CN108368508B

CN108368508B - 用于抗肌萎缩蛋白外显子53跳读的有效基因治疗工具

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Publication number: CN108368508B
Application number: CN201680072229.3A
Authority: CN
Inventors: 佛朗斯·彼得里-鲁克塞尔; 维尔日妮·弗朗索瓦
Original assignee: Genethon
Current assignee: Genethon
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2016-12-09
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2036-12-09
Also published as: WO2017098187A1; FR3044926A1; DK3387130T3; US10752898B2; HK1255100A1; FR3044926B1; CA3006515A1; PT3387130T; JP6878433B2; EP3387130A1; CN108368508A; JP2019502376A; US20180362980A1; ES2845214T3; EP3387130B1

Abstract

本发明涉及一种重组腺相关病毒载体(rAAV)，其包含编码反义寡核苷酸(AON)的序列，所述反义寡核苷酸针对抗肌萎缩蛋白(优选是人源的)的前信使RNA(pre‑mRNA)的外显子53的+30至+69区域的至少33个碱基片段，以及其作为药物的应用，尤其是用于治疗杜兴氏肌营养不良症(DMD)。

Description

用于抗肌萎缩蛋白外显子53跳读的有效基因治疗工具

技术领域

本发明涉及基因治疗工具，其在治疗肌营养不良疾病，例如杜兴氏肌营养不良症(dystrophie musculaire de Duchenne,DMD)中特别有效。

这基于对反义寡核苷酸(AON)的认真选择，能够使抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因的外显子53跳读(skip)，所述反义寡核苷酸由重组腺相关病毒载体(AAVr)传递，并有利地与修饰型snRNA相关联。

背景技术

杜兴氏肌营养不良症(DMD)是最常见的退行性进行性肌肉疾病。这是由X染色体携带的一种遗传性疾病，在5000名男孩中约有1名受到影响。它是由抗肌萎缩蛋白基因的突变或缺失而引起的。抗肌萎缩蛋白的不表达或异常高表达使肌纤维产生脆性，导致肌肉组织加速破坏。功能性抗肌萎缩蛋白缺陷导致纤维变性、炎症、坏死以及肌肉被脂肪组织替代，这会导致进行性肌无力并在生命的第二十至第四十年期间由于呼吸或心力衰竭而过早死亡(Moser,H.,Hum Genet,1984.66(1):17-40)。

编码抗肌萎缩蛋白的dmd基因(2.7Mb)由79个外显子组成，位于X染色体的21.2位点。抗肌萎缩蛋白是一种模块化蛋白，其具有由24个“血影蛋白样”重复结构域组成的中心区域。

抗肌萎缩蛋白基因的大多数严重突变由以下组成：一个或多个外显子缺失，破坏最终信使的阅读框；基因的一部分重复；或存在于编码区(或外显子)中的点突变，其会引入终止密码子或引起阅读相的位移。

然而，已经注意到，抗肌萎缩蛋白的截短形式，特别是不含某些重复序列的形式，是功能完整的，或至少仅具有部分缺陷，例如，被称为贝克肌营养不良症(BMD)的疾病的衰减形式。

从这一观察出发，作为提供缺陷基因完整副本的传统基因治疗(鉴于编码抗肌萎缩蛋白的基因的大小，这是有问题的)的替代方案，已经考虑了不同的策略来尝试“修复”功能失调的抗肌萎缩蛋白。

因此，外显子跳读是一种治疗方法，其由以下组成：施用反义寡核苷酸(AON)，所述反义寡核苷酸(AON)与参与待掩蔽的外显子的剪接的序列互补，以使阅读框恢复。特别地，在重复序列区域中发生的外显子跳读使得可能获得比天然蛋白更短的抗肌萎缩蛋白，但其仍然是功能性的。

在实践中，在能够恢复阅读框的所有情况中，外显子53跳读均被证明是有益的。这在理论上靶向大量可能存在于抗肌萎缩蛋白基因中的突变，特别是外显子52(Δ52)，外显子50至52(Δ50-52)，外显子49至52(Δ49-52)，外显子48至52(Δ48-52)，外显子47至52(Δ47-52)，外显子45至52(Δ45-52)，外显子43至52(Δ43-52)，外显子42-52(Δ42-52)，外显子41至52(Δ41-52)，外显子40至52(Δ40-52)，外显子39至52(Δ39-52)，外显子38至52(Δ38-52)，外显子37至52(Δ37-52)，外显子36至52(Δ36-52)，外显子35至52(Δ35-52)，外显子34至52(Δ34-52)，外显子33至52(Δ33-52)，外显子32至52(Δ32-52)，外显子31至52(Δ31-52)，外显子30至52(Δ30-52)，外显子29至52(Δ29-52)，外显子28至52(Δ28-52)，外显子27至52(Δ27-52)，外显子26至52(Δ26-52)，外显子25至52(Δ25-52)，外显子24至52(Δ24-52)，外显子23至52(Δ23-52)，外显子21至52(Δ21-52)和外显子10至52(Δ10-52)的缺失，或外显子53的重复。

因此，该策略尤为使得可以考虑治疗不同确定形式的DMD，特别是与外显子52(Δ52)，外显子50至52(Δ50-52)，外显子49至52(Δ49-52)，外显子48至52(Δ48-52)，外显子47至52(Δ47-52)，外显子46至52(Δ46-52)，外显子45至52(Δ45-52)，外显子43至52(Δ43-52)和外显子10至52(Δ10-52)的缺失，或与外显子53的重复相关的那些DMD。

这项技术的挑战之一是稳定持久地将反义寡核苷酸导入至病肌纤维中。

已经考虑过直接以裸露的形式注射所述AON。然而，鉴于这些寡核苷酸在肌肉中具有很短的寿命，这种治疗模式需要定期的、相对限制性的注射。对这些寡核苷酸进行了化学上的修饰(吗啉代，2'O甲基，肌苷衍生物等)。该方法能有效地使其在体内稳定，从而改善其效率并使其注射间隔开来。然而，在高剂量下，这种类型的寡核苷酸可能是有毒的。

或者，已经尝试通过表达载体来原位表达这些序列，使得可以将它们传送到靶细胞中。已证明，腺相关重组病毒载体(或AAVr)特别适用于在肌肉中转导。这些载体使得携带编码AON的序列的表达盒能够在体内转移，并导致该AON在体内连续合成。因此，注射这些载体的优点在于能够长期恢复蛋白的表达。举例来说，Le Guiner等人(Molecular Therapy,2014,22(11)1923-35)报道了外显子跳读与重组AAV8联合使用的显著效率，即使是向营养不良的狗局部区域性(loco-régionale)施用3.5个月后。

在此背景下，在这些载体(其中***了反义序列)中使用源自snRNA(“小核苷酸RNA”)的序列能够限制AON的体内衰减，甚至能随时间更多地增加治疗效率。申请WO 2006/021724中特别描述了该策略，报道了使用U7型snRNA(U7snRNA)来转运靶向抗肌萎缩蛋白基因的AON。

snRNA的特征使其成为用于AON序列稳定核表达的高性能工具。事实上，相应的基因很小，在核水平上稳定持续地表达，并靶向转录的早期阶段(pre-mRNA)。在实践中，关于U7snRNA，这涉及在snRNA的Sm蛋白的结合位点中***AON序列，使得它们不再靶向组蛋白的前信使RNA，而是靶向目标靶基因的(一个或多个)外显子，从而阻断共有剪接位点，并能够修正或修改该基因的成熟。

此外，还建议在这些snRNA序列中添加称为“外显子剪接增强子”序列的序列，使参与剪接的因素相结合(特别是hnRNPA1蛋白，“异质性核糖核蛋白A1(heterogeneousribonucleoprotein A1)”)，从而进一步改善所观察到的治疗效果(Goyenvalle等人，MolTher.；17(7):1234–1240,2009)。

事实上，AON的选择至关重要，并已证明特别复杂，因此在载体的情况下，编码这些AON的序列的选择亦是如此。事实上，很难预测哪个序列会有效。取决于靶标外显子，有效序列似乎会有所不同，并且与相同的位点无关。这一现象使得AON序列的选择特别精细和麻烦，即使使用复杂的算法(Echigoya等人，Plos One，2015年3月27日，DOI:10.1371/journal.pone.0120058)。

因此，对于外显子53，已经提出了许多反义序列，其根据靶标外显子的区域和所讨论的寡核苷酸的大小而变化。例如，以下文献中提出了候选反义序列：WO2004/083446，WO2006/000057，US2010/0168212，WO2011/057350，WO2012/029986，WO2014/100714，US2014/315977，Popelwell等人(Mol Ther.2009 Mar；17(3):554-61；NeuromusculDisord.2010 Feb；20(2):102-10)。这些文献描述了以裸露或任意修饰的寡核苷酸形式(可能组合)测试的这些序列的可变功效。

鉴于临床挑战，仍然需要开发这样的优化工具：其靶向编码抗肌萎缩蛋白的信使RNA上的外显子53跳读，即，能够使所述外显子有效跳读，并高水平表达截短的、但具有潜在功能的相应蛋白。

发明目的

本发明旨在治疗或改善多种形式的杜兴氏肌营养不良症(DMD)，其中，使编码抗肌萎缩蛋白的信使RNA上的外显子53跳读能够获得一个截短的、但至少具有部分功能的蛋白。

所提出的解决方案基于根据其靶向的外显子区域及其大小而谨慎选择的反义寡核苷酸(AON)。将相应的序列引入一个高效表达***中，所述表达***由腺相关重组病毒载体(AAVr)组成，有利地含有snRNA，优选U7型，有利地在Sm蛋白的结合位点处被修饰。

在不含外显子53的转录本的表达和截短型抗肌萎缩蛋白的生产方面，这种载体化的反义寡核苷酸已经可以获得对于申请人的认知而言从未达到的功效，因此构成了一种非常有前景的临床工具。

定义

以下定义对应于在本发明的背景中通常使用的含义，并且除非明确指出另一定义，否则应该予以考虑。

在本发明的含义下，冠词“一”和“一个”用于指代事物的一个或多个(例如，至少一个)语法主题单位。如举例来说，“一个要素”是指至少一个要素，即，一个或多个要素。

在提及可测量的值(例如数量、持续时间和其他类似的值)时使用的术语“约”或“近似”，必须被理解为涵盖给定值的±20％或±10％，优选±5％，更优选±1％，特别优选±0.1％的测量不确定度。

区间：贯穿本说明书，本发明的各种特征可以以数值的区间形式呈现。必须理解的是，以区间形式来描述数值仅旨在使得阅读更容易，并且不能被解释为对本发明的范围的严格限制。因此，数值区间的描述应被视为具体公开了所有可能的中间区间，以及该区间内的每个值。例如，对从1到6这一区间的描述应该被认为是具体描述了其包括的每个区间，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及在该区间内的每个值，例如1，2，2.7，3，4，5，5.3和6。无论区间的范围如何，该定义都是有效的。

术语“分离的”在本发明的背景中必须被理解为与从其天然环境或状态中取出或移除同义。例如，分离的核酸或肽是从其通常存在的天然环境中提取出来的核酸或肽，例如，无论其涉及植物或活体动物。因此，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是本发明含义内的分离的核酸或肽，而与其天然背景中存在的其他元素部分或完全分开的相同核酸或肽，则是本发明含义内的“分离的”。分离的核酸或肽可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如宿主细胞中。

在本发明的背景中，以下缩写用于最常见的核酸碱基。“A”指腺苷，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟苷，“T”指胸苷，“U”指尿苷。

