JP6878433B2 - ジストロフィンエクソン53スキッピングのための効果的な遺伝子治療ツール - Google Patents
ジストロフィンエクソン53スキッピングのための効果的な遺伝子治療ツール Download PDFInfo
- Publication number
- JP6878433B2 JP6878433B2 JP2018530093A JP2018530093A JP6878433B2 JP 6878433 B2 JP6878433 B2 JP 6878433B2 JP 2018530093 A JP2018530093 A JP 2018530093A JP 2018530093 A JP2018530093 A JP 2018530093A JP 6878433 B2 JP6878433 B2 JP 6878433B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- exon
- dystrophin
- aavr
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/33—Alteration of splicing
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
以下の定義は、本発明との関連において一般的に用いられる意味に対応し、他の定義が明示的に示されていない限りは、考慮されるべきである。
第一の態様によれば、本発明は、ジストロフィンのプレメッセンジャーRNA(pre-mRNA)のエクソン53の+30から+69の領域の少なくとも33塩基のセグメントに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)をコードする配列を含むアデノ随伴組換えウイルスベクター(AAVr)に関する。
・パッケージ化された組換え核酸配列、「AAVrのゲノム」とも呼ばれる。この組換え核酸配列は、AONをコードする配列を含み、このAONが、目下のケースでは、標的細胞/組織において発現されると、ジストロフィンのpre-mRNAのエクソン53のスキッピングという治療的効果を生み出す;
・遺伝子の移行及び一定の組織指向性を可能にするウイルスカプシド。
ttgaaagaat tcagaatcag tgggatgaag tacaagaaca ccttcagaac cggaggcaac
agttgaatga aatgttaaag gattcaacac aatggctgga agctaaggaa gaagctgagc
aggtcttagg acaggccaga gccaagcttg agtcatggaa ggagggtccc tatacagtag
atgcaatcca aaagaaaatc acagaaacca ag
g tacaagaaca ccttcagaac cggaggcaac agttgaatg
を有する40塩基を伴う領域を標的とする。
・配列番号3の配列(実施例において「JR53」又は「5902」として言及されるもの)は、ジストロフィンのpre-mRNAのエクソン53の+30/+69領域を標的とするAONをコードする40ヌクレオチドの配列に対応する;
・配列番号4の配列(実施例において、「N3」又は「5901」として言及されるもの)は、ジストロフィンのpre-mRNAのエクソン53の+33/+65領域を標的とするAONをコードする33ヌクレオチドの配列に対応する。
・U7 snRNAをコードする遺伝子の非翻訳5'領域、特に、有利にはマウス由来の、プロモーターを含むもの、例えば配列番号2の配列のヌクレオチド1〜258により例示されるもの;
・ジストロフィンのpre-mRNAのエクソン53の+30から+69の領域に対するAONをコードする配列。一例として、配列番号2の配列のヌクレオチド259〜298が、そのような配列を例示しており、40塩基のオリゴヌクレオチドをコードし(実施例においてJR53と表示)、配列番号3の配列を有する。しかしながら、このアンチセンス配列は、例えば配列番号4の配列により置き換えられても良い;
・Smタンパク質の改変された結合配列、例えば配列番号2の配列のヌクレオチド299〜309に相当する、smOPT配列;
・配列番号2の配列のヌクレオチド310〜340に相当する、非改変で有利にはマウス由来の、ステムループ形態をコードする配列;
・有利にはマウス由来の、U7 snRNAの非翻訳3’領域、例えば配列番号2の配列のヌクレオチド341〜442により例示されるもの。
・本発明に係るコンストラクトをコードする配列(目的のAONをコードする配列が導入されるsnRNA)、例えば配列番号2の配列の、1つ以上の追加のコピー(例えば1〜9、有利には1〜3)の導入;
・エクソン53の別の領域に対する、又はジストロフィンの別のエクソンであって、そのスキッピングもまた目的のものであるエクソンのスキッピングを可能にする、目的の別のAONをコードする少なくとも1つの配列を保持する改変snRNAをコードする1以上の他の配列の導入。
・ジストロフィン転写産物の少なくとも10%、又はさらには20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、又はさらには100%についてのエクソン53のスキッピング。これは、当業者に公知の任意の手法を用いて、例えばRT-PCRにより、評価することができる;
