체가 공개되어 있어 손쉽게 이용할 수 있었다.

스트렙토코커스 뉴모니애 R6는 베타1,4-갈락토시다아제 활성이 있는 세포 표면 단백질을 발현하는 bgaA 유전자를 가짐이 이미 보고되어 있었으며(Zahner and Hakenberck, J. Bacteriol. 182: 5919-5921, 2000), 서열 상동성(sequence homology) 비교에 의해 베타-갈락토시다아제 활성을 가질 것으로 추정되는 또 하나의 유전자 bagC 가 알려져 있었다. 그러나, bgaC 유전자의 구체적인 활성 및 생화학적 특성에 대해서는 보고된 바가 없었다.

이에 본 연구자들은 상기 bgaC로 명명된 유전자를 스트렙토코커스 뉴모니에의 염색체를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(PCR) 방법을 사용하여 증폭하였으며, 이를 클로닝하여 상기 유전자가 베타-갈락토시다아제 효소 활성을 지닌다는 것을 규명하였다. 이렇게 규명된 유전자의 아미노산 서열이 서열번호 2로 기재되었으며, 이의 유전자 서열이 서열번호 1에 기재되어 있다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 단백질을 코딩하는 DNA 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 베타-갈락토시다아제 효소 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 DNA인 유전자에 관한 것이다.

본 발명에서 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 베타-갈락토시다아제 유전자에 대해 사용된 용어 "상동성"이란 야생형(wild type) 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 베타-갈락토시다아제를 코딩하는 DNA 서열과 바람직하게는 90% 이상 동일할 수 있는 DNA 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 이러한 발현 벡터는 바람직하게는, 대장균용 발현 벡터 pET28a에 클로닝 된 pET28a-bgaC인 것이다(도 1).

본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포에 DNA를 도입하고자 하는 통상의 모든 수단을 의미하며, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다.

또한 본 발명에서 용어, "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달 법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이들로 제한되지 않는다.

발현벡터로 형질전환되는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 숙주세포로는 원핵세포가 바람직하며, 예를 들어 에세리키아 콜리(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)) 등과 같은 하등 진핵세포 등도 이용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, 상기 클로닝된 발현 벡터 pET28a-bgaC를 대장균 (Escherichia coli) BL21(DE3) 균주(Novagen)에 형질전환으로 도입하여 2006년 6월 7일에 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁번호 제KCTC 10956BP호로 기탁하였다.

상기 형질전환된 숙주세포를 적당한 배지에서 배양하여 이로부터 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 베타-갈락토시다제 활성을 갖는 단백질을 발현시키고, 이를 분리 정제함으로써, 베타-갈락토시다아제 활성을 나타내는 단백질을 생산할 수 있다. 본 발명자들은, 상기 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 bgaC 유전자로부터 발현되고 베타-갈락토시다제 활성을 갖는 단백질을 BgaC로 명명하였다.

따라서 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 BgaC 단백질 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 베타-갈락토시다아제 효소 활성을 나타내는 단백질에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 상기 단백질의 베타-갈락토시다아제는 스트렙코커스 뉴모니애 유래로 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 것으로, a) 20 내지 40℃에서 최대 활성, b) pH 5.0 내지 8.0에서 최대 활성, c) 분자량 50 내지 100 kDa 및 d) ONPG 보다 PNPG에서 더 반응성이 좋고 높은 기질 특이성이 있는 특징을 갖는 것으로, 위치 특이적인 당쇄 절단 기능을 갖는다.

상기 단백질의 베타-갈락토시다아제 효소 활성은 ONPG (o-nitrophenyl-D-galactopyranoside) 와 PNPG (p-nitrophenyl-D-galactopyranoside)를 기질로 사용하여 분석한 것으로, 분석 결과 스트렙토코커스 뉴모니애 유래 BgaC 단백질은 ONPG보다 PNPG에 대해 더 높은 활성을 갖는 것을 알 수 있었다(도 3). 또한 BgaC 단백질의 최적 활성 pH를 알기 위하여 효소 활성도를 측정하였으며, 온도에 따른 효소 활성도 변화를 보기 위하여 여러 범위의 온도에서 단백질의 활성도를 측정하였다. 이로써, BgaC 단백질이 pH 6.5일 때, 30 내지 35℃일 때 최고의 활성도를 갖는 다는 것을 알 수 있었다(실시예 4).