除非另有说明，否则在本发明的含义内，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”是指编码氨基酸序列的所有核苷酸序列，包括使得能够获得所述氨基酸序列的简并核苷酸序列。编码蛋白质或RNA或cDNA的核苷酸序列可以任选地包含内含子。

术语“编码”(“coding”或“coding for”，“code”或“code for”)指多聚核苷酸中具体核苷酸序列，例如基因、cDNA或mRNA，用作合成生物过程中的其他聚合物或大分子的模板的固有性质，其具有限定的核苷酸序列(例如rRNA，tRNA和mRNA)，或者限定的氨基酸序列，以及由此产生的生物学特性。因此，如果基因所对应的mRNA能在细胞或另一生物体系中转录和翻译产生蛋白，则该基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，并且通常在序列表和数据库中描述)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)均可以被称为编码蛋白质或该基因或cDNA的另一种产物。

在本发明的背景中使用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸的链。此外，核酸是核苷酸聚合物。因此，如在本发明的背景中使用的术语核酸和多核苷酸是可互换的。在分子生物学和基因工程领域众所周知，核酸是可以水解成单体的多核苷酸。单体形式的核苷酸可以被水解成核苷。如在本发明的背景中所用，术语多核苷酸非限制性地指任意类型的核酸分子，即，其中核酸分子可以通过本领域可用的任意手段获得，包括通过重组手段，即通过使用普通克隆技术(如PCR)或通过合成从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列。

在本发明的背景中，术语“寡核苷酸”是指这样的多核苷酸：其大小优选不超过100个核苷酸(或碱基)，或者甚至不超过95，80，75，70，65，60，55或甚至50个核苷酸(或碱基)。

在本发明的含义内，术语“肽”，“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指由通过肽键共价结合的氨基酸残基构成的化合物。根据定义，蛋白质含有至少两个氨基酸，对于最大氨基酸数目没有限制。多肽无差异地包括几种肽和/或蛋白质，所述肽和/或蛋白质又包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸。如此处所用，该术语既指短链，例如，其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚物，又指较长的链，其在本领域中通常称为蛋白质，存在许多类型的蛋白质。“多肽”例如包括生物活性片段，基本上同源的多肽，寡肽，同源二聚体，异源二聚体，多肽变体，修饰的多肽，衍生物，类似物，融合蛋白等等。多肽包括天然肽，重组肽，合成肽，或其组合。

术语“一致”或“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列一致性。当所比较的两个序列的每一个序列中的一个位置均被相同的氨基酸单体碱基或亚单位占据时(例如，当两个DNA分子的每个分子中的一个位置均被腺嘌呤占据时)，则该分子在这一位置上是同源的或一致的。两个序列之间的一致性百分比取决于两个序列共有的相应位置的数量，并且对应于该数量除以所比较的位置数量并乘以100。例如，如果两个配对序列中10个位置中有6个位置一致，那么这两个序列具有60％的一致性。作为一般规则，通过比对两个序列来进行比较，以提供最大的同源性/同一性。

本发明含义内的“载体”是分子构建体，其包含分离的核酸，并且其可用于将分离的核酸递送至细胞内部。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸，与离子型或两亲化合物相关的多核苷酸，质粒和病毒。因此，术语“载体”例如是指具有自主复制能力的质粒或病毒。该术语还必须被解释为包含有助于将核酸转移至细胞中的非质粒或非病毒化合物，例如聚赖氨酸、脂质体等化合物。特别地，病毒载体的实例包括腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。特别地，表达载体包含以顺式起作用的表达元件；其中用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或通过体外表达***提供。本发明含义内的表达载体包括本领域已知的所有表达载体，如引入了重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸体或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒，逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒)。

如本文所用的术语“启动子”被定义为由细胞的合成装置或引入的合成装置所识别的DNA序列，这对于启动多核苷酸序列的特异性转录而言是必需的。

在本发明的含义内，术语“启动子/调节子序列”是指表达与启动子/调节子序列可操作地连接的多核苷酸所必需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是启动子的碱基序列，而在其他情况下，该序列还可以包含用于表达多核苷酸的激活子序列和其他调节子元件。启动子/调节子序列可以是，例如，使得多核苷酸能够组织特异性表达(即，优选在该组织中产生)的序列。

在本发明的含义内，“组成型”启动子是这样的核苷酸序列：当其与多核苷酸可操作性地连接时，导致多核苷酸在细胞的大部分或所有生理条件下表达。

在本发明的含义内，“诱导型”启动子是这样的核苷酸序列：当其与多核苷酸可操作性地连接时，仅当细胞中存在启动子的诱导物时，才会导致多核苷酸的表达。

“组织特异性”启动子是这样的核苷酸序列：当其与多核苷酸可操作性地连接时，导致多核苷酸在细胞中表达，优选如果该细胞是对应于启动子的组织类型的细胞。

在本发明的含义内，当提及生物体、组织、细胞或其组分时，术语“异常的”是指这些生物体、组织、细胞或其组分与相应的所谓“正常的”生物体、组织、细胞或组分中的预期特征相比，至少有一项可观察或可测定的特征(例如年龄，治疗，一天中的时间等)不同。

术语“患者”，“受试者”，“个体”和同义词在本发明的背景中可互换使用，并且指动物，优选哺乳动物。在某些非限制性实施方案中，动物是人。它还可以是小鼠，大鼠，猪，狗或非人灵长类动物(NHP)，如猕猴。

在本发明的含义内，“疾病”或“病理学”是动物的这样的健康状况，其中后者的稳态发生了改变，并且如果不治疗该疾病，则会继续恶化。相反，在本发明的含义内，“病症”是这样的健康状况：其中动物能够维持其稳态，但动物的健康状况不如没有该病症时那样良好。如果不进行治疗，病症不一定会导致动物的健康状况随时间恶化。

在本发明的背景中，如果疾病或病症的症状的严重程度、或受试者感受到症状的频率、或这两者均有所降低，则疾病或病症“减轻”或“改善”。这还包括疾病进展的消失，即，健康状况恶化停止。如果疾病或病症的症状的严重程度、或受试者感受到该症状的频率、或这两者均消除，则疾病或病症被“治愈”。

在本发明的背景中，“治疗性”治疗是对具有病理学症状的受试者施用的、以减少或消除这些症状为目的的治疗。

在本发明的背景中，“疾病或病症的治疗”是指降低受试者疾病或病症的至少一种症状的频率或严重程度。

在本发明的含义内，化合物的“有效量”是足以使施用了该化合物的受试者获得有益效果的化合物的量。“治疗有效量”这一表述是指足以或有效预防或治疗(换句话说，延缓或防止出现，防止发展，抑制、减少或逆转)疾病或病症(包括缓解该疾病或病症的症状)的量。

发明详述

根据第一方面，本发明涉及一种腺相关重组病毒载体(AAVr)，其包含编码反义寡核苷酸(AON)的序列，所述反义寡核苷酸针对抗肌萎缩蛋白的前信使RNA(pre-mRNA)的外显子53的+30至+69区域的至少33个碱基的片段。

在本申请的背景中，如下所述，术语“针对”，“靶向”，“与......杂交”和“与...互补”等同使用。

本发明的AAVr载体通常包含2种组分：

-包装的重组核酸序列，也称为“AAVr的基因组”。该重组核酸序列包含编码AON的序列，当在靶细胞/组织中表达时，该AON产生治疗效果，在此处所述治疗效果为抗肌萎缩蛋白的pre-mRNA的外显子53跳读；

-允许基因转移以及某种组织趋向性的病毒衣壳。

根据本发明，AAVr载体的基因组因此包含编码反义寡核苷酸的序列，或AON。该序列优选呈现DNA形式，并且使得能够表达这样的AON：所述AON能够与靶pre-mRNA杂交，所述靶pre-mRNA在此处为抗肌萎缩蛋白的pre-mRNA的外显子53。

典型地，根据本发明，反义寡核苷酸能够使抗肌萎缩蛋白的信使RNA上的外显子53跳读。必须理解，使用本发明的AON来使外显子53跳读，是在抗肌萎缩蛋白的前信使RNA的剪接阶段完成的。以本技术领域已知的方式，所选AON靶向参与剪接的区域，并与之杂交。在存在这种AON的情况下，被AON“掩蔽”的剪接位点不被细胞装置识别，使得靶外显子不被整合到所产生的信使RNA中，因此被“跳读”。

在本发明的背景中，“抗肌萎缩蛋白前信使RNA”或“抗肌萎缩蛋白pre-mRNA”是指如在剪接步骤之前所获得的编码抗肌萎缩蛋白的基因的转录产物。

本发明靶向编码抗肌萎缩蛋白的任意基因，或包含这种基因的任意生物体，其外显子53的跳读可能是感兴趣的，即，产生较短、但至少具有部分功能的蛋白质。根据一个优选的实施方案，靶基因是人抗肌萎缩蛋白基因。人抗肌萎缩蛋白基因已有详细记载：其大小为2.7Mb，含有79个外显子。其完整序列可在数据库中获得，例如，在NCBI数据库中参考GeneID：1756，或Ensembl数据库中参考ENSG00000198947。

在本发明的背景中，“抗肌萎缩蛋白前信使RNA”优选指人源抗肌萎缩蛋白的pre-mRNA，换句话说，人抗肌萎缩蛋白的pre-mRNA。

人抗肌萎缩蛋白的pre-mRNA的序列是众所周知的，并且具体地可以使用上述与整个基因有关的参考内容获得。

更具体地，本发明目标在于人抗肌萎缩蛋白的pre-mRNA的外显子53。以已知的方式，后者由212个碱基或核苷酸组成，并具有以下序列SEQ ID NO：1：

在本发明的含义内，下面描述的区域通过核苷酸相对于抗肌萎缩蛋白的pre-mRNA的外显子53序列(即序列SEQ ID NO：1)的位置鉴定。

在说明书的其余部分中，所使用的编号因此基于序列SEQ ID NO：1，应理解AON必然且按定义具有与其靶标互补的序列。实际上，本发明载体中包含的、编码AON的序列可以是，例如，对应于抗肌萎缩蛋白的pre-mRNA的外显子53中的靶区域的反向互补的序列。然而，正如下面将概述的那样，只与靶区域的片段杂交的AON，或与该区域杂交(尽管存在错配)的AON也能够具有效果。因此必须理解，本发明编码AON的序列包含或由如下序列组成：所述序列与靶区域的互补序列(如在本发明的含义内所定义的)，或与该靶区域的至少一个片段的互补序列具有至少一定的百分比一致性。

根据第一个特征，本发明的AON靶向抗肌萎缩蛋白pre-mRNA的外显子53的+30至+69区域，即，具有40个碱基的区域，其序列为：

g tacaagaaca ccttcagaac cagaggcaac agttgaatg

优选地，AON针对所述区域的至少33个碱基(或核苷酸)的片段。换句话说，该反义序列与由40个核苷酸组成的这一区域的至少33个连续的核苷酸杂交。

在本发明的含义内，当寡核苷酸与靶序列在确定的中等或有利地高度严格条件下形成双链pre-mRNA分子时，所述寡核苷酸被称为与靶序列杂交。

严格条件通常取决于实验条件，如温度、离子力和在反应介质中变性剂(如甲酰胺)的浓度。这些条件及其可能的变化是本领域技术人员所熟知的。特别地，高度严格条件的实例包括在65-68℃下用包含氯化钠(0.015M)和柠檬酸钠(0.0015M)的组合物进行杂交和洗涤操作(参见Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning.A LaboratoryManual,2nd Ed,Cold Spring Harbor Laboratory,NY 1989)。中等严格条件可对应于在这些相同组合物中进行杂交和洗涤操作，但是在较低温度下，通常在50至65℃之间。