・健康な生物において通常生産されるジストロフィンの少なくとも5%、又はさらには10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、又はさらには100%を占める、短縮されたジストロフィン(少なくともエクソン53によりコードされる部分を欠いている)の生産、これは、当業者に公知の任意の手法を用いて、例えばウエスタンブロットにより、評価することができる。
・1〜10 mL/分、有利には1〜5 mL/分に含まれる流量、例えば3 mL/分;
・患者1 kgあたり1〜10 mLに含まれる、好ましくは5 mLに等しい総注入量のベクター調製物。注入量は、好ましくは総血液量の10%より多くを占めてはならず、好ましくは約6%である。
・同一ベクターの同一投与経路での反復投与;
・同一ベクターの異なる部位、特に異なる肢での投与;
・ベクターの血清型又は投与されるAONをコードする配列が異なっていても良い、異なる組換えベクターの投与。
以下により詳しく記述する、組換えAAV8の有効性を、2つの並行した試験の状況において、盲検で試験した。
(1/ アンチセンス、ベクター、及びプラスミド)
以下の表1に特定されるアンチセンス配列を試験した:
・rep-2及びcap-8遺伝子、並びに補助遺伝子のE2b、E4、VARNAアデノウイルスを保持する、pDP10;及び
・対応するITR-2及び導入遺伝子を保持するベクタープラスミド(上述のコンストラクト)である。
AAV8ベクターを、5トレイのCell Stackにおける接着系において培養した、HEK293細胞(細胞性ゲノム中に、E1A及びE1B遺伝子を安定的にインテグレートしたもの)から作製した。10%ウシ胎児血清(体積/体積)並びにペニシリン及びストレプトマイシン(各抗生物質について1%体積/体積)を含むDMEM培地中で培養した細胞を、リン酸カルシウムを用いた沈殿手法を使用して、2つのプラスミド(補助プラスミド:rep-2及びcap-8遺伝子、及び補助遺伝子のE2b、E4、VARNAアデノウイルスを保持するpEP10、並びに対応するITR-2及び導入遺伝子を保持するベクタープラスミド)について、トランスフェクションした。
ベクターの生成物を、DNaseで処理して、混入している遊離DNAを除去し、その後ウイルス核酸を抽出した。抽出後、核酸を希釈し、AAVウイルスゲノムのコピー数(AAV/ITRアンプリコン)を、線状化し標準化したプラスミド線を用いて、qPCRにより決定した。
AAV18mers.R: GTAGATAAGTAGCATGGC (配列番号11)
AAV22mers.F: CTCCATCACTAGGGGTTCCTTG (配列番号12)
AAV_M G B.P: TAGTTAATGATTAACCC (配列番号13)
2株のデュシェンヌ患者を用いたが、一方はジストロフィン遺伝子におけるエクソン45〜52(Δ45-52)の欠失に関連するものであり、他方は、エクソン52(Δ52)のものであった。健康な対象の筋芽細胞の第3の株は、対照の役割を果たした(8220)。
(5/ AAV2/8による不死化筋芽細胞の形質導入)
細胞を、6ウェルプレートの1ウェルあたり190,000細胞で播種し、その後、増殖培地(骨格筋細胞基本培地+骨格筋細胞生育培地キット、Promocell Ref: C23160)中で培養した。約24時間後、細胞を、1e5及び5e5 vg/細胞のMOIで、目隠しをして(ブラインドで)改変した種々のU7snRNA組換えAAV2/8ベクター、並びに形質導入の有効性を検証するための、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を可能にするAAV2/8対照を用いて形質導入した。
AAVゲノムを、Gentra Puregeneキット(Qiagen)を用いて抽出した。
AIb.R: ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC (配列番号15)
AlbVIC.P: CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC (配列番号16)
乾燥細胞ペレットからのRNA抽出を、1 mLのTrizol Reagentによって、供給元の指示を使用して(Life Technologies、Ref 15596-026)行った。RNAを30 μLの滅菌水に回収し、その後ウイルスDNAによる典型的なRNA混入を除去するために、2回の連続的DNase工程により処理した(Ambion、Ref. AM1907)。逆転写反応に500 ngのRNAを使用した(Life Technologiesキット、Ref. 28025-013)。この工程の間に、ウイルスDNAの混入が存在しないことを検証するために、逆転写陰性対照を各サンプルについて行った。
DMD Δ52株用:
・PCR1: ex51 hDMD Fext及びex54 hDMD Rext、50℃で
・PCR2: ex51 hDMD Fint及びex54 hDMD Rint、50℃で
Δ45-52株用:
・PCR1 Dys43F/Dys57R、58℃で
・PCR2 Dys44F/Dys56R、58℃で
エクソン53スキッピングのためのプライマーの配列:
・ex51 hDMD Fext: GTTACTCTGGTGACACAACC (配列番号17)
・ex54 hDMD Rext: ATGTGGACTTTTCTGGTATC (配列番号18)
・ex51 hDMD Fint: ACTAGAAATGCCATCTTCCT (配列番号19)
・ex54 hDMD Rint: CAAGTCATTTGCCACATCTA (配列番号20)
・Dys43-F: CCTGTGGAAAGGGTGAAGC (配列番号21)
・Dys44-F: CGATTTGACAGATCTGTTGAG (配列番号22)
・Dys56-R: TGAGAGACTTTTTCCGAAGT (配列番号23)
・Dys57-R: AAGTTCCTGCAGAGAAAGGT (配列番号24)
エクソン53のスキッピングを定量するために、2回のRTqPCRを行った。第1のものは、ジストロフィンについて、エクソン53をもはや含まない転写産物に特異的であった(エクソン44及び54の連結部のRTqPCR)。第2のものは、ジストロフィンの全ての転写産物を増幅することによって、正規化するために用いられた(エクソン4及び5の連結部のRTqPCR)。逆転写反応から生じたcDNAを希釈し、その後、Premix Ex Taqキットを使用し、Taqman技術を用いて、供給元の推奨に従って(Takara, Ref. RR390w)、0.3 μmol/Lの各プライマー、及び0.25 μmol/LのTaqmanプローブ(以下のプライマー及びプローブの一覧を参照)を用いて、40サイクル[95℃ 15秒間−57℃ 1分間]増幅した。RTqPCRの有効性を検証し、転写産物を定量するために、目的の配列を含有する参照プラスミドの希釈列を、プレート上にサンプルと並行して置いた。
・hDys-44/54-F: CCTGAGAATTGGGAACATGCTAA (配列番号25)
・hDys-44/54-R: GCCACTGGCGGAGGTCTT (配列番号26)
・hDys-44/54-P: GGTATCTTAAGCAGTTGGC (配列番号27)=エクソン44と54との連結部にまたがるTaqmanプローブ
・hDys-4/5-F: CATGCCCTGAACAATGTCAACAAG (配列番号28)
・hDys-4/5-R: TCCATCTACGATGTCAGTACTTCCA (配列番号29)
・hDys-4/5-P: TTGCAGAACAATAATGTTGATTTA (配列番号30)=エクソン4と5との連結部にまたがるTaqmanプローブ
(5/ AAV2/8による不死化筋芽細胞の形質導入)
細胞を、35 mmのウェルあたり100,000細胞で播種し、その後上述の増殖培地中で、80%コンフルエンスまで培養した。約24時間後、細胞を、種々の組換えAAV2/8ベクターを用いて、250,000 vg/細胞のMOIで、分化培地(血清を含まず、ゲンタマイシンを含むIMDM)中、37℃で感染させた。
上記ポイントI-6を参照。
ネステッドRT-PCRを行うために、Nucleospin RNAIIキットを用い、カラムを通してRNAを抽出し、30 μLの水(DNase/RNaseフリー)に溶離させた。500 ngのRNAを、逆転写反応(Superscript II Life Technologiesキット、Ref. 18064-014)に用いた。
対照筋芽細胞 wt (8220)及びDMD Δ52用:
・PCR1: Dys49F/Dys57R
・PCR2: Dys50F/Dys56R (ヒトジストロフィン)
筋芽細胞Δ45-52用:
・PCR1 Dys43F/Dys57R
・PCR2 Dys44F/Dys56R (ヒトジストロフィン)
エクソン53スキッピングのための5'->3’プライマーの配列:
・Dys43-F: CCTGTGGAAAGGGTGAAGC (配列番号21)
・Dys44-F: CGATTTGACAGATCTGTTGAG (配列番号22)
・Dys49-F: CAACCGGATGTGGAAGAGAT (配列番号31)
・Dys50-F: CTCTGAGTGGAAGGCGGTAA (配列番号32)
・Dys56-R: TGAGAGACTTTTTCCGAA-GT (配列番号23)
・Dys57-R: AAGTTCCTGCAGAGAAAG-GT (配列番号24)
18S、PO、及び総ヒトジストロフィンのための他のプライマーの配列:
・PO -F: GGCGAGCTGGAAGTGCAACT (配列番号33)
・PO-R: CCATCAGCACCACAGCCTTC (配列番号34)
・18S-F: TCAAGAACGAAAGTCGGAGGTTCG (配列番号35)
・18S-R: TTATGCTCAATCTCGGGTGGCTG (配列番号36)
・Dys3-F: GAGAACCTCTTCAGTGACCTAC (配列番号37)
・Dys9-R: GAGGTGGTGACATAAGCAGC (配列番号38)