또 다른 양태로서, 본 발명은 갈락토즈-베타1,3-엔아세틸글루코사민을 선택적으로 가수분해하는 것을 특징으로 하는 베타-갈락토시다제 단백질에 관한 것이며, 바람직하게 상기 단백질은 BgaC 이다.

BgaC 단백질의 당쇄 인식 특성을 분석하기 위하여 실제 기질이 될 수 있는 다양한 복합 당쇄들을 이용하여 갈락토즈 절단 실험을 수행하였다. 실험 결과, BgaC 단백질은 베타1,3-글라이코시딕 결합으로 연결되어 있는 비환원 말단의 갈락토즈 당만을 선별적으로 절단함을 알 수 있었다. 특히, 베타1,3-글라이코시딕 결합 앞에 있는 당에 대해서도 특이성을 보였다. 보다 구체적으로, 선행 당이 엔아세틸갈락토사민(GalNAc)인 경우에는 말단의 갈락토즈를 절단하지 못하였고, 선행 당으로 엔아세틸글루코사민 (GlcNAc)이 있는 경우에만 말단의 갈락토즈를 절단할 수 있었다. 상기 실험 결과들로부터 BgaC 단백질은 갈락토즈-베타1,3-엔아세틸글루코사민 구조의 비환원 말단 갈락토즈를 선별적으로 절단하는 것을 확인할 수 있었다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 베타-갈락토시다아제를 이용하여 갈락토즈 베타 1,3-엔아세틸글루코사민에 결합된 갈락토즈 및 당쇄변이체를 위치 특이적으로 절단하는 방법에 관한 것이다.

상기 BgaC 단백질을 이용한 갈락토즈-베타1,3-엔아세틸글루코사민 특이적 갈 락토즈 절단 방법은 당쇄 구조 분석에 유용하게 사용할 수 있다. 당쇄의 성분이나 서열 분석에는 HPLC나 질량분석기와 같은 장비가 널리 사용되고 있으나, 연결결합 특이적인 구조 분석에는 위치특이적인 당 절단 효소를 이용한 분석이 필수적이다. 특히, 글라이코시딕 결합 앞에 있는 선행당에 특이적인 당 절단 효소는 구조 분석에 보다 유용하게 사용될 수 있다. 현재까지, 갈락토즈 베타1,3 결합에 특이적인 베타-갈락토시다아제들은 알려진 것이 있으나, 그 선행 당이 엔아세틸글루코사민임을 요구하는 베타1,3 갈락토시다아제로는 본 발명의 BgaC가 최초이다.

바람직하게는, 본 발명은 상기 갈락토즈-베타1,3-엔아세틸글루코사민에 결합된 갈락토즈 및 당쇄변이체의 당쇄를 베타1,3-갈락토시다아제 효소 활성을 나타내는 단백질을 처리하여 당쇄를 분석하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 BgaC의 갈락토즈-베타1,3-엔아세틸글루코사민 특이적 갈락토즈 절단 활성을 이용하여 암 특이적인 당쇄들을 절단함으로써 질병의 치료 또는 진단에 이용할 수 있는 방법을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 BgaC의 암세포 군집형성의 억제능을 이용하여 항암제로의 이용 가능성을 제공한다.

sLe^a 당쇄는 암 세포의 표면에서 과량으로 발견된다고 알려져 있다. 이 sLe^a 당쇄는 갈락토즈-베타1,3-엔아세틸글루코사민 (Gal-β1,3-GlcNAc)의 핵심구조를 갖 는다. 따라서, 본 BgaC 단백질을 이용하면, 상기 sLe^a 또는 Le^a 당쇄의 갈락토즈를 선별적으로 절단하여 암의 진행을 막을 수 있는 가능성이 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리 범위는 하기 실시 예에만 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예1 ] 스트렙토코커스 뉴모니애로부터 bgaC 유전자의 증폭