换句话说，寡核苷酸必须与靶序列具有足够的一致性以使得两条链能够匹配。一旦两个序列一致，则可以提供这一点，但是在存在一个或多个(具体地，2，3，4或5个)不同核苷酸的情况下，优选当不同核苷酸位于序列内时，这一点也可能发生。就一致性而言，寡核苷酸优选与靶区域具有至少70％，75％，80％，85％或甚至90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％的一致性，甚至更优选具有100％的一致性。因此，优选地，本发明编码AON的序列或所述AON包含或由这样的序列组成：所述序列与序列SEQ ID NO：1的核苷酸+30至+69区域的互补序列具有至少70％，75％，80％，85％或甚至90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，甚至更优选具有100％的一致性。

根据一个特定实施方案，AON针对序列SEQ ID NO：1的+30至+69核苷酸区域的大于33个(即34，35，36，37，38，39或甚至40个)碱基的片段。根据一个优选的实施方案，所述寡核苷酸与序列SEQ ID NO：1的整个+30至+69区域杂交。术语“杂交”应理解为如上所定义的，即，涵盖寡核苷酸与靶区域之间完全一致的情况，但也涵盖存在一个或多个错配的情况。因此，优选地，本发明编码AON的序列包含或者由以下序列组成：所述序列为序列SEQ ID NO：1的+30至+69核苷酸区域的互补序列，或序列SEQ ID NO：1的+30至+69核苷酸区域的大于33个(即34，35，36，37，38，39或甚至40个)碱基的片段的互补序列。因此，优选地，本发明编码AON的序列或所述AON包含或由这样的序列组成：所述序列与靶区域的互补序列，或与序列SEQ ID NO：1的+30至+69核苷酸区域的大于33个(即34，35，36，37，38，39或甚至40个)碱基的片段的互补序列，具有至少70％，75％，80％，85％或甚至90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，甚至更优选具有100％的一致性。

根据另一个实施方案，AON可针对靶区域两侧的延伸区域。因此，由所述序列编码的AON可以与超出外显子53的+30至+69区域之外的5'和/或3'延伸区域杂交，在优选条件下，就外显子53跳读而言，该AON所具有的效力至少等于在AON针对序列SEQ ID NO：1的+30至+69核苷酸区域的大于33个碱基的片段中所观察到的，或甚至在AON针对序列SEQ ID NO：1的+30至+69核苷酸区域中所观察到的效力。

根据本发明，编码目标反义寡核苷酸的序列的大小至少等于外显子53中靶向的片段的大小，即至少33个核苷酸。

如果靶片段具有更大的大小，具体地可以在34至40个核苷酸之间变化，则本发明编码AON的序列具有至少相等的大小，即至少34，35，36，37，38，39或甚至40个碱基。根据一个具体实施方案，本发明编码AON的序列由34个碱基组成，优选35个，或甚至36，37，38或39个碱基。根据一个优选的实施方案，本发明编码AON的序列由40个核苷酸组成。

根据另一个具体实施方案，在本发明背景中实施的编码AON的序列的大小小于70个碱基，或者甚至小于或等于65，60，55，50或甚至45，44，43，42或41个碱基。

根据一个特定的实施方案，包含在本发明的AAVr中的、编码反义核苷酸的序列包含或由序列SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4组成，优选为SEQ ID NO：3。

更具体地：

-序列SEQ ID NO：3(其在实施例中被称为“JR53”或“5902”)对应于40个核苷酸的序列，所述序列编码靶向抗肌萎缩蛋白pre-mRNA外显子53的+30/+69区域的AON；

-序列SEQ ID NO：4(其在实施例中被称为“N3”或“5901”)对应于33个核苷酸的序列，所述序列编码靶向抗肌萎缩蛋白pre-mRNA外显子53的+33/+65区域的AON。

根据一个优选实施方案，所述寡核苷酸针对抗肌萎缩蛋白基因的外显子53的整个+30至+69区域。因此，根据一个具体实施方案，本发明AAVr中包含的、编码AON的序列的大小为40个碱基，并且具有序列SEQ ID NO：3。或者，其包含序列SEQ ID NO：3。

典型地，根据本发明，编码反义寡核苷酸的序列或AON由AAVr载体携带或传递。换言之，编码反义寡核苷酸的序列或AON被含有或包含在AAVr基因组中。

重组腺相关病毒载体(AAVr)现在被认为是转移基因的高性能工具，被用来治疗许多疾病。AAVr载体具有一定数量的特征，使其适用于基因治疗，特别是不具有致病性、适度的免疫原性能力以及稳定有效地转导有丝***后细胞和组织的能力。可以通过对AAV的血清型、启动子和施用方式进行适当选择，来进一步使AAVr载体所传递的特定基因在一种或多种细胞类型中靶向表达。

AAVr源自AAV病毒的基因工程修饰。目前已知有100多种天然血清型的AAV。AAV的衣壳存在许多天然变体，其使得能够生产和使用特定AAVr，该特定AAVr具有特别适用于肌营养不良症的特征。可以通过使用传统的分子生物学技术来产生AAVr载体，使得能够对AAV病毒进行优化以用于核酸分子的特定细胞递送，以使免疫原性最小化，调整颗粒的稳定性和寿命，用于有效降解，以及用于在核水平上进行运输。如上所述，由于其无毒性、能有效转移DNA以及针对特定目的而对其进行优化的可能性，所以使用AAVr是一种典型的递送外源DNA的方法。

在从人或非人灵长类动物中分离的、良好表征的AAV血清型中，人血清型2型是第一种用于生产用于基因转移的AAVr载体的AAV。AAVr载体生产中常用的其他AAV血清型包括AAV1，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV11和AAV12。

AAV的病毒基因组由约5000个核苷酸组成，包含编码调节蛋白和复制蛋白(rep)的基因和编码结构蛋白(cap)的基因。基因组顺式复制所必须的序列及其包装包含在基因组每个末端的130至145位核苷酸片段中(用于反向末端重复的ITR)。

从这些病毒中，还可以产生并使用大量重组载体和嵌合(杂交体)AAVr。

对于载体组装而言有用的AAV片段包括cap蛋白，特别是vp1，vp2，vp3和高变区，rep蛋白，包括rep 78，rep 68，rep 52和rep 40，以及编码这些蛋白的序列。这些片段可用于各种载体***和宿主细胞。

在AAVr生产的背景下，这些片段可以单独使用，与其他AAV血清型的序列和片段组合使用，与其他AAV的元件或与不是来源于AAV的病毒序列组合使用。在本发明的背景下，合适的AAV包括但不限于包含非天然衣壳蛋白的修饰型AAVr。可以使用任意合适的技术，通过使用选定的AAV序列(例如，vp1衣壳蛋白的片段)与异源序列(其可从不同的选定AAV血清型、相同AAV血清型的非连续部分、非AAV病毒来源或非病毒来源获得)的组合，来产生这样的人造衣壳。人造AAV血清型可以是但不限于嵌合型AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。AAV或人造AAV的这种实例包括AAV2/8(US7,282,199)，AAV2/5(可从美国国立卫生研究院获得)，AAV2/9(WO 2005/033321)，AAV2/6(US 6,156,303)和AAVrh8(WO 2003/042397)等等。根据一个实施方案，用于本发明组合物和方法的载体至少含有编码选定AAV血清型的衣壳(例如AAV8衣壳)的序列，或其片段。根据另一个实施方案，可用的载体至少含有编码选定AAV血清型的rep蛋白(例如AAV8rep蛋白)的序列，或其片段。任选地，这种载体含有AAV的cap蛋白和rep蛋白。在rep和cap均存在的载体中，AAV rep蛋白和cap蛋白的序列可以源自相同的AAV，例如全部来自AAV8。或者，可以使用这样的载体：其中rep序列所来自的AAV血清型与cap序列的不同。在一个实施方案中，rep序列和cap序列由不同来源(例如不同载体、或宿主细胞和载体)表达。在另一个实施方案中，这些rep序列与不同血清型AAV的cap序列同相融合以形成嵌合型AAVr载体，例如AAV2/8(US 7,282,199)。

可以从AAV制备重组AAV基因组，其中编码病毒蛋白(rep和cap)的基因被删除，仅保留两个ITR重复序列。生产重组载体需要繁殖并包装这些重组基因组。这一步通常在这样的培养细胞中进行：该细胞转染了目标重组基因组以及编码缺失的rep蛋白和cap蛋白的质粒(cap蛋白能够形成衣壳)。可以使用重组基因组和来自相同或不同血清型的rep基因和cap基因。因此，可以具有多种组合。

如果血清型相同，则仅指示载体所对应的血清型。如果血清型不同，会获得所谓的杂合AAVr载体，则指示其所使用的血清型。例如，血清型2型AAVr载体被理解为源自单一血清型2型。相反，血清型2/8型AAVr载体则是这样的载体：其使用源自血清型2型AAV的重组基因组，而编码所用衣壳蛋白的基因对应于血清型8型AAV的基因。

已经显示，AAV病毒的衣壳以及AAVr载体通常与特定的细胞或组织趋向性(tropism)有关。

根据本发明，所实施的AAV优选基于血清型2型(AAV2)、8型(AAV8)或9型(AAV9)AAV。以适当的方式来选择衣壳，以使得肌肉(无论是骨骼肌、心脏肌还是平滑肌)能够有效或甚至优先转导。因此，优选地，所实施的AAV优选是选自以下组的AAV：AAV2/1，AAV2，AAV2/6，AAV2/8，AAV2/9，AAV2/10。优选地，载体是AAV8载体，更优选是AAV2/8载体。

关于在本发明背景中所实施的AAVr载体，AAV基因组可以是单链核酸、双链核酸或自身互补的核酸。

AAVr载体的生产是本领域技术人员所熟知的，并且可以通过对HEK 293细胞进行双重转染或三重转染、通过单纯疱疹病毒***或使用杆状病毒***来进行。优选地，通过对HEK293细胞进行双重转染或三重转染或使用杆状病毒***来获得该颗粒。

根据一个特定实施方案，本发明的载体还含有或包含编码修饰型snRNA的序列。更具体地，将本发明编码反义寡核苷酸(AON)的序列引入或***到编码snRNA的序列中。换句话说，优选地，本发明的载体包含编码反义寡核苷酸的序列，所述编码反义寡核苷酸的序列又包含在编码修饰型snRNA的序列中。该实施方案能够使包含修饰型snRNA的寡核苷酸得以表达，在所述修饰型snRNA中整合了AON。如上所述，将AON整合到修饰型snRNA中导致所得寡核苷酸稳定表达，并进一步使得这些寡核苷酸核表达。

snRNA(“小核RNA”)是小RNA，存在于细胞核中，参与信使pre-RNA的某些成熟步骤。它们被称为U1，U2，U3……直至U13。众所周知，天然snRNA包含信使pre-RNA的特定反义区域，其提供了所述信使pre-RNA的成熟。该序列允许与靶向信使pre-RNA杂交。此外，编码天然snRNA的区域(即，实际转录的序列)尤其包含称为sm的结构域，其编码Sm蛋白(“小核核糖核蛋白”)的结合位点。该结构域对于snRNA的前信使RNA的成熟活性是必不可少的(Grimm等人，EMBO J.,1993,12(3):1229–1238)。编码天然snRNA的区域还包含编码茎环形式的序列，对此已经证明它稳定了snRNA与待成熟的pre-mRNA之间的相互作用，从而促进剪接(Sharma等人，Genes Dev.,2014,28(22):2518–2531)