形質導入され9日間分化させた細胞(第5段落を参照)から、125 mMのスクロース、5 mMのトリス-HCl pH 6.4、6%のXT-Tricine移動(migration)緩衝液(Bio-Rad)、10%のSDS、10%のグリセロール、5%の13-メルカプトエタノール、及び抗タンパク質分解酵素を含有する緩衝液中で、タンパク質を抽出した。サンプルを5分間、95℃で変性させ、その後Compat-AbleTM Protein Assay preparation Reagent Setキット(Thermo Scientific Pierce)で前処理した。タンパク質の濃度を、BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific Pierce)により決定した。75 μgのタンパク質を、Criterion XTトリス-酢酸 3-8%予備充填(pre-poured)ゲル(Bio-Rad)に置いた。1:50に希釈したNCL-DYS1モノクローナル一次抗体(Novocastra)との膜のハイブリダイゼーションにより、及びその後の1:15,000に希釈した抗マウスヒツジ二次抗体(HRP)により、ジストロフィンを検出した。タンパク質を、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrateキット(Thermo Scientific Pierce)により明らかにした。
最適化マウスU7snRNA遺伝子に挿入され、自身のプロモーターを含有し、AAV2/8に保持される、候補アンチセンス配列を、2株の不死化ヒト筋芽細胞、Δ45-52及びΔ52に対してそれぞれ用いて二重盲検試験を行った。
これらのベクターは、増殖条件下、盲検で、2人の作業者によって、1e5及び5e5 vg/細胞のMOIで試験された。形質導入の有効性は、フローサイトメトリーにより推測され、形質導入された細胞の68%〜96%の間であった。
これらのベクターは、300.E+3のMOIで試験した。修正した細胞においてジストロフィンタンパク質の回復を示すことができるような分化条件を得るために、形質導入した細胞を、9日間分化させた(材料と方法を参照)。
これらの2つの独立した及び完全に整合した試験は、エクソンスキッピングの有効性の結果が、2つのDMD株について同一であったこと、すなわち以下の有効性の大きさ:5902>5901=5903を示す。同様に、筋芽細胞の2つの株では、AON 5902を保持するコンストラクトが、最も効果的にジストロフィンの発現を回復させる。
(A. 材料及び方法)
(1/ 細胞培養)
DMD患者の線維芽細胞を、10%のウシ胎児血清(FCS)及び10 μg/mLのゲンタマイシンを補ったIMDM(イスコフ改変ダルベッコ培地)培養培地(Life Technologies)中で培養した。コンフルエンスで、細胞をトリプシン/EDTA溶液中に分離して増幅した。各患者について、サンプルを調製し、冷温で保存した(冷凍保存)。
(2.1 筋変換に用いられるベクター)
筋変換手法及びそれを実行することを可能にするツール、特に適切なレンチウイルスベクターは、当業者に公知であり、例えばCooper et al. (Neuromuscular Disorders 17 (2007), 276-284)及びChaouch et al. (Human Gene Therapy 20 (2009), 784-790)に記述されている。
ヒト線維芽細胞(HF)を、トリプシン/EDTA溶液を用いて分離し、5分間、300 gで遠心分離し、DMEM(高グルコースダルベッコ培地)中に再懸濁し、計数した。25,000細胞を、抗生物質を含まないDMEM中5 μLのLV/MyoDiの入ったEppendorfチューブに移し、総液量100 μLで、その後30分間、37℃でインキュベートした(2又は3回混合した)。次に、各チューブに含まれる混合物(細胞+ベクター)を、900 μLのDMEM、10% FCS、100 μL/mLのペニシリン、100 μg/mLのストレプトマイシンを含有する22 mmウェル(P12)に播種し、37℃、5% CO2のインキュベーターに3日間静置した。3日目から、培地を完全に交換してウイルス粒子を取り除いた。LV/MyoDiにより形質導入された細胞を、次に増幅し-80℃で凍結し、その後液体窒素中に移した。
線維筋芽細胞(FM)を、マトリゲル上の22 mmのストリップに、10,000 細胞/ウェルで接種した。24時間後に、10 μg/mLのドキシサイクリンを4〜6日間、増殖培地に加えることにより、筋変換を誘導した。線維筋芽細胞を、2%のパラホルムアルデヒド(PFA)で15分間、室温で固定した(また、必要な場合は4℃で維持した)。細胞を5分間、メタノールを用いて-20℃で透過処理し、1時間、2%のBSA(ウシ血清アルブミン)を含むPBS中でブロッキングした。免疫学的マーキングを、1/100に希釈した5.8A MyoD1マウスモノクローナル抗体(コードDAKO M3512)のクローンを用い、一晩4℃でインキュベートして行った。次に、ヤギ抗マウス488-IgG fluoro Alexa二次抗体(1/500)を、1時間、室温でインキュベートした。核をDAPIで5分間標識した。ストリップをFluoromount Gスライドにマウントし、蛍光顕微鏡下で観察した(DM2500 Leica共焦点イメージング及びImageJアプリケーション)。
配列JR53(配列番号3)を含む、臨床試験に用いられたベクターは、実施例1に記述した、Genethonにより製造されたG7U007 bacculoAAV2 / 8-U7-JR53ベクターである(ロット番号14PO353: JR53)。