스트렙토코커스 뉴모니애(ATCC BBA-255D)로부터 스트렙토코커스 뉴모니애 염색체를 기존에 알려진 페놀을 이용한 추출 방법(Ushiro et al ., J Dent Res 70: 1422-1426, 1991)에 의해 분리하였다. 추출한 염색체 DNA를 주형으로 하여 한 쌍의 프라이머 bgaC-N(cgctagCATGACACGATTTGAGATACGAG)과bgaC-C (ggaagcttTCATAAGTTTTCCCCCTTTATATG)에 NheI과 HindIII 제한 효소 자리를 인공적으로 삽입하여 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction; PCR)을 통해 bgaC가 포함된 1.8 kb 크기의 DNA 절편을 확보하였다 (도1 A 참조).

확보된 DNA 절편의 염기서열을 해독한 결과 스트렙토코커스 뉴모니애 bgaC 유전자는 595 개의 아미노산으로 구성된 세포내 단백질을 암호화하고 있음을 알게 되었다. 아미노산 서열로 번역한 결과, 스트렙토코커스 뉴모니애 BgaC 단백질은 인간 (Homo sapiens) 갈락토시다아제, 바실러스 세레우스 E33L (Bacillus cereus E33L), 카노박테리움 피스시콜라 BA (Carnobacterium piscicola BA), 및 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans)의 BgaC 단백질들과 각각 29.8%, 54.3%, 65.4% 및 46.7%의 상동성과 40.8%, 58.1%, 41.6% 및 54.2%의 유사성을 보이고 있었다 (도 2 참조).

[ 실시예 2] BgaC 단백질의 대량 발현, 분리 및 순수 정제

재조합 벡터 pET28a(Novagen)를 NheI과 HindIII 제한 효소를 사용 절단하고, 동일 제한 효소로 처리한 실시예 1에서 증폭된 PCR 산물을 삽입하였다(도1 B). 이렇게 구축된 재조합 벡터를 대장균 BL21(DE3)종에 형질전환시켰다. 형질 전환된 대장균을 5 ml LB (1% 박토트립톤, 1%염화나트륨, 0.5% 효모추출물) 액상배지에서 37℃에서 16시간 전배양 하였다. 대장균 전배양액을 100분의 1의 비율로 LB 배지에 재접종하여 37℃에서 배양하였다. 배양액의 600 nm 흡광도가 0.4~0.6 사이가 될 때 최종 농도가 1 mM이 되게 IPTG (isopropyl thiogalactoside)를 첨가하여 BgaC 단백질의 발현을 유도하고 18℃에서 24시간 배양 하였다. 배양된 대장균 균체를 원심분리에 의해 회수한 후 초음파 파쇄법으로 파쇄하였다. 세포 파쇄액을 원심 분리 후 상층액을 취하여 니켈 니트릴로트리아세틸산(Ni-NTA) 칼럼을 이용한 친화 크로마토그래피 (affinity chromatography)를 통해 69 kDa의 BgaC 단백질을 분리 정제하였다 (도1 C 참조).