在本发明的背景中，“编码修饰型snRNA的序列”是指具有snRNA的功能基因的天然序列的寡核苷酸，其中涉及snRNA初始功能的序列被失活和/或被修饰，优选地通过***本发明的编码AON的序列。在本发明的含义内，“功能基因的天然序列”是指包含编码snRNA的区域的内源基因的部分(即被转录的序列)，以及5'和3'调节区域，以及特别地，snRNA的天然启动子。

优选地，编码修饰型snRNA的序列编码U7型snRNA。根据该实施方案，对Sm蛋白的结合位点的序列进行修饰，优选地通过***本发明的编码AON的序列，从而使编码组蛋白的前信使RNA的成熟失活。

如有关U7型snRNA所述，可以对Sm蛋白的结合位点的序列进行进一步修饰，从而提高snRNA的核浓度，例如用优化的序列代替，优选Schümperli et Pillai所述的smOPT序列(Cell.Mol.Life Sci.60:2560–2570,2004)。

相反地，为了促进所期望的剪接，编码茎环形式的序列优选是天然的。换句话说，优选地其未被修饰。

如上所述，在本发明的背景中实施的修饰型snRNA优选不具有靶向由该snRNA靶向的信使pre-RNA的特异性天然反义序列，在本案中，对于U7snRNA，为组蛋白的前信使RNA。优选地，该序列被编码目标反义寡核苷酸的序列取代，在此处所述目标反义寡核苷酸靶向抗肌萎缩蛋白的pre-mRNA的外显子53的+30和+69碱基之间所包含的区域。

在本发明的含义中，编码修饰型snRNA的序列可以进一步被修饰，从而用另一启动子的序列(例如另一种类型的snRNA的启动子序列)来替换snRNA启动子的天然序列。举例来说，根据本发明，“编码修饰型U7型snRNA的序列”是指经历了上述修饰但包含snRNA U7的天然启动子的、编码U7型snRNA的序列。可以用另一种snRNA的启动子，例如U1型、U2型或U3型的启动子，或用适合于执行本发明的任意其他启动子来替换该启动子。各种snRNA启动子是众所周知的，特别已由Hernadez(J Biol Chem.；2001,276(29):26733-6)描述。

在本发明的背景中，在不同类型的snRNA中，优选使用U7型(U7snRNA)，其通常参与编码组蛋白的前信使RNA的成熟。

在此背景下，已经进一步表明，当与snRNA携带的反义寡核苷酸融合时，一个被称为“亲吻结构域(kiss domain)”的特定结构域使得能够与snRNA的茎环形式杂交。这种杂交引起修饰型snRNA的二级结构的改变，这改善了其与剪接所需的分子装置的相互作用。在申请WO 2011/113889中特别描述了该结构域，其内容必须被认为是本申请的一部分。因此，可以将如此文件中所述的编码“亲吻结构域”的序列，整合到本发明的编码修饰型snRNA的序列之中。

实践中，可以使用基因工程中的标准技术，如PCR定向诱变，来将这些各种修饰引入到编码snRNA的序列中。

应该指出，snRNA序列在不同物种之间高度保守。因此，本发明的载体中使用的、编码修饰型snRNA的序列可以是人源或鼠源的。优选地，本发明中使用的、编码修饰型snRNA的序列是鼠源的。

本发明的编码snRNA(其中***了编码目标AON的序列)的典型构建优选包括：

-编码U7 snRNA的基因的5'非翻译区域，特别是包含启动子，优选是鼠源的，例如序列SEQ ID NO：2的1至258位核苷酸所示；

-编码AON的序列，所述AON针对抗肌萎缩蛋白的pre-mRNA的外显子53的+30至+69区域。例如，序列SEQ ID NO：2的259至298位核苷酸说明了这样的序列，其编码具有40个碱基的寡核苷酸(在实施例中称为JR53)，具有序列SEQ ID NO：3。然而，该反义序列例如可以被序列SEQ ID NO：4替换；

-Sm蛋白的修饰型结合序列，例如smOPT序列，其对应于SEQ ID NO：2序列的299至309位核苷酸；

-编码茎环形式的序列，其是未经修饰的，并且优选是鼠源的，其对应于序列SEQID NO：2的310至340位核苷酸；

-U7 snRNA的3'非翻译区域，优选是鼠源的，例如序列SEQ ID NO：2的341至442位核苷酸所示。

优选地，编码目标反义寡核苷酸的序列被整合在Sm蛋白的修饰型结合序列的上游，即在smOPT序列的上游。

如上所述的(优选U7型)，并且整合了本发明含义内的目的反义寡核苷酸的修饰型snRNA，可以例如具有序列SEQ ID NO：2。

应该注意的是，可以向上述构建体中整合其他序列。特别地，可以将其他序列整合到携带编码目标AON的序列的修饰型snRNA中，优选自所述序列的上游或下游。特别可以考虑***至少一个编码另一个目标AON的序列，所述另一个目标AON针对外显子53的另一个区域，或能够使抗肌萎缩蛋白的另一个外显子跳读，其跳读也是感兴趣的。

在本发明的背景中，编码修饰型snRNA(其携带编码目标AON的序列)的序列优选被***AAV(例如血清型2型)的2个ITR序列之间。相应的构建体例如如序列SEQ ID NO：10所示。

应该注意的是，鉴于在本发明的背景中所考虑的构建体的大小和AAV包装能力，可以考虑在本发明的AAVr载体的两个ITR序列之间整合其他构建体：

-引入编码本发明构建体的序列(snRNA，其中引入了编码目标AON的序列)，例如序列SEQ ID NO：2，的一个或多个额外拷贝(例如1至9个，优选1至3个)；

-引入一个或多个编码修饰型snRNA的其他序列，所述修饰型snRNA携带至少一个编码另一目标AON的序列，所述另一目标AON针对外显子53的另一区域，或使得抗肌萎缩蛋白的另一个外显子跳读，其跳读也是感兴趣的。

换句话说，为了改善外显子跳读，本发明的AAVr载体可以包含数个编码反义寡核苷酸的序列。可以考虑不同的实施方案，它们不是互相排斥的。根据第一个实施方案，AAVr载体包含几种修饰型snRNA，这些snRNA中的每一种均包含编码反义寡核苷酸的序列。根据第二个实施方案，AAVr载体包含单个修饰型snRNA，其包含数个编码一种或多种反义寡核苷酸的序列。在该实施方案中，应理解，AAVr可以包含数个编码相同反义寡核苷酸的序列和/或编码不同反义寡核苷酸的序列。

本发明还包括任意类型的分离的细胞，所述分离的细胞被上述AAVr载体转导。优选地，其涉及肌细胞，特别是例如肌纤维(肌管)或肌肉前体(成肌细胞)。根据一个具体的实施方案，需要破坏人类胚胎的人类胚胎细胞从该范围中排除。

所要求保护的范围还包括被所述载体转导的分离的肌肉组织或非人类生物体。在非人类生物体中，动物是优选的。

本申请首次描述了所要求保护的载体的潜在治疗应用。因此，本发明还涉及药物组合物，其包含作为活性成分的至少一种如本申请中所定义的AAVr载体，以及该载体作为医用药物的用途。

根据另一方面，本发明涉及一种组合物，优选药物组合物或药物，其包含如上所述的AAVr载体，和致力于治疗相同疾病或另一种疾病的潜在的其他活性分子(其他基因治疗产品，化学实体，肽，蛋白等)。

因此，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的核酸，在此处所述核酸是本发明的AAVr载体。这种组合物包含治疗有效量的本发明的载体和药学上可接受的惰性赋形剂。根据一个特定的实施方案，“药学上可接受的”这一表述是指由联邦或州管理机构批准的，或在美国或欧洲药典中列出的，或任意其它药典认为人类和动物可接受的。术语“赋形剂”或“媒介物”是指与治疗剂一起施用的稀释剂，佐剂，载体或支持物。这样的药物赋形剂可以是液体，优选是无菌的，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当组合物静脉内施用时，水是优选的赋形剂。盐溶液、右旋糖水溶液、甘油溶液也可以用作液体赋形剂，特别是在可注射溶液的情况下。药学上可接受的赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油酯，滑石，氯化钠，甘油，丙二醇，水，乙醇等。

如果需要，所述组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以呈现溶液，悬浮液，乳液，延长释放制剂等形式。药学上可接受的赋形剂的实例例如描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。这种组合物含有治疗上有效量的活性成分，优选以纯化形式，和适量的赋形剂，从而获得对于患者而言适当的施用形式。

根据一个优选的实施方案，所述组合物根据适合于人体静脉内施用的药物组合物的典型程序进行配制。传统上，用于静脉内施用的组合物是在等渗无菌水性缓冲液中的溶液。如果需要，所述组合物还可以含有增溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。

根据一个实施方案，本发明的组合物适合于向人类施用。所述组合物优选为液体形式，优选为盐水组合物的形式，更优选地为含有磷酸盐缓冲盐水(PBS)或乳酸林格(Ringer-Lactate)溶液的组合物形式。

能有效治疗营养不良疾病的本发明治疗剂(在此处为重组载体)的量，可以通过标准临床方案来确定。此外，可以任选地进行体外和/或体内测定以帮助确定最佳剂量值。在组合物中使用的确切剂量还可以取决于所选择的施用途径、施用频率、患者的体重和/或年龄、疾病的严重程度，并且必须由医师根据每位患者的具体情况决定。

适当的施用模式必须能够将治疗有效量的活性成分递送至靶组织，尤其是递送至骨骼肌，任选地递送至心脏和横膈膜。在本发明的特定背景中，当活性成分是重组AAV载体时，治疗剂量根据每千克(kg)患者施用的病毒颗粒(vg，“病毒基因组”)的量来定义。

合适的量必须以适当的方式使得能够实现以下效果：

-抗肌萎缩蛋白转录本的至少10％，或甚至20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或甚至100％的外显子53跳读。这可以使用本领域技术人员已知的任意技术来评估，例如通过RT-PCR；

-产生截短的抗肌萎缩蛋白(至少缺少由外显子53编码的部分)，其代表健康生物体中正常产生的抗肌萎缩蛋白的至少5％，或甚至10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或甚至100％。这可以使用本领域技术人员已知的任意技术来评估，例如通过蛋白印迹。

在实践中，特别是在全身施用的情况下，组合物的施用剂量优选低于或等于10¹⁵vg/kg，甚至10¹⁴vg/kg。其可以在10¹²vg/kg和10¹⁴vg/kg之间，优选在2.10¹²vg/kg和5.10¹³vg/kg之间。以已知的方式，鼓励能获得令人满意的结果的尽可能低的剂量，从而尤其是避免毒性或免疫反应问题。

可用的施用途径有外用(topical)(局部(local))，肠内(一般效果，但通过胃肠(GI)道递送)或肠胃外(全身作用，但通过非胃肠道途径递送)。本发明组合物的优选施用途径是肠胃外途径，包括肌内施用(在肌肉中)和全身施用(在循环***中)。在这一背景中，术语“注射”(或灌注)包括血管内施用，特别是静脉内(IV)和肌内(IM)。通常使用注射器或导管来进行注射。

根据一个具体实施方案，组合物的全身递送包括在治疗部位，例如在虚弱肌肉的静脉或动脉处，局部施用组合物。涉及产生全身效果的局部施用的这种施用技术，通常被称为局部区域性(loco-régionale)施用，已被证明其特别适合治疗肌肉病理学。在实践中，这可能涉及在患者的一个肢体(腿或手臂)上进行动脉或静脉施用，由于放置止血带而在压力下完成，例如由Zheng等人(Mol.Therapy,2012,20(2):456-461)、Toromanoff等人(Mol.Therapy,2008,16(7):1291-99)和Arruda等人(Blood,2010,115(23):4678-88)所述。