筋変換した線維芽細胞(線維筋芽細胞)を、無血清IMDM培地中、37℃で、JR53配列(細胞あたりMOI 300,000ウイルスゲノム)を含むベクターに感染させた。5時間後、線維筋芽細胞を、1%のウマ血清、10 μg/mLのゲンタマイシン、及び10 μg/mLのドキシサイクリンを添加したIMDM培地中で、13〜14日間、分化させた。分化した細胞を、室温でPBS中に掻き取り、第1のチューブに回収し(ウエスタン型の移行用)、氷上で保持した。採取した量の1/10を、RNA抽出に移行した。11,000 gでの1分間の遠心分離後、細胞ペレットを凍結して、-80℃で保存した。
Nucleospin RNAIIキット(Macherey Nagel)を用いて、製造元の指示に従い、総RNAを細胞から抽出し、30 μLの水に溶離した。500 ngのアリコート部(分注量)の全RNAをネステッドRT-PCR解析に用いた。逆転写反応を、Superscript IIキット(Life Technologies)を使用し、42℃で50分間、ランダムプライマーアナライザーを用いて、その後PCR Master mix キット(Promega)を用いて、PCRにより行った。
細胞タンパク質を、溶解緩衝液(サッカロース125 mM、トリス-HCl 5 mm pH 6.4、6%のXT-Tricine移動(migration)緩衝液(Bio-Rad)、10%のSDS、10%のグリセロール、5%のβ-メルカプトエタノール、抗タンパク質分解酵素)から抽出した。サンプルを、95℃で5分間変性させた。
細胞株は、Universite de la Sorbonne UPMC - INSERM - UMRS 974 - CNRS FRE 3617 - Institut de Myologie [筋肉学研究所]のCentre de Recherche en Myologie [筋肉学研究センター]の細胞不死化プラットフォームにより提供された。
ジストロフィンの発現の対照:J5C健康なヒト線維芽細胞、UMRS974リサーチユニットにより行われた筋変換。
ジストロフィンの発現の陽性対照のための健康な筋芽細胞 no. 8220: hM
(1/ ヒトDMD線維芽細胞の線維筋芽細胞への変換:)
全てのロットのDMD線維芽細胞(10/10)は、MyoDの核発現に関して陽性であることが示され、myoD1について陽性の核の、標識した核の総数に対するパーセンテージが70%より高いことが示され(表9)、したがって筋変換されたとみなすことができた。
エクソンスキッピングについてのJR53の有効性は、各ロットのDMD線維筋芽細胞について2回又は3回の実験で試験した。エクソン53を含まない予想されるサイズに対応するRT-PCR産物が、10名のDMD患者の各々において検出された(図6)。
行われあたウエスタンブロットの結果は、図7に表される。
種々の型のDMDの患者から取得したヒト線維筋芽細胞に対して行われたこの試験の背景において得られた全ての結果を、以下の表12にまとめる:
Claims (9)
- ジストロフィンのプレメッセンジャーRNAのエクソン53の+30から+69の領域の全体に対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)をコードする配列を含む、組換えアデノ随伴ウイルスベクター(AAVr)であって、前記配列が配列番号3の配列から成る、AAVrベクター。
- 前記AONをコードする配列が、改変snRNAをコードする配列に挿入されることを特徴とする、請求項1に記載のAAVrベクター。
- 前記改変snRNAが、有利にはマウス由来であるタイプU7のもの(U7snRNA)であることを特徴とする、請求項2に記載のAAVrベクター。
- 配列番号2の配列を含むことを特徴とする、請求項3に記載のAAVrベクター。
- AAV2/1、AAV2、AAV2/6、AAV2/8、AAV2/9、AAV2/10、AAV8、及びAAV9から成る群から選択され、有利にはAAV2/8ベクターであることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載のAAVrベクター。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載のAAVrベクターを含む医薬組成物。
- 医薬品としての使用のための、請求項1から5のいずれか一項に記載のAAVrベクター。
- デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)の処置における使用のための、請求項1から5のいずれか一項に記載のAAVrベクター又は請求項6に記載の医薬組成物。
- Δ52、Δ45-52、Δ48-52、及びΔ50-52の型のデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)の処置における使用のための、請求項1から5のいずれか一項に記載のAAVrベクター又は請求項6に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR1562036 | 2015-12-09 | ||
FR1562036A FR3044926B1 (fr) | 2015-12-09 | 2015-12-09 | Outils de therapie genique efficaces pour le saut de l'exon 53 de la dystrophine |