[실시예 3] BgaC 단백질의 갈락토시다아제 활성 측정

BgaC 단백질의 기본적인 활성은 ONPG(o-nitrophenyl-D-galactopyranoside) 와 PNPG (p-nitrophenyl-D-galactopyranoside)를 기질로 사용하여 확인하였다. BgaC 단백질 2.2 mg을 반응 혼합물[90 mM 인산 나트륨 (NaPO₄) (pH 6.5), 10 mM 염화마그네슘 (MgCl₂), 45 mM 베타머캅토에탄올 (β-mercaptoethanol), 0.3 mM ONPG 또는 PNPG]과 혼합하여 300 μℓ가 되게 하여 30℃에서 30분간 반응한 후 420 nm에서 흡광도를 측정하여 ONP (o-nitrophenol) 또는 PNP(p-nitrophenol)의 생성양을 확인하였다. BgaC 단백질의 활성도(Unit)는 BgaC 단백질이 30℃에서 1분 동안 1 nmole의 ONPG나 PNPG를 ONP나 PNP로 전환할 수 있는 능력으로 정의한다. 효소의 최고 반응속도는 PNPG를 기질로 하였을 때 ONPG 보다 2.6배 높고, 기질 친화도 역시 PNPG에 대해 ONPG보다 3.5배 더 강하였다(도3 A 참조). 본 실시예를 통하여 BgaC 단백질은 ONPG보다 PNPG에 더 반응성이 좋고 높은 기질 특이성을 갖는다는 것을 알 수 있다.

[실시예 4] BgaC 단백질의 최적 활성 pH 및 온도 측정

최적의 효소 활성도를 나타내는 수소 이온 농도 (pH) 범위를 알아보기 위해 다양한 범위의 pH를 사용하여 BgaC 단백질의 효소 활성도를 측정하였다. 수소 이온 농도 범위는 3.89에서 8까지 측정하였다. pH 6 이하는 아세트산 나트륨 완충용액(sodium acetate buffer)을 사용하였고, pH 6 이상은 인산 나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer)을 사용하였다. 반응 혼합물 중 버퍼의 pH (3.89, 4.28, 4.6, 5, 5.41, 6, 6.5, 7, 7.5 and 8)만 달리하고 ONPG 또는 PNPG를 기질로 하여 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase activity) 활성도를 측정하였다. 본 BgaC 효소는 pH 6.5일 때 최고의 활성을 보였다(도 3 B 참조). 온도에 따른 BgaC 단백질의 효소 활성도 변화를 보기 위하여 여러 범위의 온도에서 BgaC 단백질의 활성도를 측정하였으며, 30 내지 35℃ 에서 최고의 활성도를 나타내었다 (도 3 C 참조).

[ 실시예 5] BgaC 단백질의 당쇄 인식 특이성 및 활성 분석

BgaC 단백질의 기질 인식 특이성은 일본 타카라(Takara)사 에서 판매하는 당쇄 042, 028 제품들과 시그마(Sigma)에서 판매하는 NA2 당쇄 [Mannotriose-di-(N-acetyl-D -glucosamine)] 제품을 사용하여 분석하였다. 타카라사에서 판매하는 당쇄들은 형광으로 표지되어 있는 제품들로서 형광감지 장치가 달려있는 미국 워터스 (Waters)사의 HPLC로 분석하였으며, 시그마에서 판매하는 당쇄는 형광 표지가 되어 있지 않은 제품이므로 독일 브루커(Bruker)사의 MALDI-TOF 질량분석장비 마이크로플렉스(microflex)를 사용하여 질량의 변화를 직접 분석하였다. 도 4A는 타카라 당쇄 042(Gal-β1,3-GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc-PA)에 BgaC를 처리한 후 HPLC로 분석한 결과이다. BgaC는 이 당쇄의 비환원 말단에 있는 갈락토즈를 가수분해하여서, 반응산물로 갈락토즈가 잘려나간 GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc-PA 당쇄 피크가 나오는 것을 볼 수 있다. 도 4B는 타카라 당쇄 028(Gal-β1,3-GalNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc-PA)에 BgaC를 처리한 결과를 보여주는데, 말단의 갈락토즈를 자르지 못하 는 것을 알 수 있다. 도 4C는 시그마의 당쇄 NA2에 BgaC를 처리한 후 MALDI-TOF로 분석한 결과이다. NA2 당쇄는 두개의 가지를 가지는 바이-안테너리(bi-antennary) 구조이며, 비환원 말단 부분은 Gal-β1,4-GlcNAc-β1,3-Man 형태로 끝난다. BgaC 단백질은 베타1,4 글라이코시딕 결합으로 연결된 말단의 갈락토즈를 절단하지 못하는 것을 알 수 있다.