除了局部区域性施用以外，本发明的一种有利的施用模式是全身施用。全身施用能够达到整个身体，尤其是患者的所有肌肉，包括心脏和横膈膜。

根据一个有利的实施方案，通过将组合物注射到血管中，即通过血管内施用(动脉内或静脉内)来进行全身施用。特别地，组合物可以通过静脉注射在外周静脉中施用。或者，全身施用可以是肌内注射。

全身施用在以下传统条件下，以本领域技术人员已知的方式进行：

-流速在1至10mL/min之间，优选在1至5mL/min，例如3mL/min；

-每kg患者注射载体化制剂(vectorial preparation)的总体积在1至10mL之间，优选等于5mL。注射体积优选不应占总血容量的10％，优选约6％以上。

单次施用本发明的组合物可证明是足够的。然而，可以考虑在不同条件下进行多次施用，具体为：

-通过相同的施用途径重复施用相同的载体；

-在不同部位，特别是在不同肢体施用相同的载体；

-施用不同的重组载体，所述不同的重组载体就其血清型或编码所递送的AON的序列而言有所不同。

根据一个实施方案，观察到本发明AAV载体的存在以及相关的有益治疗效果能持续至少1个月、或3个月、或6个月、或1年、或2年、或5年或10年、或者甚至在患者的整个一生中。

如上所述，患者优选是人类，特别是儿童、青少年或年轻成人。然而，本发明的治疗工具可以适用于治疗其他动物，特别是猪和小鼠。

这种药物尤其旨在治疗营养不良性疾病。在本发明的背景下，营养不良性疾病是指与抗肌萎缩蛋白基因缺陷有关的疾病。更具体地说，其涉及这样的缺陷：对于该缺陷，外显子53跳读能够使阅读框重建并产生假定的(granted)、截短的、但具有功能的抗肌萎缩蛋白。相对于本发明，截短的、但具有功能的抗肌萎缩蛋白是指尺寸小于天然蛋白的蛋白，特别是不包含由外显子53编码的区域，但其能够执行天然蛋白的至少一些功能，特别是至少部分减轻与天然抗肌萎缩蛋白缺失相关的症状，例如纤维变性、炎症、坏死、肌肉被瘢痕或脂肪组织代替、肌肉无力、呼吸或心力衰竭和过早死亡。

根据一个具体实施方案，营养不良疾病是杜兴氏肌营养不良症(DMD)。

与外显子52(Δ52)，外显子50至52(Δ50-52)，外显子49至52(Δ49-52)，外显子48至52(Δ48-52)，外显子47至52(Δ47-52)，外显子46至52(Δ46-52)，外显子45至52(Δ45-52)，外显子43至52(Δ43-52)和外显子10至52(Δ10-52)的缺失，或外显子53的重复相关的多种DMD形式尤其受到影响。关于Δ52和Δ45-52缺失，还有Δ48-52和Δ50-52缺失，对本发明的目标进行了进一步说明。

患者体内存在的抗肌萎缩蛋白基因缺失的性质很容易由本领域技术人员确定，例如通过测序或PCR。

鉴于在受DMD影响的肌纤维的抗肌萎缩蛋白的恢复中所观察到的显著作用，本发明还涉及如上所述的AAVr载体或含有其的组合物在生产医用药物中的用途，优选地所述药物用于治疗营养不良性疾病，特别是DMD，特别是以上列出的形式。

换句话说，本发明提供了用于治疗营养不良性疾病的方法，特别是如上所定义的，其包括向受试者施用这样的AAV载体或含有其的组合物。

实施例

从以下实施例中可以更清楚本发明及所产生的有益效果，以下实施例由附图支持。具体地，(实施例1)关于AAV 2/8载体对本发明进行了说明，所述AAV 2/8载体包含编码本发明含义内的目标AON的多种序列和U7型修饰型鼠snRNA，在成肌细胞上进行了测定，所述成肌细胞的人抗肌萎缩蛋白基因的外显子52(Δ52)或外显子45-52(Δ45-52)缺失。(实施例2)还关于AAV 2/8载体对本发明进行了说明，所述AAV 2/8载体包含编码具体AON的序列(JR53)和U7型修饰型鼠snRNA，在肌转化的患者成纤维细胞(肌成纤维细胞)上进行了测定，所述肌转化的患者成纤维细胞(肌成纤维细胞)的人抗肌萎缩蛋白基因的外显子52(Δ52)缺失，或外显子45-52(Δ45-52)、48-52(Δ48-52)、或50-52(Δ50-52)缺失。然而，这并不是以任意方式进行限制，并且其教导可以延伸至其他AAV载体、其他修饰型snRNA和患有由其他突变导致的杜兴氏疾病的受试者。

附图说明

图1：在用不同rAAV8载体转导成肌细胞Δ45/52后，盲测评估人抗肌萎缩蛋白信使的外显子53跳读。该分析通过对外显子44至56进行巢式RT-PCR来进行。Blc：PCR水对照；NT：未转导的细胞。

图2：在用不同rAAV8载体转导成肌细胞Δ52后，盲测评估人抗肌萎缩蛋白信使的外显子53跳读。该分析通过对外显子51至54进行巢式RT-PCR来进行。Blc：PCR水对照；NT：未转导的细胞。

图3：在用不同rAAV8载体转导成肌细胞Δ45/52后，通过RTqPCR盲测评估不含外显子53的人抗肌萎缩蛋白信使的表达水平(基于总抗肌萎缩蛋白的信使水平)。NT：未转导的细胞。

图4：DMD成肌细胞Δ45-52上人抗肌萎缩蛋白pre-mRNA的外显子53跳读。

A/用载体AAV2/8-U7-5901(表示为01)或5902(表示为02)或5903(表示为03)或5907(表示为07)或5912(表示为12)或5894(表示为94)或5899(表示为99)(参见材料和方法)转导成肌细胞Δ45-52，MOI为300.10E+3。通过巢式RT-PCR评估其外显子53跳读的效率。通过RT-PCR Dys3-9评估抗肌萎缩蛋白的mRNA总量，持家基因18S的表达使得能够评估mRNA的存在。

B/用载体AAV2/8-U7-5901或5902或5903或5907或5912或5894或5899(参见材料和方法)转导成肌细胞Δ45-52，MOI为300.10E+3。进行多重western印迹来检测健康受试者细胞(8220；蛋白提取物稀释至1/5)和未感染的DMD Δ45-52细胞(未感染的(Non Inf))上的抗肌萎缩蛋白和dysferlin蛋白。该图是独立完成的4次实验的代表。

图5：DMD成肌细胞Δ52上人抗肌萎缩蛋白pre-mRNA的外显子53跳读。

A/用载体AAV2/8-U7-5901(表示为01)或5902(表示为02)或5903(表示为03)或5907(表示为07)或5912(表示为12)或5894(表示为94)或5899(表示为99)(参见材料和方法)转导成肌细胞Δ52，MOI为300.10E+3。通过巢式RT-PCR评估其外显子53跳读的效率。通过RT-PCR Dys3-9评估抗肌萎缩蛋白的mRNA总量，持家基因18S的表达使得能够评估mRNA的存在。

B/用载体AAV2/8-U7-5901或5902或5903或5907或5912或5894或5899(参见材料和方法)转导成肌细胞Δ52，MOI为300.10E+3。进行多重western印迹来检测健康受试者细胞(8220；蛋白提取物稀释至1/5)和未感染的DMDΔ52细胞(Ni)上的抗肌萎缩蛋白和dysferlin蛋白。该图是独立完成的4次实验的代表。

图6：JR53在转导的DMD人肌成纤维细胞中跳读抗肌萎缩蛋白的外显子53的效率。

A，从左至右：分子量标记；健康对照成肌细胞(hM)；肌成纤维细胞(hFM)；不合格的DMD肌成纤维细胞(FMstop16)；3个DMD患者5-13889(FM13889 del49-52)、5-14211(FM14211del52)、5-14476(FM14476 del45-52)的细胞，对于每位患者，有如下4种情况：成纤维细胞(FH)，未被多西环素(doxycyclin)诱导的肌成纤维细胞(FM no)，被多西环素诱导的肌成纤维细胞(FM dox-)，被多西环素诱导并被JR53处理的肌成纤维细胞(FM dox+)；无上标酶(RT-)或无RNA(RTo)的逆转录阴性对照；分子量标记。

B：与A相同，DMD患者为DMD 5-14496(FM14496 del45-52)、5-14498(FM14498del48-52)、5-14878(FM14878 del50-52)，没有RTo对照。

C，从左至右：分子量标记；健康对照成肌细胞(hM)；肌成纤维细胞(hFM)；不合格的DMD肌成纤维细胞(FMstop16)；对照DMD成纤维细胞(FH)，4名DMD患者5-14499(FM14499del50-52)，5-14589(FM14589 del50-52)，5-14683(FM14683 del48-52)，5-16283(FM16283del45-52)的、由多西环素诱导的肌成纤维细胞，对于每位患者有以下2种情况：不用JR53处理(FM dox-)，用JR53处理(FM dox+)；无上标酶(RT-)或无RNA(RTo)的逆转录阴性对照；分子量标记。

箭头标出了不含外显子53的预期大小的RT-PCR产物。

图7：由Western印迹显示的转导的人DMD肌成纤维细胞中抗肌萎缩蛋白的表达。

通过Western印迹检测抗肌萎缩蛋白(顶部)和钙联蛋白(底部)的表达。

A，从左至右：健康对照肌成纤维细胞(hFM)；不合格的DMD肌成纤维细胞(FMstop16)；未被多西环素诱导的DMD肌成纤维细胞(FH)；3名DMD患者5-13889(FM13889del48-52)、14211(FM14211 del52)、5-14476(FM14476 del45-52)被多西环素诱导的肌成纤维细胞，每名患者2种情况：不用JR53处理(FM dox-)和用JR53处理(FM dox+)；健康成肌细胞(hM)。

B：与A相同，DMD患者为DMD 5-14878(FM14878 del45-52)、5-14496(FM14496del50-52)、5-14498(FM14498 del48-52)。

C：与A相同，DMD患者为DMD 5-14499(FM14499 del50-52)、5-14589(FM14589del50-52)、5-14683(FM14683 del48-52)、5-16283(FM16283 del45-52)。

对于每个批次的DMD肌成纤维细胞，均对JR53的效率进行了两次或三次实验测定。

实施例1：包含编码反义寡核苷酸(AON)的序列的载体在成肌细胞的抗肌萎缩蛋白的外显子53跳读中的效率

在两个平行研究的背景下，对下面更详细描述的重组AAV8的效率进行了盲测。

第一项研究(I)旨在定性和定量地比较不同反义序列在外显子53跳读(通过RT-PCR评估抗肌萎缩蛋白的mRNA)上的效率。

第二项研究(II)旨在确认不同反义序列在外显子53跳读上的效率(通过RT-PCR评估抗肌萎缩蛋白的mRNA)以及在生产抗肌萎缩蛋白上的效率。

A.材料和方法

1/反义序列、载体和质粒

对下表1中确定的反义序列进行了测定：

通过定向诱变将其克隆至含有自身启动子的优化的鼠U7snRNA基因中。与AON5902(JR53)相关的相应构建如序列SEQ ID NO：2所示。

将相应的构建***到表达质粒，例如pFBD质粒中。

如Ayuso等人(Hum.Gen.Ther.,2014,Nov 25(11):977-87)所述，用来生产AAV2/8载体的质粒是：

-pDP10，其携带rep-2和cap-8基因和E2b，E4，VARNA腺病毒的辅助基因；以及

-载体质粒，其携带相应的ITR-2s和转基因(如上所述的构建)

2/AAV2/8载体的生产

AAV8载体由HEK293细胞产生(其细胞基因组中稳定整合了E1A和E1B基因)，所述HEK293细胞培养在5托盘Cell Stack的粘附***中。用磷酸钙使用沉淀技术，向DMEM培养基中培养的细胞转染2个质粒(辅助质粒：pEP10，其携带rep-2和cap-8基因以及E2b、E4、VARNA腺病毒的辅助基因，和携带相应ITR-2s及转基因的载体质粒)，所述DMEM培养基含有10％胎牛血清(体积/体积)以及青霉素和链霉素(每种抗生素1％体积/体积)。

转染后，将培养基替换为无血清DMEM培养基。72小时后，收集上清液中的AAVr颗粒，并用40％聚乙二醇加苯佐酶(benzonase)沉淀。接下来用两个连续的CsCl梯度对颗粒进行纯化。通过对dPBS 1X缓冲液透析来消除CsCl污染。然后将颗粒于-80℃下在低结合管中冷冻(Ayuso等人，Hum.Gen.Ther。，2014，Nov 25(11)：977-87)。

3/载体的滴定

用DNase处理载体产物以消除污染性游离DNA，然后提取病毒核酸。提取后，稀释核酸，并通过qPCR用线性化和标准化质粒系来测定AAV病毒基因组的拷贝数(AAV/ITR扩增子)。

对于qPCR，使用以下引物和探针：

AAV18mers.R:GTAGATAAGTAGCATGGC(SEQ ID NO:11)

AAV22mers.F:CTCCATCACTAGGGGTTCCTTG(SEQ ID NO:12)

AAV_M G B.P:TAGTTAATGATTAACCC(SEQ ID NO:13)。

4/永生化成肌细胞系

使用了两种杜兴氏患者的细胞系，一种抗肌萎缩蛋白基因中外显子45-52缺失(Δ45-52)，另一种外显子52缺失(Δ52)。使用第三个健康受试者成肌细胞的细胞系作为对照(8220)。

I/研究I的实施方案：

5/AAV2/8转导永生化成肌细胞

以每孔190,000个细胞将细胞接种于六孔板，然后在增殖培养基(骨骼肌细胞基础培养基+骨骼肌细胞生长培养基试剂盒，Promocell Ref:C23160)中培养。约24小时后，以1^e5和5^e5vg/细胞的MOI，用不同的盲修饰的U7snRNA重组AAV2/8载体和AAV2/8对照来转导细胞，所述AAV2/8对照能够表达绿色荧光蛋白(GFP)，从而鉴定转导效率。

培养3天后，收集细胞并将细胞沉淀物在-80℃下冷冻干燥。接下来将沉淀物用于DNA和RNA纯化。

6/评估每个细胞中病毒基因组数量

使用Gentra Puregene试剂盒(Qiagen)提取AAV基因组。

使用TaqMan Real Time PCR程序测定载体DNA拷贝的数量。设计引物和探针来扩增(i)反向末端重复序列(Inverted Terminal Repeat,ITR)(参见点3)和(ii)内源白蛋白基因。对于每个样品，将Ct值与用标准质粒的不同稀释液获得的Ct值进行比较，所述标准质粒含有ITR和白蛋白基因。最终结果表示为每个二倍体基因组的病毒基因组(vg/dg，病毒基因组/二倍体基因组)

Alb.F:GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT(SEQ ID NO:14)

AIb.R:ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC(SEQ ID NO:15)

AlbVIC.P:CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC(SEQ ID NO:16)

7/通过巢式RT-PCR评估外显子跳读

使用供应商的说明书(Life Technologies，Ref 15596-026)，用1mL Trizol试剂从干细胞沉淀物中提取RNA。将RNA回收于30μL无菌水中，然后通过两个连续DNase步骤处理从而消除病毒DNA的典型RNA污染(Ambion,Ref AMI 907)。取500ng RNA用于逆转录反应(Life Technologies试剂盒，Ref 28025-013)。在此步骤中，对每个样品均进行逆转录阴性对照，从而确定不存在病毒DNA污染。

为了检测外显子跳读，由1μL互补DNA(cDNA)进行第一次PCR(PCR1)，所述PCR1用Gotaq G2酶(Promega,Ref:M7805)，用各细胞类型的适当引物对(参见下面的引物列表)，总体积50μL，进行25个循环[95℃30秒—50℃或58℃1min—72℃2min]，然后取1μL的PCR1再次扩增(PCR2)，PCR2用PCR1产物内的第二引物对，总体积50μL，进行30个循环[95℃30秒—50℃或58℃1min—72℃2min]。巢式PCR产物通过在Tris-醋酸盐-EDTA缓冲液中的1.5％琼脂糖凝胶上电泳来进行分析。切取对应于外显子跳读的条带，使用Nucleospin Gel和PCRClean-up试剂盒(MACHEREY-NAGEL,Ref:740609.250)通过柱进行纯化，并进行测序。

用于外显子53跳读的引物对为：

对于DMDΔ52细胞系：

PCR1:ex51 hDMD Fext和ex54 hDMD Rext，50℃

PCR2:ex51 hDMD Fint和ex54 hDMD Rint，50℃

对于Δ45-52细胞系：

PCR1 Dys43F/Dys57R，58℃

PCR2 Dys44F/Dys56R，58℃

用于外显子53跳读的引物序列：

ex51 hDMD Fext:GTTACTCTGGTGACACAACC(SEQ ID NO:17)

ex54 hDMD Rext:ATGTGGACTTTTCTGGTATC(SEQ ID NO:18)

ex51 hDMD Fint:ACTAGAAATGCCATCTTCCT(SEQ ID NO:19)

ex54 hDMD Rint:CAAGTCATTTGCCACATCTA(SEQ ID NO:20)

Dys43-F:CCTGTGGAAAGGGTGAAGC(SEQ ID NO:21)

Dys44-F:CGATTTGACAGATCTGTTGAG(SEQ ID NO:22)

Dys56-R:TGAGAGACTTTTTCCGAAGT(SEQ ID NO:23)

Dys57-R:AAGTTCCTGCAGAGAAAGGT(SEQ ID NO:24)

PCR2的预期大小示于下表2中。

8/通过定量PCR对Δ45-52细胞系中的外显子53跳读进行定量

进行了两次RTqPCR从而对外显子53的跳读进行定量。第一次特异于抗肌萎缩蛋白的不再含有外显子53的转录本(外显子44和54的连接处的RTqPCR)。第二次用于标准化，通过扩增抗肌萎缩蛋白的所有转录本(外显子4和5的连接处的RTqPCR)。将来自逆转录反应的cDNA进行稀释，然后根据供应商推荐使用Taqman技术用Premix Ex Taq试剂盒(Takara,RefRR390w)进行扩增，各引物0.3μmol/L，Taqman探针0.25μmol/L(参见下面的引物和探针列表)，进行40个循环[95℃15秒—57℃1min]。为了验证RTqPCR的效率，并对转录本进行定量，将含有目标序列的参照质粒的稀释系列与样品平行地加到板上。

对于不含外显子53的抗肌萎缩蛋白RTqPCR，使用以下引物和探针：

hDys-44/54-F:CCTGAGAATTGGGAACATGCTAA(SEQ ID NO:25)

hDys-44/54-R:GCCACTGGCGGAGGTCTT(SEQ ID NO:26)

hDys-44/54-P:GGTATCTTAAGCAGTTGGC(SEQ ID NO:27)＝Taqman探针跨越外显子44和54的连接处

对于总的抗肌萎缩蛋白RTqPCR，使用以下引物和探针：

hDys-4/5-F:CATGCCCTGAACAATGTCAACAAG(SEQ ID NO:28)

hDys-4/5-R:TCCATCTACGATGTCAGTACTTCCA(SEQ ID NO:29)

hDys-4/5-P:TTGCAGAACAATAATGTTGATTTA(SEQ ID NO:30)＝Taqman探针跨越外显子4和5的连接处

II/研究II的实施方案：

5/AAV2/8转导永生化成肌细胞

以每35mm的孔100,000个细胞接种细胞，然后在上述增殖培养基中培养至80％融合。约24小时后，在分化培养基中(含有庆大霉素的无血清IMDM)，在37℃下，以250,000vg/细胞的MOI用不同的重组AAV2/8载体感染细胞。

在4小时至6小时后，加入250μL掺入了庆大霉素的IMDM。在分化培养基中培养9天后，取出35mm孔的1/10体积的培养基样品。接下来将其用于RNA纯化，用于RT-PCR分析。平行地，将细胞刮掉，冲洗并以11,000g离心1分钟或以1500rpm离心5分钟。沉淀物在-80℃冷冻干燥。然后将沉淀物用于DNA纯化和病毒基因组定量。

6/评估每个细胞中的病毒基因组数量

见上述I-6点。

7/通过巢式RT-PCR评估外显子跳读

为了进行巢式RT-PCR，使用Nucleospin RNAII试剂盒通过柱子来提取RNA，并用30μL水(不含DNase/RNase)洗脱。取500ng RNA进行逆转录反应(Superscript II LifeTechnologies试剂盒，Ref 18064-014)。

为了检测外显子跳读，对2μL cDNA进行第一次PCR，所述第一次PCR用各细胞类型的适当引物对(参见下面的引物列表)，总体积20μL，进行30个循环[95℃30秒"—56℃1'—72℃2']，然后取3μL的PCR1，用PCR1产物内的第二引物对，总体积30μL，扩增25个循环。关于18S和PO RNA分析，只进行了1次PCR。将巢式PCR产物在Tris-醋酸盐-EDTA缓冲液中的1.8％琼脂糖凝胶上进行电泳分析。切取对应于外显子跳读的条带，使用Nucleospin Gel和PCRClean-up试剂盒(MACHEREY-NAGEL,Ref:740609.250)通过柱进行纯化，并进行测序(通过GATC)。

用于外显子53跳读的引物对为：

对于对照成肌细胞野生型(8220)和DMDΔ52：

PCR1:Dys49F/Dys57R

PCR2:Dys50F/Dys56R(人抗肌萎缩蛋白)

对于成肌细胞Δ45-52：

PCR1 Dys43F/Dys57R

PCR2 Dys44F/Dys56R(人抗肌萎缩蛋白)

用于外显子53跳读的5'->3’引物序列：

Dys43-F:CCTGTGGAAAGGGTGAAGC(SEQ ID NO:21)

Dys44-F:CGATTTGACAGATCTGTTGAG(SEQ ID NO:22)

Dys49-F:CAACCGGATGTGGAAGAGAT(SEQ ID NO:31)

Dys50-F:CTCTGAGTGGAAGGCGGTAA(SEQ ID NO:32)

Dys56-R:TGAGAGACTTTTTCCGAA-GT(SEQ ID NO:23)

Dys57-R:AAGTTCCTGCAGAGAAAG-GT(SEQ ID NO:24)

用于18S、PO和全人抗肌萎缩蛋白的其他引物序列：

PO-F:GGCGAGCTGGAAGTGCAACT(SEQ ID NO:33)

PO-R:CCATCAGCACCACAGCCTTC(SEQ ID NO:34)

18S-F:TCAAGAACGAAAGTCGGAGGTTCG(SEQ ID NO:35)

18S-R:TTATGCTCAATCTCGGGTGGCTG(SEQ ID NO:36)

Dys3-F:GAGAACCTCTTCAGTGACCTAC(SEQ ID NO:37)

Dys9-R:GAGGTGGTGACATAAGCAGC(SEQ ID NO:38)

用于每种细胞类型的引物和预期大小示于下表3中。

8/通过多重Western印迹来评估抗肌萎缩蛋白表达的恢复

将蛋白从转导并分化了9天的细胞中(见第5段)提取于缓冲液中，所述缓冲液含有125mM蔗糖，5mM Tris-HCl pH 6.4，6％XT-Tricine迁移缓冲液(Bio-Rad)，10％SDS，10％甘油，5％13-巯基乙醇和抗蛋白酶。样品在95℃变性5分钟，然后用Compat-AbleTM蛋白测定准备试剂套装试剂盒(Thermo Scientific Pierce)预处理。通过BCA蛋白测定试剂盒(ThermoScientific Pierce)测定蛋白的浓度。取75μg蛋白加在Criterion XT Tris-乙酸盐3-8％预注凝胶(Bio-Rad)上。通过以下步骤检测抗肌萎缩蛋白：膜与1:50稀释的NCL-DYS1单克隆一抗(Novocastra)杂交，随后与1:15,000稀释的绵羊抗小鼠二抗(HRP)孵育。通过SuperSignal West Pico化学发光底物试剂盒(Thermo Scientific Pierce)显示蛋白。

B.结果和讨论

用由AAV2/8s携带的、***到优化的鼠U7snRNA基因中并含有自身启动子的候选反义序列，分别在两个永生化的人成肌细胞系Δ45-52和Δ52上进行了双盲研究。

所测定的载体及其滴度示于下表4中：

I/研究I的结果：

在1^e5和5^e5vg/细胞的MOI下，在增殖条件下，由两名操作者对这些载体进行盲测。通过流式细胞术估测转导的效率，转导的细胞在68％和96％之间。

如下表5所示，对各细胞的病毒基因组进行qPCR定量显示不同载体具有均一性转导：

图1至3分别显示了在转导DMDΔ45-52和Δ52成肌细胞后，构建效率的评估结果：图1和图2能够通过巢式RT-PCR来评估两种细胞系上外显子53的跳读，图3显示了通过RTqPCR对Δ45-52细胞系的这种跳读的定量。

II/研究II的结果：

以300.E+3的MOI对这些载体进行测定。使转导的细胞分化9天以获得分化条件，使得抗肌萎缩蛋白在修正的细胞中能够恢复(参见材料和方法)。

图4和5分别显示了在转导DMDΔ45-52和Δ52成肌细胞后，构建效率的评估结果。

图4A和5A能够通过巢式RT-PCR来评估外显子53的跳读，图4B和5B显示了抗肌萎缩蛋白表达的Western印迹研究结果。

结论：

这两个独立并完全一致的研究表明，两个DMD细胞系的外显子跳读效率的结果是相同的，即，以下量级的效率：5902>5901＝5903。同样，对于两种成肌细胞系，对于恢复抗肌萎缩蛋白的表达而言，携带AON 5902的构建是最有效的。

在U7中克隆并在AAV2/8中载体化的反义序列，特别是被称为JR53(SEQ ID NO：3)和N3(SEQ ID NO：4)的序列，均比现有技术的Dtex53序列(5912)更有效。

实施例2：包含JR53序列(SEQ ID NO：3)的载体在人肌成纤维细胞的抗肌萎缩蛋白的外显子53跳读中的效率

A.材料和方法

1/细胞培养

将DMD患者的成纤维细胞在掺有10％胎牛血清(FCS)和10μg/mL庆大霉素的IMDM(Iscove's Modified Dubelco Medium)培养基(Life Technologies)中培养。融合时，将细胞用胰蛋白酶/EDTA溶液分离，并扩增。对于每个患者，均制备样品并冷藏(低温保存)。

2/肌转化(myoconversion)：将人DMD成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。

2.1用于肌转化的载体

肌转化技术及使其能够执行的工具，特别是合适的慢病毒载体，是本领域技术人员已知的，并且例如描述于Cooper等人(Neuromuscular Disorders 17(2007),276-284)和Chaouch等人(Human Gene Therapy 20(2009),784-790)中。

用于肌转化的载体为GU007HT_psin_pTRE_MyoD_hPGK_rtTA2M2慢病毒载体，由Généthon生产(批号13RO281 GU 007H)，随后也被称为LV/MyoD或LV/MyoDi。

2.2肌转化方法

用胰蛋白酶/EDTA溶液分离人成纤维细胞(HF)，300g离心5分钟，用DMEM(高糖Dulbecco's培养基)重悬，并计数。将25,000个细胞转移至含有5μL在无抗生素的DMEM中的LV/MyoDi的Eppendorf管中，总体积为100μL，然后在37℃下孵育30分钟(混合2或3次)。接着，将各管中含有的混合物(细胞+载体)接种于22mm的孔(P12)中，所述22mm的孔含有900μLDMEM，10％FCS，100μL/mL青霉素，100μg/mL链霉素，置于在37℃、5％CO₂的培养箱中培养3天。从第三天开始，将培养基完全替换以消除病毒颗粒。接下来对由LV/MyoDi转导的细胞进行扩增，并在-80℃下冷冻，然后转移至液氮中。

2.3通过MyoD1的免疫细胞标记来验证肌转化的效率

将肌成纤维细胞(FM)以10,000个细胞/孔接种于基质胶的22mm条带上。24小时后，通过在增殖培养基中添加10μg/mL多西环素持续4至6天，来诱导肌转化。在环境温度下，将肌成纤维细胞用2％的多聚甲醛(PFA)固定15分钟(如果需要，保持在4℃)。在-20℃下，将细胞用甲醇透化5分钟，在含有2％BSA(牛血清白蛋白)的PBS中封闭1小时。通过使用1/100稀释的克隆5.8A MyoD1小鼠单克隆抗体(代码DAKO M3512)进行免疫学标记，在4℃孵育一晚。接下来，将山羊抗小鼠488-IgG荧光Alexa二抗(1/500)在环境温度下孵育1小时。核用DAPI标记5分钟。将条带固定在Fluoromount G载玻片上，并在荧光显微镜下观察(DM2500 Leica共聚焦成像和ImageJ应用)。

通过计算MyoD1阳性核相对于DAPI阳性核的百分比(每个条件计数100个细胞)，来表示肌转化的效率。

3/临床产品

包含序列JR53(SEQ ID NO：3)的用于临床试验的载体是Généthon生产的G7U007bacculoAAV2/8-U7-JR53载体(批号14PO353：JR53)，如实施例1所述。

4/JR53转导人DMD肌成纤维细胞

在37℃下，在无血清IMDM培养基中，用含有JR53序列(MOI 300,000病毒基因组每个细胞)的载体感染肌转化的成纤维细胞(肌成纤维细胞)。5小时后，使肌成纤维细胞在IMDM培养基中分化13至14天，所述IMDM培养基掺有1％马血清，10μg/mL庆大霉素和10μg/mL多西环素。在环境温度下，将分化的细胞刮入PBS中，收集在第一管(用于Western型转移)中并保持在冰上。转移所获得的量的1/10用于RNA提取。在11,000g离心1分钟后，将细胞沉淀物冷冻并保存于-80℃。

5/转导的人DMD肌成纤维细胞中抗肌萎缩蛋白pre-mRNA上的外显子跳读的测定

根据制造商说明书使用Nucleospin RNAII(Macherey Nagel)试剂盒从细胞中提取总RNA，并用30μL水洗脱。取500ng总RNA的等分试样用于巢式RT-PCR分析。使用Superscript II试剂盒(Life Technologies)，用随机引物分析器在42℃逆转录反应50分钟，然后使用PCR Master混合试剂盒(Promega)进行PCR。

为了评估DMD的pre-mRNA的外显子跳读，进行如下巢式RT-PCR(PCR1)：2μL cDNA，用突变和外显子53周围的引物(见表6)，总体积20μL，进行30个循环[95℃(30秒)—56℃(1分钟)—72℃(2分钟)]。接下来，取3μL PCR1，用第二引物对(参见表6)，总体积30μL，扩增25秒。

为了评估抗肌萎缩蛋白的总mRNA和18S核糖体mRNA(添加cDNA的内源性对照)，使用表6所述的引物对进行了34个循环[95℃(30秒)—57℃(1分钟)—72℃(1分钟)]的单一PCR。

PCR产物通过在Tris-醋酸盐-EDTA缓冲液中的1.8％琼脂糖凝胶上的电泳进行分析。下表7提供了RT-PCR产物的预期大小。用ImageJ软件处理每个条带获得的像素数。切取对应于具有外显子跳读的扩增子的大小的条带(较低带)，使用Nucleospin Gel和PCRClean-up试剂盒(Macherey Nagel)通过柱进行纯化，并进行测序(通过GATC)。

表6：用于PCR实验的引物列表

表7：RT-PCR产物的预期大小

6/通过Western印迹检测转导的DMD人肌成纤维细胞中抗肌萎缩蛋白的表达

由裂解缓冲液(蔗糖125mM，Tris-HCl 5mM pH 6.4，6％XT-tricine迁移缓冲液(Bio-Rad)，10％SDS，10％甘油，5％β-巯基乙醇，蛋白酶抑制剂)提取细胞蛋白。样品在95℃下变性5分钟。

2μL蛋白样品用Compat-Able^TM试剂盒的蛋白测定试剂预处理，使用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific Pierce)测定蛋白浓度。将75至100μg蛋白加载到3-8％聚丙烯酰胺的预注胶上(Bio-Rad的Criterion XT Tris-醋酸盐试剂盒)。通过以下步骤检测抗肌萎缩蛋白：膜与1:50稀释的NCL-DYS1单克隆一抗(Novocastra)杂交，然后与1：15,000稀释的绵羊IgG二抗(HRP)孵育。通过SuperSignal West Pico或Femto Maximum SensitivitySubstrate试剂盒(Thermo Scientific Pierce)显示蛋白。通过进行以下步骤来显示总肌蛋白：膜与1：2000稀释的兔钙联蛋白抗体杂交，4℃下孵育一晚，然后与1：50,000稀释的山羊抗兔IgG第二抗体(HRP)孵育。

7/细胞信息

7.1/患者表(表8)：

7.2/对照细胞

细胞系由Université de la Sorbonne UPMC-INSERM-UMRS 974-CNRS FRE 3617-Institut de Myologie[Myology Institute]的Centre de Recherche en Myologie[Myology Research Center]的细胞永生化平台提供。

●肌成纤维细胞

抗肌萎缩蛋白表达的对照：J5C健康人成纤维细胞，在UMRS974研究单位完成肌转化。

抗肌萎缩蛋白恢复的阴性对照：永生化成纤维细胞，编号F033，不符合由JR53进行外显子跳读的资格(外显子16中含终止密码子)，在UMRS974研究单位中完成肌转化。

●永生化成肌细胞

用于抗肌萎缩蛋白表达的阳性对照的健康成肌细胞，编号8220:hM。

临床产品效率的阳性对照：外显子52缺失的DMD成肌细胞，符合外显子53跳读资格，称为KM571DMD10FL。

B.结果

1/人DMD成纤维细胞转化为肌成纤维细胞：

所有批次的DMD成纤维细胞(10/10)均显示MyoD核表达阳性，表明myoD1阳性核相对于所标记的核的总数的百分比大于70％(表9)，因此可以被视为肌转化的。

表9：将人DMD成纤维细胞转化为肌成纤维细胞(两个独立实验中肌转化的平均百分比)

2/JR53对于转导的DMD人肌成纤维细胞中外显子53跳读的效率

对于每个批次的DMD肌成纤维细胞，以两次或三次实验测定JR53对于外显子跳读的效率。对于10名DMD患者的每一名患者，检测了对应于不含外显子53的预期大小的RT-PCR产物(图6)。

使用跳读条带所获得的像素数与所有跳读和非跳读条带的计算像素总和的比例，来计算JR53的效率百分比(表10)。

对于8个批次的DMD肌成纤维细胞，检测到JR53的效率大于70％，而对于患者5-14878 DMD和5-14499 DMD，效率较低，分别为64％和50％。对具有外显子跳读的扩增子大小所对应的条带(较低带)进行测序，并且均给出了对应于外显子53跳读的预期序列。

表10：JR53对于人DMD肌成纤维细胞中外显子53跳读的效率

3/DMD人肌成纤维细胞中抗肌萎缩蛋白表达的恢复

Western印迹的结果如图7所示。

使用ImageJ软件对各条带信号所对应的像素数进行定量，来评估DMD肌成纤维细胞中的抗肌萎缩蛋白的表达恢复水平。由于钙联蛋白的表达(总蛋白的贡献)，抗肌萎缩蛋白水平被标准化。使用经处理的肌成纤维细胞中的标准化抗肌萎缩蛋白水平与健康肌成纤维细胞(hFM)中所观察到的抗肌萎缩蛋白表达率(被认为是100％)的比例，来计算恢复的抗肌萎缩蛋白的百分比。结果表明，在用JR53处理的所有DMD肌成纤维细胞批次中，均可以观察到抗肌萎缩蛋白的恢复。必须注意的是，对于受试者DMD 5-14889，对于恢复的抗肌萎缩蛋白水平的评估，仅测量了一次。

抗肌萎缩蛋白表达恢复数据的定量示于表11中：

表11：转导的DMD人肌成纤维细胞中抗肌萎缩蛋白恢复的定量

结论：

在这一研究的背景中获得的所有数据总结于下表12中，所述研究在人肌成纤维细胞上进行，所述人肌成纤维细胞来自具有不同DMD形式的患者：

表12：JR53对人DMD肌成纤维细胞的效率数据总结。

总之，针对以上列出的不同DMD形式(Δ52，Δ45-52，Δ48-52和Δ50-52)而获得的临床前结果验证了由所测定的构建携带的JR53反义序列的治疗潜力。

序列表

<110> 吉尼松公司

<120> 用于抗肌萎缩蛋白外显子53跳读的有效基因治疗工具

<130> G143-B-45963 PCT

<140> PCT/FR2016/053312

<141> 2016-12-09

<150> FR1562036

<151> 2015-12-09

<160> 38

<170> BiSSAP 1.3.2

<210> 1

<211> 212

<212> DNA

<213> 人类

<223> "人抗肌萎缩蛋白基因外显子53的序列（Séquence de l'exon 53 du gènehumain de la dystrophine）"

<220>

<223> 人抗肌萎缩蛋白基因外显子53的序列（Séquence de l'exon 53 du gènehumain de la dystrophine）

<400> 1

ttgaaagaat tcagaatcag tgggatgaag tacaagaaca ccttcagaac cggaggcaac 60

agttgaatga aatgttaaag gattcaacac aatggctgga agctaaggaa gaagctgagc 120

aggtcttagg acaggccaga gccaagcttg agtcatggaa ggagggtccc tatacagtag 180

atgcaatcca aaagaaaatc acagaaacca ag 212

<210> 2

<211> 442

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "U7-JR53"

<220>

<223> U7-JR53

<400> 2

taacaacata ggagctgtga ttggctgttt tcagccaatc agcactgact catttgcata 60

gcctttacaa gcggtcacaa actcaagaaa cgagcggttt taatagtctt ttagaatatt 120

gtttatcgaa ccgaataagg aactgtgctt tgtgattcac atatcagtgg aggggtgtgg 180

aaatggcacc ttgatctcac cctcatcgaa agtggagttg atgtccttcc ctggctcgct 240

acagacgcac ttccgcaaca ttcaactgtt gcctccggtt ctgaaggtgt tcttgtacaa 300

tttttggagc aggttttctg acttcggtcg gaaaacccct cccaatttca ctggtctaca 360

atgaaagcaa aacagttctc ttccccgctc cccggtgtgt gagaggggct ttgatccttc 420

tctggtttcc taggaaacgc gt 442

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "JR53 (5902)"

<220>

<223> JR53 (5902)

<400> 3

cattcaactg ttgcctccgg ttctgaaggt gttcttgtac 40

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "N3 (5901)"

<220>

<223> N3 (5901)

<400> 4

caactgttgc ctccggttct gaaggtgttc ttg 33

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "N2 (5907)"

<220>

<223> N2 (5907)

<400> 5

ttgcctccgg ttctgaaggt gttc 24

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "N1 (5894)"

<220>

<223> N1 (5894)

<400> 6

ttgcctccgg ttctgaaggt gttcttg 27

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> " Di/I (5903)"

<220>

<223> Di/I (5903)

<400> 7

caactgttgc ctccggttct gaaggtgttc 30

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Dtex53 (5912)"

<220>

<223> Dtex53 (5912)

<400> 8

ttggctctgg cctgtcctct gttgcctccg gttctg 36

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "抢占（Scramble）"

<220>

<223> 抢占（Scramble）

<400> 9

ggtgtattgc atgatatgt 19

<210> 10

<211> 812

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "ITR-U7-JR53"

<220>

<223> ITR-U7-JR53

<400> 10

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180

agataacaac ataggagctg tgattggctg ttttcagcca atcagcactg actcatttgc 240

atagccttta caagcggtca caaactcaag aaacgagcgg ttttaatagt cttttagaat 300

attgtttatc gaaccgaata aggaactgtg ctttgtgatt cacatatcag tggaggggtg 360

tggaaatggc accttgatct caccctcatc gaaagtggag ttgatgtcct tccctggctc 420

gctacagacg cacttccgca acattcaact gttgcctccg gttctgaagg tgttcttgta 480

caatttttgg agcaggtttt ctgacttcgg tcggaaaacc cctcccaatt tcactggtct 540

acaatgaaag caaaacagtt ctcttccccg ctccccggtg tgtgagaggg gctttgatcc 600

ttctctggtt tcctaggaaa cgcgttgtcg ctagagcatg gctacgtaga taagtagcat 660

ggcgggttaa tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg 720

cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc 780

cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc ca 812

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "AAV18mers.R "

<220>

<223> AAV18mers.R

<400> 11

gtagataagt agcatggc 18

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "AAV22mers.F "

<220>

<223> AAV22mers.F

<400> 12

ctccatcact aggggttcct tg 22

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "AAV_M G B.P"

<220>

<223> AAV_M G B.P

<400> 13

tagttaatga ttaaccc 17

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Alb.F "

<220>

<223> Alb.F

<400> 14

gctgtcatct cttgtgggct gt 22

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "AIb.R "

<220>

<223> AIb.R

<400> 15

actcatggga gctgctggtt c 21

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "AlbVIC.P "

<220>

<223> AlbVIC.P

<400> 16

cctgtcatgc ccacacaaat ctctcc 26

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "ex51 hDMD Fext"

<220>

<223> ex51 hDMD Fext

<400> 17

gttactctgg tgacacaacc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "ex54 hDMD Rext "

<220>

<223> ex54 hDMD Rext

<400> 18

atgtggactt ttctggtatc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "ex51 hDMD Fint "

<220>

<223> ex51 hDMD Fint

<400> 19

actagaaatg ccatcttcct 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "ex54 hDMD Rint "

<220>

<223> ex54 hDMD Rint

<400> 20

caagtcattt gccacatcta 20

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Dys43-F "

<220>

<223> Dys43-F

<400> 21

cctgtggaaa gggtgaagc 19

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Dys44-F "

<220>

<223> Dys44-F

<400> 22

cgatttgaca gatctgttga g 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Dys56-R "

<220>

<223> Dys56-R

<400> 23

tgagagactt tttccgaagt 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Dys57-R"

<220>

<223> Dys57-R

<400> 24

aagttcctgc agagaaaggt 20

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "hDys-44/54-F "

<220>

<223> hDys-44/54-F

<400> 25

cctgagaatt gggaacatgc taa 23

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "hDys-44/54-R "

<220>

<223> hDys-44/54-R

<400> 26

gccactggcg gaggtctt 18

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "hDys-44/54-P "

<220>

<223> hDys-44/54-P

<400> 27

ggtatcttaa gcagttggc 19

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "hDys-4/5-F "

<220>

<223> hDys-4/5-F

<400> 28

catgccctga acaatgtcaa caag 24

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "hDys-4/5-R "

<220>

<223> hDys-4/5-R

<400> 29

tccatctacg atgtcagtac ttcca 25

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "hDys-4/5-P "

<220>

<223> hDys-4/5-P

<400> 30

ttgcagaaca ataatgttga ttta 24

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Dys49-F "

<220>

<223> Dys49-F

<400> 31

caaccggatg tggaagagat 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Dys50-F "

<220>

<223> Dys50-F

<400> 32

ctctgagtgg aaggcggtaa 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "PO -F"

<220>

<223> PO -F

<400> 33

ggcgagctgg aagtgcaact 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "PO-R"

<220>

<223> PO-R

<400> 34

ccatcagcac cacagccttc 20

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "18S-F"

<220>

<223> 18S-F

<400> 35

tcaagaacga aagtcggagg ttcg 24

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "18S-R "

<220>

<223> 18S-R

<400> 36

ttatgctcaa tctcgggtgg ctg 23

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Dys3-F "

<220>

<223> Dys3-F

<400> 37

gagaacctct tcagtgacct ac 22

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Dys9-R "

<220>

<223> Dys9-R

<400> 38

gaggtggtga cataagcagc 20

Claims

1.一种重组腺相关病毒载体(AAVr)，其包含编码反义寡核苷酸(AON)的序列，所述反义寡核苷酸(AON)与抗肌萎缩蛋白的前信使RNA(pre-mRNA)的外显子53的+30至+69区域杂交，其中编码AON的所述序列由SEQ ID NO：3组成。

2.根据权利要求1所述的AAVr载体，其特征在于，所述抗肌萎缩蛋白是人源的。

3.根据权利要求1所述的AAVr载体，其特征在于，所述AON能够使抗肌萎缩蛋白的pre-mRNA上的外显子53跳读。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的AAVr载体，其特征在于，编码AON的所述序列被包含在编码修饰型snRNA的序列中。

5.根据权利要求4所述的AAVr载体，其特征在于，所述修饰型snRNA是U7型(U7snRNA)。

6.根据权利要求4所述的AAVr载体，其特征在于，所述修饰型snRNA是鼠源的。

7.根据权利要求4所述的AAVr载体，其特征在于，其包含序列SEQ ID NO：2。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的AAVr载体，其特征在于，所述载体选自以下组：AAV2/1，AAV2，AAV2/6，AAV2/8，AAV2/9，AAV2/10，AAV8和AAV9。

9.根据权利要求8所述的AAVr载体，其特征在于，所述载体选自AAV2/8载体。

10.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的AAVr载体。

11.根据权利要求1至9中任一项所述的AAVr载体在制备医用药物中的用途。

12.根据权利要求1至9中任一项所述的AAVr载体或根据权利要求10所述的组合物在制备用于治疗杜兴氏肌营养不良症的药物中的用途。

13.根据权利要求1至9中任一项所述的AAVr载体或根据权利要求10所述的组合物在制备用于治疗Δ52，Δ45-52，Δ48-52和Δ50-52型杜兴氏肌营养不良症的药物中的用途。