PCT/FR2016/053312 WO2017098187A1 (fr) | 2015-12-09 | 2016-12-09 | Outils de therapie genique efficaces pour le saut de l'exon 53 de la dystrophine |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019502376A JP2019502376A (ja) | 2019-01-31 |
JP6878433B2 true JP6878433B2 (ja) | 2021-05-26 |
Family
ID=55346032
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018530093A Active JP6878433B2 (ja) | 2015-12-09 | 2016-12-09 | ジストロフィンエクソン53スキッピングのための効果的な遺伝子治療ツール |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10752898B2 (ja) |
EP (1) | EP3387130B1 (ja) |
JP (1) | JP6878433B2 (ja) |
CN (1) | CN108368508B (ja) |
CA (1) | CA3006515A1 (ja) |
DK (1) | DK3387130T3 (ja) |
ES (1) | ES2845214T3 (ja) |
FR (1) | FR3044926B1 (ja) |
HK (1) | HK1255100A1 (ja) |
PT (1) | PT3387130T (ja) |
WO (1) | WO2017098187A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019146621A1 (ja) * | 2018-01-25 | 2019-08-01 | 国立大学法人大阪大学 | ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患の治療用医薬組成物 |
EP3815696A4 (en) * | 2018-06-26 | 2022-11-30 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | COMPOSITION COMPRISING AN ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE AND ITS USE FOR THE TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY |
US11168141B2 (en) | 2018-08-02 | 2021-11-09 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies |
CA3108289A1 (en) | 2018-08-02 | 2020-02-06 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy |
KR20210081322A (ko) | 2018-08-02 | 2021-07-01 | 다인 세라퓨틱스, 인크. | 근육 표적화 복합체 및 디스트로핀병증을 치료하기 위한 그의 용도 |
WO2021089736A1 (en) | 2019-11-06 | 2021-05-14 | Association Institut De Myologie | Combined therapy for muscular diseases |
CN113088531B (zh) * | 2021-03-25 | 2023-10-17 | 四川省药品检验研究院(四川省医疗器械检测中心) | 牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用 |
CN113355409A (zh) * | 2021-07-05 | 2021-09-07 | 北京华瑞康源生物科技发展有限公司 | 一种检测人dmd基因外显子拷贝数变异的引物及探针组合物和试剂盒 |
US11771776B2 (en) | 2021-07-09 | 2023-10-03 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies |
US11638761B2 (en) | 2021-07-09 | 2023-05-02 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy |
WO2023130959A1 (zh) * | 2022-01-04 | 2023-07-13 | 广州瑞风生物科技有限公司 | 靶向USH2A pre-mRNA的snRNA及其应用 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6156303A (en) | 1997-06-11 | 2000-12-05 | University Of Washington | Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom |
NZ600121A (en) | 2001-11-13 | 2013-12-20 | Univ Pennsylvania | A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby |
AU2002360291A1 (en) * | 2001-12-17 | 2003-06-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus (aav) serotype 8 sequences |
AU2003225410A1 (en) | 2003-03-21 | 2004-10-11 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure |
JP5054975B2 (ja) | 2003-09-30 | 2012-10-24 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | アデノ随伴ウイルス(aav)の同源系統群、配列、それらを含有するベクターおよびそれらの用途 |
EP3228711A1 (en) | 2004-06-28 | 2017-10-11 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
FR2874384B1 (fr) * | 2004-08-17 | 2010-07-30 | Genethon | Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables |
US8084601B2 (en) | 2008-09-11 | 2011-12-27 | Royal Holloway And Bedford New College Royal Holloway, University Of London | Oligomers |
JP5963678B2 (ja) * | 2009-11-12 | 2016-08-03 | ジ ユニバーシティ オブ ウェスタン オーストラリア | 病状を治療するためのアンチセンス分子及び方法 |
CA2792696C (en) | 2010-03-17 | 2020-01-07 | Association Institut De Myologie | Modified u7 snrnas for treatment of neuromuscular diseases |
TWI541024B (zh) | 2010-09-01 | 2016-07-11 | 日本新藥股份有限公司 | 反義核酸 |
BR112014033004B1 (pt) * | 2012-07-03 | 2021-10-19 | Biomarin Technologies B.V. | Oligonucleotídeo para tratamento de pacientes com distrofia muscular |
JP2016502858A (ja) * | 2012-12-20 | 2016-02-01 | サレプタ セラピューティクス, インコーポレイテッド | 筋ジストロフィを処置するための改善されたエキソンスキッピング組成物 |
US20160040162A1 (en) * | 2013-03-14 | 2016-02-11 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy |
US10131910B2 (en) * | 2014-07-10 | 2018-11-20 | Stichting Katholieke Universiteit | Antisense oligonucleotides for the treatment of Usher syndrome type 2 |
-
2015
- 2015-12-09 FR FR1562036A patent/FR3044926B1/fr active Active
-
2016
- 2016-12-09 CN CN201680072229.3A patent/CN108368508B/zh active Active
- 2016-12-09 CA CA3006515A patent/CA3006515A1/fr active Pending
- 2016-12-09 EP EP16825816.8A patent/EP3387130B1/fr active Active
- 2016-12-09 US US16/060,396 patent/US10752898B2/en active Active
- 2016-12-09 DK DK16825816.8T patent/DK3387130T3/da active
- 2016-12-09 WO PCT/FR2016/053312 patent/WO2017098187A1/fr active Application Filing
- 2016-12-09 ES ES16825816T patent/ES2845214T3/es active Active
- 2016-12-09 JP JP2018530093A patent/JP6878433B2/ja active Active