[ 실시예 6] BgaC 단백질의 암세포 군집 ( colony ) 형성 억제능

암 유발에 관여하는 단백질인 RAS 단백질의 과발현을 유도하기 위해 ras 유전자가 트렌스펙션(transfection)된 섬유종 암세포 NIH3T3 세포를 10 mm 지름의 배양 접시에 20% 소혈청 (fetal bovine serum)과 300 unit의 BgaC가 포함된 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) 배지에 접종하여 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. ras 유전자의 과발현은 NIH3T3 세포의 군집능을 증가시킨다. BgaC를 처리한 것과 처리하지 않은 배양 접시의 NIH3T3 세포주의 군집능 형성을 비교하면, BgaC를 처리한 세포가 처리하지 않은 세포보다 군집 형성능이 억제되었다(도5 참조). 암의 일반적인 특징 중 하나가 군집을 형성하는 것이다. 암세포의 전이에 관여하는 주요 리간드로 작용하는 루이스 항원(Lewis antigen)의 하나인 시알산화 루이스 에이(sLe^a)는 갈락토즈-베타1,3-엔아세틸글루코사민(Gal-β1,3-GlcNAc) 결합을 기반으로 구성된 당쇄이다 (Takada et al., Cancer Res. 53: 354-361, 1993). 따라서 본 실험 결과는 BgaC 단백질 처리에 의해 시알산화 루이스 에이 항 원 형성이 차단되어 암 세포의 전이가 감소되고, 이는 군집형성이 저해되는 효과로 이어졌음을 시사한다. BgaC의 활성에 의해 암의 군집능이 감소함은 BgaC 단백질 자체의 항암제로서의 가능성을 보여 주는 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 베타-갈락토시다아제 BgaC 단백질은 위치 특이적으로 갈락토즈-베타1,3-엔아세틸글루코사민 구조를 포함하는 당쇄와 복합당질 및 올리고당 등을 절단할 수 있으므로, 상기 당쇄들의 위치 특이적 구조 분석에 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 상기 당쇄 특이적 갈락토즈 절단 활성을 이용하여 특이적 당쇄들을 선별적으로 절단함으로써 종양 억제제 등의 질병의 치료를 위한 의약용 또는 진단용으로 활용이 가능하여 의약 산업상 매우 유용한 발명이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Streptococcus pneumoniae beta-galactosidase and use thereof <130> PA9606-374/KR <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1788 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 1 atgacacgat ttgagatacg agatgatttc tatctcgatg gaaaatcatt taagatttta 60 tctggtgcca ttcattattt taggattcct ccagaggatt ggtatcattc gctctataac 120 ttgaaggctc ttggttttaa tacggtagag acttatgttg cttggaattt acacgagcct 180 cgtgaaggtg agtttcattt tgaaggtgat ctggatttag agaaatttct ccaaatagcg 240 caggatttgg gtctctacgc aattgtgcgt ccgtctccat ttatctgtgc ggaatgggaa 300 ttcggtggct taccagcttg gctcttgacc aagaacatgc gaattcgctc atccgaccca 360 gcatatatcg aggcagttgg tcgctactat gatcagttat tgccaagact ggtgcctcgt 420 ttgttgaaca atggtggcaa tattctcatg atgcaggttg aaaatgagta tggttcttac 480 ggagaagata aggcttacct gagagcgatt cgacagctaa tggaagagtg tggcgtaacc 540 tgtcccctct ttacatcaga tggtccatgg cgagctactc tgaaagctgg aaccttaatt 600 gaagaggacc tctttgtaac aggaaacttt ggttctaagg caccttacaa cttttcgcag 660 atgcaggaat tctttgatga acatggtaag aaatggccac tcatgtgtat ggagttctgg 720 gatggttggt tcaatcgctg gaaagaaccg attatcacac gggatcctaa ggaattggca 780 gatgcagttc gagaggtttt ggaacaaggc tctatcaatc tttacatgtt ccacggtggt 840 gcaaactttg gtttcatgaa tggttgctca gctcgaggaa ctttggacct gccacaagtt 900 acatcttatg attacgatgc ccttctggat gaagaaggaa atccaactgc taaatatctt 960 gcagtcaaga agatgatggc aacacatttt tcagagtatc cgcagttgga accactctac 1020 aaagagagta tggagttgga tgctattcca ctagttgaaa aagtttcttt gtttgaaacc 1080 ttagatagct tgtcaagtcc tgtagaaagt ctctatcctc aaaagatgga ggagctggga 1140 caaagttatg gctacctact ttatcgaaca gaaacaaact gggatgcaga agaagaaaga 1200 cttcgtatca ttgatggtcg agatagggcc cagctgtatg tcgatggtca gtgggttaaa 1260 actcaatatc agacagagat tggggaagat attttttatc aaggtaaaaa gaaagggcta 1320 tctaggttag atatcttgat agaaaatatg gggcgtgtca actatgggca taagttctta 1380 gcggatacgc aacgtaaggg aattcggaca ggggtctgta aggatctgca tttcttacta 1440 aactggaaac actatccact cccactagac aatcctgaga aaattgattt ttcaaaagga 1500 tggactcaag gacaaccagc cttttacgct tatgacttta cagtcgaaga gccaaaagat 1560 acttacctag acttgtctga gtttggtaag ggagttgcct ttgtcaatgg gcagaatcta 1620 ggacgttttt ggaacgttgg cccaactctc tcactttata tccctcatag ctatctcaag 1680 gaaggtgcca accgtatcat tatctttgaa acagaaggtc aatataaaga agagattcat 1740 ttaactcgta aacctacact aaaacatata aagggggaaa acttatga 1788 <210> 2 <211> 595 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 2 Met Thr Arg Phe Glu Ile Arg Asp Asp Phe Tyr Leu Asp Gly Lys Ser 1 5 10 15 Phe Lys Ile Leu Ser Gly Ala Ile His Tyr Phe Arg Ile Pro Pro Glu 20 25 30 Asp Trp Tyr His Ser Leu Tyr Asn Leu Lys Ala Leu Gly Phe Asn Thr 35 40 45 Val Glu Thr Tyr Val Ala Trp Asn Leu His Glu Pro Arg Glu Gly Glu 50 55 60 Phe His Phe Glu Gly Asp Leu Asp Leu Glu Lys Phe Leu Gln Ile Ala 65 70 75 80 Gln Asp Leu Gly Leu Tyr Ala Ile Val Arg Pro Ser Pro Phe Ile Cys 85 90 95 Ala Glu Trp Glu Phe Gly Gly Leu Pro Ala Trp Leu Leu Thr Lys Asn 100 105 110 Met Arg Ile Arg Ser Ser Asp Pro Ala Tyr Ile Glu Ala Val Gly Arg 115 120 125 Tyr Tyr Asp Gln Leu Leu Pro Arg Leu Val Pro Arg Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Gly Gly Asn Ile Leu Met Met Gln Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Tyr 145 150 155 160 Gly Glu Asp Lys Ala Tyr Leu Arg Ala Ile Arg Gln Leu Met Glu Glu 165 170 175 Cys Gly Val Thr Cys Pro Leu Phe Thr Ser Asp Gly Pro Trp Arg Ala 180 185 190 Thr Leu Lys Ala Gly Thr Leu Ile Glu Glu Asp Leu Phe Val Thr Gly 195 200 205 Asn Phe Gly Ser Lys Ala Pro Tyr Asn Phe Ser Gln Met Gln Glu Phe 210 215 220 Phe Asp Glu His Gly Lys Lys Trp Pro Leu Met Cys Met Glu Phe Trp 225 230 235 240 Asp Gly Trp Phe Asn Arg Trp Lys Glu Pro Ile Ile Thr Arg Asp Pro 245 250 255 Lys Glu Leu Ala Asp Ala Val Arg Glu Val Leu Glu Gln Gly Ser Ile 260 265 270 Asn Leu Tyr Met Phe His Gly Gly Ala Asn Phe Gly Phe Met Asn Gly 275 280 285 Cys Ser Ala Arg Gly Thr Leu Asp Leu Pro Gln Val Thr Ser Tyr Asp 290 295 300 Tyr Asp Ala Leu Leu Asp Glu Glu Gly Asn Pro Thr Ala Lys Tyr Leu 305 310 315 320 Ala Val Lys Lys Met Met Ala Thr His Phe Ser Glu Tyr Pro Gln Leu 325 330 335 Glu Pro Leu Tyr Lys Glu Ser Met Glu Leu Asp Ala Ile Pro Leu Val 340 345 350 Glu Lys Val Ser Leu Phe Glu Thr Leu Asp Ser Leu Ser Ser Pro Val 355 360 365 Glu Ser Leu Tyr Pro Gln Lys Met Glu Glu Leu Gly Gln Ser Tyr Gly 370 375 380 Tyr Leu Leu Tyr Arg Thr Glu Thr Asn Trp Asp Ala Glu Glu Glu Arg 385 390 395 400 Leu Arg Ile Ile Asp Gly Arg Asp Arg Ala Gln Leu Tyr Val Asp Gly 405 410 415 Gln Trp Val Lys Thr Gln Tyr Gln Thr Glu Ile Gly Glu Asp Ile Phe 420 425 430 Tyr Gln Gly Lys Lys Lys Gly Leu Ser Arg Leu Asp Ile Leu Ile Glu 435 440 445 Asn Met Gly Arg Val Asn Tyr Gly His Lys Phe Leu Ala Asp Thr Gln 450 455 460 Arg Lys Gly Ile Arg Thr Gly Val Cys Lys Asp Leu His Phe Leu Leu 465 470 475 480 Asn Trp Lys His Tyr Pro Leu Pro Leu Asp Asn Pro Glu Lys Ile Asp 485 490 495 Phe Ser Lys Gly Trp Thr Gln Gly Gln Pro Ala Phe Tyr Ala Tyr Asp 500 505 510 Phe Thr Val Glu Glu Pro Lys Asp Thr Tyr Leu Asp Leu Ser Glu Phe 515 520 525 Gly Lys Gly Val Ala Phe Val Asn Gly Gln Asn Leu Gly Arg Phe Trp 530 535 540 Asn Val Gly Pro Thr Leu Ser Leu Tyr Ile Pro His Ser Tyr Leu Lys 545 550 555 560 Glu Gly Ala Asn Arg Ile Ile Ile Phe Glu Thr Glu Gly Gln Tyr Lys 565 570 575 Glu Glu Ile His Leu Thr Arg Lys Pro Thr Leu Lys His Ile Lys Gly 580 585 590 Glu Asn Leu 595

Claims (11)

1. 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 베타-갈락토시다아제 효소 활성을 나타내는 단백질을 이용하여 갈락토즈-베타 1,3-엔아세틸글루코사민 구조의 갈락토즈 및 당쇄변이체를 위치 특이적으로 절단하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 베타-갈락토시다아제가 갈락토즈-β1,3-엔아세틸글루코사민 구조의 갈락토즈를 선택적으로 가수분해하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 하기 (a) 내지 (d)의 특성을 갖는 방법:

   (a) 20℃ 내지 40℃에서 최대 활성;

   (b) pH 5.0 내지 8.0에서 최대 활성;

   (c) 분자량 50 내지 100 kDa; 및

   (d) ONPG보다 PNPG에 더 반응성이 좋고 높은 기질 특이성을 가짐.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 당쇄의 연결위치 특이적 구조를 분석하는 방법.
11. 삭제

Images