KR20230128470A - 안면견갑상완 근이영양증(fshd)을 치료하기 위한 조성물및 방법 - Google Patents

안면견갑상완 근이영양증(fshd)을 치료하기 위한 조성물및 방법 Download PDF

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Abstract

안면견갑상완 근이영양증(FSHD) 또는 육종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 근이영양증 또는 암을 치료, 개선, 진행 지연 및/또는 방지하기 위한 제품, 방법 및 용도가 본원에 개시된다. 보다 구체적으로, 이중 호메오박스 4(DUX4)의 발현을 억제하거나 하향조절하기 위한 RNA 간섭 기반 제품, 방법 및 용도가 본원에 개시된다. 보다 더 구체적으로, 본 개시는 DUX4의 발현을 억제하거나 하향조절하기 위한 U7 DUX4 안티센스 서열을 포함하는 핵산 및 세포에서 및/또는 FSHD 또는 암을 포함하지만 이에 제한되지 않는 근이영양증 또는 암을 갖는 대상체의 세포에서 DUX4의 발현을 억제하거나 하향조절하기 위해 상기 안티센스 서열을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

안면견갑상완 근이영양증(FSHD)을 치료하기 위한 조성물 및 방법
정부 이익의 진술
본 발명은 미국 국립 보건원의 보조금 번호 AR070604 하에 정부 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
서열 목록의 참조에 의한 편입
이 출원은 본 개시의 별도 부분으로 컴퓨터 판독 가능 형식의 서열 목록(파일명: 56061_Seqlisting.txt; 크기: 13,671바이트; 생성일: 2021년 11월 23일)을 포함하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 개시는 안면견갑상완 근이영양증(FSHD) 또는 육종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 근이영양증 또는 암의 치료 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 FSHD 또는 육종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 근이영양증 또는 암을 치료, 개선, 진행 지연 및/또는 방지하기 위한 RNA 간섭 기반 제품, 방법 및 용도를 제공한다. 구체적으로, 본 개시는 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제하거나 하향조절하기 위한 제품 및 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 개시는 DUX4의 발현을 억제하거나 하향조절하기 위한 U7 소형 핵 RNA(U7 snRNA) 및 상기 U7 snRNA를 사용하여 세포에서 및/또는 근이영양증 또는 암을 갖거나 가질 위험이 있는 대상체에서 DUX4 발현을 억제하거나 하향조절하는 방법을 제공한다.
근이영양증(MD)은 유전 질환의 한 그룹이다. 이 그룹은 움직임을 제어하는 골격근의 점진적인 약화 및 변성을 특징으로 한다. 일부 유형의 MD는 유아기 또는 아동기에 발생하지만 다른 유형은 중년 또는 그 이후까지 나타나지 않을 수 있다. 장애는 근육 약화의 분포 및 정도(일부 형태의 MD는 심장 근육에도 영향을 미침), 발병 연령, 진행 속도 및 유전 패턴의 측면에서 상이하다.
안면견갑상완 이영양증(FSHD)은 가장 일반적으로 유전되는 근이영양증 중 하나이며, 870,000명의 개인에게 영향을 미치는 것으로 추정된다. FSHD 증상의 전통적 설명은 얼굴, 견갑대 및 팔의 진행성 근육 약화를 포함하지만 질환은 몸통 및 하지 근육을 포함하여 더 광범위하게 나타날 수 있다. 비대칭 약화가 일반적이기 때문에 개체 내에서도 변동성이 흔히 나타난다. 발병 연령은 이르게는 유아기부터 성인기까지의 범위일 수 있으며 일반적으로 질환의 중증도와 관련되고, 조기 발병은 종종 더 중증 근육 약화와 관련된다. 대부분의 FSHD 환자는 정상적인 수명을 갖지만 호흡 부전이 발생할 수 있으며 이환 개체의 대략 25%는 50대에 휠체어에 의존하게 될 수 있고 더 중증 형태의 질환에서는 더 일찍 휠체어에 의존하게 되므로 질환으로 인해 쇠약해질 수 있는 반면 다른 사람들은 평생 보행을 유지한다.
FSHD는 골격근에 독성이 있는 전사 인자를 생산하는 이중 호메오박스 4 유전자(DUX4)의 비정상적인 발현에 의해 유발된다. DUX4는 일반적으로 인간 발생의 4세포 단계 동안 기능하지만 그 이후에는 아마도 고환 그리고 가능하게는 가슴샘을 제외한 본질적으로 모든 다른 조직에서 억제된다. FSHD 환자의 골격근에서 특정 유전적 및 후생적 요인이 공모하여 DUX4 억제 해제를 허용한 다음 분화 이상, 산화적 스트레스, 염증 침윤, 세포 사멸 및 근육 위축에 관여된 것들을 포함하여 몇몇 비정상적 유전자 발현 캐스케이드를 개시한다.
FSHD 분야의 발전에도 불구하고 FSHD에 대한 승인된 치료는 여전히 없으며 치료제 개발은 여전히 이 분야에서 중요한 요구사항이다. 전임상 연구에서 AAV 벡터에 의해 전달되는 RNAi 기반 유전자 치료법을 사용한 DUX4 침묵화의 안전성 및 효능은 이전에 나타났다(Wallace 등, Mol Ther Methods Clin Dev 8, 121-130 (2018)). 매우 적은 양의 DUX4 단백질도 근육 세포에 독성이 있을 수 있기 때문에 환자 근육에서 DUX4 침묵화를 최대화하는 데 도움이 되도록 단독으로 또는 조합 치료법에서 사용될 수 있는 대안적 메커니즘을 사용하는 추가 DUX4 침묵화 전략을 개발하는 것이 중요하다.
FSHD는 DUX4 탈저해(de-repression)로부터 발생하므로 치료법에 대한 가장 직접적인 경로는 근육에서의 DUX4 억제가 관여할 것이다. U7 소형 핵 RNA(U7 snRNA)에 의한 유전자 조절은 DUX4를 억제하는 강력한 접근 방식 중 하나이다. U7 snRNA는 RNA 분자이자 소형 핵 리보핵단백질 복합체(U7 snRNP)의 성분이며 히스톤 전-mRNA 처리에 필요하다.
아데노 관련 바이러스(AAV)와 같은 바이러스 벡터가 U7 snRNA를 근육에 전달하기 위해 사용되었다. AAV는 예를 들어 유전자 치료법에서 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 벡터로서 매력적으로 만드는 고유한 특징을 보유한다. 배양 중인 세포의 AAV 감염은 비세포변성이며 인간 및 다른 동물의 자연 감염은 조용하고 무증상이다. 더욱이, AAV는 많은 포유동물 세포를 감염시켜 생체내 많은 상이한 조직의 표적화 가능성을 허용한다. 더욱이, AAV는 천천히 분열하는 및 분열하지 않는 세포를 형질도입하고, 본질적으로 전사 활성 핵 에피솜(염색체외 요소)으로서 이들 세포의 수명 동안 지속될 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈은 재조합 게놈의 작제물을 실현 가능하게 만드는 플라스미드의 클로닝된 DNA로서 감염성이다. 또한 AAV 복제, 게놈 캡슐화 및 통합을 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 포함되어 있기 때문에 게놈의 내부 대략 4.3 kb(복제 및 구조적 캡시드 단백질, rep-cap 암호화)의 일부 또는 전부가 외래 DNA로 대체될 수 있다. rep 및 cap 단백질은 트랜스로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 중요한 특징은 매우 안정적이고 강건한 바이러스라는 것이다. 아데노바이러스를 비활성화하기 위해 사용되는 조건(수 시간 동안 56˚내지 65℃)을 쉽게 견디므로 AAV의 저온 보존이 덜 중요해진다. AAV는 심지어 동결건조될 수 있다. 마지막으로, AAV-감염 세포는 중복감염에 내성이 없다.
FSHD를 포함하지만 이에 제한되지 않는 근이영양증을 치료하기 위한 제품 및 방법에 대한 당업계의 요구가 남아있다. 본 개시는 근육 세포에서 DUX4 발현을 억제하기 위한 U7 소형 핵 RNA(U7 snRNA) 접근을 제공한다.
본 개시는 DUX4 발현을 억제하고 근이영양증을 치료, 개선, 진행 지연 및/또는 방지하기 위한 제품, 방법 및 용도를 제공한다. 일부 측면에서, 근이영양증은 안면견갑상완 이영양증(FSHD)이다.
본 개시는 핵산, DUX4 발현을 억제하도록 설계된 핵산을 포함하는 바이러스 벡터, 핵산 및 벡터를 포함하는 조성물 및 키트, 세포에서 DUX4 유전자의 발현을 억제 및/또는 방해하기 위해 이러한 제품을 사용하는 방법, 및 근이영양증을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시는 U7 이중 호메오박스 4(DUX4) 안티센스 리보핵산(asRNA)을 암호화하는 핵산을 제공하며, 핵산은 (a) 서열 번호 1-18 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (b) 서열 번호 1-18 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열; 또는 (c) (a) 및/또는 (b)의 뉴클레오티드 서열의 조합을 포함한다.
본 개시는 서열 번호 19-36 중 어느 하나에 제시된 DUX4 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화하는 U7 이중 호메오박스 4(DUX4) 안티센스 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 19-36 중 어느 하나에 제시된 DUX4 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화하는 U7 이중 호메오박스 4(DUX4) 안티센스 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 조합을 포함하는 핵산을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시의 핵산은 프로모터의 제어 하에 있고 따라서 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 프로모터는 U6 프로모터, U7 프로모터, tRNA 프로모터, H1 프로모터, 최소 CMV 프로모터, T7 프로모터, EF1-알파 프로모터, 최소 EF1-알파 프로모터, 또는 근육-특이적 프로모터 중 임의의 것이다. 일부 추가 측면에서, 근육-특이적 프로모터는 근육-특이적 프로모터는 unc45b 프로모터, tMCK 프로모터, 최소 MCK 프로모터, CK6 프로모터, CK7 프로모터, MHCK7 프로모터, 또는 CK1 프로모터이다.
일부 측면에서, 본 개시는 본 개시의 임의의 핵산 또는 이의 어느 하나 이상의 조합을 포함하는 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터를 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 핵산은 단일 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터로 조합된다. 일부 측면에서, 나노입자는 리포좀 또는 마이셀이다.
일부 측면에서, 본 개시는 본 개시의 핵산 또는 본 개시의 핵산 조합을 포함하는 벡터를 포함한다. 본 개시의 구현예는 벡터(예를 들어, 아데노 관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 말 관련 바이러스, 알파바이러스, 폭스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 소아마비 바이러스, 신드비스 바이러스, 백시니아 바이러스 또는 합성 바이러스, 예를 들어 키메라 바이러스, 모자이크 바이러스 또는 위유형화 바이러스, 및/또는 외래 단백질, 합성 중합체, 나노입자 또는 소분자를 포함하는 바이러스와 같은 바이러스 벡터)를 이용하여 본원에 개시된 핵산을 전달한다. 따라서, 일부 측면에서, 본 개시는 본 개시의 핵산 중 어느 하나 또는 이의 조합을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 측면에서, 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 바이러스 벡터이다. 일부 측면에서 AAV에는 rep 및 cap 유전자가 없다. 일부 측면에서, AAV는 재조합 AAV(rAAV) 또는 자가-상보적 재조합 AAV(scAAV)이다. 일부 측면에서, rAAV는 rAAV1, rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV7, rAAV8, rAAV9, rAAV10, rAAV11, rAAV12, rAAV13, rAAV-anc80, rAAV rh.74, rAAV rh.8, rAAVrh.10, 또는 rAAV-B1이다. 일부 측면에서, AAV는 rAAV-9이다.
본 개시는 (a) 본원에 기재된 바와 같은 핵산 또는 이러한 핵산의 조합; (b) 본원에 기재된 바와 같은 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터; (c) 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터; 또는 (d) 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 측면에서, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
본 개시는 세포를 (a) 본 개시의 핵산 또는 이의 조합; (b) 본 발명의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터; (c) 본 개시의 바이러스 벡터; 또는 (d) 본 발명의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제 및/또는 방해하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 세포는 대상체 내에 있다. 어떤 측면에서, 대상체는 인간 대상체이다.
본 개시는 대상체에 유효량의 (a) 본 개시의 핵산 또는 이의 조합; (b) 본 개시의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터; (c) 본 개시의 바이러스 벡터; 또는 (d) 본 개시의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 근이영양증을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 근이영양증은 안면견갑상완 근이영양증(FSHD)이다.
본 개시는 대상체에 유효량의 (a) 본 개시의 핵산 또는 이의 조합; (b) 본 개시의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터; (c) 본 개시의 바이러스 벡터; 또는 (d) 본 개시의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 암은 육종이다.
본 개시는 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제하기 위한 약제의 제조를 위한 (a) 본 개시의 핵산 또는 이의 조합; (b) 본 개시의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터; (c) 본 개시의 바이러스 벡터; 또는 (d) 본 개시의 조성물의 용도를 제공한다. 일부 측면에서, 세포는 대상체 내에 있다. 일부 측면에서, 대상체는 인간 대상체이다.
본 개시는 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제하기 위한 (a) 본 개시의 핵산 또는 이의 조합; (b) 본 개시의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터; (c) 본 개시의 바이러스 벡터; 또는 (d) 본 개시의 조성물의 용도를 제공한다. 일부 측면에서, 세포는 대상체 내에 있다. 일부 측면에서, 대상체는 인간 대상체이다.
본 개시는 근이영양증을 치료 또는 개선하기 위한 약제의 제조를 위한 (a) 본 개시의 핵산 또는 이의 조합; (b) 본 개시의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터; (c) 본 개시의 바이러스 벡터; 또는 (d) 본 개시의 조성물의 용도를 제공한다.
본 개시는 근이영양증을 치료 또는 개선하기 위한 (a) 본 개시의 핵산 또는 이의 조합; (b) 본 개시의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터; (c) 본 개시의 바이러스 벡터; 또는 (d) 본 개시의 조성물의 용도를 제공한다. 일부 측면에서 근이영양증은 FSHD이다.
본 개시는 암을 치료 또는 개선하기 위한 약제의 제조를 위한 (a) 본 개시의 핵산 또는 이의 조합; (b) 본 개시의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터; (c) 본 개시의 바이러스 벡터; 또는 (d) 본 개시의 조성물의 용도를 제공한다. 일부 측면에서, 암은 육종이다.
본 개시는 암을 치료 또는 개선하기 위한 (a) 본 개시의 핵산 또는 이의 조합; (b) 본 개시의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터; (c) 본 개시의 바이러스 벡터; 또는 (d) 본 개시의 조성물의 용도를 제공한다. 일부 측면에서, 암은 육종이다.
본 개시는 또한 방법 및 용도를 제공하며, 본 개시의 핵산, 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀, 벡터, 바이러스 벡터, 조성물 또는 약제가 근육내 주사, 경피 수송 또는 혈류로의 주사를 위해 제형화된다.
본 개시의 추가 측면 및 장점은 도면과 함께 취해진 하기 상세한 설명의 검토로부터 당업자에게 명백할 것이다. 그러나 본 개시의 정신 및 범위 내의 다양한 변화 및 변형이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이므로, 상세한 설명(도면 및 구체적인 실시예 포함)이 개시된 요지 사안의 구현예를 표시하지만 단지 예시의 방식으로 주어진다는 것이 이해되어야 한다.
도 1a-d는 U7-asDUX4 snRNA가 DUX4 매개 사멸로부터 HEK293 세포를 보호한다는 것을 나타낸다. 도 1a는 안정화 헤어핀 루프, Sm 결합 영역 및 DUX4 전-mRNA의 표적 부위에 상보적인 안티센스 서열로 구성된 U7-snRNA 구조를 나타낸다(서열에 대해서는 표 1 참고). 도 1b는 DUX4 mRNA의 상이한 부분을 표적화하는 18개의 U7-asDUX4 작제물의 모식도이다. ATG는 시작 코돈을 표시한다. 엑손 1(Ex1)은 전체 DUX4 개방 판독 프레임을 함유하는 반면 Ex2 및 Ex3은 3' 미번역 영역(3' UTR)을 함유한다. *P ≤0.05, ** P ≤0.01, ANOVA. N=3 독립 실험이 3회씩 수행되었다. 도 1c는 아폽토시스에 대한 카스파제-3/7 검정의 결과를 나타낸다. 모든 DUX4 표적화 U7-asDUX4 snRNA 작제물은 서열 6으로 처리된 세포에서를 제외하고 카스파제-3/7 활성을 유의하게 감소시켰다. 시험한 18개 작제물 중 14개는 카스파제-3/7 활성을 50% 초과 감소시켰다(예외는 1, 2, 6, 및 18이었음). 상대적 카스파제-3/7 활성이 가장 낮은 세포(DUX4로만 형질감염된 세포에서의 활성에 대해 정규화됨)는 U7-asDUX4-3(34±12), U7-asDUX4-4(26±7), U7-asDUX4-7(36±8), U7-asDUX4-11(30±3) 및 U7-asDUX4-16(33±6)으로 처리되었다. 도 1d는 DUX4 단독으로 형질감염된 세포와 비교하여 모든 U7-asDUX4-처리 세포에서 유의하게 증가된 세포 생존성을 나타내며, 각각 U7-asDUX4-7(94.8% ±4.9), U7-asDUX4-8(84.7% ±3.8) 및 U7-asDUX4-4(78.5% ±8.4)가 가장 큰 생존성 세포 백분율을 나타낸다(P<0.01, ANOVA; N=3 독립 실험).
도 2a-h는 형질감염된 HEK293 세포에서 U7-asDUX4 snRNA가 과발현된 DUX4 mRNA를 유의하게 감소시켰음을 나타낸다. RNAscope 검정: DUX4 mRNA 신호는 형질감염된 세포에서 갈색의 점상 점으로 나타났다(도 2a-d). 도 2a는 CMV.DUX4 및 DUX4 비표적화 U7 대조군 플라스미드로 공동 형질감염된 HEK293 세포에서 검출된 풍부한 DUX4 신호를 나타낸다. CMV.DUX4 및 U7-asDUX4-4(도 2b), U7-asDUX4-7(도 2c) 및 U7-asDUX4-8(도 2d) 플라스미드로 HEK293 세포를 공동 형질감염시킨 후 갈색 DUX4 신호의 감소. 도 2e는 형질감염되지 않은 HEK293 세포주에서 DUX4 탐침을 사용한 배경 신호를 나타낸다. 도 2f는 하우스키핑 유전자 PPIB가 모든 HEK293 세포에서 검출되었고 검정을 위한 양성 대조군으로 작용하였음을 나타낸다. 도 2g는 박테리아 유전자 dapB 탐침이 RNAscope 검정을 위한 음성 대조군으로 사용되었음을 나타낸다. 도 2h는 RNAscope 정량이 U7-asDUX4 snRNA 4, 7 및 8을 공동 발현하는 DUX4-형질감염 세포에서 유의하게 감소된 DUX4-양성 신호를 나타내었음을 나타낸다. 40x 대물렌즈. 눈금 막대, 50마이크론. 정량은 참고문헌 30에 기재된 바와 같이 수행되었다(개시 말미의 인용 참고). 3회 독립 실험에서 2개의 대표적 현미경 시야가 계수되었다; 각 점은 한 시야의 정량을 나타낸다. **P <0.01, ANOVA.
도 3a-e는 U7-asDUX4 snRNA가 형질감염된 HEK293 세포에서 DUX4 단백질 생산을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 도 3a는 C-말단 V5 에피토프 태그를 함유하는 전장 DUX4 발현 작제물의 모식도를 나타낸다. 14개 아미노산 V5 태그를 암호화하는 42 bp DNA 서열은 U7-asDUX4-4 표적 부위를 손상시켰다. 엑손 1(Ex1)의 검은색 막대는 DNA 결합 호메오도메인 1 및 2(HOX1 및 HOX2)를 표시하지만 축적에 맞는 것은 아니다. 인트론 1 및 2는 ∨ 기호로 표시된다. 도 3b는 DUX4-V5 신호가 빨간색 형광으로 나타나는, CMV.DUX4-V5로 공동 형질감염된 HEK293 세포의 항-V5 면역형광 염색을 나타낸다. 파란색 DAPI 염색(4',6-디아미디노-2-페닐인돌)은 HEK293 핵을 나타낸다. U7-asDUX4-7 및 U7-asDUX4-8 작제물은 비표적화 U7-snRNA로 처리된 세포와 비교하여 DUX4-V5 단백질 염색을 감소시켰다. U7-asDUX4-4 서열은 다른 검정에서 기능적이었지만, 도 3a에 표시된 바와 같이 V5 태그에 의한 그 결합 부위의 손상으로 인해 DUX4-V5 단백질 발현을 감소시키지 않았다. 40x 대물렌즈. 눈금 막대, 50마이크론. 도 3c는 웨스턴 블롯 검정에 사용된 Myc-DUX4-fl 작제물 및 DUX4의 선도 U7-asDUX4 표적화에 의한 DUX4 억제의 가능한 메커니즘을 나타낸다(텍스트에서 논의됨). DUX4-s는 C-말단 트랜스활성화 도메인이 없는 DUX4의 무독성 잠재적 이소형이다. 도 3d는 웨스턴 블롯 결과가 비표적화 U7-snRNA로 형질감염된 세포와 비교하여 U7-asDUX4 처리된 세포에서 감소된 DUX4 단백질을 실증했음을 나타낸다. CMV.myc-DUX4-형질감염 HEK293 세포 추출물에서 항-Myc 항체를 사용한 후 웨스턴 블롯에서 52 kDa 및 60 kDa의 두 밴드가 나타났다. 60 kDa 단백질 밴드가 형질감염되지 않은 세포에서 검출되었으며 대략 내인성 Myc 단백질의 크기로 이동한다. 이전의 면역형광, 세포 사멸 및 관찰된 RNAscope 결과와 일치하게, U7-asDUX4 snRNA는 비표적화 대조군과 비교하여 형질감염된 DUX4 발현을 감소시켰다. 웨스턴 블롯은 3회 독립 실험에서 단백질 추출물을 사용하여 3회 수행되었다(미가공 블롯을 도 6에 나타냄). 튜불린은 정규화물로 사용되었다. 도 3e는 도 3d의 웨스턴 블롯의 정량을 나타낸다. 비표적화 대조군과 비교될 때 U7-asDUX4-4(87.4% ± 9.8) 및 U7-asDUX4-8(84.7% ± 13.5)로 처리된 세포에서 DUX4 단백질 신호 강도가 유의하게 감소되었다. U7-asDUX4-5 및 -7은 유사한 스플라이스 접합부 부위를 표적화하고 U7-asDUX4-6은 인트론1 SD 부위를 표적화한다. 이 3개 작제물은 이 중 임의의 것이 전장 DUX4 mRNA의 정확한 스플라이싱을 변경하여 DUX4-s 생산을 유도할 수 있는지 결정하기 위해 시험되었다. 웨스턴 블롯 검정을 사용하여 DUX4 짧은 단백질 밴드(22 kDa)가 검출되지 않았다. ** P ≤0.01, ANOVA; N=3 독립 실험으로, 각 실험은 100% DUX4 발현으로 설정된 각각의 비표적화 대조군에 대해 정규화되었다.
도 4a-i는 U7-asDUX4 작제물이 FSHD 환자 유래 근관에서 내인성 DUX4 및 DUX4 관련 바이오마커를 감소시키는 것을 나타낸다. 도 4a는 FSHD 15A 근관이 U7-asDUX4로 처리된 세포와 비교하여 더 많은 양의 DUX4 mRNA 신호를 실증하였음을 나타낸다. 패널 도 4a의 화살표는 DUX4 양성의 한 예가 갈색 신호를 표시함을 나타낸다. FSHD 15A 근관에서 DUX4 발현은 U7-asDUX4-4(도 4b), U7-asDUX4-7(도 4c) 및 U7-asDUX4-8(도 4d)로 형질감염된 15A 세포에서 감소되거나 존재하지 않았다. 도 4e는 영향을 받지 않은 15V 근관에 매우 약한 신호가 존재하거나 신호가 없음을 나타내며, 이는 DUX4 탐침을 사용한 RNAscope 염색에 대한 음성 대조군으로 작용하였다. 도 4f는 RNAscope 검정을 위한 하우스키핑 유전자 PPIB 양성 대조군으로 염색된 15A 근관을 나타낸다. 도 1g는 박테리아 dapB 유전자 탐침으로 염색된 15A 근관을 나타내며, 이는 검정을 위한 음성 대조군으로 작용하였다. 100x 대물렌즈. 눈금 막대, 20마이크론. 도 1h는 DUX4 RNAscope 신호의 정량을 나타내며, 이는 참고문헌 30에 기재된 바와 같이 수행되었다. 3~4개의 대표적 현미경 시야가 3회 독립 실험에서 계수되었다; 각 점은 한 시야의 정량을 나타낸다. **P <0.01, ANOVA. DUX4 신호는 영향을 받지 않은 15V 세포뿐만 아니라 처리되지 않은 영향을 받은 15A 샘플과 비교하여 선도 U7-asDUX4 snRNA 플라스미드로 형질감염된 영향을 받은 15A 세포에서 없거나 매우 낮았다. **P ≤0.01, ANOVA. 도 4i는 U7-asDUX4 서열에 의한 DUX4-활성화 바이오마커의 녹다운을 나타낸다. 그래프는 비표적화 snRNA로 형질감염된 대조군과 비교하여 U7-asDUX4-처리 FSHD 15A 근관에서 ZSCAN4, PRAMEF12, MBD3L2 및 TRIM43의 유의한 감소를 나타낸다. N=4 독립 실험을 3회 또는 경우에 따라 2회씩 수행했다. **P ≤0.01, ANOVA.
도 5a-c는 인간 스플라이스 파인더(Human Splice Finder) 3.1 도구의 예측을 사용하여 DUX4 전-mRNA 상에서 예측된 스플라이스 부위 및 스플라이스 인핸서/사일런서 부위를 나타낸다. 도 5a는 예측된 스플라이스 모티프(도 5b-c)와 중첩된 U7-asDUX4 결합 부위 위치를 나타낸다.
도 6a-c는 미가공 웨스턴 블롯 1(도 6a), 2(도 6b) 및 3(도 6c)을 나타낸다.
도 7은 DUX4-s가 네스티드(nested) RT-PCR로 검출되지 않았음을 나타낸다. cDNA 합성은 이전에 기재된 올리고-dT 어댑터 프라이머(Giesige 등, JCI Insight 2018;3(22):e123538)로 프라이밍되었다. 3 μl의 cDNA 생성물이 1차 PCR 반응에서 주형으로 사용되었고, 이 생성물이 2차 PCR에서 1/10로 희석되었다. DUX4-s에 대해 예상되는 569 bp 밴드는 양성 대조군(DUX4-s 형질감염된 세포)에서만 발견되었지만 다른 샘플에서는 발견되지 않았다. 이 실험은 DUX4-형질감염 HEK293 및 15A 인간 FSHD 근관에서 적어도 4회 반복되었다. DNA 사다리, TrackIt 1 Kb Plus DNA 사다리. 1.5% 아가로스 겔.

도 8은 인간 15V FSHD 근모세포가 CMV.GFP 플라스미드로 효율적으로 형질감염됨을 나타낸다. 이 실험은 인간 근모세포가 U7-snRNA 플라스미드 형질감염을 통한 DUX4 억제의 유효성을 시험하기 위해 사용될 수 있음을 확인하기 위해 수행되었다.
도 9는 생체내 사용을 위한 RNAscope 탐침의 개발을 나타낸다. RNAscope 탐침은 DUX4 및 5개의 DUX4-활성화 바이오마커인 MBD3L2, PRAMEF12, LEUTX, ZSCAN4 및 TRIM43을 검출하도록 설계되었다. 도 9의 상단 패널은 DUX4 플라스미드 형질감염된 HEK293(갈색 염색)을 사용한 시험관내 탐침의 최적화를 나타낸다. 하단 패널은 FSHD 환자 근육 생검의 순차적 절편에서 DUX4 및 TRIM43 신호의 공동편재를 나타낸다. 화살표는 신호를 나타낸다. 문자 a, b, c는 순차적 절편을 배향하는 것을 돕는다. DUX4 탐침으로부터의 명백한 신호가 20개 중 11개 샘플에서, TRIM43은 20개 중 13개 샘플에서 확인되었다. 2개 샘플은 분명한 DUX4 신호가 없이 TRIM43이 있었고 7개 샘플은 DUX4 또는 TRIM43 신호를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 DUX4가 FSHD 환자 생검의 모든 근핵에서 균일하게 발견되지 않음을 실증한다. 이러한 결과는 또한 RNAscope가 임상 사용을 위한 결과 측정으로 사용될 수 있는 환자 샘플에서 생체내 DUX4 mRNA를 검출하기 위해 사용될 수 있음을 실증한다.
본 개시는 근육에서 DUX4의 발현이 안면견갑상완 근이영양증(FSHD)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 근이영양증을 유발하는 것으로 알려져 있기 때문에 DUX4 단백질 생산을 저해하거나 억제함으로써 전사 후 이중 호메오박스 단백질 4(DUX4) 유전자 발현을 달성하기 위한 신규 전략을 제공한다. 따라서, 일부 측면에서, 본원에 기재된 제품 및 방법은 FSHD의 치료, 개선, 진행 지연 및/또는 방지에 사용된다.
DUX4 유전자는 대략 45 kDA 단백질을 암호화한다; UniProtKB - Q9UBX2(DUX4_인간)를 참고한다. DUX4 유전자의 탈저해는 FSHD의 질환 발병에 관여한다. 탈저해는 D4Z4 반복 수축 또는 염색질 변형인자 유전자 SMCHD1 또는 DNMT3B의 돌연변이라는 2개의 알려진 메커니즘을 통해 발생할 수 있다. 전자의 경우 영향을 받지 않은 대상체에서 D4Z4 어레이는 11~100 반복으로 구성되는 반면 FSHD1 환자에서는 어레이가 1~10 반복으로 감소된다(PubMed:19320656). 두 조건 모두 염색체 4q35에서 DNA 저메틸화를 유발하여 DUX4 발현을 허용하는 염색체 환경을 만들 수 있다.
DUX4는 신체 조직에서 후생적으로 억제되는 D4Z4 거대부수체 반복에 위치한다. FSHD1에서 D4Z4 염색질 이완은 골격근 핵의 하위세트에서 DUX4의 비효율적인 후생적 억제 및 DUX4 단백질 발현의 다양한 패턴을 초래한다. 골격근에서 DUX4의 이소성 발현은 줄기 세포 및 생식계열 유전자의 발현을 활성화하고, 체세포에서 과발현될 때 DUX4는 궁극적으로 세포 사멸을 야기할 수 있다.
각 D4Z4 반복 단위는 2개의 호메오박스를 암호화하는 개방 판독 프레임(DUX4라고 함)을 갖는다; 반복 어레이 및 ORF가 다른 포유동물에서 보존된다. 암호화된 단백질은 ZSCAN4, PRAMEF12, TRIM43 및 MBD3L2(PMID: 24861551)를 포함하는 FSHD 질환 바이오마커로 간주되는 일부를 포함하여 여러 유전자의 전사 활성화제로서 기능하는 것으로 보고되었다. 거대부수체 반복의 수축은 상염색체 우성 FSHD를 유발한다. 대안적 스플라이싱은 여러 전사체 변이체를 생성한다.
본 개시의 일부 구현예에서, DUX4 핵산 및 단백질이 제공된다. 일부 측면에서, 인간 DUX4를 암호화하는 핵산이 서열 번호 37에 제시된 뉴클레오티드 서열에 제시된다. 일부 측면에서, 인간 DUX4의 아미노산 서열이 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열에 제시된다. 다양한 측면에서, 본 개시의 방법은 또한 서열 번호 37에 제시된 뉴클레오티드 서열의 이소형 및 변이체를 표적화한다. 일부 측면에서, 변이체는 서열 번호 37에 제시된 뉴클레오티드 서열과 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71% 및 70% 동일성을 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시의 방법은 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산의 이소형 및 변이체를 표적화한다. 일부 측면에서, 변이체는 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71% 및 70% 동일성을 포함한다.
현재 FSHD에 대한 치료는 없으며, 근이영양증 중 그 상대적 풍부도에도 불구하고 FSHD를 표적화하는 번역 연구는 거의 발표되지 않았다. 몇몇 FSHD 후보 유전자가 확인되었지만 최근의 여러 연구는 FSHD 병인의 주요 기여요인이 전사 인자를 암호화하는 친-아폽토시스 DUX4 유전자임을 지지한다. 따라서 가장 간단한 관점에서, DUX4-과발현은 FSHD의 기저에 있는 주요 병원성 손상이다(Chen 등, (2016) Mol Ther 24, 1405-1411; Ansseau 등 (2017) Genes (Basel) 8; Lek 등 (2020) Sci Transl Med 12; Himeda 등 (2016) Mol Ther 24, 527-535; DeSimone 등 (2019) Sci Adv 5, 12; Lim 등 (2020) Proc Natl Acad Sci U S A 117, 16509-16515; Wallace 등 (2018), 상기 문헌; Rojas 등 (2020) J Pharmacol Exp Ther. Sep; 374(3):489-498).
일부 구현예에서, 본 개시는 안티센스 전사체, 천연 안티센스 전사체, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드로도 지칭되는 안티센스 RNA(asRNA)를 제공한다. 안티센스 RNA는 혼성화하고 이에 따라 단백질로의 그 번역을 차단하는, 단백질 코딩 메신저 RNA(mRNA)에 상보적인 단일 가닥 RNA이다. asRNA의 주요 기능은 유전자 발현을 조절하는 것이다. 안티센스 RNA는 본원에 기재된 바와 같이 합성적으로 제조될 수도 있고, DUX4 발현을 하향조절하기 위해 사용된다.
본 개시는 U7-안티센스(as)DUX4 snRNA를 사용하여 DUX4 녹다운 또는 침묵화를 달성하기 위한 신규 작제물 및 방법을 제공한다. U7-as snRNA는 핵에서 전사된 다음 세포질로 외수송되고, 여기서 Sm 및 Lsm 단백질과 조립된다. 조립된 U7-snRNP는 세포질에 남아 있거나 다시 핵으로 내수송될 수 있다. 핵에서 이들은 스플라이싱 기구와 관련되는 반면, 세포질에서는 mRNA 턴오버에서 정상적으로 기능하는 P 바디와 관련된다(Liu 등 (2007). PNAS 104(28), 11655-11659). 유사하게, mRNA는 핵에서 전사되고 성숙된 다음 번역을 위해 세포질로 수송되기 때문에 핵과 세포질 모두에서 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 근육에서 독성 DUX4 유전자의 발현을 하향조절하거나 억제함으로써 FSHD를 치료하기 위한 유전자 치료법 접근법을 제공한다. 전장 DUX4 유전자 생성물은 세포 사멸 및 근육 독성을 유발하므로, 본원에 기재된 FSHD 치료법은 전장 DUX4 발현을 억제하도록 설계된다. 본원에 기재된 일부 측면에서, DUX4 억제는 U7-snRNA 안티센스 발현 카세트(U7-asDUX4라고 함)를 사용하여 달성된다. 이러한 비코딩 RNA는 DUX4 시작 코돈, 스플라이스 부위 또는 폴리아데닐화 신호를 차폐하여 전장 DUX4 전-mRNA의 생산 또는 성숙을 억제하도록 설계되었다. U7-asDUX4 작제물은 3개의 주요 특징: 한쪽 말단의 안정화 헤어핀 구조, Sm 단백질에 대한 결합 부위, 임의의 관심 유전자, 예를 들어 DUX4를 표적화하도록 변형될 수 있는 안티센스 영역을 갖는다.
본원에서 확인된 일부 작제물은 엑손 1/인트론1 접합부(즉, U7-asDUX4-4 및 -7) 또는 DUX4 폴리 A 신호(PAS)(즉, U7-asDUX4-8)를 표적화한다. 시험관내 및 생체내 DUX4 및 DUX4-활성화 바이오마커를 감소시키는 것으로 나타난, DUX4 PAS에 결합하는 안티센스 서열의 사용이 화학적으로 합성된 ASO를 사용하여 이전에 실증되었지만 스플라이스 접합부를 표적화하는 것은 새로운 접근이다(Vanderplanck 등 (2011) PLoS One 6, e26820; Marsollier 등 (2016) Hum Mol Genet 25, 1468-1478; Chen, 등 (2016) Mol Ther 24, 1405-1411; Ansseau 등 (2017) Genes (Basel) 8). 본원에 기재된 U7-asDUX4 서열은 Sm 및 Lsm 단백질을 모집하기 위해 추가 서열을 통합하고 프로모터로부터 생체내 발현되기 때문에 독특하고 신규하며 ASO와 구별된다. 폴리아데닐화는 신생 mRNA를 안정화하고 번역을 위해 핵공을 통해 세포질로 이동하는 mRNA를 조정하는 데 필요한 중요한 과정이다. 화학적으로 합성된 DNA 기반 ASO는 DNA:RNA 하이브리드를 형성하고 표적 전사체에 대해 RNAse H를 활성화하여 작동할 수 있지만, DUX4 PAS와 염기쌍을 형성하도록 설계된 공개된 ASO 서열이 신호를 차폐하고 폴리아데닐화를 방지하여 DUX4 mRNA 탈안정화를 야기함으로써 작동할 수도 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 DUX4를 표적화하고 DUX4의 발현을 억제하는 U7 snRNA(U7-asDUX4)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 본 개시는 본원에 기재된 다양한 뉴클레오티드 서열을 함유하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 구성되는 다양한 핵산을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산은 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산은 본질적으로 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 핵산은 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
따라서, 일부 측면에서, 본 개시는 DUX4 유전자의 발현을 방지 및 억제하기 위해 억제 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함한다. 억제 RNA는 DUX4의 발현을 억제하는 안티센스 서열을 포함한다. 서열 번호 1-18에 제시된 서열은 DUX4 유전자의 발현을 방지하고 억제하는 U7 snRNA를 암호화하는 DNA 서열이다.
일부 측면에서, 용어 "U7-asDUX4"는 서열 번호 1-18 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열을 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 다른 측면에서, 본 개시는 서열 번호 19-36 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DUX4 서열을 표적화하는 DUX4 안티센스, 예를 들어 U7-asDUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함한다.
일부 측면에서, 용어 "U7-asDUX4"는 서열 번호 19-36 중 어느 하나에 제시된 DUX4 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화하는 U7 이중 호메오박스 4(DUX4) 안티센스 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
따라서 일부 측면에서 본 개시는 (1) 서열 번호 1-18에 제시된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하는 핵산 또는 서열 번호 1-18에 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 포함하는 이의 변이체; 및 (2) 서열 번호 19-36에 제시된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 표적화하는 snRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시는 U7 프로모터의 제어 하에 서열 번호 1-18에 제시된 서열 중 어느 하나를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 또는 서열 번호 1-18에 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시는 근육-특이적 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 또 다른 프로모터의 제어 하에 서열 1-18에 제시된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하는 핵산을 포함한다.
따라서 일부 측면에서 본 개시는 U7 프로모터의 제어 하에 서열 번호 19-36에 제시된 표적 서열 중 어느 하나에 결합하는 snRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시는 근육-특이적 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 또 다른 프로모터의 제어 하에 서열 번호 19-36에 제시된 표적 서열 중 어느 하나에 결합하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
본원에 기재된 DUX4의 snRNA 표적화에 사용되는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래 표 1에서 확인된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 뉴클레오티드 서열의 다양한 특성이 아래 표 2에 제시되어 있다.
상기 표 1 및 2에 제시된 DNA 뉴클레오티드 서열은 (1) DUX4를 표적화하기 위한 RNA 안티센스 서열을 암호화하거나 (2) DUX4 snRNA에 대한 표적 서열 부위이다.
일부 측면에서, 본 개시는 DUX4 유전자의 발현을 억제하거나 방해하는 snRNA 또는 U-RNA를 제공한다. 일부 측면에서, snRNA는 인간 또는 뮤린 U7 프로모터, 즉 U7snRNA에 의해 또는 그의 제어 하에 구동된다. 일부 측면에서, snRNA는 예를 들어 조직 특이적 또는 근육 특이적 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다른 프로모터의 제어 하에 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 제품 및 방법은 DUX4 발현을 하향조절하거나 억제하기 위해 일반적으로 U-RNA로도 지칭되는 소형 핵 리보핵산(snRNA)을 암호화하는 핵산을 포함한다. snRNA는 진핵 세포에서 세포 핵의 스플라이싱 반점 및 카잘 바디 내에서 발견되는 소형 RNA 분자의 한 클래스이다. 소형 핵 RNA는 특정 단백질 세트와 관련되며 복합체는 소형 핵 리보핵단백질(snRNP, 종종 "스널프(snurps)"로 발음됨)로 지칭된다. 각 snRNP 입자는 snRNA 성분 및 몇몇 snRNP 특이적 단백질(핵 단백질의 한 패밀리인 Sm 단백질 포함)로 이루어진다. snRNA는 이의 관련 단백질과 함께 전-mRNA 기질의 특정 서열에 결합하는 리보핵단백질 복합체(snRNP)를 형성한다. 이들은 RNA 중합효소 II 또는 RNA 중합효소 III에 의해 전사된다. snRNA는 종종 공통 서열 특징 및 RNA 결합 LSm 단백질과 같은 관련된 단백질 인자 둘 모두에 기반하여 2개 클래스로 나뉜다. Sm-클래스 snRNA로 알려진 첫 번째 클래스는 U1, U2, U4, U4atac, U5, U7, U11 및 U12로 구성된다. Sm-클래스 snRNA는 RNA 중합효소 II에 의해 전사된다. Lsm-클래스 snRNA로 알려진 두 번째 클래스는 U6 및 U6atac으로 구성된다. Lsm-클래스 snRNA는 RNA 중합효소 III에 의해 전사되며 Sm-클래스 snRNA와 달리 핵을 절대 떠나지 않는다. 일부 측면에서, 본 개시는 DUX4 안티센스 서열의 전달을 위한 U7 snRNA를 포함하는 AAV 벡터의 제조 및 투여를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시는 유전자 발현을 억제, 녹다운 또는 방해하기 위해 U7 snRNA 분자를 사용한다. U7 snRNA는 일반적으로 히스톤 전-mRNA 3' 말단 처리에 관여하지만, 일부 측면에서 스플라이싱 조절을 위해 다목적 도구로 또는 세포에서 연속 발현되는 안티센스 RNA로 전환된다(Goyenvalle 등, Science 306(5702): 1796-9 (2004)). 야생형 U7 Sm 결합 부위를 스플라이소좀 snRNA로부터 유래된 공통 서열로 대체함으로써 생성된 RNA는 스플라이소좀 snRNA에서 발견되는 7개의 Sm 단백질과 조립된다(도 7). 그 결과, 이 U7 Sm OPT RNA는 핵질에서 더 효율적으로 축적되고 더 이상 히스톤 전-mRNA 절단을 매개하지 않을 것이지만 여전히 히스톤 전-mRNA에 결합하고 야생형 U7 snRNP에 대한 경쟁적 억제제로 작용할 수 있다. 히스톤 하류 요소에 결합하는 서열을 스플라이싱 기질의 특정 표적과 상보적인 것으로 추가 대체함으로써 특정 스플라이싱 이벤트를 조절할 수 있는 U7 snRNA를 생성할 수 있다. U7 유도체를 사용하는 장점은 안티센스 서열이 소형 핵 리보핵단백질(snRNP) 복합체에 포매된다는 것이다. 더욱이, 유전자 치료법 벡터로 포매될 때, 이러한 소형 RNA는 단일 주사 후 표적 세포 내에서 영구적으로 발현될 수 있다[Gorman 등, Proc Natl Acad Sci. 28; 95(9): 4929-34 (1998); Goyenvalle 등, Science. 3;306(5702):1796-9 (2004); Levy 등, Eur. J. Hum. Genet. 18(9): 969-70 (2010); Wein 등, Hum. Mutat. 31(2): 136-42, (2010); Wein 등, Nat. Med. 20(9): 992-1000 (2014)]. CUG 반복의 발현을 변경하기 위한 U7의 사용이 DM1 환자 세포주에서 시험관내 시험되었고[Francois 등, Nat. Struct. Mol. Biol. 18(1): 85-7 (2011)] CUG 반복을 표적화하는 U7 RNA는 DUX4 관련 초점의 양을 감소시키고 비정상 스플라이싱 패턴을 수정하는 것으로 나타났다; 그러나 이 접근은 렌티바이러스에 기반하였고 더 이상 생체내 추구되지 않았다. AAV 접근을 사용하여 신경근 장애에서 U7snRNA 시스템의 가능성이 생체내 조사되었다(AAV.U7)[Gorman 등, Proc Natl Acad Sci. 28;95(9):4929-34 (1998); Goyenvalle 등, Science. 3; 306(5702):1796-9 (2004); Levy 등, Eur. J. Hum. Genet. 18(9): 969-70 (2010); Wein 등, Hum. Mutat. 31(2): 136-42 (2010); Wein 등, Nat. Med. 20(9): 992-1000 (2014)].
U7 snRNA는 일반적으로 히스톤 전-mRNA 3' 말단 처리에 관여하지만, 스플라이싱 조절을 위한 다목적 도구로 또는 세포에서 연속 발현되는 안티센스 RNA로 또한 사용된다. U7 유도체 사용의 한 가지 장점은 안티센스 서열이 소형 핵 리보핵단백질(snRNP) 복합체로 포매된다는 것이다. 또한, 유전자 치료법 벡터로 포매될 때 이러한 소형 RNA는 단일 주사 후 표적 세포 내부에서 영구적으로 발현될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시는 본 개시의 임의의 핵산 또는 이의 어느 하나 이상의 조합을 포함하는 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터를 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 핵산은 단일 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터로 조합된다. 일부 측면에서, 나노입자는 리포좀 또는 마이셀이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기재된 임의의 핵산 또는 임의의 핵산의 조합을 포함하는 벡터를 포함한다. 본 개시의 구현예는 벡터(예를 들어, 아데노 관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 말 관련 바이러스, 알파바이러스, 폭스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 소아마비 바이러스, 신드비스 바이러스, 백시니아 바이러스 또는 합성 바이러스, 예를 들어 키메라 바이러스, 모자이크 바이러스 또는 위유형화 바이러스, 및/또는 외래 단백질, 합성 중합체, 나노입자 또는 소분자를 포함하는 바이러스와 같은 바이러스 벡터)를 이용하여 본원에 개시된 핵산을 전달한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 벡터(예를 들어, 아데노 관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 말 관련 바이러스, 알파바이러스, 폭스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 소아마비 바이러스, 신드비스 바이러스, 백시니아 바이러스 또는 합성 바이러스, 예를 들어 키메라 바이러스, 모자이크 바이러스 또는 위유형화 바이러스, 및/또는 외래 단백질, 합성 중합체, 나노입자 또는 소분자를 포함하는 바이러스와 같은 바이러스 벡터)를 포함하여 본원에 개시된 핵산 또는 핵산의 조합을 전달한다.
일부 구현예에서, 벡터는 AAV 벡터이다. 일부 측면에서, 벡터는 단일 가닥 AAV 벡터이다. 일부 측면에서 AAV는 재조합 AAV(rAAV)이다. 일부 측면에서, rAAV에는 rep 및 cap 유전자가 없다. 일부 측면에서 rAAV는 자가 상보적(sc)AAV이다.
따라서, 일부 측면에서, 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV), 예컨대 AAV1(즉, AAV1 전위 말단 반복(ITR) 및 AAV1 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV2(즉, AAV2 ITR 및 AAV2 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV3(즉, AAV3 ITR 및 AAV3 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV4(즉, AAV4 ITR 및 AAV4 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV5(즉, AAV5 ITR 및 AAV5 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV6(즉, AAV6 ITR 및 AAV6 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV7(즉, AAV7 ITR 및 AAV7 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV8(즉, AAV8 ITR 및 AAV8 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV9(즉, AAV9 ITR 및 AAV9 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAVrh74(즉, AAVrh74 ITR 및 AAVrh74 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAVrh.8(즉, AAVrh.8 ITR 및 AAVrh.8 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAVrh.10(즉, AAVrh.10 ITR 및 AAVrh.10 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV11(즉, AAV11 ITR 및 AAV11 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV12(즉, AAV12 ITR 및 AAV12 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV13(즉, AAV13 ITR 및 AAV13 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV-anc80, AAV rh.74, AAV rh.8, AAVrh.10 또는 AAV-B1이다.
따라서, 본 개시의 일부 구현예는 서열 번호 1-18 중 임의의 것에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 또는 상세한 설명에서 본원에 개시된 바와 같이 서열 번호 1-18 중 임의의 것에 제시된 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 rAAV 게놈을 포함한다. 추가로, 본 개시의 일부 구현예는 상세한 설명에서 본원에 개시된 바와 같이 서열 번호 19-36 중 임의의 것에 제시된 표적 서열에 결합하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV 게놈을 포함한다.
AAV는 복제 결함 파보바이러스로, 그 단일 가닥 DNA 게놈은 전위 말단 반복(ITR)의 145개 뉴클레오티드를 포함하여 약 4.7 kb 길이이다. AAV에는 여러 혈청형이 있다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다. 예를 들어, AAV1의 전체 게놈은 GenBank 접근 번호 NC_002077에서 제공되며; AAV2의 전체 게놈은 GenBank 접근 번호 NC_001401 및 문헌(Srivastava 등, J. Virol., 45: 555-564 {1983))에서 제공되고; AAV3의 전체 게놈은 GenBank 접근 번호 NC_1829에서 제공되고; AAV4의 전체 게놈은 GenBank 접근 번호 NC_001829에서 제공되고; AAV5 게놈은 GenBank 접근 번호 AF085716에서 제공되고; AAV6의 전체 게놈은 GenBank 접근 번호 NC_00 1862에서 제공되고; AAV7 및 AAV8 게놈의 적어도 일부는 GenBank 접근 번호 AX753246 및 AX753249에서 각각 제공되고(또한 AAV8에 관한 미국 특허 번호 7,282,199 및 7,790,449 참고); AAV9 게놈은 문헌(Gao 등, J. Virol., 78: 6381-6388 (2004))에서 제공되고; AAV10 게놈은 문헌(Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006))에서 제공되고; AAV11 게놈은 문헌(Virology, 330(2): 375-383 (2004))에서 제공되고; AAV12 게놈은 문헌(J Virol. 2008 Feb; 82(3):1399-406)에서 제공되고; AAV13 게놈은 문헌(J Virol 2008; 82:8911)에서 제공된다. 바이러스 DNA 복제(rep), 캡슐화/패키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 시스-작용 서열은 AAV ITR 내에 포함되어 있다. 3개의 AAV 프로모터(이의 상대적 맵 위치에 대해 p5, p19 및 p40으로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 2개의 AAV 내부 개방 판독 프레임의 발현을 지시한다. 2개의 rep 프로모터(p5 및 p19)는 단일 AAV 인트론(뉴클레오티드 2107 및 2227)의 차별적 스플라이싱과 커플링되어 rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질(rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40)의 생산을 초래한다. Rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈 복제를 담당하는 여러 효소 특성을 보유한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되며 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 암호화한다. 대안적 스플라이싱 및 비공통 번역 시작 부위가 3개의 관련된 캡시드 단백질의 생산을 담당한다. 단일 공통 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 맵 위치 95에 위치한다. AAV의 생활 주기 및 유전학은 문헌(Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992))에서 검토된다.
AAV는 이를, 예를 들어 유전자 치료법에서, 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 벡터로서 매력적으로 만드는 고유한 특징을 보유한다. 배양 중인 세포의 AAV 감염은 비세포변성이며 인간 및 다른 동물의 자연 감염은 조용하고 무증상이다. 더욱이, AAV는 많은 포유동물 세포를 감염시켜 생체내 여러 상이한 조직의 표적화 가능성을 허용한다. 더욱이, AAV는 천천히 분열하는 및 분열하지 않는 세포를 형질도입하고, 본질적으로 전사 활성 핵 에피솜(염색체외 요소)으로서 이들 세포의 수명 동안 지속될 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈은 재조합 게놈의 작제를 실현 가능하게 만드는 플라스미드의 클로닝된 DNA로서 감염성이다. 또한 AAV 복제, 게놈 캡슐화 및 통합을 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 포함되어 있기 때문에 게놈의 내부 대략 4.7 kb(복제 및 구조적 캡시드 단백질, rep-cap을 암호화함)의 일부 또는 전부가 외래 DNA로 대체될 수 있다. rep 및 cap 단백질은 트랜스로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 중요한 특징은 매우 안정적이고 왕성한 바이러스라는 것이다. 아데노바이러스를 비활성화하기 위해 사용되는 조건(몇 시간 동안 56˚내지 65℃)을 쉽게 견뎌서 AAV의 저온 보존을 덜 중요하게 만든다. AAV는 동결건조될 수 있으며 AAV-감염 세포는 중복감염에 내성이 없다.
일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 게놈을 포함하는 본 개시의 DNA 플라스미드가 제공된다. DNA 플라스미드는 rAAV 게놈을 감염성 바이러스 입자로 조립하기 위해 AAV의 헬퍼 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, E1-결실 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)로의 감염이 허용되는 세포로 전달된다. 패키징될 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능이 세포에 제공되는 rAAV 입자를 제조하는 기술은 당업계에서 표준이다. rAAV의 생산은 하기 성분: rAAV 게놈, rAAV 게놈과 분리된(즉, rAAV 게놈 내에 있지 않은) AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능이 단일 세포(본원에서 패키징 세포로 표시됨) 내에 존재하는 것을 필요로 한다. AAV rep 유전자는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있고, AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-anc80, AAV rh.74, AAV rh.8, AAVrh.10, 및 AAV-B1을 포함하지만 이에 제한되지 않는 rAAV 게놈 ITR과 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 일부 측면에서, rAAV 게놈의 AAV DNA는 AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-anc80, AAV rh.74, AAV rh.8, AAVrh.10, 및 AAV-B1을 포함하지만 이에 제한되지 않는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV도 본 개시에 포함된다. 예를 들어, 문헌(Marsic 등, Molecular Therapy 22(11): 1900-1909 (2014))을 참고한다. 상기 주지된 바와 같이, 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 당업계에 알려져 있다. 동족체 성분의 사용이 구체적으로 고려된다. 위유형화 rAAV의 제조는 예를 들어 WO 01/83692에 개시되어 있으며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 AAV 게놈은 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 전-mRNA에서 주요 엑손 정의 요소에 결합하는 하나 이상의 안티센스 서열 측면에 있는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 게놈은 예를 들어 하나 이상의 DUX4 안티센스 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 측면에 있는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. Ambion Inc.(Austin, TX), Darmacon Inc.(Lafayette, CO), InvivoGen(San Diego, CA) 및 Molecular Research Laboratories, LLC(Herndon, VA)와 같은 상업적 공급업체가 맞춤형 억제 RNA 분자를 생성한다. 또한 SILENCER™ siRNA 작제 키트(Ambion Inc., Austin, TX) 또는 psiRNA 시스템(InvivoGen, San Diego, CA)과 같은 맞춤형 siRNA 분자를 제조하기 위해 상업적 키트를 이용 가능하다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 AAV 게놈은 적어도 하나의 DUX4-표적화 폴리뉴클레오티드 작제물 측면에 있는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 snRNA, snRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 표적 서열에 결합하도록 설계된 snRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 측면에서, snRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 DUX4를 표적화하는 다른 폴리뉴클레오티드 작제물과 함께 투여된다.
다양한 측면에서, 조직 특이적 발현을 허용하기 위해 프로모터가 사용된다. 일부 측면에서, snRNA는 U6 프로모터, U7 프로모터, T7 프로모터, tRNA 프로모터, H1 프로모터, EF1-알파 프로모터, 최소 EF1-알파 프로모터, unc45b 프로모터, CK1 프로모터, CK6 프로모터, CK7 프로모터, 미니CMV 프로모터, CMV 프로모터, 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터, 알파-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터(MHCK7), rAAV 게놈의 tMCK 프로모터, 최소 MCK 프로모터 또는 데스민 프로모터와 같은 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 프로모터 하에서 발현되며 AAV DNA는 AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-anc80, AAV rh.74, AAV rh.8, AAVrh.10, 및 AAV-B1을 포함하지만 이에 제한되지 않는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 상기 본원에 제시된 바와 같이, 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 당업계에 알려져 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 하나의 AAV 혈청형으로부터의 ITR 및 상이한 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함하는 위유형화 AAV이다. 일부 구현예에서, 위유형화 AAV는 AAV2/9(즉, AAV2 ITR 및 AAV9 캡시드 단백질을 포함하는 AAV)이다. 일부 구현예에서, 위유형화 AAV는 AAV2/8(즉, AAV2 ITR 및 AAV8 캡시드 단백질을 포함하는 AAV)이다. 일부 구현예에서, 위유형화 AAV는 AAV2/1(즉, AAV2 ITR 및 AAV1 캡시드 단백질을 포함하는 AAV)이다.
일부 구현예에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-anc80, AAVrh74, AAVrh.8, 또는 AAVrh.10, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 또는 AAV-B1으로부터의 캡시드 단백질 중 하나 이상의 키메라를 포함하는 캡시드 단백질과 같은 재조합 캡시드 단백질을 포함한다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV도 고려된다. 예를 들어, 문헌(Marsic 등, Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014))을 참고한다. 상기 본원에서 제시된 바와 같이, 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 당업계에 알려져 있다.
일부 구현예에서, 패키징 세포가 제공된다. 패키징 세포는 AAV 입자 생산에 필요한 모든 성분을 안정적으로 발현하는 세포주를 갖기 위해 생성된다. 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 gag, pol 및 env 유전자를 제거하여 생성된다. 이들은 치료 유전자로 대체된다. 벡터 입자를 생산하기 위해서는 패키징 세포가 필수적이다. 패키징 세포주는 벡터의 캡시드 생산 및 비리온 성숙에 필요한 모든 바이러스 단백질을 제공한다. 따라서 패키징 세포주는 gag, pol 및 env 유전자를 포함하도록 만들어진다. 원하는 유전자를 레트로바이러스 DNA 벡터에 삽입하고 적절한 패키징 세포주를 유지한 후, 이제 레트로바이러스 벡터를 제조하는 것은 간단하다.
예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자가 결여된 rAAV 게놈, rAAV 게놈과 분리된 AAV rep 및 cap 유전자, 및 네오마이신 내성 유전자와 같은 선별 마커를 포함하는 플라스미드(또는 다중 플라스미드)가 세포 게놈으로 통합된다. AAV 게놈은 GC 테일링(Samulski 등, 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 포함하는 합성 링커의 부가(Laughlin 등, 1983, Gene, 23:65-73) 또는 직접적 무딘-말단 결찰(Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666)과 같은 절차에 의해 박테리아 플라스미드로 도입된다. 그런 다음 패키징 세포주는 아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로 감염된다. 이 방법의 장점은 세포가 선별되고 rAAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는 패키징 세포로 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 도입하기 위해 플라스미드가 아닌 아데노바이러스 또는 배큘로바이러스를 사용한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 희석제, 부형제 또는 완충제와 함께 본원에 기재된 임의의 핵산 또는 임의의 벡터를 포함하는 조성물을 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, AAV 입자 생산에 필요한 모든 성분를 안정적으로 발현하는 세포주를 생성하기 위해 패키징 세포를 생성하는 방법이 제공된다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자가 결여된 rAAV 게놈, rAAV 게놈과 분리된 AAV rep 및 cap 유전자, 및 네오마이신 내성 유전자와 같은 선별 마커를 포함하는 플라스미드(또는 다중 플라스미드)가 세포 게놈으로 통합된다. AAV 게놈은 GC 테일링(Samulski 등, 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 포함하는 합성 링커의 부가(Laughlin 등, 1983, Gene, 23:65-73) 또는 직접적 무딘-말단 결찰(Senapathy 등, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666)과 같은 절차에 의해 박테리아 플라스미드로 도입되었다. 그런 다음 패키징 세포주가 아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로 감염된다. 이 방법의 장점은 세포가 선별되고 rAAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는 패키징 세포로 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 도입하기 위해 플라스미드가 아닌 아데노바이러스 또는 배큘로바이러스를 사용한다.
rAAV 생산의 일반 원칙은 예를 들어 문헌(Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; and Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129)에서 검토된다. 다양한 접근이 문헌(Ratschin 등, Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin 등, Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin 등, J. Virol., 62:1963 (1988); and Lebkowski 등, 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski 등, J. Virol., 63:3822-3828 (1989); U.S. 특허 번호 5,173,414; WO 95/13365 및 상응하는 U.S. 특허 번호 5,658.776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441(PCT/US96/14423); WO 97/08298(PCT/US96/13872); WO 97/21825(PCT/US96/20777); WO 97/06243(PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin 등, Vaccine, 13:1244-1250 (1995); Paul 등, Human Gene Therapy, 4:609-615 (1993); Clark 등, Gene Therapy, 3:1124-1132 (1996); U.S. 특허 번호 5,786,211; U.S. 특허 번호 5,871,982; U.S. 특허 번호 6,258,595; 및 McCarty, Mol. Ther., 16(10): 1648-1656 (2008))에 기재되어 있다. 전술한 문서는 rAAV 생산과 관련된 문서의 해당 섹션을 특히 강조하여, 이의 전체가 본원에 참조로 포함된다. 다양한 유형의 rAAV의 생산 및 사용이 구체적으로 고려되고 예시된다. 따라서 재조합 AAV(즉, 감염성 캡슐화된 rAAV 입자)가 본원에서 제공된다. 일부 측면에서, rAAV의 게놈에는 AAV rep 및 cap 유전자가 결여되어 있다; 즉, rAAV 게놈의 ITR 간에는 AAV rep 또는 cap DNA가 없다. 일부 구현예에서, AAV는 재조합 선형 AAV(rAAV), 단일 가닥 AAV(ssAAV) 또는 재조합 자가 상보적 AAV(scAAV)이다.
따라서 본 개시는 일부 구현예에서 감염성 rAAV를 생산하는 패키징 세포를 제공한다. 한 구현예에서, 패키징 세포는 HeLa 세포, 293 세포 및 PerC.6 세포(동족체 293 세포주)안정적으로 형질전환된 암 세포이다. 또 다른 구현예에서, 패키징 세포는 저계대 293 세포(아데노바이러스의 E1로 형질전환된 인간 태아 신장 세포), MRC-5 세포(인간 태아 섬유아세포), WI-38 세포(인간 태아 섬유아세포), Vero 세포(원숭이 신장 세포) 및 FRhL-2 세포(붉은털원숭이 태아 폐 세포)와 같은 형질전환된 암 세포가 아닌 세포이다.
rAAV는 일부 측면에서 컬럼 크로마토그래피 또는 염화세슘 구배와 같은 당업계에서의 표준 방법에 의해 정제된다. 헬퍼 바이러스로부터 rAAV 벡터를 정제하는 방법은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 문헌(Clark 등, Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69 427-443 (2002); U.S. 특허 번호 6,566,118 및 WO 98/09657)에 개시된 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 또는 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터를 포함하는 조성물 또는 조성물들을 제공한다. 따라서, 본원에 기재된 전달 비히클(예컨대 rAAV)을 포함하는 조성물이 제공된다. 다양한 측면에서, 이러한 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 다양한 측면에서, 이러한 조성물은 또한 희석제, 부형제 및/또는 보조제와 같은 다른 성분을 포함한다. 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 및 보조제는 수신체에 무독성이고 바람직하게는 사용된 투여량 및 농도에서 불활성이며, 포스페이트, 시트레이트 또는 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산과 같은 항산화제; 저분자량 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염 형성 짝이온; 및/또는 Tween, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
일부 측면에서, 핵산이 전달을 위해 벡터로 도입된다. 일부 측면에서, 전달을 위한 벡터는 AAV 또는 rAAV이다. 따라서, 본 개시의 구현예는 (i) 서열 번호 1-18 중 임의의 것에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 번호 1-18 중 임의의 것에 제시된 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 핵산; 또는 (ii) 서열 번호 19-36 중 임의의 것에 제시된 DUX4 표적 서열에 결합하는 DUX4 asRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV 게놈을 포함한다.
일부 상이한 측면에서, 핵산은 벡터화되지 않은 전달을 통해 세포로 도입된다. 따라서, 구현예에서, 본 개시는 DUX4 asRNA를 암호화하는 핵산의 벡터화되지 않은 전달을 포함한다. 일부 측면에서, 이러한 맥락에서, 핵산과 복합체를 형성할 수 있고 이를 세포외 및 세포내 뉴클레아제로부터 보호할 수 있는 합성 담체가 바이러스 벡터에 대한 대안이다. 본 개시는 이러한 벡터화되지 않은 전달을 포함한다. 본 개시는 또한 본원에 기재된 임의의 작제물을 단독으로 또는 조합하여 포함하는 조성물을 포함한다.
멸균 주사제 용액은 필요에 따라 위에 열거된 다양한 기타 구성성분과 함께 적절한 용매 중 필요한 양의 rAAV를 혼입한 다음 필터 멸균하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 멸균된 활성 구성성분을 기본 분산 매질 및 위에 열거된 것들 중 필요한 기타 구성성분을 포함하는 멸균 비히클로 혼입하여 제조된다. 멸균 주사제 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 구성성분 및 임의의 추가적인 원하는 구성성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
본 개시의 방법에서 투여된 rAAV의 역가는 예를 들어 특정 rAAV, 투여 방식, 치료 목표, 개체 및 표적화되는 세포 유형(들)에 따라 변할 것이며, 당업계의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. rAAV의 역가는 약 1x106, 약 1x107, 약 1x108, 약 1x109, 약 1x1010, 약 1x1011, 약 1x1012, 약 1x1013 내지 약 1x1014 이상의 DNase 내성 입자(DRP)/ml의 범위일 수 있다. 투여량은 또한 바이러스 게놈(vg)의 단위로 표현될 수 있다(예를 들어, 각각 1x107 vg, 1x108 vg, 1x109 vg, 1x1010 vg, 1x1011 vg, 1x1012 vg, 1x1013 vg, 및 1x1014 vg).
따라서 일부 측면에서 본 개시는 (i) 서열 번호 1-18 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 1-18에 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 U7-asDUX4 안티센스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 (ii) 서열 번호 19-36 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DUX4 서열을 표적화하는 U7-asDUX4 안티센스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어느 하나 이상의 핵산을 세포에 또는 대상체에 전달하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 방법은 (i) 서열 번호 1-18 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 1-18에 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 U7-asDUX4 안티센스 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 (ii) 서열 번호 19-36 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DUX4 서열을 표적화하는 U7-asDUX4 안티센스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어느 하나 이상의 핵산을 포함하는 AAV를 세포에 또는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 세포 또는 대상체에서 DUX4 유전자의 발현을 감소시키거나 기능적 DUX4의 발현을 감소시키는 방법을 제공하며, 방법은 세포 또는 대상체를 다음: i) 서열 번호 1-18 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 번호 1-18에 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 U7-asDUX4 안티센스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 (ii) 서열 번호 19-36 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DUX4 서열을 표적화하는 U7-asDUX4 안티센스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어느 하나 이상의 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 방법은 하나 이상의 AAV 벡터에서 핵산을 전달하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 벡터화되지 않은 전달에서 세포에 핵산을 전달하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, DUX4의 발현 또는 기능적 DUX4의 발현은 본원에 제공된 방법에 의해 세포 또는 대상체에서 적어도 또는 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99, 또는 100% 감소된다.
일부 측면에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 U7-asDUX4 안티센스 작제물을 암호화하는 핵산의 전달을 위한 AAV 형질도입 세포를 제공한다. 생체내 또는 시험관내, rAAV로 표적 세포를 형질도입하는 방법이 본 개시에 포함된다. 방법은 유효 용량 또는 유효 다회 용량의 본 개시의 rAAV를 포함하는 조성물을 투여를 필요로 하는 동물(예컨대 인간)을 포함하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 근이영양증의 발생 전에 용량이 투여되는 경우 투여는 예방적이다. 근이영양증의 발생 후에 용량이 투여되는 경우 투여는 치료적이다. 본 개시의 구현예에서, 유효 용량은 치료되는 근이영양증과 관련된 적어도 하나의 증상을 완화(제거 또는 감소)하고, 근이영양증의 진행을 늦추거나 방지하고, 근이영양증의 진행을 늦추거나 방지하고, 질환의 정도를 감소시키고, 근이영양증의 경감(부분적 또는 전체적)을 초래하고 및/또는 생존을 연장하는 용량이다. 일부 측면에서 근이영양증은 FSHD이다.
조합 치료법도 본 개시에 의해 고려된다. 본원에 사용된 바와 같은 조합은 동시 치료 또는 순차적 치료를 포함한다. 전체가 본원에 참조로 포함된, 국제 공개 번호 WO 2013/016352에 개시된 것들과 같은 다른 치료법과의 조합과 같이, 표준 의학적 치료(예를 들어, 코르티코스테로이드 및/또는 면역억제 약물) 또는 다른 억제성 RNA 작제물과 본 개시의 방법의 조합이 특히 고려된다.
유효 용량의 조성물의 투여는 근육내, 비경구, 혈관내, 정맥내, 경구, 협측, 비강, 폐, 두개내, 뇌실내, 척수내, 골내, 안구내, 직장, 또는 질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에서의 표준 경로에 의할 수 있다. 본 개시의 rAAV의 AAV 성분(특히, AAV ITR 및 캡시드 단백질)의 투여 경로(들) 및 혈청형(들)은 치료받는 질환 상태 및 DUX4를 발현하는 세포와 같은 표적 세포/조직(들)을 고려하여 당업자에 의해 선택 및/또는 매칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여 경로는 근육내이다. 일부 구현예에서, 투여 경로는 정맥내이다.
일부 측면에서, 본 개시의 rAAV의 실제 투여는 rAAV 재조합 벡터를 동물의 표적 조직으로 수송할 임의의 물리적 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 본 개시에 따른 투여는 근육, 혈류, 중추 신경계로의 주사 및/또는 뇌 또는 다른 장기로의 직접 주사를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. rAAV를 인산염 완충 식염수 중 단순히 재현탁하는 것이 근육 조직 발현에 유용한 비히클을 제공하기에 충분한 것으로 실증되었으며, rAAV와 공동 투여될 수 있는 담체 또는 기타 성분에 대한 알려진 제한은 없다(그러나 DNA를 분해하는 조성물은 rAAV와 함께 일반적인 방식에서는 피해야 함). rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 근육과 같은 특정 관심 표적 조직으로 표적화되도록 변형될 수 있다. 예를 들어 그 개시가 본원에 참조로 포함된 WO 02/053703을 참고한다. 약학 조성물은 경피 수송에 의해 근육에 전달될 주사제 제형물 또는 국소 제형물로서 제조될 수 있다. 근육내 주사 및 경피 수송 둘 모두를 위한 다수의 제형물이 이전에 개발되었고 본 개시의 실행에 사용될 수 있다. rAAV는 용이한 투여 및 취급을 위해 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 사용될 수 있다.
근육내 주사의 목적을 위해 참깨 또는 땅콩 기름과 같은 보조제 중 또는 수성 프로필렌 글리콜 중 용액뿐만 아니라 멸균 수용액이 사용될 수 있다. 이러한 수용액은 필요에 따라 완충될 수 있으며, 액체 희석제는 먼저 식염수 또는 글루코스로 등장성이 된다. 유리 산(DNA는 산성 포스페이트기를 포함함)으로서의 rAAV 용액 또는 약리적으로 허용 가능한 염은 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 수중 제조될 수 있다. rAAV의 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 및 오일 중 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건 하에, 이러한 조제물은 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 포함한다. 이와 관련하여, 사용되는 멸균 수성 매질은 모두 당업자에게 잘 알려진 표준 기술에 의해 쉽게 얻을 수 있다.
주사제 용도에 적합한 약학 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사제 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에 형태는 멸균 상태여야 하고 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 보관 조건 하에 안정적이어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대비해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 측면에서, 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지된다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 야기될 수 있다. 많은 경우에, 예를 들어 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사제 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연하는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 야기될 수 있다.
일부 측면에서, 제형물은 안정화제를 포함한다. 용어 "안정화제"는 가열 또는 동결 동안 발생하는 것들과 같은 유해 조건으로부터 제형물을 보호하고/하거나 안정한 상태에서 제형물의 안정성 또는 저장 수명을 연장하는 물질 또는 부형제를 지칭한다. 안정제의 예는 수크로스, 락토스 및 만노스와 같은 당류; 만니톨과 같은 당 알코올; 글리신 또는 글루탐산과 같은 아미노산; 및 인간 혈청 알부민 또는 젤라틴과 같은 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 제형물은 항균 보존제를 포함한다. 용어 "항균 보존제"는 사용되는 바이알 또는 용기의 반복 천공 시 도입될 수 있는 미생물의 성장을 억제하는, 조성물에 첨가되는 임의의 물질을 지칭한다. 항균 보존제의 예는 티메로살, 2-페녹시에탄올, 벤제토늄 클로라이드 및 페놀과 같은 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "형질도입"은 수신체 세포에 의한 DUX4 miRNA의 발현을 초래하는 본 개시의 복제-결함 rAAV를 통한 생체내 또는 시험관내 수신체 세포에 본원에 기재된 하나 이상의 핵산의 투여/전달을 지칭하기 위해 사용된다.
한 측면에서, rAAV를 사용한 형질도입은 시험관내 수행된다. 한 구현예에서, 원하는 표적 세포가 대상체로부터 제거되고, rAAV로 형질도입되고 대상체로 재도입된다. 대안적으로, 그 세포가 대상체에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않을 동계 또는 이종 세포가 사용될 수 있다.
형질도입된 세포를 대상체에 형질도입 및 재도입하기 위해 적합한 방법은 당업계에 알려져 있다. 한 구현예에서, 세포는 예를 들어 적절한 배지 중 rAAV를 세포와 조합하고 서던 블롯 및/또는 PCR과 같은 통상적인 기술을 사용하거나 선별 마커를 사용하여 관심 DNA를 보유하는 세포를 스크리닝함으로써 시험관내 형질도입된다. 이어서, 형질도입된 세포는 약학 조성물로 제형화될 수 있고, 조성물은 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내 주사와 같은 다양한 기술에 의해, 또는 예를 들어 카테터를 사용하여 평활근 및 심근으로 주사함으로써 대상체에 도입될 수 있다.
본 개시는 DUX4의 발현을 하향조절하거나 억제하도록 설계된 마이크로RNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 rAAV의 유효 용량(또는 본질적으로 동시에 투여되는 용량 또는 간격을 두고 제공되는 용량)을 이를 필요로 하는 세포에 또는 대상체에 투여하는 방법을 제공한다. 따라서 일부 측면에서 유효 용량은 치료 유효 용량이다.
일부 구현예에서, 투여되는 rAAV의 용량 또는 유효 용량은 약 1.0x1010 vg/kg 내지 약 1.0x1016 vg/kg이다. 일부 측면에서 1.0x1010 vg/kg은 또한 1.0 E10 vg/kg으로 지명되며, 이는 단순히 과학적 표기법을 표시하는 대안적 방법이다. 마찬가지로 1011은 E11와 동등하다. 일부 측면에서, 투여되는 rAAV의 용량은 약 1.0x1011 vg/kg 내지 약 1.0x1015 vg/kg이다. 일부 측면에서 rAAV의 용량은 약 1.0x1010 vg/kg, 약 2.0x1010 vg/kg, 약 3.0x1010 vg/kg, 약 4.0x1010 vg/kg, 약 5.0x1010 vg/kg, 약 6.0x1010 vg/kg, 약 7.0x1010 vg/kg, 약 8.0x1010 vg/kg, 약 9.0x1010 약 1.0x1011 vg/kg, 약 2.0x1011 vg/kg, 약 3.0x1011 vg/kg, 약 4.0x1011 vg/kg, 약 5.0x1011 vg/kg, 약 6.0x1011 vg/kg, 약 7.0x1011 vg/kg, 약 8.0x1011 vg/kg, 약 9.0x1011 vg/kg, 약 1.0x1012 vg/kg, 약 2.0x1012 vg/kg, 약 3.0x1012 vg/kg, 약 4.0x1012 vg/kg, 약 5.0x1012 vg/kg, 약 6.0x1012 vg/kg, 약 7.0x1012 vg/kg, 약 8.0x1012 vg/kg, 약 9.0x1012 vg/kg, 약 1.0x1013 vg/kg, 약 2.0x1013 vg/kg, 약 3.0x1013 vg/kg, 약 4.0x1013 vg/kg, 약 5.0x1013 vg/kg, 약 6.0x1013 vg/kg, 약 7.0x1013 vg/kg, 약 8.0x1013 vg/kg, 약 9.0x1013 vg/kg, 약 1.0x1014 vg/kg, 약 2.0x1014 vg/kg, 약 3.0x1014 vg/kg, 약 4.0x1014 vg/kg, 약 5.0x1014 vg/kg, 약 6.0x1014 vg/kg, 약 7.0x1014 vg/kg, 약 8.0x1014 vg/kg, 약 9.0x1014 vg/kg, 약 1.0x1015 vg/kg, 약 2.0x1015 vg/kg, 약 3.0x1015 vg/kg, 약 4.0x1015 vg/kg, 약 5.0x1015 vg/kg, 약 6.0x1015 vg/kg, 약 7.0x1015 vg/kg, 약 8.0x1015 vg/kg, 약 9.0x1015 vg/kg, 또는 약 1.0x1016 vg/kg이다.
일부 측면에서, 용량은 약 1.0x1011 vg/kg 내지 약 1.0x1015 vg/kg이다. 일부 측면에서, 용량은 약 1.0x1013 vg/kg 내지 약 5.0x1013 vg/kg이다. 일부 측면에서, 용량은 약 2.0x1013 vg/kg 내지 약 4.0x1013 vg/kg이다. 일부 측면에서, 용량은 약 3.0x1013 vg/kg이다.
일부 측면에서, 초기 용량에 이어 두 번째 더 큰 용량이 뒤따른다. 일부 측면에서, 초기 용량에 이어 두 번째 동일한 용량이 뒤따른다. 일부 측면에서, 초기 용량에 이어 하나 이상의 더 적은 용량이 뒤따른다. 일부 측면에서, 초기 용량에 이어 동일하거나 더 큰 용량인 다회 용량이 뒤따른다.
생체내 또는 시험관내 전달 비히클(예를 들어, rAAV)로 표적 세포를 형질도입하는 방법이 고려된다. 본 개시의 rAAV를 사용한 세포의 형질도입은 DUX4 안티센스 서열의 지속적인 발현을 초래한다. 따라서 일부 측면에서, 본 개시는 rAAV 및 전-mRNA의 주요 엑손 정의 요소에 결합하는 안티센스 서열을 발현하여 스플라이소좀에 의한 특정 엑손의 인식을 억제하고 대상체에 대해 성숙 RNA로부터 표적의 배제를 야기하는 rAAV를 투여/전달하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 측면에서, 포유동물은 인간이다. 이들 방법은 본원에 기재된 하나 이상의 rAAV로 세포 및 조직(근육과 같은 조직을 포함하지만 이에 제한되지 않음)을 형질도입하는 단계를 포함한다. 형질도입은 세포 특이적 제어 요소를 포함하는 유전자 카세트로 수행될 수 있다. 용어 "형질도입"은 예로서, 안티센스 서열을 포함하는 u7snRNA, 예를 들어 U7-asDUX4를 본원에 기재된 복제-결함 rAAV를 통해 생체내 또는 시험관내 표적 세포에 투여/전달하여 표적 세포에 의한 DUX4의 발현 감소 또는 발현의 억제를 초래하는 것을 지칭하기 위해 사용된다.
생체내 방법은 투여를 필요로 하는 대상체(인간 대상체 포함)에 전달 비히클(예컨대 rAAV)을 포함하는 유효 용량 또는 유효 다회 용량의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 유효 용량(또는 본질적으로 동시에 투여되는 용량 또는 간격을 두고 제공되는 용량)의 rAAV를 투여를 필요로 하는 대상체에 투여하는 방법이 제공된다. 장애/질환의 발생 전에 용량 또는 용량들이 투여되는 경우, 투여는 예방적이다. 장애/질환의 발생 후에 용량 또는 용량들이 투여되는 경우, 투여는 치료적이다. 유효 용량은 치료되는 장애/질환 상태와 관련된 적어도 하나의 증상을 완화(제거 또는 감소)시키고, 장애/질환 상태로의 진행을 늦추거나 방지하고, 장애/질환 상태의 진행을 늦추거나 방지하고, 질환의 정도를 감소시키고, 질환의 경감(부분적 또는 전체적)을 초래하고 및/또는 생존을 연장하는 용량이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 조성물 및 방법은 근이영양증(MD)과 같은 질환을 치료, 개선 또는 방지하는 데 사용된다. 다양한 측면에서 이러한 MD는 FSHD이다. FSHD는 가장 일반적으로 유전되는 근이영양증 중 하나이며, 870,000명의 개인에게 영향을 미치는 것으로 추정된다. FSHD 증상의 전통적 설명은 얼굴, 견갑대 및 팔의 진행성 근육 약화를 포함하지만 질환은 몸통 및 하지 근육을 포함하여 더 광범위하게 나타날 수 있다. 비대칭 약화가 일반적이기 때문에 개체 내에서도 변동성이 흔히 나타난다. 발병 연령은 이르게는 유아기부터 성인기까지의 범위일 수 있으며 일반적으로 질환의 중증도와 관련되고, 조기 발병은 종종 더 중증 근육 약화와 관련된다. 대부분의 FSHD 환자는 정상적인 수명을 갖지만 호흡 부전이 발생할 수 있으며 이환 개체의 대략 25%는 50대에 휠체어에 의존하게 될 수 있고 더 중증 형태의 질환에서는 더 일찍 휠체어에 의존하게 되므로 질환으로 인해 쇠약해질 수 있는 반면 다른 사람들은 평생 보행을 유지한다.
FSHD는 골격근에 독성이 있는 전사 인자를 생산하는 이중 호메오박스 4 유전자(DUX4)의 비정상적 발현에 의해 유발된다. DUX4는 일반적으로 인간 발생의 2세포 단계에서 기능하지만 그 이후에는 아마도 고환을 제외하고 본질적으로 모든 다른 조직에서 억제된다. FSHD 환자의 골격근에서 특정 유전적 및 후생적 요인이 공모하여 DUX4 억제 해제를 허용하고, 이어서 분화 이상, 산화적 스트레스, 염증 침윤, 세포 사멸 및 근육 위축에 관여하는 것들을 포함하여 여러 비정상적 유전자 발현 캐스케이드를 개시한다.
병리학적 FSHD를 보유하는 것으로 알려진 가족에서, 본 개시의 방법은 다양한 측면에서 질환을 방지하는 방법이며 이들은 질환 발병 전에 수행된다. 다양한 다른 측면에서, 본 개시의 방법은 진단 후에 수행되며, 따라서 질환을 치료 또는 개선하는 방법이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 조성물 및 방법은 암과 같은 질환을 치료, 개선 또는 방지하는 데 사용된다. DUX4는 면역계로부터 종양 세포를 차폐하는 기능을 하는 일부 암 유형에서 활성화되는 것으로 나타났다(Chew 등, Dev. Cell 2019 Sep 9; 50(5):658-71). 예를 들어, DUX4 단백질 융합은 횡문근육종 및 유잉 육종과 같은 암을 유발하는 것으로 알려져 있다. CIC-DUX4 유전자 융합은 육종을 유도하고 육종 전이를 유발한다(Yoshimoto 등, Cancer Res. 2017 Jun 1; 77(11): 2927-2937; Okimoto 등, J Clin Invest. 2019;129(8): 3401-3406). 따라서, 본원에 기재된 핵산, rAAV 및 조성물은 암의 치료, 개선 또는 방지에서 DUX4 발현을 억제하는 데 사용된다.
분자, 생화학적, 조직학적 및 기능적 결과 측정은 DUX4 유전자 및 단백질의 발현을 감소시키고 FSHD와 같은 근이영양증을 치료하기 위한 본원에 개시된 제품 및 방법의 치료 유효성을 실증한다. 결과 측정은 예를 들어 문헌(Chapters 32, 35 and 43 of Dyck and Thomas, Peripheral Neuropathy, Elsevier Saunders, Philadelphia, PA, 4th Edition, Volume 1 (2005) 및 Burgess 등, Methods Mol. Biol., 602: 347-393 (2010))에 기재되어 있다. 결과 측정은 이환 조직에서 DUX4 mRNA 또는 단백질의 감소 또는 제거를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 세포에서 DUX4 발현의 결여 및/또는 DUX4 발현의 하향조절은 향상을 결정하기 위해 rAAV 투여 전 및 후에 근육 생검에서의 RT-PCR, QRT-PCR, RNAscope, 웨스턴 블롯, 면역형광 또는 면역조직화학을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 알려진 방법에 의해 DUX4 단백질 수준을 측정하여 검출된다.
일부 구현예에서, 대상체의 세포에서 DUX4 유전자 발현 또는 단백질 발현 수준은 안티센스 snRNA 작제물 또는 벡터, 예를 들어 rAAV의 투여 전 DUX4 유전자 발현 또는 단백질 발현과 비교하여 안티센스 snRNA 작제물 또는 안티센스 snRNA 작제물을 포함하는 벡터, 예를 들어 rAAV의 투여 후 감소된다. 일부 측면에서, DUX4의 발현은 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 100%, 또는 적어도 약 100% 초과 감소된다. 다양한 측면에서, 향상된 근력, 향상된 근육 기능, 및/또는 향상된 이동성 및 체력은 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 100%, 또는 적어도 약 100% 초과 향상을 나타낸다.
다른 결과 측정은 치료 전 및 후에 대상체의 혈청 크레아티닌 키나제(CK) 수준 측정을 포함한다. 증가된 CK 수준은 근육 손상의 특징이다. 근이영양증 환자에서, CK 수준은 정상 범위보다 크게 증가된다(출생 이후 정상 수준의 10~100배). 혈액 샘플에서 상승된 CK 수준이 발견되면 일반적으로 근이영양증 또는 염증과 같은 일부 비정상적인 과정에 의해 근육이 붕해되고 있음을 의미한다. 따라서, 본 개시의 방법을 사용한 치료에 대한 긍정적인 치료 결과는 rAAV 투여 전 혈청 크레아티닌 키나제 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 혈청 크레아티닌 키나제 수준의 감소이다.
다른 결과 측정은 치료 후 대상체에서 향상된 근력, 향상된 근육 기능, 향상된 이동성, 향상된 체력, 또는 이의 둘 이상의 조합이 있는지를 결정하기 위한 측정을 포함한다. 이러한 결과 측정은 대상체에서 근이영양증 진행을 결정하는데 중요하며 당업계에 알려진 다양한 시험에 의해 측정된다. 이러한 시험 중 일부는 6분 걷기 시험, 일어나기까지의 시간 시험, 4단계 상승 시험, 4단계 상승 및 하강 시험, 북극성 보행 평가(NSAA) 시험, 10미터 시간 시험, 100 미터 시간 시험, 핸드헬드 동력계(HHD) 시험, 시간 초과 및 이동 시험, 총 운동 하위시험 척도(배일리(Bayley)-III) 점수, 최대 등척성 자발 수축 시험(MVICT) 또는 이의 둘 이상의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
조합 치료법도 본 개시에 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 조합은 동시 치료 및 순차적 치료 둘 모두를 포함한다. 글루코코르티코이드와 같은 치료법과의 조합과 같이 표준 의학적 치료 및 지지 관리와 본원에 기재된 방법의 조합이 특히 고려된다. 모든 유형의 글루코코르티코이드가 본원에 개시된 조합 치료법에 사용하기 위해 포함된다. 이러한 글루코코르티코이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 덱사메타손, 데플라자코트, 베클로메타손, 베타메타손, 부데소니드, 코르티손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론 및 트리암시놀론을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 개시에 포함된 다른 조합 치료법은 본원에 기재된 바와 같은 U7-snRNA와 다른 U7-snRNA와 조합, 또는 miRNA 기반 유전자 치료법, DUX4 발현의 소분자 억제제, RNAi 또는 RNAse H 또는 엑손 건너뛰기 메커니즘을 통해 DUX4를 억제하는 올리고뉴클레오티드의 조합, U7-snRNA와 이론적 CRISPR-기반 유전자 치료법 접근법이다.
본 개시의 유효 용량의 핵산, 바이러스 벡터 또는 조성물의 투여는 근육내, 비경구, 혈관내, 정맥내, 경구, 협측, 비강, 폐, 두개내, 뇌실내, 척수내, 골내, 안구내, 직장, 또는 질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계의 표준 경로에 의할 수 있다. 일부 측면에서, 유효 용량은 전신 투여 경로, 즉 전신 투여에 의해 전달된다. 전신 투여는 전신이 영향을 받도록 하는 순환계로의 투여 경로이다. 이러한 전신 투여는 다양한 측면에서 장 투여(위장관을 통한 약물 흡수) 또는 비경구 투여(일반적으로 주사, 주입 또는 이식을 통해)를 통해 발생한다. 다양한 측면에서, 유효 용량은 경로의 조합에 의해 전달된다. 예를 들어, 다양한 측면에서, 유효 용량은 정맥내 및/또는 근육내, 또는 정맥내 및 뇌실내 등으로 전달된다. 일부 측면에서, 유효 용량은 순서대로 또는 순차적으로 전달된다. 일부 측면에서 유효 용량은 동시에 전달된다. 다양한 측면에서 본 개시의 rAAV의 AAV 성분(특히, AAV ITR 및 캡시드 단백질)의 투여 경로(들) 및 혈청형(들)은 치료되는 질환 또는 장애의 ㅂ병 또는 상태, 대상체의 병태, 상태 또는 연령, 및 핵산 또는 단백질을 발현할 표적 세포/조직(들)을 고려하여 당업자에 의해 선택 및/또는 매칭된다.
특히, 전달 비히클(예를 들어, rAAV)의 실제 투여는 전달 비히클(예를 들어, rAAV)을 동물의 표적 세포로 수송할 임의의 물리적 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 투여는 근육, 혈류로 및/또는 직접 신경계 또는 간으로의 주사를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. rAAV를 인산염 완충 식염수 중 단순히 재현탁하는 것이 근육 조직 발현에 유용한 비히클을 제공하기 충분한 것으로 실증되었으며, rAAV와 공동 투여될 수 있는 담체 또는 기타 성분에 대한 알려진 제한은 없다(그러나 DNA를 분해하는 조성물은 rAAV와 함께 일반적인 방식에서는 피해야 함). rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 뉴런과 같은 특정 관심 표적 조직이 표적화되도록 변형될 수 있다. 예를 들어 그 개시가 본원에 참조로 포함된, WO 02/053703을 참고한다. 약학 조성물은 경피 수송에 의해 근육에 전달될 주사제 제형물 또는 국소 제형물로서 제조될 수 있다. 근육내 주사 및 경피 수송 둘 모두를 위한 다수의 제형물이 이전에 개발되었고 본 개시의 실행에 사용될 수 있다. 전달 비히클(예컨대 rAAV)은 용이한 투여 및 취급을 위해 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 사용될 수 있다.
전달 비히클(예컨대 rAAV)의 분산액이 또한 글리세롤, 소르비톨, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 중 및 오일 중 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건 하에 이러한 조제물은 미생물의 성장을 방지하는 보존제를 포함한다. 이와 관련하여, 사용되는 멸균 수성 매질은 모두 당업자에게 알려진 표준 기술에 의해 쉽게 얻을 수 있다.
주사제 용도에 적합한 약학 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 그리고 멸균 주사제 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에 형태는 무균 상태여야 하고 주사가 용이할 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 보관 조건 하에 안정적이어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대비해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 소르비톨 등), 이의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 야기될 수 있다. 많은 경우에, 예를 들어 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사제 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연하는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 야기될 수 있다.
멸균 주사제 용액은 필요에 따라 위에 열거된 다양한 기타 구성성분과 함께 적절한 용매 중 필요한 양의 rAAV를 혼입한 다음 필터 멸균하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 멸균된 활성 구성성분을 기본 분산 매질 및 위에 열거된 것들 중 필요한 기타 구성성분을 함유하는 멸균 비히클로 혼입하여 제조된다. 멸균 주사제 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 구성성분 및 임의의 추가적인 원하는 구성성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
"치료"는 근육 소모, 근육 약화, 근긴장, 골격근 문제, 망막 이상, 고관절 약화, 안면 약화, 복부 근육 약화, 관절 및 척추 이상, 하지 약화, 어깨 약화, 청력 상실, 근육 염증 및 비대칭 약화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 근이영양증의 하나 이상의 증상 개선 또는 억제를 포함한다.
본 개시의 유효 용량의 핵산, 바이러스 벡터 또는 조성물의 투여는 근육내, 비경구, 혈관내, 정맥내, 경구, 협측, 비강, 폐, 두개내, 뇌실내, 척수내, 골내, 안구내, 직장, 또는 질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계의 표준 경로에 의할 수 있다. 일부 측면에서, 유효 용량은 전신 투여 경로, 즉 전신 투여에 의해 전달된다. 전신 투여는 전신이 영향받도록 하는 순환계로의 투여 경로이다. 이러한 전신 투여는 다양한 측면에서 장 투여(위장관을 통한 약물 흡수) 또는 비경구 투여(일반적으로 주사, 주입 또는 이식을 통해)를 통해 발생한다. 다양한 측면에서, 유효 용량은 경로의 조합에 의해 전달된다. 예를 들어, 다양한 측면에서, 유효 용량은 정맥내 및/또는 근육내, 또는 정맥내 및 뇌실내 등으로 전달된다. 일부 측면에서, 유효 용량은 순서대로 또는 순차적으로 전달된다. 일부 측면에서 유효 용량은 동시에 전달된다. 다양한 측면에서 본 개시의 rAAV의 AAV 성분(특히, AAV ITR 및 캡시드 단백질)의 투여 경로(들) 및 혈청형(들)은 치료되는 질환 또는 장애의 병태 또는 상태, 대상체의 병태, 상태 또는 연령, 및 핵산 또는 단백질을 발현할 표적 세포/조직(들)을 고려하여 당업자에 의해 선택 및/또는 매칭된다.
특히, 전달 비히클(예를 들어, rAAV)의 실제 투여는 전달 비히클(예컨대 rAAV)을 동물의 표적 세포로 수송할 임의의 물리적 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 투여는 근육, 혈류로 및/또는 직접 신경계 또는 간으로의 주사를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. rAAV를 인산염 완충 식염수 중 단순히 재현탁하는 것이 근육 조직 발현에 유용한 비히클을 제공하기 충분한 것으로 실증되었으며, rAAV와 공동 투여될 수 있는 담체 또는 기타 성분에 대한 알려진 제한은 없다(그러나 DNA를 분해하는 조성물은 rAAV와 함께 일반적인 방식에서는 피해야 함). rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 뉴런과 같은 특정 관심 표적 조직에 표적화되도록 변형될 수 있다. 예를 들어 그 개시가 본원에 참조로 포함된, WO 02/053703을 참고한다. 약학 조성물은 경피 수송에 의해 근육에 전달될 주사제 제형물 또는 국소 제형물로서 제조될 수 있다. 근육내 주사 및 경피 수송 둘 모두를 위한 다수의 제형물이 이전에 개발되었고 본 개시의 실행에 사용될 수 있다. 전달 비히클(예컨대 rAAV)은 용이한 투여 및 취급을 위해 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 사용될 수 있다.
전달 비히클(예컨대 rAAV)의 분산액이 또한 글리세롤, 소르비톨, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 중 및 오일 중 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건 하에 이러한 조제물은 미생물의 성장을 방지하는 보존제를 포함한다. 이와 관련하여, 사용되는 멸균 수성 매질은 모두 당업자에게 알려진 표준 기술에 의해 쉽게 얻을 수 있다.
주사제 용도에 적합한 약학 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 그리고 멸균 주사제 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에 형태는 멸균 상태여야 하고 주사가 용이할 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 보관 조건 하에 안정적이어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대비해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 소르비톨 등), 이의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 야기될 수 있다. 많은 경우에 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사제 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연하는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 야기될 수 있다.
멸균 주사제 용액은 필요에 따라 위에 열거된 다양한 기타 구성성분과 함께 적절한 용매 중 필요한 양의 rAAV를 혼입한 다음 필터 멸균하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 멸균된 활성 구성성분을 기본 분산 매질 및 위에 열거된 것들 중 필요한 기타 구성성분을 포함하는 멸균 비히클로 혼입하여 제조된다. 멸균 주사제 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 구성성분 및 임의의 추가적인 원하는 구성성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
본 개시는 또한 본 개시의 핵산, 벡터 또는 조성물을 포함하거나 본 개시의 방법에 따라 제조된 키트를 제공한다. 본 개시와 관련하여 용어 "키트"는 2개 이상의 성분을 의미하며, 그 중 하나는 본 개시의 핵산, 벡터 또는 조성물에 해당하고 다른 하나는 용기, 수신물, 지침 등에 해당한다. 따라서 다양한 측면에서 키트는 단일 단위로 판매될 수 있는, 특정 목표를 달성하기 충분한 제품 세트이다.
키트는 투여를 위한 적절한 투여량으로 본 개시의 핵산, 벡터 또는 조성물을 포함하는 임의의 적절한 모양, 크기 및 물질의 하나 이상의 수신물(예를 들어, 바이알, 앰플, 용기, 주사기, 병, 백)를 포함할 수 있다(상기 참고). 키트는 추가로 사용 지시 또는 지침(예를 들어, 소책자 또는 지침 매뉴얼의 형태), 주사기, 펌프, 주입기 등과 같은 핵산, 벡터 또는 조성물을 투여하기 위한 수단, 핵산, 벡터 또는 조성물을 재구성하기 위한 수단 및/또는 핵산, 벡터 또는 조성물을 희석하기 위한 수단을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 키트는 키트에 제공된 시약의 용도를 설명하는 표지 및/또는 지침을 포함한다. 키트는 또한 임의로 본원에 기재된 방법에 사용된 하나 이상의 조성물을 전달하기 위한 카테터, 주사기 또는 기타 전달 장치를 포함한다.
본 개시는 또한 투여 단위의 단회 용량 또는 다회 용량을 위한 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 단일 챔버 및 다중 챔버 사전충전 주사기를 포함하는 키트를 제공한다.
이 전체 문서는 단일화된 개시로 관련되도록 의도되었으며, 특징의 조합이 이 문서의 동일한 문장 또는 단락 또는 섹션에서 함께 발견되지 않더라도 본원에 기재된 특징의 모든 조합이 고려됨이 이해되어야 한다. 본 개시는 또한 예를 들어 위에서 구체적으로 언급된 변화가 아닌 임의의 방식으로 범위가 더 좁은 본 개시의 모든 구현예를 포함한다. 속(genus)으로 기재된 본 개시의 측면과 관련하여, 모든 개별 종이 본 개시의 별개의 측면으로 간주된다. 하나("a" 또는 "an")로 기재되거나 청구된 본 개시의 측면과 관련하여, 문맥상 명확하게 더 제한된 의미를 요구하지 않는 한 이들 용어는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
달리 표시되지 않는 한, 일련의 요소 앞에 오는 용어 "적어도"는 일련의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 개시의 특정 구현예에 대한 많은 균등부를 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등부는 본 개시에 포괄되는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결된 요소들의 전부 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 보다 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 그러나 이는 구체적인 수도 포함한다, 예를 들어 약 10은 10을 포함한다.
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서 및 이어지는 청구범위에 걸쳐, 단어 "포함한다" 그리고 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변화는 명시된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계 그룹의 포함을 의미하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계 그룹의 제외를 의미하는 것은 아님이 이해될 것이다. 본원에 사용된 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는" 또는 "포함되는"으로 또는 때때로 본원에서 용어 "갖는"으로 대체될 수 있다.
본원에서 사용될 때 "구성된"은 청구범위 요소에 지정되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 구성성분을 제외한다. 본원에서 사용될 때, "본질적으로 구성된"은 청구범위의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다.
본원의 각 경우에서 임의의 용어 "포함하는", "본질적으로 구성된" 및 "구성된"은 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다.
본 개시는 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 물질, 시약 및 물질 등에 제한되지 않으며 그 자체가 변할 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 개시의 요지 사안의 범위를 제한하려는 의도가 아니며, 이는 청구범위에 의해서만 정의된다.
본 명세서의 본문에 걸쳐 인용된 모든 간행물 및 특허(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체의 사양, 지침 등을 포함)는 위 또는 아래를 막론하고 이의 전체가 본원에 참조로 포함된다. 참조로 포함된 자료가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 범위 내에서 명세서가 임의의 이러한 자료에 우선할 것이다.
본 개시 및 그 장점에 대한 더 나은 이해가 예시 목적으로만 제공되는 하기 실시예로부터 얻어질 것이다. 실시예는 본 개시의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 본원에 기재된 실시예 및 구현예는 예시 목적만을 위한 것이며, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제시될 것이고 본 출원의 사상 및 범주 그리고 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다.
실시예
본 개시의 추가적인 측면 및 상세사항은 제한이 아닌 예시를 위한 것으로 의도된 하기 실시예로부터 명백할 것이다.
실시예 1
물질 및 방법
U7-snRNA를 표적화하는 DUX4 설계
마르세유 대학(Marseille University)의 인간 스플라이싱 파인더 버전 3.1 프로그램(http-colon-slash-slash-www.umd.be-slash-HSF-slash)을 사용하여 DUX4 엑손 1(코딩 서열)의 말단 및 미번역 엑손 1 및 2 내의 잠재적인 스플라이스 수신체(SA), 스플라이스 공여체(SD) 및 스플라이스 인핸서 부위를 예측하였다. DUX4에 대한 U7-snRNA(U7-asDUX4라고 함)를 설계하기 위해, 가장 적은 수의 CpG 및 하나의 비표적 영역을 갖는 18개의 고점수 표적 부위를 선택했다(표 1). 인간 게놈 데이터베이스(https colon-slash-slash-blast.ncbi.nlm.nih.gov)에 대한 각 서열을 사용하여 BLAST에 의해 예측된 표적-외 매칭을 결정했다. 마우스 U7 프로모터를 함유하는 모든 U7-asDUX4의 발현 카세트를 합성하고 pUCIDT 플라스미드(Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa)로 클로닝했다. 서열은 또한 역상보적 염기쌍 형성을 통해 DUX4 시작 코돈 및 폴리 A 신호에 결합하도록 설계하였다(표 1). 비표적화 대조군 snRNA 안티센스 서열은 5'-GTCATGTCGCGTGCCCCGGTGGTCGACACGTCGG-3'(서열 번호 43)이다.
세포 배양
인간 배아 신장(HEK293) 세포를 37 C에서 5% CO2로 10% 우태 혈청, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 중 배양하였다. 인간 FSHD 환자로부터 유래된 이환 및 비이환 불멸화 근모세포 및 비이환 관련 15Abic 및 15Vbic(40, 60)을 16% 배지 199, 20% 우태 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 30 ng/ml 황산아연, 1.4 mg/ml 비타민 B12, 55 ng/ml 덱사메타손, 2.5 ng/ml 인간 성장 인자, 10 ng/ml 섬유아세포 성장 인자 및 20 mM HEPES가 보충된 DMEM 배지 중 증식시켰다. 세포를 근모세포로 유지하였고 qRT-PCR 및 RNAscope에 의한 DUX4 및 DUX4 활성 바이오마커 스크리닝을 위해 분화시켰다. 근모세포를 근관으로 분화시키기 위해, 형질감염된 근모세포를 15% KnockOut 혈청(ThermoFisher Scientific), 2 mM L-글루타민 및 1% 항생제/항진균제가 보충된 4:1 비의 DMEM:배지 199로 이루어진 분화 배지로 수확 전 최대 7일 동안 교체하였다.
생존성 검정
HEK293 세포(250,000개 세포/웰)를 프로토콜을 사용하여 전장 DUX4 전-mRNA(DUX4-fl)가 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(CMV.DUX4-fl)로부터 전사되는 발현 플라스미드와 U7-asDUX4 snRNA 또는 비표적화 U7-snRNA를 발현하는 플라스미드와 함께 1:6 비로 공동 형질감염시켰다(리포펙타민-2000, Invitrogen). 세포를 형질감염 48시간 후 트립신 처리하고 1 ml의 성장 배지 중 수집하였다. 자동화된 세포 계수를 Countess® 세포 계수 챔버 슬라이드(Thermo Fisher)를 사용하여 수행하였다. 결과를 혈구계수기를 사용한 전통적인 세포 계수 및 트리판 블루 염색으로 확인하였다. 3회 독립 실험을 수행하였고 데이터는 그룹당 총 세포 수의 평균 ± SEM으로 보고하였다.
세포 사멸 검정
HEK293 세포(42,000개 세포/웰)를 형질감염 16시간 전에 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날 아침, 세포를 CMV.DUX4-fl 및 U7-asDUX4 snRNA 또는 비표적화 U7-snRNA 발현 플라스미드로 1:6 몰비로 공동 형질감염시켰다(리포펙타민-2000, Invitrogen). 형광 플레이트 판독기(Spectra Max M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 형질감염 48시간 후 Apo-ONE 동종 카스파제-3/7 검정(Promega, Madison, WI)를 사용하여 세포 사멸을 측정했다. 3개의 개별 검정을 3회 수행하고(n = 3), 데이터를 실험당 평균내고 CMV.DUX4-fl만으로 형질감염된 대조군 검정 대비 평균 카스파제 활성 ± SEM으로 보고하였다.
웨스턴 블롯 검정
이 실험을 위해, 에피토프 태그가 있거나 없는 DUX4 발현 플라스미드(DUX4 N-말단에 융합된 myc 에피토프 태그를 포함하는 CMV.Myc-DUX4-fl 또는 CMV-DUX4-fl)를 사용하였다. HEK293 세포를 1:6 비의 DUX4:U7asDUX4 발현 플라스미드로 공동 형질감염시켰다. 형질감염 20시간 후, 프로테아제 억제제를 함유하는 칵테일이 보충된 RIPA 완충액(50 mM 트리스, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% 데옥시콜산나트륨, 1% 트리톤 X 100) 중 세포를 용해시켰다. 단백질 농도는 로우리 단백질 검정 키트(Bio-Rad Laboratories)에 의해 결정했다. 25 μg의 각각의 총 단백질 샘플을 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 걸었다. 단백질을 반건조 전달 방법을 통해 PVDF 막으로 전달한 다음 5% 탈지유 중 차단하고, 1차 모노클로날 마우스 항-DUX4(1:500; P4H2, Novus Biologicals), 마우스 항-Myc(R95125, Invitrogen) 또는 토끼 폴리클로날 항-α 튜불린 항체(1:1,000; ab15246, Abcam, Cambridge, MA)와 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음 날, 여러 번 세척한 후, 블롯을 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-접합 염소 항-마우스 또는 염소 항-토끼 2차 항체(1:100,000; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)로 실온에서 1시간 동안 탐침처리하였다. 상대적 단백질 밴드를 Immobilon 화학발광 HRP 기질(Millipore, Billerica, MA) 중 짧은 인큐베이션 후 X선 필름에서 현상하였다. 단백질 정량을 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, imagej.nih.gov/ij/)에 의해 평가하였다.
면역형광 염색
처리 세포 및 비처리 세포에서 V5 에피토프-태그화 DUX4 단백질의 세포하 편재를 V5 면역형광 염색을 사용하여 가시화하였다(Wallace 등 (2011) Ann Neurol 69, 540-552. 이 플라스미드는 코딩 및 3' UTR 서열로 구성된 전장 DUX4 서열을 운반하지만 프레임-내 카복시 말단 V5 에피토프 융합을 갖는 DUX4 단백질을 발현하도록 조작하였다. 형질감염 20시간 후, 세포를 4% 파라포름알데히드(PFA) 중 20분 동안 고정하고 비특이적 항원을 0.2% 트리톤 X-100이 보충된 PBS 중 5% BSA로 차단했다. 세포를 토끼 폴리클로날 항-V5 1차 항체(1:2,500; Abcam, ab9116) 중 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 다음날, 세포를 PBS로 세척하고, 염소 항-토끼 Alexa-594 2차 항체(1:2,500; Invitrogen)와 함께 인큐베이션하고, DAPI(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 포함하는 Vectashield 실장 배지와 함께 실장했다.
RNAscope 검정 및 정량
HEK293에서 과발현된 DUX4 검출. HEK293 세포에서 CMV.DUX4-fl 및 U7.asDUX4 발현 플라스미드의 공동 형질감염(1:6 비) 후 DUX4 mRNA 수준을 측정하기 위해 RNAscope 원 위치 혼성화 검정을 사용했다. 구체적으로, 형질감염 16시간 전에 HEK293 세포를 웰당 120,000개 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에서 유리 커버슬립 상에 3개씩 시딩하였다. 다음날 아침, 70% 융합성에 도달했을 때, 제조업체의 지침에 따라 세포를 250 ng의 CMV.DUX4-fl 발현 플라스미드(리포펙타민-2000, Thermo Fisher Scientific)로 공동형질감염시켰다. 형질감염 16시간 후, 세포를 4% PFA로 고정하고 RNAscope 염색을 제조업체의 지침에 따라 수행하였다(아래에 상세히 기재됨).
인간 FSHD 근관에서 내인성 DUX4 검출. 내인성 DUX4 mRNA를 표적화하기 위한 U7-asDUX4 snRNA의 특이성을 결정하기 위해, 15Abic FSHD 근모세포(15A, 500,000개 세포/반응)를 전기천공(Lonza, VVPD-1001)을 통해 U7-asDUX4 발현 플라스미드로 형질감염시킨 다음 최대 7일 근관으로 분화시켰다. RNAscope 염색을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Amini Chermahini, 등 (2019) RNA 25, 1211-1217). 세포를 4% PFA 중 고정하고 에탄올 구배로 탈수/재수화하였다. 내인성 과산화효소 활성을 과산화수소 처리에 의해 차단하였다. 프로테아제 III을 첨가하여 RNAscope 탐침에 대한 고정된 세포의 투과성을 증가시켰다. 세포를 DUX4-특이적 RNAscope 탐침(ACDBio, Cat. No. 498541) 또는 양성 대조군 하우스키핑 펩티딜프롤릴 이소머라제 B(PPIB) 및 음성 대조군 세균 유전자인 디하이드로피콜리네이트 환원효소(dapB)를 검출하기 위한 탐침들로 처리하였다. 탐침 인큐베이션 후, 세포를 제조업체의 프로토콜(ACDBio)에 따라 RNAscope 2.5 HD 갈색 검정을 사용하여 몇몇 신호 증폭 단계로 처리했다. 세포를 실온에서 2분 동안 50% 길(Gill's) 헤마톡실린 I(카탈로그 번호 HXGHE1LT, American Master Tech Scientific)으로 대조염색한 후 여러 번 세척했다. 실장 후 Olympus DP71 현미경을 사용하여 이미지를 포착했다. 이전에 기재된 바와 같이(30) ImageJ-Fiji 소프트웨어를 사용하여 DUX4 RNAscope 신호를 정량했다.
DUX4 바이오마커의 정량적 실시간 PCR 분석
15A FSHD 근모세포를 RNAscope 섹션에서 본원에 기재된 바와 같이 형질감염시키고 근관으로 분화시켰다. 제조업체의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약(ThermoFisher)을 사용하여 총 RNA 내용물을 추출하고 Nanodrop으로 수율을 측정했다. 그런 다음 단리된 RNA를 Dnase 처리하고(DNA-비함유, Ambion, TX) 무작위 육량체 프라이머를 사용하여 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)로 cDNA를 생성했다. 그런 다음 후속 cDNA 샘플을 사전 설계된 TRIM43, MBD3L2, PRAMEF12, ZSCAN4(DUX4 활성의 바이오마커) 및 인간 RPL13A 대조군 프라이머/탐침 세트(Applied Biosystems)를 사용하여 Taqman 검정을 위한 주형으로 사용했다. 모든 데이터를 비표적화-U7-snRNA 형질감염된 세포에 대해 정규화하였다. 데이터는 각각의 바이오마커에 대해 3개씩 수행한 2회 독립 실험으로부터 생성하였다.
통계 분석
모든 통계 분석(카스파제 3/7 검정, 세포 생존성 검정, RNAscope 정량, 웨스턴 블롯, qRT-PCR)은 표시된 통계 시험을 사용하여 GraphPad Prism 5(GraphPad Software, La Jolla, CA)에서 수행하였다.
실시예 2
DUX4-표적화 U7-snRNA가 공동 형질감염된 HEK293의 아폽토시스를 감소시키고 생존성을 증가시킴
재조합 U7-snRNA가 뒤시엔느 근이영양증(Goyenvalle 등 (2012) Mol Ther 20, 1212-1221) 및 β-지중해빈혈(Nualkaew 등 (2019) Sci Rep 9, 7672)에 대한 잠재적 치료로서 돌연변이된 엑손의 건너뜀을 유도하기 위해 이전에 개발되었다. 이 연구에서 U7-snRNA는 전체 엑손을 건너뛰어 프레임-이동 유전자의 발현을 복원하기 위해 사용하였다. 대조적으로, 이 연구의 목표는 U7-snRNA를 사용하여 DUX4 전-mRNA 성숙을 방해하거나 번역 개시를 억제함으로써 새로운 유전자 침묵화 전략을 개발하는 것이었다(Biferi 등 (2017) Mol Ther 25, 2038-2052; Wein 등 (2014) Nat Med 20, 992-1000).
이를 위해, 스플라이스 공여체(SD), 스플라이스 수신체(SA) 및 스플라이스 인핸서(SE) 서열 또는 DUX4 엑손 3의 폴리아데닐화 신호(PAS)를 표적화하는 재조합 U7-snRNA를 개발하였다(도 1a-b). 또한 전체 길이의 DUX4 시작 코돈 위에 위치하여 잠재적으로 번역을 방해하도록 설계된 2개의 작제물(9 및 10)을 생성하였다. 이러한 DUX4-표적화 U7-snRNA(U7-asDUX4라고 함)의 구조를 도 1a에 나타내며, 특이성의 주요 특징은 DUX4 전-mRNA의 다양한 영역과 염기쌍을 형성하도록 변형된 안티센스 서열이다. 정확한 스플라이싱을 방해하는 효과적인 서열을 선택하기 위해 인간 스플라이싱 파인더 도구(도 5a-c)를 사용하여 3개의 DUX4 엑손 모두와 인트론 1 및 2 내에서 잠재적인 SD, SA 및 SE 부위를 예측했다. 그런 다음 U7-asDUX4를 가장 높은 점수를 받은 부위를 표적화하도록 설계하였다(도 1b). 폴리A 신호 또는 시작 코돈을 표적화하는 U7-asDUX4의 경우 안티센스 서열이 DUX4 mRNA의 동족체 부위를 완전히 덮는 것이 확인되었다. 모든 U7-asDUX4 서열 및 이의 중요한 기능을 본원의 표 1 및 2에 요약한다.
HEK293 세포는 일반적으로 검출 가능한 DUX4를 발현하지 않지만 CMV.DUX4 발현 플라스미드로 형질감염된 후 DUX4-유도 세포 사멸에 취약하다. 따라서 U7-asDUX4 발현 플라스미드의 유효성은 처음에 공동 형질감염된 HEK293 세포에서 결과 측정으로서 카스파제-3/7 및 세포 생존성 검정을 사용하여 아폽토시스 세포 사멸을 측정함으로써 평가했다. 18개의 U7-asDUX4 서열을 설계하고 작제물을 만들고 시험하였다. 이 18개의 작제물 중 13개는 공동 형질감염된 HEK293 세포의 세포 사멸을 유의하게 감소시키고(50%) 생존성을 증가시켰다(50%)(도 1c-d). 가장 효과적인 U7-asDUX4는 엑손 1-인트론 1 접합부 또는 폴리A 신호(PAS)를 표적화하는 작제물 4, 7 및 8이었다. 이러한 작제물은 카스파제-3/7 활성을 각각 75% ± 7, 60% ± 9 및 50% ± 8 감소시켰고 생존성을 DUX4 단독(19.1% ± 1.6) 또는 비표적 U7-snRNA를 포함하는 DUX4(23.3% ± 0.5)와 비교하여 다른 U7-asDUX4보다 각각 78.5% ± 8.4, 94.8% ± 4.9 및 84.8% ± 3.8로 유의하게 증가시켰다(도 1c-d). 더 우수한 보호 특성으로 인해 U7-asDUX4 작제물 4, 7 및 8이 주요 후보 서열인 것으로 나타났다.
실시예 3
U7-asDUX4가 형질감염된 HEK293 세포에서 DUX4 발현을 유의하게 감소시킴
U7-asDUX4 플라스미드로 처리한 샘플에서 DUX4 관련 세포 사멸 결과의 감소는 이러한 서열이 전장 DUX4 유전자 발현을 억제하도록 작동함을 제시했다. 추정되는 선도 U7-asDUX4 서열이 HEK293 세포에서 과발현된 DUX4 mRNA를 표적화하고 감소시키는 특이성을 조사하기 위해, 먼저 RNAscope 원 위치 혼성화 검정을 사용하여 공동 형질감염된 세포에서 DUX4 mRNA를 검출하였다. 고정된 세포를 DUX4를 표적화하는 탐침, 대조군 전사체 또는 음성 대조군 시약과 인큐베이션한 다음 혼성화된 표적 mRNA를 갈색으로 염색하는 디아미노벤지딘(DAB) 시약으로 처리했다. 이전에 보고된 바와 같이(Amini Chermahini 등 (2019) RNA 25, 1211-1217), DUX4 발현 플라스미드 단독으로 형질감염된 세포는 DUX4 탐침와 함께 인큐베이션했을 때 거미와 같은 풍부한 갈색 신호뿐만 아니라 사멸과 일치하는 상대적으로 낮은 세포 밀도를 나타냈다(도 2a). 대조적으로, DUX4 탐침 신호는 DUX4 및 본 발명의 3개의 선도 U7-asDUX4로 공동 형질감염된 세포에서 유의하게 감소되었다(도 2b-d). 구체적으로, U7-asDUX4-처리 웰에서 DUX4-양성 세포가 현저히 더 적고 및/또는 DUX4 신호를 여전히 나타내는 세포에서 DUX4 염색 강도가 감소되었다(도 2b-d). 형질감염되지 않은 HEK293 세포에서는 DUX4 신호가 발견되지 않은 반면(도 2e), RNAscope 검정에 대한 양성 대조군인 펩티딜프롤릴 이소머라제 B(PPIB) 유전자에 대한 탐침으로 염색된 세포에서는 풍부한 신호가 분명했기 때문에 양성 및 음성 대조군은 예상된 바와 같이 거동했다(도 2f). 세포 사멸로부터 일부 보호를 제공하는 DUX4 녹다운과 일치하게(도 1d), U7-asDUX4 플라스미드로 형질감염된 웰은 "DUX4 단독" 형질감염된 샘플에 비해 더 큰 세포 밀도를 가졌다.
실시예 4
U7-asDUX4 snRNA가 형질감염된 HEK293 세포에서 전장 DUX4 단백질을 감소시킴
전장 DUX4 mRNA 녹다운을 확인하기 위해 DUX4 단백질 발현을 억제하는 U7-asDUX4의 효율을 결정했다. 이를 위해 세포는 CMV.DUX4 발현 플라스미드와 함께 3개의 선도 U7-asDUX4 작제물 또는 비표적화 대조군으로 공동 형질감염된 세포였다. 단백질 검출을 용이하게 하기 위해 V5 에피토프 태그의 프레임-내 COOH-말단 융합을 함유하는 전장 DUX4 작제물(CMV.DUX4.V5-fl)을 사용했다(도 3a). DUX4 단백질을 검출하기 위해 세포를 V5 태그에 대한 형광-표지 항체로 염색했다. 비표적화 대조군 U7-snRNA를 받은 세포와 비교하여 감소된 DUX4.V5 신호가 U7-asDUX4 서열 7 또는 8로 공동 형질감염된 세포에서 관찰되었다(도 3b). 흥미롭게도, U7-asDUX4-4는 그 결합 부위가 V5-에피토프 태그에 의해 손상되어 특이성에 대한 부주의한 대조군 역할을 하였으므로 DUX4.V5 단백질 수준에 영향을 미치지 않았다.
선도 U7-snRNA에 의한 DUX4 단백질 녹다운을 추가로 확인하기 위해 HEK293 세포에서 유사한 공동 형질감염 실험을 수행했다; 그러나 웨스턴 블롯을 사용하여 결과를 측정했다. 또한, C-말단 V5 태그가 U7-asDUX4-4 결합 부위를 손상시켰기 때문에, 이 실험 세트에서는 상이한 DUX4 발현 작제물을 이용하였다. 구체적으로, 아미노-말단, 프레임-내 myc-에피토프 태그를 함유하는 CMV.DUX4 발현 플라스미드를 생성하였다(도 3c). 이 작제물은 엑손 1의 3' 말단 근처에 있는 전장 DUX4 mRNA SD/SA를 차폐하도록 설계된 U7-asDUX4 서열이 스플라이싱을 편향시켜 절단된 무독성 DUX4-s 단백질 이소형(도 3c)을 생성하는지를 결정할 수 있게 하는 것으로 추론되었다(Snider 등 (2010) PLoS Genet 6, e1001181). 웨스턴 블롯팅을 Myc.DUX4를 발현하는 플라스미드와 엑손 1/인트론 1 접합부 근처에서 염기쌍을 형성하도록 설계된 3개의 선도 작제물 및 서열 5 및 6을 포함하는 5개의 상이한 U7-asDUX4 작제물로 공동 형질감염된 HEK293 세포로부터의 단백질 추출물을 사용하여 수행하였다. myc-에피토프 항체를 사용하여 전장 Myc-DUX4 단백질 밴드(52 kDa)가 모든 형질감염된 세포에서 검출되었다. 또한 모든 샘플은 내인성 c-myc 단백질(약 60 kDa)의 크기로 이동하는 더 큰 비 DUX4 단백질을 포함하였다. 이전 실험과 일치하게, 선도 작제물인 U7-asDUX4 서열 4, 7 및 8은 DUX4 단백질을 87.4% ± 9.8% SEM, 65.9% ± 15% SEM 및 84.7% ± 13.5% SEM으로 유의하게 감소시켰다(n=3 독립 실험; 도 3d~e 및 6a-b). 웨스턴 블롯에 의해 DUX4-s 생산의 증거는 검출되지 않아서(예측된 크기 22 kDa), DUX4 스플라이스 부위를 차폐하도록 설계된 U7-asDUX4 서열(4, 5, 6 및 7)에 의한 전장 DUX4 유전자 발현의 감소가 DUX4-s 이소형을 선호하도록 스플라이싱 패턴을 이동시켜 작동하지 않음을 제시하였다. 유사하게, 3' RACE RT-PCR을 사용하여 더 짧은 DUX4-s 전사체의 증거는 발견되지 않았다(도 7). 이들 웨스턴 블롯의 비특이적 상부 밴드는 다양한 발현을 나타내었다. DUX4가 Myc를 활성화하는 것으로 나타났기 때문에 DUX4 수준 변화는 Myc인 경우 해당 상부 밴드의 풍부도에 영향을 미칠 수 있었다(Shadle 등 (2017) PLoS Genet 13, e1006658). 그러나 이러한 실험에서 잔류 DUX4와 Myc 풍부도 사이의 강한 상관관계는 관찰되지 않았다.
실시예 5
U7-asDUX4가 FSHD 환자의 근관에서 내인성 DUX4 발현을 유의하게 감소시킴
HEK293에서의 연구 결과는 몇몇 U7-asDUX4 snRNA가 전장 DUX4 발현을 감소시키고 과발현 모델에서 세포 사멸로부터 보호할 수 있음을 제시했다. 따라서, FSHD 환자 근관에서 내인성 DUX4 mRNA를 감소시키는 선도 U7-asDUX4 snRNA 작제물(4, 7 및 8)의 능력을 RNAscope 원 위치 혼성화를 사용하여 평가했다. RNAscope는 이전에 FSHD 근관에서 DUX4를 검출하기 위해 사용하였다(Amini Chermahini 등 (2019) RNA 25, 1211-1217). 이전 보고와 일치하게 DUX4 염색은 임의의 주어진 시간에 적은 백분율의 세포에만 존재하는 것으로 나타났다. 중요하게는, 인공 DUX4-표적화 마이크로RNA(mi405)의 전달 후 DUX4 녹다운을 정량할 수 있었다(Amini Chermahini 등 (2019) 상기 문헌; Jones 등 (2012) Hum Mol Genet 21, 4419-4430). 따라서 RNAscope는 U7-asDUX4 snRNA가 인간 FSHD 환자에서 유도된 근관에서 내인성 DUX4 신호를 감소시킬 수 있는지를 결정하기 위해 사용되어 이 접근의 잠재적 반영 가능성을 지지한다. 이를 위해 전기천공을 사용하여 FSHD 근육 세포를 형질감염시켰고, 이는 전형적으로 ~50-70% 형질감염 효율을 생성한다(도 8). 이전 결과와 일치하게, 형질감염되지 않은 15A FSHD 근관은 갈색 DUX4 신호를 나타낸 반면, U7-asDUX4 서열 4, 7 및 8로 형질감염된 근육세포는 RNAscope 신호가 유의하게 감소했다(도 4a-h). 이러한 결과는 이러한 3개의 U7-asDUX4 작제물(즉, U7-asDUX4 서열 4, 7 및 8)이 FSHD 근육 세포에서 내인성 DUX4 mRNA의 탈안정화 및 분해에 영향을 미칠 수 있음을 확인시켜준다.
실시예 6
U7-asDUX4 snRNA가 FSHD 근관에서 DUX4-활성화 바이오마커 발현을 감소시킴
유망한 FSHD 치료법의 출현으로 FSHD 분야에서 치료 유효성을 확립하기 위해 사용할 수 있는 임상 결과 측정 및 바이오마커를 개발해야 할 필요성이 생겼다(LoRusso 등 (2019) BMC Neurol 19, 224; Mul 등 (2017). Neurology 89, 2057-2065; Wang 등 (2019) Hum Mol Genet 28, 476-486; Wong 등 (2020) Hum Mol Genet 29, 1030-1043). DUX4 발현이 비약물 또는 유전자 치료법에 의한 표적 연루의 가장 직접적인 측정이지만, FSHD 근육 생검에서는 검출하기 어렵고 상대적으로 희소하다. 따라서, 인간 근육 생검에서의 DUX4 발현은 현재 FSHD 임상 시험에 대한 신뢰할 수 있는 결과 측정이 아니며, 이제 몇몇 그룹이 DUX4 발현의 간접적인 측정으로 DUX4-활성화 바이오마커를 조사하기 시작했다. 적어도 67개의 상이한 유전자가 DUX4 결합 부위를 갖는 조절 영역을 포함하고 DUX4 발현 시 지속적으로 활성화된다. 그러나 최근 연구는 적은 수의 바이오마커만 전체 세트를 나타내는 데 필요하다고 제시한다(Rickard 등 (2015) Hum Mol Genet 24, 5901-5914; Yao 등 (2014) Hum Mol Genet 23, 5342-5352; Eidahl (2016) Hum Mol Genet 25, 4577-4589; Geng 등 (2012) Dev Cell 22, 38-51; Jagannathan (2016) Hum Mol Genet 25, 4419-4431; van den Heuvel 등 (2019) Hum Mol Genet 28, 1064-1075). 따라서 4개의 바이오마커, 즉 ZSCAN4, PRAMEF12, TRIM43 및 MBD3L2가 확립된 DUX4 표적 유전자 및 FSHD 질환 바이오마커이며 FSHD와 건강한 대조군 세포 간에 지속적으로 차별적 발현을 나타냈기 때문에 본 연구에서 선택하였다(Yao 등 (2014) Hum Mol Genet 23, 5342-5352; Eidahl (2016) Hum Mol Genet 25, 4577-4589; Chen 등 (2016) Mol Ther 24, 1405-1411; Lek 등 (2020) Sci Transl Med 12.; Amini Chermahini (2019) RNA 25, 1211-1217). 따라서, FSHD 환자 세포에서 이러한 DUX4-활성화 바이오마커를 억제하는 몇몇 U7-asDUX4 snRNA의 능력을 시험했다.
이를 위해 15A FSHD 환자 근모세포를 U7-asDUX4 snRNA-4, -7 및 -8 뿐만 아니라 비표적화 대조군으로 형질감염시켰다. 그런 다음 세포를 7일 동안 근관으로 분화시키고 정량적 RT-PCR을 수행하여 DUX4-활성화 인간 바이오마커 TRIM43, MBD3L2, PRAMEF12 및 ZSCAN4의 발현을 측정했다. 4개 바이오마커 모두의 발현이 미처리 15A 근관에 존재했으며 U7-asDUX4-처리 15A 세포에서 유의하게 감소되었다(도 4i).
공동 형질감염된 세포 및 FSHD 환자 유래 근관 둘 모두에서 DUX4 및 DUX4 관련 결과를 유의하게 감소시킨 몇몇 U7-asDUX4 작제물이 확인되었다. 이러한 실험은 FSHD 치료를 위한 새로운 접근법으로서 새로운 재조합 U7-asDUX4를 사용하여 DUX4 침묵화에 대한 개념 증명을 제공한다. FSHD 마우스 모델에서 생체내 이러한 접근법을 반영하는 작업이 수행되고 있다.
실시예 7
U7-asDUX4 snRNA가 FSHD 마우스 모델에서 DUX4-활성화 바이오마커 발현을 감소시킴
본 개시의 AAV.U7-asDUX4를 새로운 FSHD 마우스 모델, 예를 들어 중증 FSHD의 타목시펜-유도성 DUX4(TIC-DUX4) 마우스 모델(Giesige 등, JCI Insight. 2018; 3(22)) 또는 FSHD 마우스의 임의의 다른 마우스 모델에 근육내(IM) 또는 정맥내(IV) 주사한다. 동물은 mi405, mi405H 또는 miLacZ 서열을 운반하는 AAV6 벡터의 3x10E14 vg/kg, 8x10E13 vg/kg 또는 3x10E13 vg/kg 입자 또는 식염수를 꼬리 정맥을 통해 또는 근육내로 받는다.
동물을 무작위화하고 맹검 방식으로 주사하므로 두 명의 작업자가 필요하다: 한 명은 맹검을 설정하고 전달을 위해 벡터를 희석하고 다른 한 명은 동물에 주사하고 결과 측정을 수행한다. TIC-DUX4 마우스의 공개된 특성규명에서 수행된 검정력 분석에 기반하여, 그룹당 N=20마리의 동물이 결과 측정을 시험하기 충분한 검정력을 제공했다. 그러나 인간과 마찬가지로 TIC-DUX4 마우스는 다양한 표현형을 나타낼 수 있으므로 보다 강력한 연구를 보장하고 소모에 대해 보호하기 위해 N을 각 용량 및 시점에 대해 26(N=수컷 13명 및 암컷 13명)으로 증가시킨다.
일부 연구에서는 동물을 무작위로 하기와 같이 두 그룹으로 나눈다:
급성 FSHD 모델. TIC-DUX4 마우스 또는 WT 마우스, 타목시펜(10주 동안 매주 1회 5 mg/kg) 또는 해바라기유 비히클을 경구 위관영양법으로 처리했다.
만성 FSHD 모델. TIC-DUX4 마우스 또는 WT 마우스를 유도되지 않은 상태로 유지하며 결과 측정을 수행하기 전에 9개월 동안 살게 한다.
4주, 8주, 12주, 16주, 20주 및 24주 후, Wfdc3 또는 Trim36과 같은 DUX4 바이오마커의 발현 수준을 qRT-PCR, RNAscope 또는 ddPCR로 측정한다.
감소된 수준의 DUX4 바이오마커 발현이 미처리 마우스의 근육에서의 수준과 비교하여 U7-asDUX4로 처리된 마우스의 근육에서 관찰된다.
실시예 8
U7-asDUX4 snRNA가 FSHD 마우스 모델에서 근육의 내인성 DUX4 발현을 감소시킴
본 개시의 AAV.U7-asDUX4를 새로운 FSHD 마우스 모델(TIC-DUX4) 또는 FSHD 마우스의 임의의 다른 마우스 모델로 근육내(IM) 또는 정맥내(IV) 주사한다. 4주, 8주, 12주, 16주, 20주 및 24주 후, DUX4 mRNA의 발현 수준을 qRT-PCR, RNAscope 또는 ddPCR로 측정한다. 조직병리학 및 분자 분석을 위해 전경골근, 비복근, 삼두근, 이두근, 대퇴사두근 및 횡경막을 포함한 몇몇 근육을 수집한다. 비복근 근육에서 절대 및 특이적 힘 측정을 수행한다. 힘 측정은 근육 조직병리의 온전성에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에(즉, 이를 조영에 대해 비공개 품질로 만듦), 조직병리적 분석을 위한 품질의 이미지를 보장하기 위해 그룹당 일부 추가 마우스에 임의로 주사한다.
미처리 마우스의 근육에서의 수준과 비교하여 U7-asDUX4로 처리된 마우스의 근육에서 감소된 수준의 DUX4 mRNA가 관찰되었다.
실시예 9
U7-asDUX4 snRNA가 근육에서 내인성 DUX4 발현을 감소시킴
본 개시의 AAV.U7-asDUX4를 FSHD를 앓고 있는 환자로 근육내(IM) 또는 정맥내(IV) 주사한다. 치료 전 및 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52주 후, 환자의 근육에서 DUX4 mRNA의 발현 수준을 qRT-PCR, RNAscope 또는 ddPCR에 의해 생검 근육에서 측정한다.
치료 전 동일한 환자의 근육에서의 DUX4 mRNA 수준과 비교하여 U7-asDUX4로 처리된 환자의 근육에서 감소된 수준의 DUX4 mRNA가 관찰된다. FSHD 질환 증상의 향상도 관찰된다.
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문맥상 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 이어지는 청구범위에 걸쳐, 단어 "포함한다" 및 변화 "포함하다" 및 "포함하는"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계 그룹을 포함함을, 그러나 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계 그룹을 제외하지 않음을 시사하는 것으로 이해될 것이다.
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본원에 개시된 방법 및 이의 개별 단계의 실행은 수동으로 및/또는 전자 장비의 도움으로 또는 전자 장비에 의해 제공되는 자동화로 수행될 수 있다. 과정이 특정 구현예를 참조하여 기재되었지만, 당업자는 방법과 관련된 행위를 수행하는 다른 방식이 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 달리 기재되지 않는 한, 방법의 범위 또는 사상을 벗어나지 않고 다양한 단계의 순서가 변화될 수 있다. 또한 개별 단계 중 일부는 조합, 생략 또는 추가 단계로 더 세분화될 수 있다.
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참고문헌
1. Deenen, J.C., Arnts, H., van der Maarel, S.M., Padberg, G.W., Verschuuren, J.J., Bakker, E., Weinreich, S.S., Verbeek, A.L., and van Engelen, B.G. (2014). Population-based incidence and prevalence of facioscapulohumeral dystrophy. Neurology 83, 1056-1059.
2. Pastorello, E., Cao, M., and Trevisan, C.P. (2012). Atypical onset in a series of 122 cases with FacioScapuloHumeral Muscular Dystrophy. Clin Neurol Neurosurg 114, 230-234.
3. Klinge, L., Eagle, M., Haggerty, I.D., Roberts, C.E., Straub, V., and Bushby, K.M. (2006). Severe phenotype in infantile facioscapulohumeral muscular dystrophy. Neuromuscul Disord 16, 553-558.
4. Statland, J.M., and Tawil, R. (2016). Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. Continuum (Minneap Minn) 22, 1916-1931.
5. Lemmers, R.J., van der Vliet, P.J., Klooster, R., Sacconi, S., Camano, P., Dauwerse, J.G., Snider, L., Straasheijm, K.R., van Ommen, G.J., Padberg, G.W., 등 (2010). A unifying genetic model for facioscapulohumeral muscular dystrophy. Science 329, 1650-1653.
6. Hendrickson, P.G., Dorais, J.A., Grow, E.J., Whiddon, J.L., Lim, J.W., Wike, C.L., Weaver, B.D., Pflueger, C., Emery, B.R., Wilcox, A.L., 등 (2017). Conserved roles of mouse DUX and human DUX4 in activating cleavage-stage genes and MERVL/HERVL retrotransposons. Nat Genet 49, 925-934.
7. Whiddon, J.L., Langford, A.T., Wong, C.J., Zhong, J.W., and Tapscott, S.J. (2017). Conservation and innovation in the DUX4-family gene network. Nat Genet 49, 935-940.
8. Bosnakovski, D., Xu, Z., Gang, E.J., Galindo, C.L., Liu, M., Simsek, T., Garner, H.R., Agha-Mohammadi, S., Tassin, A., Coppee, F., 등 (2008). An isogenetic myoblast expression screen identifies DUX4-mediated FSHD-associated molecular pathologies. EMBO J 27, 2766-2779.
9. Dixit, M., Ansseau, E., Tassin, A., Winokur, S., Shi, R., Qian, H., Sauvage, S., Matteotti, C., van Acker, A.M., Leo, O., 등 (2007). DUX4, a candidate gene of facioscapulohumeral muscular dystrophy, encodes a transcriptional activator of PITX1. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 18157-18162.
10. Wallace, L.M., Garwick, S.E., Mei, W., Belayew, A., Coppee, F., Ladner, K.J., Guttridge, D., Yang, J., and Harper, S.Q. (2011). DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo. Ann Neurol 69, 540-552.
11. Giesige, C.R., Wallace, L.M., Heller, K.N., Eidahl, J.O., Saad, N.Y., Fowler, A.M., Pyne, N.K., Al-Kharsan, M., Rashnonejad, A., Chermahini, G.A., 등 (2018). AAV-mediated follistatin gene therapy improves functional outcomes in the TIC-DUX4 mouse model of FSHD. JCI Insight 3.
12. Kowaljow, V., Marcowycz, A., Ansseau, E., Conde, C.B., Sauvage, S., Matteotti, C., Arias, C., Corona, E.D., Nunez, N.G., Leo, O., 등 (2007). The DUX4 gene at the FSHD1A locus encodes a pro-apoptotic protein. Neuromuscul Disord 17, 611-623.
13. Snider, L., Asawachaicharn, A., Tyler, A.E., Geng, L.N., Petek, L.M., Maves, L., Miller, D.G., Lemmers, R.J., Winokur, S.T., Tawil, R., 등 (2009). RNA transcripts, miRNA-sized fragments and proteins produced from D4Z4 units: new candidates for the pathophysiology of facioscapulohumeral dystrophy. Hum Mol Genet 18, 2414-2430.
14. Snider, L., Geng, L.N., Lemmers, R.J., Kyba, M., Ware, C.B., Nelson, A.M., Tawil, R., Filippova, G.N., van der Maarel, S.M., Tapscott, S.J., 등 (2010). Facioscapulohumeral dystrophy: incomplete suppression of a retrotransposed gene. PLoS Genet 6, e1001181.
15. Shadle, S.C., Zhong, J.W., Campbell, A.E., Conerly, M.L., Jagannathan, S., Wong, C.J., Morello, T.D., van der Maarel, S.M., and Tapscott, S.J. (2017). DUX4-induced dsRNA and MYC mRNA stabilization activate apoptotic pathways in human cell models of facioscapulohumeral dystrophy. PLoS Genet 13, e1006658.
16. Dmitriev, P., Bou Saada, Y., Dib, C., Ansseau, E., Barat, A., Hamade, A., Dessen, P., Robert, T., Lazar, V., Louzada, R.A.N., 등 (2016). DUX4-induced constitutive DNA damage and oxidative stress contribute to aberrant differentiation of myoblasts from FSHD patients. Free Radic Biol Med 99, 244-258.
17. Rickard, A.M., Petek, L.M., and Miller, D.G. (2015). Endogenous DUX4 expression in FSHD myotubes is sufficient to cause cell death and disrupts RNA splicing and cell migration pathways. Hum Mol Genet 24, 5901-5914.
18. Vanderplanck, C., Ansseau, E., Charron, S., Stricwant, N., Tassin, A., Laoudj-Chenivesse, D., Wilton, S.D., Coppee, F., and Belayew, A. (2011). The FSHD atrophic myotube phenotype is caused by DUX4 expression. PLoS One 6, e26820.
19. Yao, Z., Snider, L., Balog, J., Lemmers, R.J., Van Der Maarel, S.M., Tawil, R., and Tapscott, S.J. (2014). DUX4-induced gene expression is the major molecular signature in FSHD skeletal muscle. Hum Mol Genet 23, 5342-5352.
20. Eidahl, J.O., Giesige, C.R., Domire, J.S., Wallace, L.M., Fowler, A.M., Guckes, S.M., Garwick-Coppens, S.E., Labhart, P., and Harper, S.Q. (2016). Mouse Dux is myotoxic and shares partial functional homology with its human paralog DUX4. Hum Mol Genet 25, 4577-4589.
21. Lyle, R., Wright, T.J., Clark, L.N., and Hewitt, J.E. (1995). The FSHD-associated repeat, D4Z4, is a member of a dispersed family of homeobox-containing repeats, subsets of which are clustered on the short arms of the acrocentric chromosomes. Genomics 28, 389-397.
22. Gabriels, J., Beckers, M.C., Ding, H., De Vriese, A., Plaisance, S., van der Maarel, S.M., Padberg, G.W., Frants, R.R., Hewitt, J.E., Collen, D., 등 (1999). Nucleotide sequence of the partially deleted D4Z4 locus in a patient with FSHD identifies a putative gene within each 3.3 kb element. Gene 236, 25-32.
23. Marsollier, A.C., Ciszewski, L., Mariot, V., Popplewell, L., Voit, T., Dickson, G., and Dumonceaux, J. (2016). Antisense targeting of 3' end elements involved in DUX4 mRNA processing is an efficient therapeutic strategy for facioscapulohumeral dystrophy: a new gene-silencing approach. Hum Mol Genet 25, 1468-1478.
24. Chen, J.C., King, O.D., Zhang, Y., Clayton, N.P., Spencer, C., Wentworth, B.M., Emerson, C.P., Jr., and Wagner, K.R. (2016). Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics. Mol Ther 24, 1405-1411.
25. Ansseau, E., Vanderplanck, C., Wauters, A., Harper, S.Q., Coppee, F., and Belayew, A. (2017). Antisense Oligonucleotides Used to Target the DUX4 mRNA as Therapeutic Approaches in FaciosScapuloHumeral Muscular Dystrophy (FSHD). Genes (Basel) 8.
26. Lek, A., Zhang, Y., Woodman, K.G., Huang, S., DeSimone, A.M., Cohen, J., Ho, V., Conner, J., Mead, L., Kodani, A., 등 (2020). Applying genome-wide CRISPR-Cas9 screens for therapeutic discovery in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Sci Transl Med 12.
27. Himeda, C.L., Jones, T.I., and Jones, P.L. (2016). CRISPR/dCas9-mediated Transcriptional Inhibition Ameliorates the Epigenetic Dysregulation at D4Z4 and Represses DUX4-fl in FSH Muscular Dystrophy. Mol Ther 24, 527-535.
28. DeSimone, A.M., Leszyk, J., Wagner, K., and Emerson, C.P., Jr. (2019). Identification of the hyaluronic acid pathway as a therapeutic target for facioscapulohumeral muscular dystrophy. Sci Adv 5, eaaw7099.
29. Lim, K.R.Q., Maruyama, R., Echigoya, Y., Nguyen, Q., Zhang, A., Khawaja, H., Sen Chandra, S., Jones, T., Jones, P., Chen, Y.W., 등 (2020). Inhibition of DUX4 expression with antisense LNA gapmers as a therapy for facioscapulohumeral muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A 117, 16509-16515.
30. Amini Chermahini, G., Rashnonejad, A., and Harper, S.Q. (2019). RNAscope in situ hybridization-based method for detecting DUX4 RNA expression in vitro. RNA 25, 1211-1217.
31. Wallace, L.M., Saad, N.Y., Pyne, N.K., Fowler, A.M., Eidahl, J.O., Domire, J.S., Griffin, D.A., Herman, A.C., Sahenk, Z., Rodino-Klapac, L.R., 등 (2018). Pre-clinical Safety and Off-Target Studies to Support Translation of AAV-Mediated RNAi Therapy for FSHD. Mol Ther Methods Clin Dev 8, 121-130.
32. Verma, A. (2018). Recent Advances in Antisense Oligonucleotide Therapy in Genetic Neuromuscular Diseases. Ann Indian Acad Neurol 21, 3-8.
33. Ideue, T., Adachi, S., Naganuma, T., Tanigawa, A., Natsume, T., and Hirose, T. (2012). U7 small nuclear ribonucleoprotein represses histone gene transcription in cell cycle-arrested cells. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 5693-5698.
34. Schumperli, D., and Pillai, R.S. (2004). The special Sm core structure of the U7 snRNP: far-reaching significance of a small nuclear ribonucleoprotein. Cell Mol Life Sci 61, 2560-2570.
35. Goyenvalle, A., Babbs, A., van Ommen, G.J., Garcia, L., and Davies, K.E. (2009). Enhanced exon-skipping induced by U7 snRNA carrying a splicing silencer sequence: Promising tool for DMD therapy. Mol Ther 17, 1234-1240.
36. Goyenvalle, A., Wright, J., Babbs, A., Wilkins, V., Garcia, L., and Davies, K.E. (2012). Engineering multiple U7snRNA constructs to induce single and multiexon-skipping for Duchenne muscular dystrophy. Mol Ther 20, 1212-1221.
37. Nualkaew, T., Jearawiriyapaisarn, N., Hongeng, S., Fucharoen, S., Kole, R., and Svasti, S. (2019). Restoration of correct beta(IVS2-654)-globin mRNA splicing and HbA production by engineered U7 snRNA in beta-thalassaemia/HbE erythroid cells. Sci Rep 9, 7672.
38. Biferi, M.G., Cohen-Tannoudji, M., Cappelletto, A., Giroux, B., Roda, M., Astord, S., Marais, T., Bos, C., Voit, T., Ferry, A., 등 (2017). A New AAV10-U7-Mediated Gene Therapy Prolongs Survival and Restores Function in an ALS Mouse Model. Mol Ther 25, 2038-2052.
39. Wein, N., Vulin, A., Falzarano, M.S., Szigyarto, C.A., Maiti, B., Findlay, A., Heller, K.N., Uhlen, M., Bakthavachalu, B., Messina, S., 등 (2014). Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nat Med 20, 992-1000.
40. Jones, T.I., Chen, J.C., Rahimov, F., Homma, S., Arashiro, P., Beermann, M.L., King, O.D., Miller, J.B., Kunkel, L.M., Emerson, C.P., Jr., 등 (2012). Facioscapulohumeral muscular dystrophy family studies of DUX4 expression: evidence for disease modifiers and a quantitative model of pathogenesis. Hum Mol Genet 21, 4419-4430.
41. LoRusso, S., Johnson, N.E., McDermott, M.P., Eichinger, K., Butterfield, R.J., Carraro, E., Higgs, K., Lewis, L., Mul, K., Sacconi, S., 등 (2019). Clinical trial readiness to solve barriers to drug development in FSHD (ReSolve): protocol of a large, international, multi-center prospective study. BMC Neurol 19, 224.
42. Mul, K., Vincenten, S.C.C., Voermans, N.C., Lemmers, R., van der Vliet, P.J., van der Maarel, S.M., Padberg, G.W., Horlings, C.G.C., and van Engelen, B.G.M. (2017). Adding quantitative muscle MRI to the FSHD clinical trial toolbox. Neurology 89, 2057-2065.
43. Wang, L.H., Friedman, S.D., Shaw, D., Snider, L., Wong, C.J., Budech, C.B., Poliachik, S.L., Gove, N.E., Lewis, L.M., Campbell, A.E., 등 (2019). MRI-informed muscle biopsies correlate MRI with pathology and DUX4 target gene expression in FSHD. Hum Mol Genet 28, 476-486.
44. Wong, C.J., Wang, L.H., Friedman, S.D., Shaw, D., Campbell, A.E., Budech, C.B., Lewis, L.M., Lemmers, R., Statland, J.M., van der Maarel, S.M., 등 (2020). Longitudinal measures of RNA expression and disease activity in FSHD muscle biopsies. Hum Mol Genet 29, 1030-1043.
45. Geng, L.N., Yao, Z., Snider, L., Fong, A.P., Cech, J.N., Young, J.M., van der Maarel, S.M., Ruzzo, W.L., Gentleman, R.C., Tawil, R., 등 (2012). DUX4 activates germline genes, retroelements, and immune mediators: implications for facioscapulohumeral dystrophy. Dev Cell 22, 38-51.
46. Jagannathan, S., Shadle, S.C., Resnick, R., Snider, L., Tawil, R.N., van der Maarel, S.M., Bradley, R.K., and Tapscott, S.J. (2016). Model systems of DUX4 expression recapitulate the transcriptional profile of FSHD cells. Hum Mol Genet 25, 4419-4431.
47. van den Heuvel, A., Mahfouz, A., Kloet, S.L., Balog, J., van Engelen, B.G.M., Tawil, R., Tapscott, S.J., and van der Maarel, S.M. (2019). Single-cell RNA sequencing in facioscapulohumeral muscular dystrophy disease etiology and development. Hum Mol Genet 28, 1064-1075.
48. Sharma, V., Harafuji, N., Belayew, A., and Chen, Y.W. (2013). DUX4 differentially regulates transcriptomes of human rhabdomyosarcoma and mouse C2C12 cells. PLoS One 8, e64691.
49. Rojas, L.A., Valentine, E., Accorsi, A., Maglio, J., Shen, N., Robertson, A., Kazmirski, S., Rahl, P., Tawil, R., Cadavid, D., 등 (2020). P38α Regulates Expression of DUX4 in a Model of Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. J Pharmacol Exp Ther. 374(3):489-498.
50. Wein, N., Vulin, A., Findlay, A.R., Gumienny, F., Huang, N., Wilton, S.D., and Flanigan, K.M. (2017). Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. J Neuromuscul Dis 4, 199-207.
51. Voit, T., Topaloglu, H., Straub, V., Muntoni, F., Deconinck, N., Campion, G., De Kimpe, S.J., Eagle, M., Guglieri, M., Hood, S., 등 (2014). Safety and efficacy of drisapersen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy (DEMAND II): an exploratory, randomised, placebo-controlled phase 2 study. Lancet Neurol 13, 987-996.
52. Kinali, M., Arechavala-Gomeza, V., Feng, L., Cirak, S., Hunt, D., Adkin, C., Guglieri, M., Ashton, E., Abbs, S., Nihoyannopoulos, P., 등 (2009). Local restoration of dystrophin expression with the morpholino oligomer AVI-4658 in Duchenne muscular dystrophy: a single-blind, placebo-controlled, dose-escalation, proof-of-concept study. Lancet Neurol 8, 918-928.
53. Mendell, J.R., Goemans, N., Lowes, L.P., Alfano, L.N., Berry, K., Shao, J., Kaye, E.M., Mercuri, E., Eteplirsen Study, G., and Telethon Foundation, D.M.D.I.N. (2016). Longitudinal effect of eteplirsen versus historical control on ambulation in Duchenne muscular dystrophy. Ann Neurol 79, 257-271.
54. Carrell, S.T., Carrell, E.M., Auerbach, D., Pandey, S.K., Bennett, C.F., Dirksen, R.T., and Thornton, C.A. (2016). Dmpk gene deletion or antisense knockdown does not compromise cardiac or skeletal muscle function in mice. Hum Mol Genet 25, 4328-4338.
55. Aoki, Y., Nagata, T., Yokota, T., Nakamura, A., Wood, M.J., Partridge, T., and Takeda, S. (2013). Highly efficient in vivo delivery of PMO into regenerating myotubes and rescue in laminin-alpha2 chain-null congenital muscular dystrophy mice. Hum Mol Genet 22, 4914-4928.
56. Heemskerk, H., de Winter, C., van Kuik, P., Heuvelmans, N., Sabatelli, P., Rimessi, P., Braghetta, P., van Ommen, G.J., de Kimpe, S., Ferlini, A., 등 (2010). Preclinical PK and PD studies on 2'-O-methyl-phosphorothioate RNA antisense oligonucleotides in the mdx mouse model. Mol Ther 18, 1210-1217.
57. Shimizu-Motohashi, Y., Komaki, H., Motohashi, N., Takeda, S., Yokota, T., and Aoki, Y. (2019). Restoring Dystrophin Expression in Duchenne Muscular Dystrophy: Current Status of Therapeutic Approaches. J Pers Med 9.
58. Gonzalez-Barriga, A., Kranzen, J., Croes, H.J., Bijl, S., van den Broek, W.J., van Kessel, I.D., van Engelen, B.G., van Deutekom, J.C., Wieringa, B., Mulders, S.A., 등 (2015). Cell membrane integrity in myotonic dystrophy type 1: implications for therapy. PLoS One 10, e0121556.
59. Brun, C., Suter, D., Pauli, C., Dunant, P., Lochmuller, H., Burgunder, J.M., Schumperli, D., and Weis, J. (2003). U7 snRNAs induce correction of mutated dystrophin pre-mRNA by exon skipping. Cell Mol Life Sci 60, 557-566.
60. Stadler, G., Rahimov, F., King, O.D., Chen, J.C., Robin, J.D., Wagner, K.R., Shay, J.W., Emerson, C.P., Jr., and Wright, W.E. (2013). Telomere position effect regulates DUX4 in human facioscapulohumeral muscular dystrophy. Nat Struct Mol Biol 20, 671-678.
61. Liu, J., and Gall, J.G. (2007). U bodies are cytoplasmic structures that contain uridine-rich small nuclear ribonucleoproteins and associate with P bodies. PNAS 104(28), 11655-11659.
본 개시는 본 개시의 실행을 위한 구체적 양태를 포함하는 것으로 발견되거나 제안된 특정 구현예의 관점에서 기재되었다. 본 개시의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 본 개시의 다양한 변형 및 변화가 당업자에게 명백할 것이다. 본 개시가 특정 구현예와 관련하여 기재되었지만, 청구된 바와 같은 본 개시의 방법이 이러한 특정 구현예에 과도하게 제한되어서는 안된다는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 당업자에게 명백한 방법을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 하기 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Research Institute at Nationwide Children's Hospital <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY (FSHD) <130> 28335/56061/PC <150> US 63/119,268 <151> 2020-11-30 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 gctgaggggt gcttccagcg aggcggcctc ttcc 34 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 aggcctccag ctcccccggg gcctccgttt cta 33 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 tgcagaaact ccgggctcgc caggagctca tc 32 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 aaccccgcgt cctaaagctc ctccagcaga gcccggtatt cttc 44 <210> 5 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 gctcctccag cagagcccgg tattcttcct cgctgagggg tgcttcca 48 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 cgaaccaccc 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cggcgcgcgg ggatttcgcc 720 tacgccgccc cggctcctcc ggacggggcg ctctcccacc ctcaggctcc tcggtggcct 780 ccgcacccgg gcaaaagccg ggaggaccgg gacccgcagc gcgacggcct gccgggcccc 840 tgcgcggtgg cacagcctgg gcccgctcaa gcggggccgc agggccaagg ggtgcttgcg 900 ccacccacgt cccaggggag tccgtggtgg ggctggggcc ggggtcccca ggtcgccggg 960 gcggcgtggg aaccccaagc cggggcagct ccacctcccc agcccgcgcc cccggacgcc 1020 tccgcctccg cgcggcaggg gcagatgcaa ggcatcccgg cgccctccca ggcgctccag 1080 gagccggcgc cctggtctgc actcccctgc ggcctgctgc tggatgagct cctggcgagc 1140 ccggagtttc tgcagcaggc gcaacctctc ctagaaacgg aggccccggg ggagctggag 1200 gcctcggaag aggccgcctc gctggaagca cccctcagcg aggaagaata ccgggctctg 1260 ctggaggagc tttag 1275 <210> 38 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Seuqence <220> <223> Synthetic <400> 38 Met Ala Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ser Thr Leu Pro Ala Glu Ala Arg 1 5 10 15 Gly Arg Gly Arg Arg Arg Arg Leu Val Trp Thr Pro Ser Gln Ser Glu 20 25 30 Ala Leu Arg Ala Cys Phe Glu Arg Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Ala Thr 35 40 45 Arg Glu Arg Leu Ala Gln Ala Ile Gly Ile Pro Glu Pro Arg Val Gln 50 55 60 Ile Trp Phe Gln Asn Glu Arg Ser Arg Gln Leu Arg Gln His Arg Arg 65 70 75 80 Glu Ser Arg Pro Trp Pro Gly Arg Arg Gly Pro Pro Glu Gly Arg Arg 85 90 95 Lys Arg Thr Ala Val Thr Gly Ser Gln Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ala 100 105 110 Phe Glu Lys Asp Arg Phe Pro Gly Ile Ala Ala Arg Glu Glu Leu Ala 115 120 125 Arg Glu Thr Gly Leu Pro Glu Ser Arg Ile Gln Ile Trp Phe Gln Asn 130 135 140 Arg Arg Ala Arg His Pro Gly Gln Gly Gly Arg Ala Pro Ala Gln Ala 145 150 155 160 Gly Gly Leu Cys Ser Ala Ala Pro Gly Gly Gly His Pro Ala Pro Ser 165 170 175 Trp Val Ala Phe Ala His Thr Gly Ala Trp Gly Thr Gly Leu Pro Ala 180 185 190 Pro His Val Pro Cys Ala Pro Gly Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Val 195 200 205 Ser Gln Ala Ala Arg Ala Ala Pro Ala Leu Gln Pro Ser Gln Ala Ala 210 215 220 Pro Ala Glu Gly Ile Ser Gln Pro Ala Pro Ala Arg Gly Asp Phe Ala 225 230 235 240 Tyr Ala Ala Pro Ala Pro Pro Asp Gly Ala Leu Ser His Pro Gln Ala 245 250 255 Pro Arg Trp Pro Pro His Pro Gly Lys Ser Arg Glu Asp Arg Asp Pro 260 265 270 Gln Arg Asp Gly Leu Pro Gly Pro Cys Ala Val Ala Gln Pro Gly Pro 275 280 285 Ala Gln Ala Gly Pro Gln Gly Gln Gly Val Leu Ala Pro Pro Thr Ser 290 295 300 Gln Gly Ser Pro Trp Trp Gly Trp Gly Arg Gly Pro Gln Val Ala Gly 305 310 315 320 Ala Ala Trp Glu Pro Gln Ala Gly Ala Ala Pro Pro Pro Gln Pro Ala 325 330 335 Pro Pro Asp Ala Ser Ala Ser Ala Arg Gln Gly Gln Met Gln Gly Ile 340 345 350 Pro Ala Pro Ser Gln Ala Leu Gln Glu Pro Ala Pro Trp Ser Ala Leu 355 360 365 Pro Cys Gly Leu Leu Leu Asp Glu Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Leu 370 375 380 Gln Gln Ala Gln Pro Leu Leu Glu Thr Glu Ala Pro Gly Glu Leu Glu 385 390 395 400 Ala Ser Glu Glu Ala Ala Ser Leu Glu Ala Pro Leu Ser Glu Glu Glu 405 410 415 Tyr Arg Ala Leu Leu Glu Glu Leu 420 <210> 39 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 gaatcgagca ccagttacgc atgccgaggt cgacttccta gatttttttt tttttttttt 60 t 61 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Claims (28)

  1. U7 이중 호메오박스 4(DUX4) 안티센스 리보핵산(asRNA)을 암호화하는 핵산으로서, 다음을 포함하는, 핵산:
    (a) 서열 번호 1-18 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열;
    (b) 서열 번호 1-18 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열; 또는
    (c) (a) 및/또는 (b)의 뉴클레오티드 서열의 조합.
  2. 서열 번호 19-36 중 어느 하나에 제시된 DUX4 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화하는 U7 이중 호메오박스 4(DUX4) 안티센스 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 조합을 포함하는 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로모터 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
  4. 제3항에 있어서, 프로모터가 U6 프로모터, U7 프로모터, tRNA 프로모터, H1 프로모터, 최소 CMV 프로모터, T7 프로모터, EF1-알파 프로모터, 최소 EF1-알파 프로모터 또는 근육 특이적 프로모터 중 임의의 것인, 핵산.
  5. 제4항에 있어서, 근육 특이적 프로모터가 unc45b 프로모터, tMCK 프로모터, 최소 MCK 프로모터, CK6 프로모터, CK7 프로모터, MHCK7 프로모터 또는 CK1 프로모터인, 핵산.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산 또는 이의 어느 하나 이상의 조합을 포함하는 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터인, 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스, 배큘로바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스 또는 합성 바이러스인, 바이러스 벡터.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, AAV인, 바이러스 벡터.
  10. 제9항에 있어서, AAV에 rep 및 cap 유전자가 결여된, 바이러스 벡터.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, AAV가 재조합 AAV(rAAV) 또는 자가-상보적 재조합 AAV(scAAV)인, 바이러스 벡터.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, AAV가 rAAV1, rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV7, rAAV8, rAAV9, rAAV10, rAAV11, rAAV12, rAAV13, rAAV-anc80, rAAV rh.74, rAAV rh.8, rAAVrh.10 또는 rAAV-B1인, 바이러스 벡터.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, AAV가 rAAV-9인, 바이러스 벡터.
  14. 다음을 포함하는 조성물:
    (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제6항의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터; 또는
    (c) 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터; 및
    약학적으로 허용 가능한 담체.
  15. 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제 및/또는 방해하는 방법으로서, 세포를 다음과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제6항의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터;
    (c) 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터; 또는
    (d) 제14항의 조성물.
  16. 근이영양증을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에 유효량의 다음을 투여하는 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제6항의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터;
    (c) 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터; 또는
    (d) 제14항의 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 근이영양증이 안면견갑상완 근이영양증(FSHD)인, 방법.
  18. 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에 유효량의 다음을 투여하는 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제6항의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터;
    (c) 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터; 또는
    (d) 제14항의 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 암이 육종인, 방법.
  20. 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제하기 위한 약제의 제조를 위한, 다음의 용도:
    (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제6항의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터;
    (c) 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터; 또는
    (d) 제14항의 조성물.
  21. 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제하기 위한, 다음의 용도:
    (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제6항의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터;
    (c) 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터; 또는
    (d) 제14항의 조성물.
  22. 근이영양증을 치료 또는 개선하기 위한 약제의 제조를 위한, 다음의 용도:
    (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제6항의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터;
    (c) 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터; 또는
    (d) 제14항의 조성물.
  23. 근이영양증의 치료 또는 개선을 위한, 다음의 용도:
    (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제6항의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터;
    (c) 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터; 또는
    (d) 제14항의 조성물.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 근이영양증이 안면견갑상완 근이영양증인, 용도.
  25. 암을 치료 또는 개선하기 위한 약제의 제조를 위한, 다음의 용도:
    (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제6항의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터;
    (c) 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터; 또는
    (d) 제14항의 조성물.
  26. 암을 치료 또는 개선하기 위한, 다음의 용도:
    (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제6항의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터;
    (c) 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터; 또는
    (d) 제14항의 조성물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 암이 육종인, 용도.
  28. (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제6항의 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀 또는 벡터;
    (c) 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터;
    (d) 제14항의 조성물;
    (e) 제15항 내지 제19항중 어느 한 항의 방법; 또는
    (e) 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항의 용도로서,
    여기서 핵산, 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀, 벡터, 조성물 또는 약제가 근육내 주사, 경피 수송 또는 혈류로의 주사를 위해 제형화되는, 핵산, 나노입자, 세포외 소포, 엑소좀, 벡터, 바이러스 벡터, 조성물, 방법 또는 용도.
KR1020237022057A 2020-11-30 2021-11-30 안면견갑상완 근이영양증(fshd)을 치료하기 위한 조성물및 방법 KR20230128470A (ko)

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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3108289A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
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Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
CA2176117C (en) 1993-11-09 2006-01-03 Terence R. Flotte Generation of high titers of recombinant aav vectors
US5837484A (en) 1993-11-09 1998-11-17 Medical College Of Ohio Stable cell lines capable of expressing the adeno-associated virus replication gene
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
WO1996017947A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
US6143548A (en) 1995-08-30 2000-11-07 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adeno-associated virus (AAV)
EP0850313B8 (en) 1995-09-08 2009-07-29 Genzyme Corporation Improved aav vectors for gene therapy
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
AU723497C (en) 1996-09-06 2001-10-11 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
DK1009808T3 (da) 1997-09-05 2013-01-21 Genzyme Corp Fremgangsmåder til generering af hjælper-frie præparater af rekombinante aav-vektorer med høj titer
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
WO2001083692A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
US6962815B2 (en) 2001-01-05 2005-11-08 Children's Hopital Inc. AAV2 vectors and methods
AU2002360291A1 (en) 2001-12-17 2003-06-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) serotype 8 sequences
EP3290055A3 (en) 2011-07-25 2018-05-30 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of dux4
DE102012007232B4 (de) 2012-04-07 2014-03-13 Susanne Weller Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen
JP2015092462A (ja) 2013-09-30 2015-05-14 Tdk株式会社 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池
JP6202701B2 (ja) 2014-03-21 2017-09-27 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及びプログラム
JP6197169B2 (ja) 2014-09-29 2017-09-20 東芝メモリ株式会社 半導体装置の製造方法
US11180755B2 (en) * 2016-02-26 2021-11-23 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Recombinant virus products and methods for inducing DUX4 exon skipping
US20220202845A1 (en) * 2018-07-30 2022-06-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for treating cancer
CA3124963A1 (en) * 2018-12-31 2020-07-09 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Dux4 rna silencing using rna targeting crispr-cas13b

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