- 2016-12-09 PT PT168258168T patent/PT3387130T/pt unknown
-
2018
- 2018-11-08 HK HK18114253.3A patent/HK1255100A1/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2017098187A1 (fr) | 2017-06-15 |
FR3044926A1 (fr) | 2017-06-16 |
DK3387130T3 (da) | 2020-12-07 |
US10752898B2 (en) | 2020-08-25 |
HK1255100A1 (zh) | 2019-08-02 |
FR3044926B1 (fr) | 2020-01-31 |
CA3006515A1 (fr) | 2017-06-15 |
PT3387130T (pt) | 2020-11-20 |
CN108368508B (zh) | 2022-07-05 |
EP3387130A1 (fr) | 2018-10-17 |
CN108368508A (zh) | 2018-08-03 |
JP2019502376A (ja) | 2019-01-31 |
US20180362980A1 (en) | 2018-12-20 |
ES2845214T3 (es) | 2021-07-26 |
EP3387130B1 (fr) | 2020-11-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6878433B2 (ja) | ジストロフィンエクソン53スキッピングのための効果的な遺伝子治療ツール | |
US20230025574A1 (en) | Recombinant Adeno-Associated Virus Delivery of Exon 2-Targeted U7SNRNA Polynucleotide Constructs | |
JP5894543B2 (ja) | 神経筋疾患の治療のための修飾型U7snRNA | |
KR102398039B1 (ko) | 선택적 유전자 치료 발현 시스템 | |
EP2933335A1 (en) | A method of treating peripheral neuropathies and motor neuron diseases | |
US20220106592A1 (en) | DUX4 RNA Silencing Using RNA Targeting CRISPR-CAS13b | |
AU2023216733A1 (en) | Recombinant Virus Products And Methods For Inducing DUX4 Exon Skipping | |
KR20230128470A (ko) | 안면견갑상완 근이영양증(fshd)을 치료하기 위한 조성물및 방법 | |
US20230357795A1 (en) | Aav-mediated homology-independent targeted integration gene editing for correction of diverse dmd mutations in patients with muscular dystrophy | |
CN115996758A (zh) | 使sgcg在肌肉和心脏中充分表达的基因治疗表达*** | |
US20230365967A1 (en) | Abcd1 for treatment of neurodisorders | |
JP2023532806A (ja) | 新規の筋肉特異的プロモーター | |
CA3218631A1 (en) | Vector system | |
KR20230123925A (ko) | Neurod1 및 dlx2 벡터 | |
AU2022267320A1 (en) | Multiplex crispr/cas9-mediated target gene activation system |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191015 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200831 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20200831 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20201116 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210212 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210329 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210428 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6878433 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |