ES2845214T3 - Herramientas de terapia génica eficaces para el salto del exón 53 de la distrofina - Google Patents

Abstract

Vector vírico adenoasociado recombinante (AAVr) que comprende una secuencia que codifica un oligonucleótido antisentido (AON) dirigido contra la totalidad de la región +30 a +69 del exón 53 del ARN premensajero de la distrofina, estando dicha secuencia constituida por la secuencia SEQ ID NO: 3.

Description

DESCRIPCIÓN

Herramientas de terapia génica eficaces para el salto del exón 53 de la distrofina

Campo técnico

La presente invención concierne a herramientas de terapia génica particularmente competentes en el tratamiento de enfermedades distróficas musculares tales como la distrofia muscular de Duchenne (DMD).

Éstas se basan en la juiciosa elección de un oligonucleótido antisentido (AON) que permite el salto del exón 53 del gen de la distrofina, vehiculados por un vector vírico adenoasociado recombinante (AAVr), y asociados ventajosamente a un snRNA modificado.

Estado de la técnica anterior

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) constituye la enfermedad muscular progresiva degenerativa más frecuente. Se trata de una enfermedad genética portada por el cromosoma X que afecta aproximadamente a 1 niño de cada 5.000. Es el resultado de mutaciones o de deleciones en el gen de la distrofina. La ausencia de expresión o la expresión de una distrofina muy anormal genera una fragilidad de la fibra muscular, que tiene como consecuencia la destrucción acelerada del tejido muscular. La deficiencia en distrofina funcional causa una degradación de las fibras, una inflamación, una necrosis y la sustitución del músculo por tejido adiposo, lo que implica una progresiva debilidad muscular y la muerte prematura debido a una deficiencia respiratoria o cardiaca en el transcurso de entre la segunda y la cuarta década de la vida (Moser, H., Hum Genet, 1984. 66 (1): 17-40).

El gen dmd (2.7 Mb), que codifica la proteína distrofina, está formado por 79 exones y está situado en el locus 21.2 del cromosoma X. La distrofina es una proteína modular que presenta una región central formada por 24 dominios repetitivos de tipo "spectrin-like".

La mayoría de las mutaciones graves del gen de la distrofina consisten en deleciones de uno o varios exones que alteran marco de lectura del mensajero final, duplicaciones de una porción del gen o bien mutaciones puntuales, presentes en las regiones codificantes (o exones), que introducen codones de terminación o desplazamientos de la fase de lectura.

No obstante, se ha destacado que algunas formas truncadas de la distrofina, en particular desprovistas de ciertas secuencias repetitivas, son perfectamente funcionales o por lo menos solamente parcialmente defectuosas, como por ejemplo, en la forma atenuada de la enfermedad denominada distrofia muscular de Becker (DMB).

Partiendo de esta constatación, y de forma alternativa a la terapia génica clásica, que consiste en aportar una copia intacta del gen defectuoso (lo que supone un problema en vista del tamaño del que codifica la distrofina), se han considerado diferentes estrategias para intentar "reparar" las distrofinas disfuncionales.

Así, el "salto de exón" ("exon skipping" en inglés) es una estrategia terapéutica que consiste en administrar oligonucleótidos antisentido (AON) complementarios de las secuencias implicadas en el ayuste de los exones que se quieren enmascarar, con el fin de restaurar el marco de lectura. En particular, los saltos de los exones que intervienen en las regiones de secuencias repetidas permiten obtener una proteína distrofina más corta que la proteína nativa, pero que es, no obstante, funcional.

En la práctica, el salto del exón 53 puede resultar beneficioso en todos los casos en los que permite restaurar el marco de lectura. Esto apunta teóricamente a un importante número de mutaciones que pueden estar presentes en el gen de la distrofina, particularmente las deleciones del exón 52 (A52), de los exones 50 a 52 (A50-52), de los exones 49 a 52 (A49-52), de los exones 48 a 52 (A48-52), de los exones 47 a 52 (A47-52), de los exones 45 a 52 (A45-52), de los exones 43 a 52 (A43-52), de los exones 42 a 52 (A42-52), de los exones 41 a 52 (A41-52), de los exones 40 a 52 (A40-52), de los exones 39 a 52 (A39-52), de los exones 38 a 52 (A38-52), de los exones 37 a 52 (A37-52), de los exones 36 a 52 (A36-52), de los exones 35 a 52 (A35-52), de los exones 34 a 52 (A34-52), de los exones 33 a 52 (A33-52), de los exones 32 a 52 (A32-52), de los exones 31 a 52 (A31-52), de los exones 30 a 52 (A30-52), de los exones 29 a 52 (A29-52), de los exones 28 a 52 (A28-52), de los exones 27 a 52 (A27-52), de los exones 26 a 52 (A26-52), de los exones 25 a 52 (A25-52), de los exones 24 a 52 (A24-52), de los exones 23 a 52 (A23-52), de los exones 21 a 52 (A21-52) y de los exones 10 a 52 (A10-52), o la duplicación del exón 53.

Así, esta estrategia permite particularmente de considerar el tratamiento de diferentes formas de DMD identificadas, en particular las asociadas con las deleciones del exón 52 (A52), de los exones 50 a 52 (A50-52), de los exones 49 a 52 (A49-52), de los exones 48 a 52 (A48-52), de los exones 47 a 52 (A47-52), de los exones 46 a 52 (A46-52), de los exones 45 a 52 (A45-52), de los exones 43 a 52 (A43-52) y de los exones 10 a 52 (A10-52), o a una duplicación del exón 53.

Uno de los retos de esta tecnología consiste en introducir de forma estable y duradera un oligonucleótido antisentido en las fibras musculares enfermas.

Se ha considerado inyectar directamente dichos AON desnudos. No obstante, en vista de la corta vida útil de estos oligonucleótidos en el músculo, este modo de tratamiento necesita inyecciones regulares, relativamente limitantes. Se han realizado desarrollos para modificar químicamente estos oligonucleótidos (morfolinos, 2'O metilo, derivados de inosina, ...). Esta estrategia permite efectivamente estabilizarlos in vivo, y mejorar así su eficacia y separar su inyección. Sin embargo y a una dosis alta, este tipo de oligonucleótidos puede resultar tóxico.

Alternativamente, se ha intentado la expresión in situ de estas secuencias a través de los vectores de expresión permiten vehicularlas en las células objetivo. Los vectores víricos recombinantes adenoasociados (o AAVr) se consideran particularmente adaptados para la transducción en los músculos. Estos vectores permiten la transferencia in vivo de un casete de expresión portador de la secuencia que codifica el AON y que conduce a la síntesis continua de este AON in vivo. Así, la inyección de estos vectores tiene la ventaja de permitir una restauración de la expresión de la proteína a largo plazo. Como ejemplo, Le Guiner el al. (Molecular Therapy, 2014, 22(11)1923-35) han notificado une eficacia notable del salto de exón acoplado a la utilización de un AAV8 recombinante, y esto mismo 3,5 meses después de una administración locorregional en perros distróficos.

En este ámbito, la utilización de secuencias procedentes de snRNA ("small nucléotide RNA") en estos vectores, en los cuales se insertan las secuencias antisentido, ha permitido limitar la degradación de los AON in vivo, aumentando aún más la eficacia de los tratamientos en el tiempo. Esta estrategia se ha descrito particularmente en la solicitud WO 2006/021724, que notifica la utilización de un snRNA de tipo U7 (U7snRNA) para transportar los AON dirigidos al gen de la distrofina.

Las características de los snRNA los hacen unas herramientas competentes para la expresión estable y nuclear de las secuencias AON. En efecto, los genes correspondientes son de pequeño tamaño, expresados de forma estable y continua en el núcleo y dirigidos a los estadios precoces de la transcripción (pre-ARNm). En la práctica y en relación con el U7snRNA, se trata de insertar las secuencias AON en los sitios de unión con las proteínas Sm de los snRNA, de forma que ya no se dirijan a los ARN premensajeros de las histonas sino al o los exones del gen de interés objetivo, bloqueando así los sitios consenso del ayuste y permitiendo corregir o modificar la maduración de este gen.

Por otro lado, se ha sugerido la adición, a esta secuencias de snRNA, de las secuencias denominadas "exon splicing enhancei1', tales como, por ejemplo, de las secuencias que permiten la unión de factores implicados en el ayuste (en particular, la proteína hnRNpAl, "heterogeneous ribonucleoprotein A1"), con el fin de mejorar aún más los efectos terapéuticos observados (Goyenvalle et al., Mol Ther.; 17 (7): 1234-1240, 2009).

El hecho es que la elección de los AON, y por lo tanto de las secuencias que codifican estos AON en el caso de vectores, es crítica y resulta ser particularmente compleja. En efecto, es difícil predecir qué secuencia será eficaz. Según los exones objetivo, las secuencias eficaces parecen variar y no concernir a los mismos sitios. Este fenómeno hace que la elección de las secuencias AON sea particularmente delicada y laboriosa, incluso utilizando algoritmos complejos (Echigoya et al., Plos One, March 27, 2015, DOI: 10.1371/journal.pone.0120058).

Así, y en relación con el exón 53, se han propuesto numerosos antisentido, variando tanto la región del exón objetivo como el tamaño del oligonucleótido en cuestión. Se han propuesto secuencias antisentido candidatas, por ejemplo, en los siguientes documentos: W02004/083446, W02006/000057, US2010/0168212, WO2011/057350, WO2012/029986, WO2014/100714, US2014/0315977, US 2014/315977, Popelwell et al. (Mol Ther. 2009 Mar; 17(3): 554-61; Neuromuscul Disord. 2010 Feb; 20 (2): 102-10). En estos documentos se ha descrito una eficacia variable de estas secuencias, analizadas en forma de oligonucleótidos desnudos o eventualmente modificados, posiblemente en combinación.

En vista de los retos clínicos, todavía existe la necesidad de desarrollar una herramienta optimizada dirigida al salto del exón 53 del ARN mensajero que codifica la distrofina, es decir, que permita el salto eficaz de dicho exón y un importante nivel de expresión de la proteína correspondiente, truncada pero potencialmente funcional.

Objeto de la invención

La presente invención tiene por objeto tratar o mejorar las formas de la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), en las cuales el salto del exón 53 del ARN mensajero que codifica la distrofina permite obtener una proteína truncada, pero al menos parcialmente funcional.

La solución propuesta se basa en oligonucleótidos antisentido (AON) elegidos juiciosamente, tanto por la región del exón a la que se dirigen como por su tamaño. Las secuencias correspondientes se introducen en un sistema de expresión competente, constituido por un vector vírico recombinante adenoasociado (AAVr) que comprende ventajosamente un snRNA, preferentemente de tipo U7 ventajosamente modificado en el sitio de fijación a las proteínas Sm.

Dichos oligonucleótidos antisentido vectorizados han permitido obtener una eficacia, tanto en la expresión de los transcritos desprovistos del exón 53 como en la producción de la distrofina truncada, nunca jamás conseguida según el conocimiento de la Solicitante, y por lo tanto constituyen una herramienta clínica muy prometedora.

Definiciones

Las siguientes definiciones corresponden al sentido utilizado generalmente en el contexto de la invención y deben tenerse en cuenta, a menos que se indique explícitamente otra definición.

En el sentido de la invención, los artículos "un/o" y "una" se utilizan para referirse a una o varias (por ejemplo, a al menos una) unidades del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" indica al menos un elemento, es decir, un elemento o más.

Debe entenderse que los términos "aproximadamente" o "de forma aproximada", utilizados en referencia a un valor medible tal como una cantidad, una duración y otros valores análogos, engloban unas incertidumbres de medición del ±20 % o del ±10 %, preferentemente del ±5 %, aún más preferentemente del ±1 %, y de una forma particularmente preferida del ±0,1 % del valor especificado.

Intervalos: a lo largo de la presente descripción, las diferentes características de la invención pueden presentarse en forma de un intervalo de valores. Debe comprenderse que la descripción de valores en forma de un intervalo tiene únicamente como finalidad hacer más simple la lectura, y no debe interpretarse como una limitación rígida del alcance de la invención. En consecuencia, debería considerarse que la descripción de un intervalo de valores divulga específicamente todos los intervalos intermedios posibles, así como cada uno de los valores en el seno de este intervalo. Por ejemplo, debería considerarse que la descripción de un intervalo que varía entre 1 y 6 describe específicamente cada uno de los intervalos que comprende, tales como los intervalos que varían entre 1 y 3, entre 1 y 4, entre 1 y 5, entre 2 y 4, entre 2 y 6, entre 3 y 6, etc., así como cada uno de los valores de este intervalo, por ejemplo,, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esta definición es válida independientemente del alcance del intervalo.

Debe comprenderse que el término "aislado", en el contexto de la invención, es sinónimo de retirado o extraído de su ambiente o su estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido aislado es un ácido nucleico o un péptido extraído del ambiente natural en el cual se encuentra habitualmente, ya sea una planta o un animal vivo, por ejemplo. Así, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no es un ácido nucleico o un péptido aislado en el sentido de la invención, mientras que el mismo ácido nucleico o péptido, parcial o completamente separado de los demás elementos presentes en su contexto natural, está "aislado" en el sentido de la invención. Un ácido nucleico o un péptido aislado puede existir en una forma sustancialmente purificada, o puede existir en un entorno no natural tal como, por ejemplo, una célula hospedadora.

En el contexto de la invención, se utilizan las siguientes abreviaturas para las bases de ácido nucleico más corrientes. "A" " se refiere a la adenosina, "C" se refiere a la citosina, "G" indica la guanosina, "T" indica la timidina y "U" se refiere a la uridina.

Salvo indicación contraria, en el sentido de la invención, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" indica todas las secuencias nucleotídicas que codifican la secuencia de aminoácidos, comprendiendo las secuencias de nucleótidos degeneradas que permiten obtener dicha secuencia de aminoácidos. La secuencia nucleotídica que codifica una proteína o un ARN o un ADNc puede comprender eventualmente intrones.

Los términos "que codifican" o "que codifica", "codifican" o "codifica" se refieren a la propiedad inherente a las secuencias específicas de nucleótidos de un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, que van a servir como matriz para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos, que tienen una secuencia definida de nucleótidos (por ejemplo, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos, y las propiedades biológicas derivadas. Así, un gen codifica una proteína si la transcripción y la traducción del ARNm correspondiente a este gen producen la proteína en una célula o en otro sistema biológico. Tanto la hebra codificante, cuya secuencia nucleotídica es idéntica a la secuencia de ARNm y que generalmente está descrita en las listas de secuencias y bases de datos, como la hebra no codificante, utilizada como matriz para la transcripción de un gen o del ADNc, pueden designarse como codificantes de la proteína o de otro producto de este gen o ADNc.

El término "polinucleótido" tal como se utiliza en el contexto de la invención se define como una cadena de nucleótidos. Además, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Así, los términos ácidos nucleicos y polinucleótidos, tal como se utilizan en el ámbito de la invención, son intercambiables. En el ámbito de la biología molecular y la ingeniería genética, es bien conocido que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, que pueden ser hidrolizados en monómeros. Los nucleótidos en forma de monómero pueden ser hidrolizados en nucleósidos. Tal como se utiliza en el contexto de la invención, el término polinucleótido indica, de un modo no limitante, cualquier tipo de molécula de ácidos nucleicos, es decir, las moléculas de ácidos nucleicos pueden obtenerse mediante cualquier medio disponible en la técnica, comprendiendo medios recombinantes, a saber, la clonación de secuencias de ácidos nucleicos a partir de una biblioteca recombinante o del genoma de una célula, utilizando las tecnologías de clonación habituales tales como la PCR, o por síntesis.

En el ámbito de la invención, el término "oligonudeótido" indica un polinucleótido que, preferentemente, tiene un tamaño que no excede 100 nucleótidos (o bases), incluso 95, 80, 75, 70, 65, 60, 55 o incluso 50 nucleótidos (o bases).

En el sentido de la invención, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se utilizan de forma intercambiable y hacen referencia a un compuesto constituido por residuos de aminoácidos unidos en forma covalentes por enlaces peptídicos. Una proteína contiene por definición al menos dos aminoácidos, sin limitación en cuanto al número máximo de aminoácidos. Los polipéptidos comprenden indistintamente varios péptidos y/o proteínas, las cuales comprenden a su vez dos aminoácidos o más unidos entre sí por enlaces peptídicos. Tal como se utiliza aquí, el término se refiere a la vez a cadenas cortas, que igualmente se designan habitualmente en la técnica como péptidos, a oligopéptidos y a oligómeros, por ejemplo, y a cadenas más largas, que generalmente se designan en la técnica como proteínas, de las cuales existen numerosos tipos. Los "polipéptidos" comprenden, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos comprenden péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o une combinación de estos.

Los términos "idéntico" u "homólogo" se refieren a la similitud de secuencia o a la identidad de secuencia entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. Cuando una posición en cada una de las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad de monómero de aminoácido (por ejemplo, cuando una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por una adenina), entonces las moléculas son homólogas o idénticas para esta posición. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es función del correspondiente número de posiciones compartidas por las secuencias, y corresponde a este número dividido por el número de posiciones comparadas y multiplicado por 100. Por ejemplo, si 6 de 10 posiciones en dos secuencias apareadas son idénticas, entonces las dos secuencias son idénticas al 60 %. Como norma general, la comparación se realiza alineando las secuencias de forma que se proporcione una homología/identidad máxima.

Un "vector" en el sentido de la invención es una construcción molecular que comprende un ácido nucleico aislado y que puede ser utilizado para suministrar el ácido nucleico aislado en el interior de una célula. En la técnica se conoce en numerosos vectores que comprenden, aunque no de forma limitativa, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados a compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Así, el término "vector" indica, por ejemplo, un plásmido de replicación autónoma o un virus. Igualmente, debe interpretarse que el término comprende compuestos no plasmídicos o no víricos que facilitan la transferencia de ácidos nucleicos a las células, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas, y análogos. A modo de ejemplo de vectores víricos, se citarán particularmente los vectores adenovíricos, los vectores víricos adenoasociados y los vectores retrovíricos.

Los términos "vector de expresión" designan un vector que comprende un polinucleótido recombinante, el cual comprende las secuencias de control de la expresión unidas operativamente a una secuencia nucleotídica que se va a expresar. Un vector de expresión comprende particularmente elementos de expresión activos en cis; otros elementos para la expresión pueden ser proporcionados por la célula hospedadora o por un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión en el sentido de la invención incluyen todos aquellos conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

El término "promotor" tal como se utiliza aquí se define como una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula o la maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de una secuencia de polinucleótidos.

En el sentido de la invención, los términos "secuencia promotora/reguladora" designan una secuencia de ácido nucleico necesaria para la expresión del polinucleótido unida operativamente a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia de base del promotor, mientras que en otros casos, esta secuencia puede comprender igualmente una secuencia activadora y otros elementos reguladores, útiles para la expresión del polinucleótido. La secuencia promotora/reguladora puede ser, por ejemplo, una secuencia que permite la expresión del polinucleótido que sea específica de un tejido, es decir, que se produce preferentemente en este tejido.

En el sentido de la invención, un promotor "constitutivo" es una secuencia nucleotídica que, cuando está unida operativamente a un polinucleótido, conduce a una expresión del polinucleótido en la mayor parte o en todas las condiciones fisiológicas de la célula.

En el sentido de la invención, un promotor "inducible" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está unida operativamente a un polinucleótido, conduce a una expresión del polinucleótido únicamente cuando hay presente un inductor del promotor en la célula.

Un promotor "específico de un tejido" es una secuencia nucleotídica que, cuando está unida operativamente a un polinucleótido, conduce a una expresión del polinucleótido en una célula preferentemente si la célula es una célula del tipo de tejido correspondiente al promotor.

En el sentido de la invención, cuando se utiliza el término "anormal" en referencia a organismos, tejidos, células o componentes de estos, se refiere a aquellos organismos, tejidos, células o componentes de estos que difieren en al menos una característica observable o detectable (por ejemplo, edad, tratamiento, momento del día, etc.) de la característica esperada en los organismos, tejidos, células o componentes correspondientes denominados "normales".

Los términos "paciente", "sujeto", "individuo" y sinónimos se utilizan en el contexto de la invención de forma intercambiable y se refieren a un animal, preferentemente a un mamífero. En ciertos modos de realización no limitantes, el animal es un ser humano. Puede tratarse igualmente de un ratón, una rata, un cerdo, un perro o un primate no humano (NHP), tal como el macaco.

En el sentido de la invención, una "enfermedad" o "patología" es un estado de la salud de un animal en el cual se ha alterado la homeostasis de este, y que, si no se trata la enfermedad, continúa deteriorándose. Por el contrario, en el sentido de la invención, un "trastorno" es un estado de la salud en el cual el animal es capaz de mantener su homeostasis, pero en el que el estado de salud del animal es menos favorable de lo que sería en ausencia del trastorno. Sin tratamiento, un trastorno no implica necesariamente un deterioro del estado de salud del animal en el tiempo.

En el contexto de la invención, una enfermedad o un trastorno es "aliviado" o "mejorado" si la gravedad de un síntoma de la enfermedad o del trastorno, o la frecuencia con la cual el síntoma es experimentado por el sujeto, o las dos, es reducida. Esto incluye igualmente la desaparición de la progresión de la enfermedad, es decir, el cese del deterioro del estado de salud. Una enfermedad o un trastorno está "curado" si la gravedad de un síntoma de la enfermedad o del trastorno, o la frecuencia con la cual el síntoma es experimentado por el sujeto, o las dos, son eliminadas.

En el contexto de la invención, un tratamiento "terapéutico" es un tratamiento administrado a un sujeto que presenta los síntomas de una patología, con el objetivo de disminuir o eliminar estos síntomas.

En el contexto de la invención, el " tratamiento de una enfermedad o de un trastorno " indica la reducción de la frecuencia o de la intensidad de al menos un síntoma de una enfermedad o de un trastorno en un sujeto.

En el sentido de la invención, una "cantidad eficaz" de un compuesto es la cantidad de compuesto que es suficiente para tener un efecto beneficioso para el sujeto al cual se administra el compuesto. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad que es suficiente o eficaz para prevenir o tratar (en otras palabras, retrasar o prevenir la aparición, prevenir la evolución, inhibir, reducir o invertir) una enfermedad o un trastorno, que comprende mitigar los síntomas de esta enfermedad o este trastorno.

Descripción detallada de la invención

Según un primer aspecto, la presente solicitud concierne a un vector vírico recombinante adenoasociado (AAVr) que comprende una secuencia que codifica un oligonucleótido antisentido (AON) dirigido contra un segmento de al menos 33 bases de la región 30 a 69 del exón 53 del ARN premensajero (pre-ARNm) de la distrofina.

En el ámbito de la presente solicitud y como se detalla a continuación, los términos "dirigido contra", "objetivo", "hibrida con" y "complementario de" se utilizan de forma equivalente.

El vector AAVr según la invención comprende normalmente 2 componentes:

- La secuencia de ácido nucleico recombinante encapsidada, denominada también "genoma del AAVr". Esta secuencia de ácido nucleico recombinante comprende la secuencia que codifica el AON, AON que produce el efecto terapéutico, en la circunstancia del salto del exón 53 del pre-ARNm de la distrofina, l cuando es expresada en la célula/el tejido objetivo;

- La cápside vírica permite la transferencia del gen y un cierto tropismo tisular.

Según la invención, el genoma del vector AAVr comprende por tanto una secuencia que codifica un oligonucleótido antisentido o AON. Esta secuencia se presenta ventajosamente en forma de ADN, y permite la expresión de un AON capaz de hibridar con el pre-ARNm objetivo, en este caso en el exón 53 del pre-ARNm de la distrofina.

De forma característica según la invención, el oligonucleótido antisentido permite el salto del exón 53 sobre el ARN mensajero de la distrofina. Debe comprenderse que el salto del exón 53 con la ayuda del AON según la invención se efectúa en la fase del ayuste del ARN premensajero de la distrofina. De una forma conocida en este ámbito técnico, el AON elegido se dirige e hibrida con las regiones implicadas en el ayuste. En presencia de dicho AON, los sitios de ayuste "enmascarados" por el AON no son reconocidos por la maquinaria celular, de forma que el exón objetivo no es integrado en el ARN mensajero resultante, y por lo tanto, se "salta".

En el ámbito de la invención, se entiende por "ARN premensajero de la distrofina" o "pre-ARNm de la distrofina" el producto de la transcripción del gen que codifica la proteína distrofina, tal como el obtenido antes de la etapa de ayuste.

La presente solicitud está dirigida a cualquier gen que codifique de una distrofina, o a cualquier organismo que comprenda dicho gen, para el cual el salto del exón 53 pueda tener un interés, a saber, la producción de una proteína más corta pero al menos parcialmente funcional. Según un modo de realización privilegiado, el gen objetivo es el gen humano de la distrofina. El gen humano de la distrofina está bien documentado: tiene un tamaño de 2.7 Mb y está compuesto por 79 exones. Su secuencia completa está disponible en las bases de datos, por ejemplo, en la base de datos NCBI con la referencia Gene ID: 1756 o la base de datos Ensembl con la referencia ENSG00000198947.

Ventajosamente y en el ámbito de la invención, se entiende por "ARN premensajero de la distrofina" el pre-ARNm de la distrofina de origen humano, en otras palabras, el pre-ARNm de la distrofina humana.

Las secuencias del pre-ARNm de la distrofina humana son bien conocidas y están particularmente accesibles gracias a las referencias indicadas a continuación en relación con el gen completo.

Más concretamente, la presente invención se dirige al exón 53 del pre-ARNm de la distrofina humana. De forma conocida, éste está constituido por 212 bases o nucleótidos y presenta la siguiente secuencia SEQ ID NO: 1:

ttgaaagaat tcagaatcag tgggatgaag tacaagaaca ccttcagaac cggaggcaac

agttgaatga aatgttaaag gattcaacac aatggctgga agctaaggaa gaagctgagc

aggtcttagg acaggccaga gccaagcttg agtcatggaa ggagggtccc tatacagtag

atgcaatcca aaagaaaatc acagaaacca ag

En el ámbito de la presente solicitud, las regiones descritas a continuación están identificadas por la posición de los nucleótidos con respecto a la secuencia del exón 53 del pre-ARNm de la distrofina, es decir, a la secuencia SEQ ID NO: 1.

En lo sucesivo en la descripción, la numeración utilizada se basa por tanto en la secuencia SEQ ID NO: 1, entendiéndose que el AON tiene necesariamente y por definición una secuencia complementaria a la de su objetivo. En la práctica, la secuencia que codifica el AON, la cual está comprendida en el vector de la invención, puede ser, por ejemplo, una secuencia correspondiente al complementario inverso de la región objetivo en el exón 53 del pre-ARNm de la distrofina. No obstante, y como se detalla a continuación, los AON que solo hibridan con un fragmento de la región objetivo, o que hibridan con esta región a pesar de la presencia de emparejamientos incorrectos, también son susceptibles de ser eficaces. Por lo tanto, debe comprenderse que la secuencia que codifica el AON según la invención comprende o consiste en una secuencia que presenta al menos un cierto porcentaje de identidad con la secuencia complementaria de la región objetivo tal como se define en el sentido de la invención, o con la secuencia complementaria de al menos un segmento de esta región objetivo.

Según una primera característica, el AON según la invención se dirige a la totalidad de la región 30 a 69 del exón 53 del pre-ARNm de la distrofina, a saber, la región de 40 bases de secuencia:

Según la presente divulgación, el AON se dirige contra un segmento de al menos 33 bases (o nucleótidos) de dicha región. En otras palabras, el antisentido hibrida con al menos 33 nucleótidos consecutivos de esta región, constituida por 40 nucleótidos.

En el ámbito de la presente solicitud, se entiende que un oligonucleótido hibrida con una secuencia objetivo cuando dicho oligonucleótido y la secuencia objetivo forman, en unas condiciones de rigurosidad determinadas, moderadas o ventajosamente altas, una molécula de pre-ARNm de hebra doble.

Las condiciones de rigurosidad dependen clásicamente de condiciones experimentales tales como la temperatura, la fuerza iónica y la concentración de agentes desnaturalizantes (tales como formamida) en el medio de reacción. Estas condiciones y sus posibles variaciones son bien conocidas por el experto en la técnica. Como ejemplo de condiciones de alta rigurosidad, se puede mencionar particularmente la hibridación y el lavado realizados con composiciones que comprenden cloruro de sodio (0,015 M) y citrato de sodio (0,0015 M), a 65-68 °C (Véase Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a Ed, Cold Spring Harbor Laboratory, NY 1989). Las condiciones de rigurosidad moderada pueden corresponderse con una hibridación y un lavado realizados en estas mismas composiciones, pero a una temperatura inferior, comprendida normalmente entre 50 y 65 °C.

En otras palabras, el oligonucleótido debe presentar una identidad con la secuencia objetivo suficiente para permitir un apareamiento de las dos hebras. Esto se asegura cuando las dos secuencias son idénticas, pero igualmente puede tener lugar en presencia de uno o varios (en particular 2, 3, 4 o 5) nucleótidos divergentes, ventajosamente cuando éstos están situados en el interior de la secuencia. En términos de identidad, el oligonucleótido presenta ventajosamente al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 % incluso 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, aún más ventajosamente un 100 % de identidad con la región objetivo. Así, preferentemente, la secuencia que codifica el AON según la presente solicitud o dicho AON comprende o consiste en una secuencia que presenta al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 % incluso 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad con la secuencia complementaria de la región que comprende los nucleótidos 30 a 69 de la secuencia SEQ ID NO: 1. Según la invención, la secuencia que codifica el AON consiste en una secuencia que presenta un 100 % de identidad con la secuencia complementaria de la región que comprende los nucleótidos 30 a 69 de la secuencia SEQ ID NO: 1.

Según la presente solicitud, el AON está dirigido contra un segmento de más de 33 bases, a saber, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o incluso 40 bases de la región que comprende los nucleótidos 30 a 69 de la secuencia SEQ ID NO: 1. Según la invención, el oligonucleótido hibrida con la totalidad de la región 30 a 69 de la secuencia SEQ ID NO: 1. El término "hibrida" se entiende como se define a continuación, es decir, cubre el caso de una identidad perfecta entre el oligonucleótido y la región objetivo, pero igualmente el caso en el que existen uno o varios emparejamientos incorrectos (denominados "mismatchs" en inglés). Así, preferentemente, la secuencia que codifica el AON según la invención consiste en una secuencia complementaria de la región que comprende los nucleótidos 30 a 69 de la secuencia SEQ ID NO: 1, o en una secuencia complementaria de un segmento de 40 bases de la región que comprende los nucleótidos 30 a 69 de la secuencia s Eq ID NO: 1. Así, preferentemente, la secuencia que codifica el AON según la invención o dicho AON consiste en una secuencia que presenta un 100 % de identidad con la secuencia complementaria de la región objetivo, o con la secuencia complementaria de un segmento de 40 bases de la región que comprende los nucleótidos 30 a 69 de la secuencia SEQ ID NO: 1.

Según la presente solicitud, el AON puede dirigirse contra una región que se extiende a un lado y a otro de la región objetivo. Así, el AON codificado por dicha secuencia puede hibridar con una región que se extiende en 5' y/o en 3' más allá de la región 30 a 69 del exón 53, con la condición ventajosa de que dicho AON tenga una eficacia, en términos del salto del exón 53, al menos igual a la observada con un AON dirigido contra un segmento de más de 33 bases de la región que comprende los nucleótidos 30 a 69 de la secuencia SEQ ID NO: 1, incluso a la de un AON dirigido contra la región que comprende los nucleótidos 30 a 69 de la secuencia SEQ ID NO: 1.

Según la presente divulgación, el tamaño de la secuencia que codifica el oligonucleótido antisentido de interés es al menos igual al tamaño del segmento objetivo del exón 53, a saber, al menos 33 nucleótidos.

En el caso en el que el segmento objetivo tenga un tamaño superior, que puede variar particularmente de 34 a 40 nucleótidos, la secuencia que codifica el AON según la presente solicitud tiene un tamaño al menos igual, a saber, de al menos 34, 35, 36, 37, 38, 39 incluso hasta 40 bases. Según un modo de realización particular, la secuencia que codifica el AON según la presente solicitud está constituida por 34 bases, preferentemente 35, incluso 36, 37, 38 o 39 bases. Según la invención, la secuencia que codifica el AON según la invención está constituida por 40 nucleótidos.

Según otro modo de realización particular, la secuencia que codifica el AON implementada en el ámbito de la presente solicitud tiene un tamaño inferior a 70 bases, incluso inferior o igual a 65, 60, 55, 50 incluso hasta 45, 44, 43, 42 o 41 bases.

Según la invención, la secuencia que codifica el oligonucleótido antisentido, comprendida en el AAVr de la invención, está constituida por la secuencia SEQ ID NO: 3.

Según un modo de realización particular de la presente divulgación, la secuencia que codifica el oligonucleótido antisentido comprendido en el AAVr comprende o está constituida por la secuencia SEQ ID NO: 4.

Más concretamente:

- La secuencia SEQ ID NO: 3 (la cual está indicada en los ejemplos como "JR53" o "5902") corresponde a una secuencia de 40 nucleótidos que codifica un AON que se dirige a la región 30/+69 del exón 53 del pre-ARNm de la distrofina;

- La secuencia SEQ ID NO: 4 (la cual está indicada en los ejemplos como "N3" o "5901") corresponde a una secuencia de 33 nucleótidos que codifica un AON que se dirige a la región 33/+65 del exón 53 del pre-ARNm de la distrofina.

Según la invención, dicho oligonucleótido está dirigido contra la totalidad de la región 30 a 69 del exón 53 del ARN premensajero del gen de la distrofina. En consecuencia, según un modo de realización particular, la secuencia que codifica el AON comprendido en el AAVr de la invención presenta un tamaño de 40 bases y presenta la secuencia SEQ ID NO: 3.

De forma característica según la invención, la secuencia que codifica el oligonucleótido antisentido o AON es portada o vehiculada por un vector AAVr. En otras palabras, la secuencia que codifica el oligonucleótido antisentido o AON está contenida o comprendida en el genoma del AAVr.

Los vectores víricos adenoasociados recombinantes (AAVr) están actualmente reconocidos como herramientas competentes para la transferencia de genes, considerados en el tratamiento de numerosas enfermedades. Los vectores AAVr presentan un cierto número de características que les hacen ser apropiados para la terapia génica, en particular la ausencia de patogenia, un poder inmunógeno moderado y la capacidad de transducir células y tejidos postmitóticos de una forma estable y eficaz. La expresión de un gen particular vehiculado por un vector AAVr puede, además, estar dirigida a uno o varios tipos celulares si se elige de forma apropiada el serotipo del AAV, el promotor y el modo de administración.

Los AAVr proceden de la modificación mediante ingeniería genética de virus AAV. Actualmente se conocen más de 100 serotipos naturales de AAV. Existen numerosas variantes naturales en cuanto a la cápside del AAV, lo que ha permitido la producción y la utilización de AAVr específicos con unas propiedades particularmente apropiadas para las distrofias musculares. Los vectores AAVr pueden generarse utilizando las técnicas clásicas de biología de molécula, haciendo posible la optimización de los virus AAV para la administración celular específica de moléculas de ácidos nucleicos, para minimizar la inmunogenicidad, para ajustar la estabilidad y la vida útil de las partículas, para una degradación eficaz y para el transporte hasta el núcleo. Como se mencionó anteriormente, la utilización de AAVr es un modo habitual para administrar ADN exógenos debido a su ausencia de toxicidad, a la eficaz transferencia de ADN y a la posibilidad de optimizarlos con fines particulares.

Entre los serotipos de AAV aislados a partir de seres humanos o de primates no humanos y bien caracterizados, el serotipo 2 humano es el primer AAV que se ha utilizado para la producción de vector AAVr para la transferencia de genes. Otros serotipos de AAV utilizados habitualmente en la producción de vectores AAVr incluyen AAVI, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 y AAV12.

El genoma vírico de los AAV está constituido por aproximadamente 5.000 nucleótidos y comprende un gen que codifica las proteínas de regulación y de replicación (rep) y un gen que codifica las proteínas estructurales (cap). Las secuencias necesarias en cis a la replicación del genoma y a su empaquetamiento están contenidas en un segmento de 130 a 145 nucleótidos que se encuentra en cada extremo del genoma (ITR significa "inverted terminal repeat").

A partir de estos virus, puede producirse y utilizarse igualmente un gran número de vectores recombinantes y de AAVr quiméricos (híbridos).

Los fragmentos de los AAV útiles para el ensamblaje en vectores incluyen las proteínas cap, en particular vp1, vp2, vp3 y las regiones hipervariables, las proteínas rep, incluyendo rep 78, rep 68, rep 52 y rep 40, y las secuencias que codifican estas proteínas. Estos fragmentos pueden ser utilizados en una gran diversidad de sistemas vectoriales y células hospedadoras.

En el ámbito de la producción de AAVr, estos fragmentos pueden utilizarse solos, en combinación con las secuencias y fragmentos de otros serotipos de AAV, en combinación con elementos de otros AAV o con secuencias víricas no derivadas de AAV. En el ámbito de la invención, algunos AAVr apropiados incluyen, sin limitación, los AAVr modificados que comprenden una proteína de cápside no natural. Dicha cápside artificial puede ser generada mediante cualquier técnica adecuada, utilizando una secuencia de AAV seleccionada (por ejemplo, un fragmento de la proteína de la cápside vpl) en combinación con secuencias heterólogas que pueden obtenerse a partir de un serotipo seleccionado de un AAV diferente, de porciones no contiguas del mismo serotipo de AAV, de una fuente vírica distinta a un AAV o de una fuente no vírica. Un serotipo artificial de AAV puede ser, sin limitación, una cápside de AAV quimérica, una cápside de AAV recombinante o una cápside de AAV "humanizada". Dichos ejemplos de AAV o de AAV artificiales incluyen AAV2/8 (documento US 7,282,199), AAV2/5 (disponible en el National Institutes of Health), AAV2/9 (documento WO 2005/033321), AAV2/6 (documento US 6,156,303) y AAVrh8 (documento WO 2003/042397), entre otros. Según un modo de realización, los vectores útiles en las composiciones y los métodos de la invención contienen como mínimo las secuencias que codifican una cápside de un serotipo de a Av seleccionado, por ejemplo, una cápside de AAV8 o un fragmento de ésta. Según otro modo de realización, los vectores útiles contienen como mínimo las secuencias que codifican una proteína rep de un serotipo de AAV seleccionado, por ejemplo, una proteína rep AAV8 o un fragmento de ésta. Opcionalmente, dichos vectores contienen a la vez las proteínas cap y rep de AAV. En los vectores en los que están la vez rep y cap, las secuencias de las proteínas rep y cap de los AAV pueden proceder del mismo AAV, por ejemplo, derivar todas de un AAV8. De forma alternativa, pueden utilizarse vectores en los cuales las secuencias rep derivan de un serotipo de AAV diferente del que derivan las secuencias cap. En un modo de realización, las secuencias rep y cap se expresan a partir de fuentes individuales (por ejemplo, de los vectores individuales o de una célula hospedadora y un vector). En otro modo de realización, estas secuencias rep están fusionadas en fase con las secuencias cap de un AAV de un serotipo diferente para formar un vector AAVr quimérico tal como AAV2/8 (documento US 7,282,199).

A partir de los AAV pueden prepararse genomas recombinantes AAV, en los cuales se han eliminado los genes que codifican las proteínas víricas (rep y cap), quedando solamente las dos secuencias repetidas ITR. La producción de vectores recombinantes necesita la multiplicación y el empaquetamiento de estos genomas recombinantes. Esta etapa se realiza, lo más a menudo, en células en cultivo que han sido transfectadas a la vez con el genoma recombinante de interés y con los plásmidos que codifican las proteínas rep y cap ausentes (las proteínas cap que permiten la formación de la cápside). Es posible utilizar un genoma recombinante y genes rep y cap procedentes de serotipos idénticos o diferentes. Son posibles un gran número de combinaciones.

En el caso en el que los serotipos sean idénticos, se indicará el único serotipo correspondiente al vector. En el caso en el que los serotipos sean diferentes, se obtienen los vectores AAVr denominados híbridos, para los cuales se indican los serotipos utilizados. Como ejemplo, se comprende que un vector AAVr de serotipo 2 deriva únicamente del serotipo 2. Por el contrario, un vector AAVr de serotipo 2/8 es un vector para el cual se ha utilizado un genoma recombinante derivado de un AAV del serotipo 2, mientras que los genes que codifican las proteínas de la cápside utilizados corresponden a los de un AAV de serotipo 8.

Se ha demostrado que la cápside de los virus AAV, y en consecuencia de los vectores AAVr, está asociada generalmente a un tropismo celular o tisular en particular.

Según la invención, el AAV implementado se basa ventajosamente en un AAV de serotipo 2 (AAV2), 8 (AAV8) o 9 (AAV9). De forma apropiada, la cápside se elige para permitir una transducción eficaz incluso preferentemente del músculo, ya sea esquelético, cardíaco o liso. Así, y preferentemente, el AAV implementado es ventajosamente un AAV elegido del siguiente grupo: AAV2/1, AAV2, AAV2/6, AAV2/8, AAV2/9, AAV2/10. De manera privilegiada, el vector es un vector AAV8, aún más ventajosamente un vector AAV2/8.

Con respecto a los vectores AAVr implementados en el ámbito de la invención, el genoma del AAV puede ser también un ácido nucleico monocatenario (ss de "single stranded"), bicatenario (ds de "double stranded') o un ácido nucleico autocomplementario (sc de "self complementary").

es bien conocida por el experto en la técnica, y puede realizarse por bitransfección o tritransfección de células HEK 293, mediante el sistema vírico del herpes simple o con la ayuda del sistema baculovirus. De manera ventajosa, las partículas se obtienen por bi- o tritransfección de células HEK 293, o con la ayuda del sistema baculovirus.

Según un modo de realización particular, el vector según la invención contiene o comprende además una secuencia que codifica un snRNA modificado. Más concretamente, la secuencia que codifica el oligonucleótido antisentido (AON) según la invención es introducida o insertada en la secuencia que codifica el snRNA. En otras palabras y preferentemente, el vector de la invención comprende una secuencia que codifica un oligonucleótido antisentido, la cual está comprendida en una secuencia que codifica un snRNA modificado. Este modo de realización permite la expresión de un oligonucleótido que comprende el snRNA modificado en el cual está integrado el AON. Como ya se mencionó, la integración del AON en el seno de un snRNA modificado tiene el efecto de estabilizar la expresión del oligonucleótido resultante, y además, de permitir una expresión nuclear de estos oligonucleótidos.

Los snRNA ("small nuclear RNA") son unos ARN de pequeño tamaño, presentes en el núcleo de las células e implicados en ciertas etapas de maduración de los pre-ARN mensajeros. Se denominan U1, U2, U3 ... hasta U13. Es bien conocido que el snRNA nativo comprende una región antisentido específica del pre-ARN mensajero, del que asegura la maduración. Esta secuencia permite la hibridación con el pre-ARN mensajero objetivo. Asimismo, la región que codifica el snRNA nativo (es decir, la secuencia que es efectivamente transcrita) comprende particularmente un dominio denominado sm, que codifica un sitio de fijación de la proteína Sm ("small nuclear ribonucleoproteína"). Este dominio es indispensable para la actividad de maduración del ARN premensajero del snRNA (Grimm el al. EMBO J., 1993, 12 (3): 1229-1238). La región que codifica el snRNA nativo comprende además una secuencia que codifica una forma en tallo-bucle, la cual se ha demostrado que estabiliza la interacción entre el snRNA y el pre-mRNA que va a madurar, facilitando así el ayuste (Sharma et al., Genes Dev., 2014, 28 (22): 2518-2531).

En el ámbito de la invención, se entiende por "secuencia que codifica un snRNA modificado", un oligonucleótido que tiene como secuencia la secuencia nativa del gen funcional del snRNA, en el cual las secuencias implicadas en la función inicial del snRNA están inactivadas y/o modificadas, ventajosamente por inserción de la secuencia que codifica el AON según la invención. Por "secuencia nativa del gen funcional" se entiende, en el sentido de la invención, la parte del gen endógeno que comprende la región que codifica el snRNA (es decir, la secuencia transcrita), así como las regiones reguladoras 5' y 3', y particularmente el promotor nativo del snRNA.

Preferentemente, la secuencia que codifica el snRNA modificado codifica un snRNA de tipo U7. Según este modo de realización, la secuencia de los sitios de fijación de las proteínas Sm está modificada de forma que inactive la maduración de los ARN premensajeros que codifican las histonas, ventajosamente por inserción de la secuencia que codifica el AON según la invención.

Como se ha descrito en relación con el snRNA de tipo U7, la secuencia de los sitios de fijación de las proteínas Sm puede además estar modificada de forma que aumente la concentración nuclear de snRNA, por ejemplo, remplazada por una secuencia optimizada, ventajosamente la secuencia smOPT descrita por Schümperli et Pillai (Cell. Mol. Life Sci. 60: 2560-2570, 2004).

Por el contrario, y con el fin de facilitar el ayuste deseado, la secuencia que codifica la forma en tallo-bucle es preferentemente nativa. En otras palabras, ventajosamente no está modificada.

Como ya se mencionó, el snRNA modificado implementado en el ámbito de la invención está, preferentemente, desprovisto de la secuencia antisentido específica nativa que se dirige al pre-ARN mensajero objetivo de este snRNA, en este caso el de las histonas para el u7snRNA. Ventajosamente, esta secuencia es sustituida por una secuencia que codifica el oligonucleótido antisentido de interés, en caso de que se dirija a la totalidad de la región comprendida entre las bases 30 y 69 del exón 53 del pre-ARNm de la distrofina.

En el sentido de la invención, la secuencia que codifica el snRNA modificado puede además estar modificada de forma que se sustituya la secuencia inactiva del promotor del snRNA por la secuencia de otro promotor, por ejemplo, la secuencia del promotor de otro tipo de snRNA. A modo de ejemplo y según la invención, una "secuencia que codifica un snRNA modificado de tipo U7" indica una secuencia que codifica un snRNA de tipo U7 que ha experimentado las modificaciones indicadas a continuación, pero que comprende el promotor nativo del snRNA U7. Es posible reemplazar este promotor por el de otro snRNA, por ejemplo, de tipo U1, u 2 o U3, o por cualquier otro promotor apropiado para la implementación de la invención. Los diferentes promotores de los snRNA son bien conocidos y particularmente han sido descritos por Hemadez (J Biol Chem:, 2001, 276 (29): 26733-6).

En el ámbito de la invención y entre los diferentes tipos de snRNA, preferentemente se utiliza el de tipo U7 (U7snRNA), implicado normalmente en la maduración de los a Rn premensajeros que codifican las histonas.

En este ámbito, se ha demostrado además que un dominio particular, denominado "kiss dominio" permite, cuando está fusionado con el oligonucleótido antisentido portado por el snRNA, hibridar con la forma en tallo-bucle del snRNA. Esta hibridación induce una modificación de la estructura secundaria del snRNA modificado que mejora su interacción con la maquinaria molecular necesaria para el ayuste. Este dominio se ha descrito particularmente en la solicitud WO 2011/113889, cuyo contenido debe considerarse que forma parte de la presente solicitud. Así, es posible integrar, en la secuencia que codifica el snRNA modificado según la invención, una secuencia que codifica el "kiss dominio" como se describe en este documento.

En la práctica, estas diferentes modificaciones pueden ser introducidas en las secuencias que codifican el snRNA por medio de las técnicas habituales de ingeniería genética, tal como la mutagénesis dirigida por PCR.

Señalar que las secuencias de los snRNA están muy conservadas entre las diferentes especies. Así, la secuencia que codifica el snRNA modificado utilizado en el vector de la invención puede ser tanto de origen humano como murino. Preferentemente, la secuencia que codifica el snRNA modificado utilizado en la invención es de origen murino.

Una construcción típica según la invención, que codifica un snRNA en el cual se ha insertado la secuencia que codifica el AON de interés, comprenderá ventajosamente:

- La región 5' no traducida del gen que codifica el U7 snRNA, que comprende particularmente el promotor, ventajosamente de origen murino, tal como, por ejemplo, la ilustrada por los nucleótidos 1 a 258 de la secuencia SEQ ID NO: 2;

- La secuencia que codifica el AON dirigido contra la totalidad de la región 30 a 69 del exón 53 del pre-ARNm de la distrofina. A modo de ejemplo, los nucleótidos 259 a 298 de la secuencia SEQ ID NO: 2 ilustran dicha secuencia, la cual codifica un oligonucleótido de 40 bases (indicado como JR53 en los ejemplos) y de secuencia SEQ ID NO: 3;

- La secuencia de fijación de la proteína Sm modificada, por ejemplo, la secuencia smOPT, correspondiente a los nucleótidos 299 a 309 de la secuencia SEQ ID NO: 2;

- La secuencia que codifica la forma en tallo-bucle, no modificada y ventajosamente de origen murino, correspondiente a los nucleótidos 310 a 340 de la secuencia SEQ ID NO: 2;

- La región 3' no traducida del U7 snRNA, ventajosamente de origen murino, tal como, por ejemplo, la ilustrada por los nucleótidos 341 a 442 de la secuencia SEQ ID NO: 2.

Preferentemente, la secuencia que codifica un oligonucleótido antisentido de interés está integrada antes de la secuencia de fijación de la proteína Sm modificada, a saber, antes de la secuencia smOPT.

Un snRNA modificado como se describe a continuación, ventajosamente de tipo U7, y que integra un oligonucleótido antisentido de interés en el sentido de la invención, puede presentar, por ejemplo, la secuencia SEQ ID NO: 2.

Debe apreciarse que pueden integrarse otras secuencias en la construcción descrita a continuación. En particular, pueden integrarse otras secuencias en el snRNA modificado portador de la secuencia que codifica el AON de interés, ventajosamente antes o después de dicha secuencia. En particular, puede contemplarse la inserción de al menos una secuencia que codifica otro AON de interés, dirigido contra otra región del exón 53 o que permite el salto de otro exón de la distrofina cuyo salto presenta igualmente interés.

La secuencia que codifica el snRNA modificado, portador de la secuencia que codifica el AON de interés en el ámbito de la invención, está insertada ventajosamente entre las 2 secuencias ITR de un AAV, por ejemplo, de serotipo 2. Una construcción correspondiente se ilustra, por ejemplo, en la secuencia SEQ ID NO: 10.

Señalar que, en vista del tamaño de las construcciones consideradas en el ámbito de la invención y de la capacidad de encapsidación de los AAV, es posible considerar la integración de otras construcciones entre las dos secuencias ITR del vector AAVr según la invención:

- la introducción de una o varias copias adicionales (por ejemplo, de 1 a 9, ventajosamente de 1 a 3) de la secuencia que codifica la construcción según la invención (snRNA en el cual se ha insertado la secuencia que codifica el AON de interés), por ejemplo, de la secuencia SEQ ID NO: 2;

- la introducción de una o varias de otras secuencias que codifican un snRNA modificado, portador de al menos una secuencia que codifica otro AON de interés, dirigido contra otra región del exón 53 o que permite el salto de otro exón de la distrofina cuyo salto presenta igualmente interés.

En otras palabras y con el fin de mejorar el salto de exones, el vector AAVr según la invención puede comprender varias secuencias que codifican los oligonucleótidos antisentido. Pueden considerarse diferentes modos de realización, que no son mutuamente excluyentes. Según un primer modo de realización, el vector AAVr comprende varios snRNA modificados, comprendiendo cada uno de estos snRNA una secuencia que codifica un oligonucleótido antisentido. Según un segundo modo de realización, el vector AAVr comprende un único snRNA modificado, el cual comprende varias secuencias que codifican uno o varios oligonucleótidos antisentido. En este modo de realización, se entiende que el AAVr puede comprender varias secuencias que codifican un mismo oligonucleótido antisentido, y/o secuencias que codifican oligonucleótidos antisentido diferentes.

Igualmente, forma parte de la invención cualquier tipo de célula aislada, transducida por el vector AAVr descrito a continuación. Se trata ventajosamente de células musculares, en particular del tipo fibras musculares (miotubos) o precursores musculares (mioblastos). Según un modo de realización particular, las células embrionarias humanas que hayan requerido la destrucción de un embrión humano están excluidas del ámbito.

Un tejido muscular aislado o un organismo no humano transducido por dicho vector están igualmente comprendidos en la extensión de la protección buscada. Entre los organismos no humanos se prefieren los animales.

La presente solicitud describe por primera vez un potencial terapéutico para el vector reivindicado. La presente invención se refiere por tanto igualmente a composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo al menos un vector AAVr tal como se define en la presente solicitud, así como la utilización de este vector como medicamento.

Según otro aspecto, la presente invención concierne a una composición, ventajosamente a una composición farmacéutica o a un medicamento, que comprende un vector AAVr como se describe a continuación, y potencialmente otras moléculas activas (otros productos de terapia génica, entidades químicas, péptidos, proteínas, . . .), dedicada al tratamiento de la misma enfermedad o de otra enfermedad.

Así, la presente invención ofrece composiciones farmacéuticas que comprenden un ácido nucleico según la invención, en este caso un vector AAVr según la invención. Dicha composición comprende une cantidad terapéuticamente eficaz del vector según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable e inerte. Según un modo de realización particular, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reglamentaria federal o estatal o incluido en la Farmacopea americana o europea, o en cualquier otra Farmacopea reconocida como admisible para el ser humano y los animales. El término "vehículo" hace referencia a un diluyente, adyuvante, excipiente o soporte con el cual es administrado el agente terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos, ventajosamente estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y otros. El agua es un vehículo preferido cuando la composición se administra por vía intravenosa. Igualmente pueden utilizarse como vehículos líquidos soluciones salinas, dextrosa acuosa, soluciones de glicerol, en particular en el caso de soluciones inyectables. Algunos excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y otros.

Si fuera necesario, la composición puede contener igualmente cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o de agentes tamponantes del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, formulaciones de liberación prolongada y otras. Algunos ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables se describen, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin. Dichas composiciones contienen una cantidad terapéutica mente eficaz del principio activo, preferentemente en forma purificada, con una cantidad adaptada de vehículo, de forma que se obtenga la forma de administración adaptada para el paciente.

Según un modo de realización preferido, la composición se formula de acuerdo con los procedimientos habituales para las composiciones farmacéuticas adaptadas para una administración intravenosa en el ser humano. T radicionalmente, las composiciones para la administración intravenosa son soluciones en un tampón acuoso estéril isotónico. Si fuera necesario, la composición puede contener igualmente un agente solubilizante y un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de inyección.

Según un modo de realización, la composición según la invención está adaptada para su administración en el ser humano. La composición está preferentemente en forma líquida, ventajosamente en forma de una composición salina, aún más ventajosamente en forma de una composición contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS) o una solución de tipo Ringer-Lactato.

La cantidad del agente terapéutico según la invención, en este caso un vector AAV recombinante, que es eficaz para el tratamiento de las enfermedades distróficas puede determinarse mediante los protocolos clínicos habituales. Además, pueden implementarse ensayos in vitro y/o in vivo de manera opcional para ayudar a la determinación de los valores óptimos de dosis. La dosis precisa que se va a utilizar en la composición puede depender igualmente de la vía de administración elegida, de la frecuencia de administración, del peso y/o de la edad del paciente, de la gravedad de la enfermedad, y debe ser decidida por el médico en vista del contexto particular de cada paciente.

Un modo de administración apropiado debe permitir la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del principio activo en los tejidos objetivo, en particular en los músculos esqueléticos, y eventualmente en el corazón y el diafragma. En el contexto particular de la invención en el que el principio activo es un vector AAV recombinante, la dosis terapéutica se define en términos de cantidad de partículas víricas (vg de "viral genome") administrada por kilogramo (kg) del paciente.

De forma apropiada, la cantidad apropiada debe permitir:

- El salto del exón 53 para al menos el 10 %, incluso el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % incluso hasta el 100 % de los transcritos de la distrofina. Esto puede ser evaluado mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica, por ejemplo, por RT-PCR;

- La producción de una distrofina truncada (al menos desprovista de la parte codificante del exón 53) que representa al menos el 5 %, incluso el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % incluso hasta el 100 % de la distrofina producida normalmente en un organismo sano. Esto puede ser evaluado mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica, por ejemplo, por western blot.

En la práctica, y particularmente en el caso de la administración sistémica, la composición se administra ventajosamente a una dosis inferior o igual a 1015 vg/kg, incluso hasta de 1014 vg/kg. Puede estar comprendida entre 1012 vg/kg y 1014 vg/kg, preferentemente comprendida entre 2.1012 vg/kg y 5.1013 vg/kg. De forma conocida, una dosis lo más baja posible que permita obtener un resultado satisfactorio es privilegiada con el fin de evitar particularmente los problemas de toxicidad o de reacciones inmunitarias.

Las vías de administración disponibles son la administración tópica (local), enteral (efecto general pero administración a través del tracto gastrointestinal (GI)) o parental (acción sistémica pero administración a través de otras vías distintas al tracto GI). La vía de administración preferida de la composición según la invención es la vía parental e incluye la administración intramuscular (en el músculo) y la administración sistémica (en el sistema circulatorio). En este contexto, el término "inyección" (o perfusión) comprende la administración intravascular, en particular intravenosa (IV) e intramuscular (IM). Las inyecciones se realizan generalmente con la ayuda de una jeringa o un catéter.

Según un modo de realización particular, la administración sistémica de la composición comprende la administración local de la composición en un sitio de tratamiento, por ejemplo, o en una vena o una arteria de un músculo débil. Esta técnica de administración, que implica una administración local que produce efectos sistémicos, denominada generalmente administración locorregional, se considera particularmente apropiada para el tratamiento de las patologías musculares. En la práctica, puede tratarse de una administración arterial o intravenosa en un miembro del paciente (pierna o brazo), realizada bajo presión gracias a la colocación de un torniquete, como describe, por ejemplo, Zhenge et al. (Mol. Therapy, 2012, 20 (2): 456-461), Toromanoff et al. (Mol. Therapy, 2008, 16 (7): 1291-99) et Arruda et al. (Blood, 2010, 115 (23): 4678-88).

Además de la administración locorregional, un modo de administración privilegiado según la invención es la administración sistémica. La administración sistémica permite alcanzar todo el cuerpo, y en particular, el conjunto de músculos del paciente, incluyendo el corazón y el diafragma.

Según un modo de realización privilegiado, la administración sistémica se realiza a través de la inyección de la composición en un vaso sanguíneo, a saber, a través de una administración intravascular (intraarterial o intravenosa). En particular, la composición puede ser administrada mediante una inyección intravenosa, en una vena periférica. Alternativamente, la administración sistémica puede ser una inyección intramuscular.

De una forma conocida por el experto en la técnica, la administración sistémica se realiza en las siguientes condiciones clásicas:

- Un caudal de salida comprendido entre 1 y 10 ml/min, ventajosamente entre 1 y 5 ml/min, por ejemplo, 3 ml/min; - Un volumen de inyección total comprendido entre 1 y 10 ml, preferentemente igual a 5 ml de la preparación vectorial por kg del paciente. El volumen inyectado no debe representar preferentemente más del 10 % del volumen sanguíneo total, preferentemente aproximadamente un 6 %.

Puede considerarse suficiente una única administración de la composición según la invención. No obstante, pueden considerarse varias administraciones en diferentes condiciones, particularmente:

- Administración repetida del mismo vector por la misma vía de administración;

- Administración del mismo vector en diferentes sitios, en particular en diferentes miembros;

- Administración de vectores recombinantes diferentes que pueden variar en cuanto a su serotipo o en la secuencia que codifica el AON suministrado.

Según un modo de realización, la presencia del vector AAV según la invención, y los efectos terapéuticos beneficiosos asociados, se observan durante al menos 1 mes, o 3 meses, o 6 meses o 1 año, o 2 años, o 5 años o 10 años, o incluso durante toda la vida del paciente.

Como ya se mencionó, el paciente es ventajosamente un ser humano, en particular un niño, un adolescente o un joven adulto. No obstante, la herramienta terapéutica según la invención puede ser apropiada y útil para el tratamiento de otros animales, en particular cerdos y ratones.

Dichos medicamentos están destinados particularmente al tratamiento de las enfermedades distróficas. En el ámbito de la invención, una enfermedad distrófica indica una enfermedad ligada a un defecto en el gen de la distrofina. Más concretamente, se trata de un defecto para el cual el salto del exón 53 permite restablecer el marco de lectura y la producción de una distrofina ciertamente truncada pero funcional. En relación con la invención, una distrofina truncada pero funcional indica una proteína de un tamaño inferior a la proteína nativa, en particular que no comprende la región codificada por el exón 53, pero que es capaz de asegurar al menos ciertas funciones de la proteína nativa, y particularmente de atenuar al menos parcialmente los síntomas asociados a la ausencia de la distrofina nativa, tales como la degeneración de las fibras, la inflamación, la necrosis, la sustitución del músculo por tejido de cicatrización o adiposo, la debilidad muscular, la insuficiencia respiratoria o cardíaca, así como la muerte prematura.

Según un modo de realización particular, la enfermedad distrófica es la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD o enfermedad de Duchenne).

Son particularmente relevantes las formas de la DMD asociadas a las deleciones del exón 52 (A52), de los exones 50 a 52 (A50-52), de los exones 49 a 52 (A49-52), de los exones 48 a 52 (A48-52), de los exones 47 a 52 (A47-52), de los exones 46 a 52 (A46-52), de los exones 45 a 52 (A45-52), de los exones 43 a 52 (A43-52) y de los exones 10 a 52 (A10-52), o a una duplicación del exón 53. El interés de la presente invención se ilustra más adelante en relación con las deleciones A52 y A45-52, pero también A48-52 y A50-52.

La naturaleza de las deleciones del gen de la distrofina presentes en un paciente es fácilmente determinada por el experto en la técnica, por ejemplo, por secuenciación o PCR.

En vista de los notables efectos observados sobre la restauración de la distrofina en las fibras musculares afectadas por DMD, la invención concierne igualmente a la utilización de un vector AAVr como se describe a continuación o de una composición que lo contiene para la fabricación de un medicamento, destinado ventajosamente al tratamiento de las enfermedades distróficas, en particular las DMD, particularmente las formas indicadas a continuación.

En otras palabras, la presente invención proporciona un método de tratamiento de las enfermedades distróficas, en particular tales como las definidas a continuación, que comprende la administración a un sujeto de dicho vector AAV o de una composición que lo contiene.

Ejemplos de realización

La invención y las ventajas que derivan de la misma se establecerán mejor a partir de los siguientes ejemplos de realización, con el apoyo de las figuras anexas. En particular, la presente invención se ilustra (ejemplo 1) en relación con los vectores AAV 2/8 que comprenden diversas secuencias que codifican AON de interés en el sentido de la invención y un snRNA modificado murino de tipo U7, analizados con mioblastos que presentan una deleción del exón 52 (A52) o de los exones 45-52 (A45-52) del gen humano de la distrofina. La invención se ilustra además (ejemplo 2) en relación con un vector AAV 2/8 que comprende una secuencia que codifica un AON particular (JR53) y un snRNA modificado murino de tipo U7, analizado con fibroblastos de pacientes mioconvertidos (fibromioblastos) que presenta una deleción del exón 52 (A52) o de los exones 45-52 (A45-52), 48-52 (A48-52) o incluso 50-52 (A50-52), del gen humano de la distrofina. Sin embargo, éstos no tienen ningún ámbito limitante, y sus enseñanzas pueden extenderse a otros vectores AAV, a otros snRNA modificados y a sujetos afectados por la enfermedad de Duchenne resultante de otras mutaciones.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Evaluación del salto del exón 53 del mensajero de la distrofina humana tras la transducción de los mioblastos A45/52 con los diferentes vectores rAAV8 analizados con enmascaramiento. El análisis se ha realizado por RT-PCR anidada entre los exones 44 a 56. Blc: blanco de agua de PCR; NT: células no transducidas.

Figura 2: Evaluación del salto del exón 53 del mensajero de la distrofina humana tras la transducción de los mioblastos A52 con los diferentes vectores rAAV8 analizados con enmascaramiento. El análisis se ha realizado por RT-PCR anidada entre los exones 51 a 54. Blc: blanco de agua de PCR; NT: células no transducidas.

Figura 3: Evaluación por RTqPCR del nivel de expresión del mensajero de la distrofina humana sin exón 53 (en función del nivel de mensajero de la distrofina total) tras transducción de los mioblastos A45/52 con los diferentes vectores rAAV8 analizados con enmascaramiento. NT: células no transducidas.

Figura 4: Salto del exón 53 del pre-ARNm de la distrofina humana en mioblastos DMD A45-52.

A/ Los mioblastos A45-52 han sido transducidos con los vectores AAV2/8-U7-5901 (indicado como 01) o 5902 (indicado como 02) o 5903 (indicado como 03) o 5907 (indicado como 07) o 5912 (indicado como 12) o 5894 (indicado como 94) o 5899 (indicado como 99) (véase Material y métodos) a una MOI de 300.10E+3. Su eficacia para el salto del exón 53 se ha evaluado por RT-PCR anidadas. La cantidad de ARNm total de la distrofina se evalúa por RT-PCR Dys3-9, y la expresión del gen constitutivo 18S permite evaluar la presencia de ARNm.

B/ Los mioblastos A45-52 han sido transducidos con los vectores AAV2/8-U7-5901 o 5902 o 5903 o 5907 o 5912 o 5894 o 5899 (véase Material y métodos) a una MOI de 300.10E+3. Se ha realizado una western blot múltiple para detectar las proteínas distrofina y disferlina en las células de un sujeto sano (8220; extracto proteico diluido a 1/5) y las células DMD A45-52 no infectadas (No Inf). Esta figura es representativa de 4 experimentos realizados de forma independiente.

Figura 5: Salto del exón 53 del pre-ARNm de la distrofina humana en mioblastos DMD A52.

A/ Los mioblastos A52 han sido transducidos con los vectores AAV2/8-U7-5901 (indicado como 01) o 5902 (indicado como 02) o 5903 (indicado como 03) o 5907 (indicado como 07) o 5912 (indicado como 12) o 5894 (indicado como 94) o 5899 (indicado como 99) (véase Material y métodos) a una MOI de 300.10E+3. Su eficacia para el salto del exón 53 se ha evaluado por RT-PCR anidadas. La cantidad de ARNm total de la distrofina se evalúa por RT-PCR Dys3-9, y la expresión del gen constitutivo 18S permite evaluar la presencia de ARNm.

B/ Los mioblastos A52 han sido transducidos con los vectores AAV2/8-U7-5901 o 5902 o 5903 o 5907 o 5912 o 5894 o 5899 (véase Material y métodos) a una MOI de 300.10E+3. Se ha realizado una western blot múltiple para detectar las proteínas distrofina y disferlina en las células de un sujeto sano (8220; extracto proteico diluido a 1/5) y las células DMD A52 no infectadas (Ni). Esta figura es representativa de 4 experimentos realizados de forma independiente.

Figura 6: Eficacia de JR53 para el salto del exón 53 de la distrofina en fibromioblastos humanos DMD transducidos. A, de izquierda a derecha: marcador de peso molecular; mioblastos de control sanos (hM); fibromioblastos (hFM); fibromioblastos DMD no aptos (FMstop16); células de 3 pacientes DMD 5-13889 (FM13889 del49-52), 5-14211 (FM14211 del52), 5-14476 (FM14476 del45-52) con, para cada paciente, 4 condiciones: fibroblastos (FH), fibromioblastos no inducidos con doxiciclina (FM no), fibromioblastos inducidos con doxiciclina (FM dox-), fibromioblastos inducidos con doxiciclina y tratados con JR53 (FM dox+); control negativo de la transcripción inversa sin enzima superscript (RT-) o sin ARN (RTo); marcador de peso molecular.

B: idéntico a A con los pacientes DMD 5-14496 (FM14496del45-52), 5-14498 (FM14498 del48-52), 5-14878 (FM14878 del50-52) y sin el blanco de RTo.

C, de izquierda a derecha: marcador de peso molecular; mioblastos de control sanos (hM); fibromioblastos (hFM); fibromioblastos DMD no aptos (FMstop16); fibroblastos DMD de control (FH), fibromioblastos inducidos con doxiciclina de 4 pacientes DMD 5-14499 (FM 14499 del50-52), 5-14589 (FM 14589 del50-52), 5-14683 (FM 14683 del48-52), 5­ 16283 (FM 16283 del45-52), con, para cada uno, 2 condiciones: no tratados con JR53 (FM dox-), tratados con JR53 (FM dox+); control negativo de la transcripción inversa sin enzima superscript (RT-) o sin ARN (RTo); marcador de peso molecular.

Los productos de la RT-PCR que tienen el tamaño esperado en ausencia del exón 53 están marcados con una flecha.

Figura 7: Expresión de la proteína distrofina en los fibromioblastos DMD humanos transducidos revelada por western blot.

La detección de la expresión de la distrofina (arriba) y de la calnexina (abajo) se ha realizado por western blot. A, de izquierda a derecha: fibromioblastos de control sanos (hFM); fibromioblastos DMD no aptos (FMstop16); fibromioblastos DMD no inducidos con doxiciclina (FH); fibromioblastos inducidos con doxiciclina de 3 pacientes DMD 5-13889 (FM 13889 del48-52), 14211 (FM14211 del52), 5-14476 (FM14476 del45-52), cada uno en 2 condiciones: no tratados con JR53 (FM dox-) y tratados con JR53 (FM dox+); mioblastos sanos (hM).

B: idéntico a A con los pacientes DMD 5-14878 (FM 14878 del45-52), 5-14496 (FM14496 del50-52), 5-14498 (FM14498 del48-52).

C: idéntico a A con los pacientes DMD 5-14499 (FM14499 del50-52), 5-14589 (FM 14589 del50-52), 5-14683 (FM14683 del48-52), 5-16283 (FM16283 del45-52).

La eficacia de JR53 se ha analizado en dos o tres experimentos para cada lote de fibromioblastos DMD.

EJEMPLO 1: EFICACIA DE LOS VECTORES QUE COMPRENDEN SECUENCIAS QUE CODIFICAN LOS OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO (AON) EN EL SALTO DEL EXÓN 53 DE LA DISTROFINA EN MIOBLASTOS

Se ha ensayado la eficacia de los AAV8 recombinantes descritos con más detalle a continuación con enmascaramiento en el ámbito de dos estudios realizados en paralelo.

El primer estudio (I) ha tenido por objeto comparar la eficacia de las diferentes secuencias antisentido en el salto del exón 53 (evaluada por RT-PCR en el ARNm de la distrofina), en términos cualitativos y cuantitativos.

El segundo estudio (II) ha tenido por objeto comparar la eficacia de las diferentes secuencias antisentido en el salto del exón 53 (evaluada por RT-PCR en el ARNm de la distrofina) y en la proteína distrofina producida.

A. Materiales y métodos

1/ Antisentido, vectores y plásmidos

Se han ensayado las secuencias antisentido identificadas en la siguiente Tabla 1:

Se han clonado por mutagénesis dirigida en el gen U7snRNA murino optimizado y contienen su propio promotor. La construcción correspondiente en relación con el AON 5902 (JR53) se ilustra en la secuencia SEQ ID NO: 2.

Las construcciones correspondientes se han insertado en un plásmido de expresión. por ejemplo, el plásmido pFBD.

Como se describe en Ayuso et al. (Hum. Gen. Ther., 2014. Nov 25 (11): 977-87). los plásmidos utilizados para la producción de los vectores AAV2/8 son:

- pDP10 portador de los genes rep-2 y cap-8 y de los genes auxiliares del adenovirus E2b, E4, VARNA; y

- el plásmido vector portador de las ITR-2 correspondientes y el transgén (construcciones descritas a continuación).

2/ Producción de los vectores AAV2/8

Los vectores AAV8 se han producido a partir de células HEK293 (que han integrado de forma estable en su genoma celular los genes E0A y E1B) cultivadas en sistema adherente en bandejas Cell Stack 5. Las células, cultivadas en medio DMEM que contiene un 10 % de suero bovino fetal (volumen/volumen) así como penicilina y estreptomicina (1 % volumen/ volumen para cada antibiótico), han sido transfectadas por la técnica de precipitación con fosfato de calcio de 2 plásmidos (plásmido auxiliar: pDP10 portador de los genes rep-2 y cap-8 y los genes auxiliares del adenovirus E2b, E4, VARNA y el plásmido vector portador de las correspondientes ITR-2 y el transgén).

El medio se cambia después de la transfección por medio DMEM sin suero. Las partículas AAVr se recogen después de 72 h del sobrenadante y se precipitan con polietilenglicol al 40 % más benzonasa Las partículas se purifican después con 2 gradientes sucesivos de CsCl. La contaminación de CsCl se elimina por diálisis contra tampón dPBS 1 X. A continuación, las partículas se congelan a -80 °C en tubos "low binding" (Ayuso et al., Hum. Gen. Ther., 2014, Nov 25 (11): 977-87).

3/ Titulación de los vectores

Las producciones de vectores se tratan con DNAsa para eliminar el ADN libre contaminante, y después se procede a una extracción de los ácidos nucleicos víricos. Después de la extracción, los ácidos nucleicos se diluyen, y el número de copias de genomas víricos AAV (amplicón Aa V/ITR) se determina por qPCR con una serie de plásmidos linealizados y estandarizados.

Para la qPCR, se utilizan los siguientes cebadores y sonda:

AAV18mers.R: GTAGATAAGTAGCATGGC (SEQ ID NO: 11)

AAV22mers.F: CTCCATCACTAGGGGTTCCTTG (SEQ ID NO: 12)

AAV_M G B P: TAGTTAATGATTAACCC (SEQ ID NO: 13).

4/ Líneas de mioblastos inmortalizados

Se han utilizado dos líneas de pacientes Duchenne, una portadora de una deleción en el gen de la distrofina de los exones 45 a 52 (A45-52) y otra del exón 52 (A52). Una tercera línea de mioblastos de un sujeto sano ha servido de control (8220).

I/ Protocolo implementado en el ámbito del estudio I:

5/ Transducción de los mioblastos inmortalizados por AAV2/8

Las células se siembran a 190.000 células por pocillo de una placa de 6 pocillos, y después se cultivan a medio de proliferación (skeletal muscle cell basal medium skeletal muscle cell growth medium kit, Promocell Ref: C23160). Después de 24 horas aproximadamente, las células son transducidas a unas MOI de 1e5 y 5e5 vg/célula con los diferentes vectores AAV2/8 recombinantes U7snRNA modificados con enmascaramiento y un blanco de AAV2/8 que permite la expresión de la Green Fluorescent Protein (GFP) con el fin de verificar la eficacia de las transducciones.

Después de 3 días de cultivo, las células se recogen y los residuos celulares se congelan en seco a -80 °C. A continuación los residuos se utilizan para las purificaciones del ADN y del ARN.

6/ Evaluación del número de genomas víricos por célula

La extracción de los genomas AAV se realiza utilizando el kit Gentra Puregene kit (Qiagen). El número de copias del ADN de vector se determina utilizando el procedimiento TaqMan Real time PCR. Los cebadores y la sonda se elaboran para amplificar (i) las Inverted Terminal Repeats (ITR) (véase el punto 3) y (ii) el gen endógeno de la albúmina. Para cada muestra, se comparan los valores del Ct con los obtenidos con diferentes diluciones de un plásmido patrón que contiene a la vez las iTr y el gen de la albúmina. Los resultados finales se expresan en genomas víricos por genoma diploide (vg/dg de "viral genome/ diploid genome").

Alb.F: GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT (SEQ ID NO: 14)

Alb.R: ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC (SEQ ID NO: 15)

AlbVIC.P: CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC (SEQ ID NO: 16)

7/ Evaluación del salto de exón por RT-PCR anidada

La extracción de ARN a partir del residuo seco de células se realiza con 1 ml de Trizol Reagent según el modo operativo del proveedor (Life Technologies, Ref 15596-026). Los ARN se recogen en 30 pl de agua estéril y después se tratan en dos etapas sucesivas de DNasa con el fin de eliminar las contaminaciones habituales de los a Rn por los ADN víricos (Ambion, Ref AM1907). Se utilizan 500 ng de ARN para la reacción de transcripción inversa (kit Life Technologies, Ref 28025-013). Durante esta etapa se realizan controles negativos de la transcripción inversa en cada muestra con el fin de verificar la ausencia de contaminación por los ADN víricos.

Para la detección del salto de exón, se realiza una primera PCR (PCR1) con la enzima Gotaq G2 (Promega, Ref: M7805) a partir de 1 pl de ADN complementarios (ADNc) en un volumen final de 50 pl con los pares de cebadores apropiados para cada tipo celular (véase la lista de los cebadores, a continuación) para 25 ciclos [95 °C 30 segundos - 50 °C o 58 °C 1 min - 72 °C 2 min], después se reamplifica 1 pl de la PCR1 en un volumen total de 50 pl (PCR2) para 30 ciclos [95 °C 30 segundos - 50 °C o 58 °C 1 min - 72 °C 2 min] con un segundo par de cebadores internos en el producto de la PCR1. El análisis de los productos de la PCR anidada se realiza por electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % en tampón Trisacetato-EDTA. Las bandas correspondientes al salto de exón se recortan, se purifican en columna con la ayuda del Kit Nucleospin Gel and PCR Clean-up (MACHEREY-NAGEL, Ref: 740609.250) y se secuencian.

Los pares de cebadores utilizados para el salto de exón 53 son:

Para la línea DMD A52:

PCR1: ex51 hDMD Fext y ex54 hDMD Rext a 50 °C

PCR2: ex51 hDMD Fint y ex54 hDMD Rint a 50 °C

Para la línea A45-52:

PCR1 Dys43F/Dys57R a 58 °C

PCR2 Dys44F/Dys56R a 58 °C

Secuencias de los cebadores para el salto de exón 53:

ex51 hDMD Fext: GTTACTCTGGTGACACAACC (SEQ ID NO: 17)

ex54 hDMD Rext: ATGTGGACTTTTCTGGTATC (SEQ ID NO: 18)

ex51 hDMD Fint: ACTAGAAATGCCATCTTCCT (SEQ ID NO: 19)

ex54 hDMD Rint: CAAGTCATTTGCCACATCTA (SEQ ID NO: 20)

Dys43-F: CCTGTGGAAAGGGTGAAGC (SEQ ID NO: 21)

Dys44-F: CGATTTGACAGATCTGTTGAG (SEQ ID NO: 22)

Dys56-R: TGAGAGACTTTTTCCGAAGT (SEQ ID NO: 23)

Dys57-R: AAGTTCCTGCAGAGAAAGGT (SEQ ID NO: 24)

Los tamaños esperados para la PCR2 están indicados en la siguiente Tabla 2.

8/ Cuantificación del salto del exón 53 por PCR cuantitativa en la línea A45-52

Se realizan dos RTqPCR con el fin de cuantificar el salto del exón 53. La primera es específica del transcrito y solo contiene el exón 53 de la distrofina (RTqPCR de la unión de los exones 44 y 54). La segunda se utiliza para normalizar amplificando todos los transcritos de la distrofina (RTqPCR de la unión de los exones 4 y 5). Los ADNc procedentes de la reacción de transcripción inversa se diluyen y después se amplifican con la ayuda del kit Premix Ex Taq utilizando la tecnología Taqman según las recomendaciones del proveedor (Takara, Ref RR390w) con 0.3 pmol/l de cada cebador y 0.25 pmol/l de la sonda Taqman (véase la lista de cebadores y sondas, a continuación) para 40 ciclos [95 °C 15 segundos - 57 °C 1 min]. Para validar la eficacia de las RTqPCR y cuantificar los transcritos, se depositan unas series de diluciones de un plásmido de referencia que contiene las secuencias de interés en paralelo a las muestras de la placa.

Para la RTqPCR de la distrofina sin el exón 53, se utilizan los siguientes cebadores y sonda:

hDys-44/54-F: CCTGAGAATTGGGAACATGCTAA (SEQ ID NO: 25)

hDys-44/54-R: GCCACTGGCGGAGGTCTT (SEQ ID NO: 26)

hDys-44/54-P: GGTATCTTAAGCAGTTGGC (SEQ ID NO: 27) = sonda Taqman que llega hasta la unión de los exones 44 y 54

Para la RTqPCR distrofina total, se utilizan los siguientes cebadores y sonda:

hDys-4/5-F: CATGCCCTGAACAATGTCAACAAG (SEQ ID NO: 28)

hDys-4/5-R: TCCATCTACGATGTCAGTACTTCCA (SEQ ID NO: 29)

hDys-4/5-P: TTGCAGAACAATAATGTTGATTTA (SEQ ID NO: 30) = sonda Taqman que llega hasta la unión de los exones 4 y 5

II/ Protocolo implementado en el ámbito del estudio II:

5/ Transducción de los mioblastos inmortalizados por AAV2/8

Las células se siembran a 100.000 células por pocillo de 35 mm, después se cultivan en el medio de proliferación mencionado anteriormente hasta una confluencia del 80 %. Después de 24 horas aproximadamente, las células se infectan con los diferentes vectores AAV2/8 recombinantes a una MOI de 250.000 vg/célula en medio de diferenciación (IMDM sin suero con gentamicina), a 37 °C.

Después de entre 4 y 6 h, se añaden 250 pl de IMDM adicionado con gentamicina. Después de 9 días de cultivo en medio de diferenciación, se recoge una muestra del medio de cultivo de 1/10 del volumen del pocillo de 35 mm. A continuación se utilizará para la purificación de ARN para los análisis por RT-PCR. En paralelo, las células se raspan, se aclaran y se centrifugan I minuto a 11.000 g o 5 minutos a 1.500 rpm. Los residuos se congelan en seco a -80 °C. A continuación los residuos se utilizan para la purificación de ADN y la cuantificación de genoma vírico.

6/ Evaluación del número de genomas víricos por célula

Véase el punto I-6, a continuación.

7/ Evaluación del salto de exón por RT-PCR anidada

Con el fin de proceder con la RT-PCR anidada, se extrae el TARN en una columna con la ayuda del kit Nucleospin RNAII y se eluye en 30 pl de agua (DNAse/RNAse free). Se utilizan 500 ng de ARN para la reacción de transcripción inversa (kit Superscript II Life Technologies, Ref 18064-014).

Para la detección del salto de exón, se realiza una primera PCR con 2 pl de cDNA en un volumen total de 20 pl con los pares de cebadores apropiados para cada tipo celular (véase la lista, a continuación) para 30 ciclos [95 °C 30" -56 °C T- 72 °C 2'], después se amplifican 3 pl de la PCR1 en un volumen total de 30 pl para 25 ciclos con un segundo par de cebadores internos en el producto de la PCR1. Con respecto al análisis de los ARN 18S y PO, se realiza una única PCR. El análisis de los productos de la PCR anidada se realiza por electroforesis en gel de agarosa al 1,8 % en tampón Tris-acetato-EDTA. Las bandas correspondientes al salto de exón se recortan, se purifican en columna con la ayuda del Kit Nucleospin Gel and PCR Clean-up (MACHEREY-NAGEL, Ref: 740609.250) y se secuencian (por GATC).

Los pares de cebadores utilizados para el salto de exón 53 son:

Para los mioblastos de control wt (8220) y DMD A52:

PCR1: Dys49F/Dys57R

PCR2: Dys50F/Dys56R (distrofina humana)

Para los mioblastos A45-52:

PCR1 Dys43F/Dys57R

PCR2 Dys44F/Dys56R (distrofina humana)

Secuencias de los cebadores 5'->3' para el salto de exón 53:

Dys43-F: CCTGTGGAAAGGGTGAAGC (SEQ ID NO: 21)

Dys44-F: CGATTTGACAGATCTGTTGAG (SEQ ID NO: 22)

Dys49-F: CAACCGGATGTGGAAGAGAT (SEQ ID NO: 31)

Dys50-F: CTCTGAGTGGAAGGCGGTAA (SEQ ID NO: 32)

Dys56-R: TGAGAGACTTTTTCCGAA-GT (SEQ ID NO: 23)

Dys57-R: AAGTTCCTGCAGAGAAAG-GT (SEQ ID NO: 24)

Secuencias de los otros cebadores para la amplificación 18S, PO y distrofina humana total:

PO -F: GGCGAGCTGGAAGTGCAACT (SEQ ID NO: 33)

PO-R: CCATCAGCACCACAGCCTTC (SEQ ID NO: 34)

18S-F: TCAAGAACGAAAGTCGGAGGTTCG (SEQ ID NO: 35)

18S-R: TTATGCTCAATCTCGGGTGGCTG (SEQ ID NO: 36)

Dys3-F: GAGAACCTCTTCAGTGACCTAC (SEQ ID NO: 37)

Dys9-R: GAGGTGGTGACATAAGCAGC (SEQ ID NO: 38)

Los cebadores utilizados para cada tipo celular y los tamaños esperados se indican en la siguiente Tabla 3.

8/ Evaluación de la restauración de la expresión de la distrofina por western blot múltiple

Las proteínas se extraen a partir de las células transducidas y diferenciadas durante 9 días (véase el párrafo 5) en un tampón que contiene 125 mM de sacarosa, 5 mM de Tris-HCI a pH 6.4, 6 % de tampón de migración XT-Tricina (Bio-Rad), 10 % de SDS, 10 % de glicerol, 5 % de 13-mercaptoetanol y de antiproteasas. Las muestras se desnaturalizan 5 minutos a 95 °C y después se pretratan con el Kit Compat-AbleTM Protein Assay preparación Reagent Set (Thermo Scientific Pierce). La concentración de las proteínas se determina con el BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific Pierce). Se depositan 75 |jg de proteínas en un gel Criterion XT Tris-Acetato al 3-8 % previamente unido (Bio-Rad). La distrofina se detecta por la hibridación de la membrana con el anticuerpo primario monoclonal NCL-DYS1 (Novocastra) diluido a 1:50 seguida por una incubación con el anticuerpo secundario sheep anti-mouse (HRP), diluido a 1:15.000. Las proteínas se revelan con el kit SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific Pierce).

B. Resultados y análisis

Se ha llevado a cabo un estudio con enmascaramiento doble con las secuencias antisentido candidatas insertadas en el gen U7snRNA murino optimizado y que contiene su propio promotor, portadas por los AAV2/8, en dos líneas de mioblastos humanos inmortalizados, A45-52 y A52 respectivamente.

Los vectores ensayados y su título se indican en la siguiente Tabla 4:

continuación

I/ Resultados del estudio I:

Estos vectores se han analizado a una MOI de le5 y 5e5 vg/célula en condiciones de proliferación con enmascaramiento por dos manipuladores. La eficacia de las transducciones se estima por citometría en flujo y se encuentra entre un 68 % y un 96 % de células transducidas.

Como se muestra en la siguiente Tabla 5, la cuantificación por qPCR de los genomas víricos por célula pone en evidencia la homogeneidad de transducción de los diferentes vectores:

Las figuras 1 a 3 presentan los resultados de la evaluación de la eficacia de las construcciones tras la transducción de los mioblastos d Md A45-52 y A52 respectivamente: Las figuras 1 y 2 permiten apreciar el salto del exón 53 por RT-PCR anidadas en las dos líneas, y la figura 3 presenta la cuantificación de este salto por RTqPCR en la línea A45-52. II/ Resultados del estudio II:

Estos vectores se han analizado a una MOI de 300.E+3. Las células transducidas se han puesto en diferenciación durante 9 días con el fin de obtener las condiciones de diferenciación que permiten poner en evidencia una restauración de la proteína distrofina en las células corregidas (véase Material y metodos).

Las figuras 4 y 5 presentan los resultados de la evaluación de la eficacia de las construcciones tras la transducción de los mioblastos d Md A45-52 y A52, respectivamente.

Las figuras 4A y 5A permiten apreciar el salto del exón 53 por RT-PCR anidadas, y las figuras 4B y 5B presentan los resultados del estudio de la expresión de la proteína distrofina por western blot.

CONCLUSIONES:

A partir de estos dos estudios independientes y plenamente coherentes se concluye que los resultados de la eficacia del salto de exón son idénticos para las dos líneas DMD, a saber, una eficacia del orden siguiente: 5902 > 5901 = 5903. Asimismo, en las dos líneas de mioblastos, la construcción que porta el AON 5902 es la más eficaz para restaurar la expresión de la distrofina.

Las secuencias antisentido clonadas en U7 y vectorizadas en AAV2/8, en particular las secuencias denominadas JR53 (SEQ ID NO: 3) y N3 (SEQ ID NO: 4), son, todas, más eficaces que la secuencia Dtex53 según la técnica anterior (5912).

EJEMPLO 2: EFICACIA DE VECTORES QUE COMPRENDEN LA SECUENCIA JR53 (SEQ ID NO: 3) EN EL SALTO DEL EXÓN 53 DE LA DISTROFINA, EN FIBROMIOBLASTOS HUMANOS

A. Materiales y métodos

1/ Cultivo de células

Los fibroblastos de pacientes con DMD se han cultivado en un medio de cultivo IMDM ("Iscove's Modified Dubelco Médium"; Life Technologies) adicionado con un 10 % de suero bovino fetal (SBF) y 10 pg/ml de gentamicina. En la confluencia, las células se disocian en una solución de tripsina/EDTA y se amplifican. Se han preparado muestras de cada paciente y se han conservado en frío (crioconservación).

2/ Mioconversión: conversión de los fibroblastos DMD humanos en fibromioblastos

2.1 Vector utilizado para la mioconversión

La técnica de mioconversión y las herramientas que permiten su implementación, particularmente los vectores lentivíricos adaptados, son conocidas por el experto en la técnica y se describen, por ejemplo, en Cooper et al. (Neuromuscular Disorders 17 (2007), 276-284) y en Chaouch et al. (Human Gene Therapy 2o (2009), 784-790).

El vector utilizado para la mioconversión es el vector lentivírico GU007HT_psin_pTRE_MyoD_hPGK_rtTA2M2, producido por Généthon (lote n°13RO281 GU 007H), denominado igualmente en lo sucesivo LV/MyoD o LV/MyoDi.

2.2 Método de mioconversión

Los fibroblastos humanos (FH) se han disociado con una solución de tripsina/EDTA, se han centrifugado durante 5 minutos a 300 g, se han suspendido en medio DMEM ("High glucose Dulbecco's Medium") y se han contado. Se han transferido 25.000 células a un tubo Eppendorf con 5 pl de LV/MyoDi en DMEM sin antibiótico, en un volumen total de 100 pl, después se han incubado durante 30 minutos a 37 °C (con entre 2 y 3 agitaciones). A continuación, la mezcla (células vector) contenida en cada tubo se ha sembrado en un pocillo de 22 mm (P12) que contiene 900 pl de DMEM, 10 % de SBF, 100 pl/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, y se ha colocado en una estufa de incubación a 37 °C, 5 % de CO² durante 3 días. A partir del tercer día, el medio se ha reemplazado íntegramente para eliminar las partículas víricas. Las células transducidas por LV/MyoDi se han amplificado después y se han congelado a -80 °C antes de ser transferidas a nitrógeno líquido.

2.3 Validación de la eficacia de la mioconversión por marcaje inmunocelular de MyoD1

Los fibromioblastos (FM) se han inoculado en una lámina de 22 mm en matrigel a 10.000 células/pocillo. La mioconversión es inducida después de 24 h por la adición de 10 pg/ml de doxiciclina durante 4 a 6 días en un medio de proliferación. Los fibromioblastos se han fijado con un 2 % de paraformaldehído (PFA) durante 15 minutos a la temperatura ambiente (y, si fuera necesario, se han mantenido a 4 °C). Las células se han permeabilizado durante 5 minutos con metanol a -20 °C, se han bloqueado durante 1 hora en PBS que comprende un 2 % de BSA ("Bovine Sérum Albumine"). Se han realizado marcajes inmunológicos utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón MyoDl clon 5.8A (código DAK.0 M3512) diluido a 1/100, incubado durante una noche a 4 °C. A continuación se ha incubado un anticuerpo secundario Alexa fluoro 488-IgG anti-ratón de cabra (1/500) durante 1 hora a la temperatura ambiente. Los núcleos se han marcado con DAPI durante 5 minutos. Las láminas se han montado en un portaobjetos Fluoromount G y se han observado bajo un microscopio de fluorescencia (DM2500 Leica confocal imaging et application ImageJ).

La eficacia de la mioconversión se ha expresado calculando el porcentaje de núcleos positivos para MyoD1 con respecto a los núcleos positivos para DAPI (100 células contadas por condición).

3/ Producto clínico

El vector utilizado para los ensayos clínicos, que comprende la secuencia JR53 (SEQ ID NO: 3), es el vector G7U007 bacculoAAV2 / 8-U7-JR53 producido por Généthon (lote n ° 14PO353: JR53), como se describe en el ejemplo 1.

4/ Transducción de los fibromioblastos DMD humanos por JR53

Los fibroblastos mioconvertidos (fibromioblastos) se han infectado con el vector que comprende la secuencia JR53 (MOI 300.000 genomas víricos por célula) en medio IMDM sin suero a 37 °C. Cinco horas más tarde, los fibromioblastos se han diferenciado en medio IMDM, adicionado con un 1 % de suero de caballo, 10 pg/ml de gentamicina y 10 pg/ml de doxiciclina durante entre 13 y 14 días. Las células diferenciadas se han raspado con PBS, a la temperatura ambiente, se han recogido en un primer tubo (destinado a la transferencia de tipo Western) y se han mantenido en hielo. Se ha transferido 1/10 de la cantidad recogida para la extracción del a Rn . Después de una centrifugación de 1 minuto a 11.000 g, los residuos celulares se han congelado y almacenado a -80 °C.

5/ Análisis del salto de exón en los pre-ARNm de la distrofina en fibromioblastos DMD humanos transducidos

El ARN total se ha extraído de las células con la ayuda del kit Nucleospin RNAII (Macherey Nagel) según las instrucciones del fabricante, y se ha eluido en 30 pl de agua. Se han utilizado alícuotas de 500 ng de ARN total para un análisis por RT-PCR anidada. La reacción de transcripción inversa se ha realizado con un analizador de cebador aleatorio a 42 °C durante 50 min con la ayuda del kit Superscript II (Life Technologies), después por PCR utilizando el kit PCR master mix (Promega).

Para la evaluación del salto de exón del pre-ARNm de la DMD se ha realizado una RT-PCR anidada (PCR1): 2 j l de ADNc en un volumen total de 20 j l con los cebadores que rodean la mutación y el exón 53 (véase la Tabla 6), durante 30 ciclos [95 °C (30 s) - 56 °C (1 min) - 72 °C (2 min)]. A continuación, se han amplificado 3 j l de la PCR1 en un volumen total de 30 j l durante 25 ciclos con un segundo par de cebadores (véase la Tabla 6).

Para la evaluación del ARNm total de la distrofina y del ARNm ribosómico 18S (control endógeno de la adición de ADNc), se ha realizado una única PCR de 34 ciclos [95 °C (30 s) - 57 °C (1 min) - 72 °C (1 min)] con el par de cebadores descrito en la Tabla 6.

Los productos de la PCR se han analizado por electroforesis en gel de agarosa al 1,8 % en tampón T ris-acetato-EDTA. Los tamaños esperados de los productos de la RT-PCR se presentan en la siguiente Tabla 7. La multitud de píxeles obtenidos para cada banda se ha tratado con el programa informático ImageJ. Las bandas correspondientes al tamaño del amplicón que presenta un salto de exón (banda inferior) se han recortado, se han purificado en columna utilizando el Kit Nucleospin Gel y una PCR Clean-up (Macherey Nagel) y se han secuenciado (por GATC).

Tabla 6: Lista de los cebadores utilizados en los ex erimentos de PCR

T l T m ñ r i l r l RT-P R

6/ Análisis de la expresión de la proteína distrofina por western blot en los fibromioblastos humanos DMD transducidos

Las proteínas celulares se han extraído en tampón de lisis (sacarosa 125 mM, Tris-HCI 5 mm a pH 6,4, tampón de migración de XT-tricina al 6 % (Bio-Rad), SDS al 10 %, glicerol al 10 %, p-mercaptoetanol al 5 %, inhibidores de proteasas). Las muestras se han desnaturalizado 5 minutos a 95 °C.

La concentración de proteínas se ha determinado con la ayuda del kit BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific Pierce) en 2 |jl de muestra de proteína pretratada con el reactivo de dosis de proteína del kit Compat-Able ™ (Thermo Scientific Pierce). Se han cargado entre 75 y 100 jg de proteínas en un gel previamente unido de poliacrilamida al 3-8 % (kit Criterion XT Tris-acetato de Bio-Rad). La distrofina se ha detectado por hibridación de la membrana con el anticuerpo monoclonal primario NCL-DYS1 (Novocastra) diluido a 1:50, después se ha incubado con el anticuerpo secundario anti-IgG de carnero (HRP) de carnero diluido a 1:15.000. Las proteínas se revelan con el kit SuperSignal West Pico o Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific Pierce). Las proteínas musculares totales se han revelado efectuando una hibridación de la membrana con un anticuerpo anti-calnexina de conejo diluido a 1:2.000, durante una noche a 4 °C, después, una incubación con el anticuerpo secundario IgG anti-conejo (HRP) de cabra diluido a 1:50.000.

7/ Informaciones de las células

7.1/ Tabla de los pacientes (Tabla 8):

7.2/ Células de control

Las líneas celulares han sido proporcionadas por la plataforma de inmortalización celular del Centre de Recherche en Myologie, de la Université de la Sorbonne UPMC - iNs ERM - UMRS 974 - CNRS FRE 3617 - Institut de Myologie

• Fibromioblastos

Control de la expresión de la distrofina: fibroblastos humanos sanos J5C, mioconversión efectuada en la unidad de investigación u Mr S974.

Control negativo de la restauración de la distrofina: fibroblastos inmortalizados n °F033 no aptos (codón stop en el exón 16) para el salto de exón por JR53, mioconversión efectuada en la unidad de investigación UMRS974.

• Mioblastos inmortalizados

Mioblastos sanos para el control positivo de la expresión de la distrofina n ° 8220: hM Control positivo de la eficacia del producto clínico: mioblastos DMD con una deleción en el exón 52 aptos para el salto del exón 53, denominados KM571DMD10FL.

B. RESULTADOS

1/ Conversión de los fibroblastos DMD humanos en fibromioblastos:

T odos los lotes de fibroblastos DMD (10/10) han resultado ser positivos para la expresión nuclear de MyoD, mostrando un porcentaje de núcleos positivos para mioD1, con respecto al número total de núcleos marcados, superior al 70 % (Tabla 9), pudiendo considerarse por tanto como mioconvertidos.

Tabla 9: Conversión de los fibroblastos DMD humanos en fibromioblastos (media de los porcentajes de

2/ Eficacia de JR53 para el salto del exón 53 en los fibromioblastos humanos DMD transducidos

La eficacia de JR53 para el salto de exón se ha analizado en dos o tres experimentos independientes para cada lote de fibromioblastos DMD. Se han detectado productos de la RT-PCR correspondientes al tamaño esperado en ausencia del exón 53 en cada uno de los 10 pacientes DMD (Figura 6).

El porcentaje de eficacia de JR53 se ha calculado con la ayuda de la razón entre el número de píxeles obtenidos para la banda saltada y la suma de los píxeles calculados para el conjunto de las bandas saltadas y no saltadas (Tabla 10).

Para 8 de los lotes de fibromioblastos DMD, se ha detectado una eficacia de JR53 superior al 70 %, mientras que para los pacientes 5-14878 DMD y 5-14499 DMD, la eficacia era más baja, con una eficacia de entre el 64 y el 50 %, respectivamente. Las bandas correspondientes al tamaño del amplicón que presenta un salto de exón (banda inferior) se han secuenciado, y todas han proporcionado la secuencia esperada correspondiente al salto del exón 53.

Tabla 10: Eficacia de JR53 en el salto del exón 53 en los fibromioblastos DMD humanos

3/ Restauración de la expresión de la proteína distrofina en los fibromioblastos DMD humanos

Los resultados de las westerns blots realizadas aparecen en la figura 7.

El nivel de restauración de la expresión de la proteína distrofina en los fibromioblastos DMD humanos se ha evaluado mediante la cuantificación del número de píxeles correspondiente a la señal de cada banda con la ayuda del programa informático ImageJ. El nivel de distrofina se ha normalizado a la expresión de la calnexina (aporte de proteínas totales). El porcentaje de distrofina restaurada se ha calculado con ayuda de la razón entre el índice de distrofina normalizada en los fibromioblastos tratados y el índice de expresión de la distrofina observado en los fibromioblastos sanos (hFM), que se considera que representa el 100 %. Los resultados muestran que la restauración de la proteína distrofina podía observarse en todos los lotes de fibromioblastos DMD tratados con JR53. Debe mencionarse que para el sujeto DMD 5-14889, la evaluación del nivel de distrofina restaurada solo se ha medido una vez.

La cuantificación de los datos de restauración de la expresión de la proteína distrofina se presenta en la Tabla 11:

Tabla 11: Cuantificación de la restauración de la proteína distrofina en los fibromioblastos DMD humanos transducidos

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Vector vírico adenoasociado recombinante (AAVr) que comprende una secuencia que codifica un oligonucleótido antisentido (AON) dirigido contra la totalidad de la región 30 a 69 del exón 53 del ARN premensajero de la distrofina, estando dicha secuencia constituida por la secuencia SEQ ID NO: 3.

2. Vector AAVr según la reivindicación 1 caracterizado por que la secuencia que codifica el AON está comprendida en una secuencia que codifica un snRNA modificado.

3. Vector AAVr según la reivindicación 2 caracterizado por que el snRNA modificado es de tipo U7 (U7snRNA), ventajosamente de origen murino.

4. Vector AAVr según la reivindicación 3 caracterizado por que el vector comprende la secuencia SEQ ID NO: 2.

5. Vector AAVr según una de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que el vector se elige del siguiente grupo: AAV2/1, AAV2, AAV2/6, AAV2/8, AAV2/9, AAV2/10, AAV8 y AAV9, ventajosamente un vector AAV2/8.

6. Composición farmacéutica que comprende un vector AAVr según una de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Vector AAVr según una de las reivindicaciones 1 a 5 para su utilización como medicamento.

8. Vector AAVr según una de las reivindicaciones 1 a 5 o composición según la reivindicación 6 para su utilización en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne (DMD).

9. Vector AAVr según una de las reivindicaciones 1 a 5 o composición según la reivindicación 6 para su utilización en el tratamiento de las formas A52, A45-52, A48-52 y A50-52 de la distrofia muscular de Duchenne (DMD).