KR101712085B1 - 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 계통으로의 분화 - Google Patents

인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 계통으로의 분화 Download PDF

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Abstract

본 발명은 MAFA의 발현을 증가시키기에 충분한 양의 사이클린 의존성 키나아제 억제제를 포함하는 배지로 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서 MAFA의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.

Description

인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 계통으로의 분화{DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS TO THE PANCREATIC ENDOCRINE LINEAGE}
본 발명은 2008년 10월 31일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/110,287호를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서 MAFA의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
제1형 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포 대체 치료법의 발전으로, 생착(engraftment)에 적합한 인슐린 생산 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되어 왔다. 한 가지 접근법은 예를 들어, 배아 줄기 세포와 같은 만능 줄기 세포로부터 기능성 β 세포를 생성하는 것이다.
척추동물 배아 발생에서, 만능 세포는 낭배형성 (gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층 (three germ layers) (외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 예를 들어, 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 HNF-3 베타, GATA4, MIXL1, CXCR4 및 SOX17과 같은 많은 마커를 발현한다.
췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자, PDX1을 발현한다. PDX1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 원기(ventral bud) 및 배측 원기(dorsal bud)의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, Pdx1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 특징짓는다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.
췌도 세포의 특징을 지닌 세포가 생쥐의 배아 세포로부터 유도된 것으로 보고되었다. 예를 들어, 루멜스키(Lumelsky) 등 (문헌[Science 292:1389, 2001])은 생쥐 배아 줄기 세포가 췌도와 유사한 인슐린-분비 구조로 분화한 것을 보고한다. 소리아(Soria) 등(문헌[Diabetes 49:157, 2000])은 생쥐 배아 줄기 세포로부터 유도된 인슐린-분비 세포가 스트렙토조토신-유도 당뇨 생쥐에서 혈당을 정상화시킴을 보고한다.
한 예에서, 호리(Hori) 등 (문헌[PNAS 99: 16105, 2002])은 생쥐 배아 줄기 세포를 포스포이노시티드 3-키나아제의 억제제(SLY294002)로 처리하여 β 세포와 닮은 세포를 생성하였음을 개시한다.
다른 예에서는, 블리츠주크(Blyszczuk) 등 (문헌[PNAS 100:998, 2003])은 Pax4를 구성적으로 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포로부터 인슐린-생산 세포를 생성하는 것을 보고한다.
미칼레프(Micallef) 등은 레틴산이 PDX1 양성 췌장 내배엽을 형성하는 배아 줄기 세포의 의무를 조절할 수 있음을 보고한다. 레틴산은 배아에서 낭배형성의 마지막에 해당하는 기간 동안 배아 줄기 세포 분화의 4일째에 배양물에 첨가될 때 Pdx1 발현을 유도하는 데 가장 효과적이다 (문헌[Diabetes 54:301, 2005]).
미야자키(Miyazaki) 등은 Pdx1을 과다 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포주를 보고한다. 그들의 결과는 외인성 Pdx1 발현이 생성된 분화된 세포에서 인슐린, 소마토스타틴, 글루코키나아제, 뉴로제닌3, P48, Pax6, 및 HNF6 유전자의 발현을 명확히 향상시켰음을 보여준다 (문헌[Diabetes 53: 1030, 2004]).
스쿠디(Skoudy) 등은 액티빈(activin) A(TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원)가 생쥐 배아 줄기 세포에서 외분비 췌장 유전자(p48 및 아밀라아즈) 및 내분비 유전자(Pdx1, 인슐린, 및 글루카곤)의 발현을 상향조절함을 보고한다. 최대 효과는 1 nM 액티빈 A를 이용할 때 관찰되었다. 그들은 또한 인슐린 및 Pdx1 mRNA의 발현 수준이 레틴산에 의해 영향을 받지 않지만, 3 nM FGF7 처리가 Pdx1의 전사체의 수준을 증가시킴을 관찰하였다 (문헌[Biochem. J. 379: 749, 2004]).
쉬라키(Shiraki) 등은 배아 줄기 세포의 Pdx1 양성 세포로의 분화를 특이적으로 향상시키는 성장 인자들의 효과를 연구하였다. 이들은 TGF-β2가 재현가능하게 더 높은 비율의 Pdx1 양성 세포를 생성함을 관찰하였다 (문헌[Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.]).
고든(Gordon) 등은 혈청의 부재 하에서 그리고 Wnt 시그널링의 억제제와 함께 액티빈의 존재 하에서 생쥐 배아 줄기 세포로부터 브라키우리(brachyury)+/HNF-3베타+ 내배엽 세포의 유도를 증명하였다 (미국 특허 출원 공개 제2006/0003446A1호).
고든(Gordon) 등(문헌[PNAS, Vol 103, page 16806, 2006])은"Wnt 및 TGF-베타/ 노달(nodal)/ 액티빈 시그널링은 전방 원시선(anterior primitive streak)의 생성에 동시에 필요하였다"라고 진술한다.
그러나, 배아 줄기 세포 발생의 생쥐 모델은 예를 들어, 인간과 같은 고등 포유류에서의 발생 프로그램을 정확하게 모방하지 않을 수 있다.
톰슨(Thomson) 등은 인간 배반포로부터 배아 줄기 세포를 단리하였다(문헌[Science 282:114, 1998]). 동시에, 기어하트(Gearhart)와 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 배(인간 배아 생식, hEG) 세포주를 유도하였다 (문헌[Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998]). 백혈병 억제 인자(LIF)와 함께 배양함으로써 간단하게 분화를 방지할 수 있는 생쥐 배아 줄기 세포와는 달리, 인간 배아 줄기 세포는 매우 특별한 조건 하에서 유지되어야 한다 (미국 특허 제6,200,806호; 국제특허 공개 WO 99/20741호; 국제특허 공개 WO 01/51616호).
드'아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재 하에서 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽의 농축 배양물의 생성을 개시한다 (문헌[Nature Biotechnology 2005]). 생쥐의 신장 피막하에 이들 세포를 이식하면 일부 내배엽 기관의 특징을 가진 보다 성숙한 세포로의 분화가 야기되었다. 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽 세포는 FGF-10의 첨가 후에 Pdx1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다 (미국 특허 출원 공개 제2005/0266554A1호).
드'아무르 등 (문헌[Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)])은 "우리는 인간 배아 줄기 (hES) 세포를 췌장 호르몬 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드 및 그렐린(ghrelin)을 합성할 수 있는 내분비 세포로 전환시키는 분화 과정을 개발하였다. 이 과정은 도중에 완성 내배엽, 창자관 내배엽, 췌장 내배엽, 및 내분비 전구체를 닮은 단계들을 통해 세포를 내분비 호르몬 발현 세포가 되도록 함으로써 생체내 (in vivo) 췌장 기관형성을 모방한다고 "밝혔다.
다른 예에서, 피스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터 췌도 세포를 생성하는 시스템을 보고한다(미국 특허 출원 공개 제2006/0040387A1호). 이 경우에, 분화 경로를 세 단계로 나누었다. 먼저, 인간 배아 줄기 세포는 부티르산나트륨과 액티빈 A의 조합을 사용하여 내배엽으로 분화되었다. 이어서, EGF 또는 베타셀룰린과 조합된 노긴(Noggin)과 같은 TGF-β 길항제를 이용하여 세포를 배양하여 Pdx1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.
일 예에서, 벤베니스트리(Benvenistry) 등은 "우리는 Pdx1의 과다 발현이 췌장에 풍부한 유전자의 발현을 향상시켰으며 인슐린 발현의 유도는 생체내에서만 존재하는 추가의 시그널을 필요로 할 수 있다고 결론내린다"라고 진술한다 (문헌[Benvenistry et al," Stem Cells 2006; 24:1923-1930]).
사이클린은 베타 세포 기능에 연루되어 있었다. 예를 들어, 릴자(Lilja) 등은 Cdk5가 인슐린-분비 췌장 β-세포에 존재함을 보고한다 (문헌[J. Biol. Chem., Vol. 276, Issue 36, 34199-34205, September 7, 2001]). 릴자 등은 "Cdk5는 β-세포에 존재하며 인슐린 엑소사이토시스(exocytosis)의 양성 조절자로서 작용한다."라고 진술한다.
다른 예에서, 마르조(Marzo) 등은 "Cdk4 넉인(knockin) 생쥐는 베타 세포 덩어리(mass)를 유의하게 증가시켰으며 생리학적으로 기능성인데, 이는 Cdk4가 제1형 당뇨병에서 췌장 베타 세포 덩어리 재생에 있어서의 잠재적인 표적임을 나타낸다"라고 진술한다 (문헌[Diabetalogia, Vol. 47, Number 4, 686-694, April 1, 2004.])
다른 예에서, 우베다(Ubeda) 등은 사이클린-의존성 키나아제 5 활성의 억제가 당독성으로부터 췌장 베타 세포를 보호함을 보고한다 (문헌[J. Biol. Chem., Vol. 281, Issue 39, 28858-28864, September 29, 2006]).
다른 예에서, 웨이(Wei) 등은 글루코스-자극된 인슐린 분비의 Cdk5-의존성 조절을 보고한다 (문헌[Nature Medicine 11, 1104-1108 (1 October 2005.)]).
다른 예에서, 반데르포드(Vanderford) 등은 "MafA는 췌장의 베타 세포 내에서 발현되는 염기성 류신 지퍼(leucine zipper) 전사 인자이고 정상적인 글루코스 항상성의 유지에 필요하며, 그 이유는 이것이 베타 세포 생물학의 다양한 측면에 연루되어 있기 때문이다. MafA 단백질 레벨은 아직도 완전히 특성화되어야 하는 기작을 통하여 고 글루코스에 반응하여 증가하는 것으로 공지되어 있다. 우리는 별개의 세포내 시그널링 이벤트(event)가 mafA 발현을 제어하는지를 조사하였다. 우리는 일반적인 키나아제 억제제 스타우로스포린이 mafA의 발현을 상기 단백질의 안정성을 변경하지 않고서 유도함을 알아내었다. MAP-키나아제 JNK의 억제는 mafA의 발현에 대한 스타우로스포린의 영향을 모방한다. 칼모듈린 키나아제 및 칼슘 시그널링이 고 글루코스에 의한 mafA 발현 촉진에 또한 중요하다. 그러나, 스타우로스포린, JNK 및 칼모듈린 키나아제는 인슐린 발현의 유도에 대하여 상이한 영향을 미친다. 이들 데이터는 MafA 레벨이 다수의 키나아제 경로들의 조화된 작용에 의해 엄중히 제어됨을 나타낸다."라고 진술한다 (문헌[Archives of Biochemistry and Biophysics (2008), doi: 10.1016/j.abb.2008.10.001]).
따라서, 만능 줄기 세포를 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포 또는 췌장 호르몬 분비 세포로 분화시키는 방법을 개발해야 할 상당한 필요성이 여전히 남아있다. 본 발명은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서 MAFA의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서 MAFA의 발현을 증가시키는 방법을 제공하며, 이는 MAFA의 발현을 증가시키기에 충분한 양의 사이클린-의존성 키나아제 억제제를 포함하는 배지에서 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
도 1의 패널 a는 실시간 PCR에 의해 결정할 때 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서 인슐린 대 글루카곤의 발현의 비에 대한 이엠디 칼바이오켐(EMD Calbiochem) 키나아제 억제제 라이브러리(library)로부터의 화합물의 영향을 나타낸다. 영숫자 라벨은 표 1에 예시된 바와 같이 화합물의 아이덴티티(identity)에 상응한다. 패널 b는 실시간 PCR에 의해 결정할 때 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서 MAFA 대 ARX4의 발현의 비에 대한 이엠디 칼바이오켐 키나아제 억제제 라이브러리로부터의 화합물의 영향을 나타낸다. 영숫자 라벨은 표 1에 예시된 바와 같이 화합물의 아이덴티티에 상응한다.
도 2의 A)는 실시예 1에 설명한 방법에 따라 처리된, 제6기의 처리의 4일에서의 세포의 4x 현미경 사진을 나타낸다. 도 2의 B)는 0.5 μM의 펍켐(PubChem) ID# 5330812 화합물로 처리한, 처리 4일에서의 세포의 4x 현미경 사진을 나타낸다. 도 2의 C)는 1 μM의 펍켐 ID# 5330812 화합물로 처리한, 처리 4일에서의 세포의 4x 현미경 사진을 나타낸다. 도 2의 D)는 실시예 1에 설명한 방법에 따라 처리된, 제6기의 처리의 6일에서의 세포의 20x 현미경 사진을 나타낸다. 도 2의 E)는 0.5 μM의 펍켐 ID# 5330812 화합물로 처리한, 처리 6일에서의 세포의 20x 현미경 사진을 나타낸다. 도 2의 F)는 1 μM의 펍켐 ID# 5330812 화합물로 처리한, 처리 6일에서의 세포의 20x 현미경 사진을 나타낸다.
도 3은 0.5 μM (짙은 막대) 또는 1.0 μM (연한 막대)의 펍켐 ID#5330812 화합물로 5일간 처리한 이후 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서의 23가지의 지시된 유전자의 발현을 예시한다. 발현 수준은 0일, 2일 및 5일에 결정되었다.
도 4는 실시예 4에 설명한 분화 프로토콜의 제7기로 처리된 세포에서의 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현에 대한 CDK 억제제 III 처리의 영향을 나타낸다.
도 5는 췌도-유사 클러스터의 디타존 염색에 대한 CDK 억제제 III의 영향을 나타낸다.
도 6은 실시예 5에 설명한 방법에 따라 생성된 인슐린-생산 세포에서의 인슐린, 시납토피신 및 글루카곤의 발현을 나타낸다. 지시된 단백질의 발현은 FACS에 의해 결정하였다.
도 7은 실시예 5에 설명한 방법에 따라 생성된 인슐린-생산 세포에서의 인슐린, 시납토피신 및 글루카곤의 발현을 나타낸다. 지시된 단백질의 발현은 FACS에 의해 결정하였다.
도 8은 본 발명의 방법에 의해 생성된, 인슐린 생산 세포에서의 MAFA (패널 a) 및 인슐린 (패널 b)의 발현을 나타낸다. 세포 샘플은 PCR 분석을 위하여 1일, 2일, 3일 및 4일에 취해졌다. CDK 억제제로 4일간 처리한 후, CDK 억제제를 배양물로부터 제거하고, 세포를 DMEM-F12 + 1% B27 + 20 ng/㎖의 액티빈 A에서 추가로 4일간 배양하였다. 4일의 마지막에, 샘플은 PCR 분석을 위하여 삼중으로 수집되었다.
도 9는 실시간 PCR에 의해 결정할 때, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서의 MAFA의 발현에 대한 이엠디 칼바이오켐 키나아제 억제제 라이브러리 I로부터의 화합물의 영향을 나타낸다.
도 10은 실시간 PCR에 의해 결정할 때, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서의 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 MAFA의 mRNA 발현에 대한 제네스테인의 영향을 나타낸다.
개시내용을 분명하게 하고 제한되지 않기 위해, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 소정 특징, 실시 형태 또는 응용을 기재 또는 예시하는 하기 세부 항목으로 나뉘어진다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 레벨에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 전구 세포, 비재생 전구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포 (progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 그들의 발생 잠재력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배자외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위세트이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위세트가 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 조상세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 만능 줄기 세포보다 더 제한된 하위세트의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통(예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은 ("미결정된 (uncommitted)") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화 유도된 세포는 세포 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된 (committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경하에서 특정 세포형 또는 세포형의 서브세트로 계속 분화할 것이며, 통상적인 환경하에서 다른 세포형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화는 세포가 세포 계통 내의 덜 특화된 (또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포 계통은 세포의 유전, 즉, 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포를 발생시킬 수 있는지를 규정한다. 세포 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 대상 계통의 세포 표현형과 특이적으로 관련되며, 미결정된 세포가 대상 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
"β-세포 계통"은 하기 전사 인자들 중 적어도 하나 및 전사 인자 PDX-1에 대해 양성 유전자 발현을 갖는 세포를 말한다: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 베타, MAFA, PAX4, 또는 PAX6. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: SOX-17, GATA-4, HNF-3 베타, GSC, CER1, 노달(Nodal), FGF8, 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소더민(eomesodermin)(EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99, 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, HNF-1베타, PTF-1 알파, HNF-, 또는 HB9. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포, 원시 장관(gut tube) 세포, 및 후방 전장 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, 또는 PTF1 알파. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 및 췌장 호르몬 분비 세포, 및 β-세포 계통의 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽"은 낭배의 외피(epiblast)로 인한 세포의 특징을 갖고 위장관로 및 그의 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들을 발현한다: HNF3 베타, GATA4, SOX17, 세르베루스 (Cerberus), OTX2, 구스코이드 (goosecoid), C-Kit, CD99, 또는 MIXL1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "배아외 내배엽"은 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포 집단을 말한다: SOX-7, AFP, 또는 SPARC.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 레벨 증가 및 음성 마커의 레벨 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 레벨은 다른 세포에 비하여 대상 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 대상 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "중내배엽 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: CD48, 에오메소데르민(EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 베타, GSC, FGF17 또는 GATA-6.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 세포", 또는 ,"췌장 호르몬 발현 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 또는 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내배엽 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, PAX4, 또는 NKX2.2.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 호르몬 생산 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 생산할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 또는 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 호르몬 분비 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "후방 전장 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: PDX-1, HNF-1, PTF1 알파, HNF-6, HB-9, 또는 PROX-1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전(pre)-원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 노달, 또는 FGF8.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "원시 장관 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: HNF-1 또는 HNF-4A.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질, 또는 FGF4.
만능 줄기 세포의 단리, 팽창 및 배양
만능 줄기 세포의 특성화
만능 줄기 세포는 시기-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson 등, Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현(존재하는 경우)의 손실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼라인 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때 Oct-4 및 TERT를 발현한다.
번식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 만능 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficient, SCID) 생쥐내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 만능성은 배양체 (embryoid body)를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정될 수 있다.
번식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.
만능 줄기 세포의 공급원
사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 전-배아(pre-embryonic) 조직(예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안 그러나 전형적으로 약 10-12주 임신 전일 필요는 없는 임의의 시점에 취한 태아 조직을 비롯한, 임신 후 형성된 조직으로부터 유래된 만능 세포의 확립된 주를 포함한다. 비제한적인 예로는 수립된 인간 배아 줄기 세포주 또는 인간 배아 생식 세포주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 이러한 세포의 초기 수립 또는 안정화 시에 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 만능 세포일 것이다. 영양세포의 부재하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (BresaGen (Athens, GA))가 또한 적합하다.
일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨등 (미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science 282:1145, 1998]; 문헌[Curr. Top. Biol. 38:133 ff., 1998]; 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995]에 기재된 바와 같이 제조된다.
만능 줄기 세포의 배양
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 전형적으로 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 영양 세포층 상에서 배양된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 본질적으로 영양 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지를 이용하여 지지된다. 대안적으로, 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.
예를 들어, 문헌[Reubinoff et al., Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000)] 및 문헌[Thompson et al, Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147]은 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포층을 사용하여 인간 배반포로부터 만능 줄기 세포주를 배양하는 것을 개시한다.
리차즈(Richards) 등, (문헌[Stem Cells 21: 546-556, 2003])은 인간 만능 줄기 세포 배양을 지지하는 능력에 대해 11가지 상이한 인간 성인, 태아 및 신생아 영양 세포층의 패널을 평가하였다. 리차즈 등은 "성인 피부 섬유아세포 영양세포 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포주는 인간 배아 줄기 세포 형태를 유지하며 만능으로 남아 있다"고 진술한다.
미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 영양세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기 세포의 성장을 지지하는 배지를 생성하는 세포주를 개시한다. 이용된 세포주는 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주이다. 미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 또한 일차 영양 세포층으로서의 당해 세포주의 사용을 개시한다.
다른 예에서는, 왕(Wang) 등 (문헌[Stem Cells 23: 1221-1227, 2005])은 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 영양 세포층 상에서 인간 만능 줄기 세포의 장기 성장을 위한 방법을 개시한다.
다른 예에서는, 스토코빅(Stojkovic) 등 (문헌[Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005])은 인간 배아 줄기 세포의 자발적 분화로부터 유래된 영양 세포 시스템을 개시한다.
추가 예에서, 미야모토(Miyamoto) 등 (문헌[Stem Cells 22: 433-440, 2004])은 인간 태반으로부터 얻은 영양 세포의 공급원을 개시한다.
아미트(Amit) 등 (문헌[Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003])은 인간 포피로부터 유래된 영양 세포층을 개시한다.
다른 예에서, 인준자(Inzunza) 등 (문헌[Stem Cells 23: 544-549, 2005])은 인간 출생후 포피 섬유아세포 유래의 영양 세포층을 개시한다.
미국 특허 제6642048호는 영양세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기(primate pluripotent stem, pPS) 세포의 성장을 지지하는 배지 및 그러한 배지의 생성에 유용한 세포주를 개시한다. 미국 특허 제6642048호는 "본 발명은 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주를 포함한다. 그러한 세포주를 유도하고, 배지를 가공하고, 조절된 배지를 이용하여 줄기 세포를 성장시키는 방법이 이 개시 내용에 기재되고 예시된다."라고 진술한다.
다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005014799호는 포유류 세포의 유지, 증식 및 분화를 위한 조절된 배지를 개시한다. 국제특허 공개 WO2005014799호는 "본 발명에 따라 생성된 배양 배지는 쥐과 세포, 특히 MMH(Met 쥐과 간세포(Met Murine Hepatocyte))로 불리는, 분화되고 불멸화된 트랜스제닉(transgenic) 간세포의 세포 분비 활성에 의해 조절된다"고 진술한다.
다른 예에서, 수(Xu) 등 (문헌[Stem Cells 22: 972-980, 2004])은 인간 텔로머라아제 역전사효소를 과다 발현하도록 유전적으로 변형된 인간 배아 줄기 세포 유도체로부터 얻은 조절된 배지를 개시한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20070010011호는 만능 줄기 세포의 유지를 위한 화학적으로 규명된 배양 배지를 개시한다.
대안적인 배양 시스템은 배아 줄기 세포의 증식을 촉진할 수 있는 성장 인자로 보충된 무-혈청 배지를 이용한다. 예를 들어, 천(Cheon) 등 (문헌[BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005])은 배아 줄기 세포 자가-재생을 일으킬 수 있는 상이한 성장 인자로 보충된 비조절된 혈청 대체(serum replacement, SR) 배지에서 배아 줄기 세포가 유지되는 영양세포가 없는 무-혈청 배양 시스템을 개시한다.
다른 예에서, 레벤스타인(Levenstein) 등 (문헌[Stem Cells 24: 568-574, 2006])은 bFGF로 보충된 배지를 이용하여, 섬유아세포 또는 조절된 배지의 부재 하에서 인간 배아 줄기 세포의 장기 배양을 위한 방법을 개시한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050148070호는 혈청 없이 그리고 섬유아세포 영양 세포 없이 규명된 배지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 개시하였으며, 이 방법은 알부민, 아미노산, 비타민, 미네랄, 적어도 하나의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 적어도 하나의 인슐린 또는 인슐린 대체물을 함유한 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양 배지는 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없으며 적어도 약 100 ng/㎖의, 섬유아세포 성장 인자 시그널링 수용체를 활성화시킬 수 있는 섬유아세포 성장 인자를 함유하며, 여기서 성장 인자는 단지 섬유아세포 영양세포층 이외의 공급원으로부터 공급되며, 배지는 영양 세포 또는 조절된 배지 없이 미분화된 상태로 줄기 세포의 증식을 지지한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050233446호는 미분화 영장류 원시 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포를 배양하는데 유용한 한정 배지 (defined medium)를 개시하고 있다. 용액 중에서, 배지는 배양되는 줄기 세포와 비교할 때 사실상 등장성이다. 소정의 배양액에서, 특정 배지는 기본 배지 및 원시 줄기 세포의 사실상 미분화된 성장을 지지하는데 필요한 양의 bFGF, 인슐린 및 아스코르브산 각각을 포함한다.
다른 예에서, 미국 특허 제6800480호는 "일 실시 형태에서, 사실상 미분화된 상태의 영장류-유래 원시 줄기 세포를 성장시키기 위한 세포 배양 배지가 제공되며 이 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 저 삼투압, 저 내독소 기본 배지를 포함한다. 기본 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 영양 혈청과, 영양 세포 및 영양 세포로부터 유래된 세포외 기질 성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 기질과 조합된다. 배지는 추가로 비필수 아미노산, 산화방지제, 및 뉴클레오시드와 피루베이트염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 성장 인자를 포함한다."고 진술한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050244962호는 "일 태양에서 본 발명은 영장류 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없는 (바람직하게는 또한 본질적으로 임의의 동물 혈청이 없는) 배지에서 그리고 단지 섬유아세포 영양세포층 이외의 공급원으로부터 공급된 섬유아세포 성장 인자의 존재 하에서 줄기 세포를 배양한다. 바람직한 형태에서, 이전에는 줄기 세포 배양을 지속하기 위해 필요했던 섬유아세포 영양세포층이 충분한 섬유아세포 성장 인자의 첨가에 의해 불필요해지게 된다."고 진술한다.
추가의 예에서, 국제특허 공개 WO2005065354호는 본질적으로 영양세포가 없는 그리고 무혈청인 규명된 등장성 배양 배지를 개시하였으며, 이 배지는 a. 기본 배지; b. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 bFGF; c. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 인슐린; 및 d. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 아스코르브산을 포함한다.
다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005086845호에는 미분화 줄기 세포의 유지 방법이 개시되어 있는데, 상기 방법은 줄기 세포를 원하는 결과를 성취하기에 충분한 양의 시간 동안 미분화 상태로 유지하기에 충분한 양의 형질전환 성장 인자-베타 (transforming growth factor-beta, TGF-β) 패밀리의 단백질류의 구성원, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 패밀리의 단백질류의 구성원 또는 니코틴아미드 (NIC)에 줄기 세포를 노출시키는 것을 포함한다.
만능 줄기 세포는 적합한 배양 기재 상에 도말될 수 있다. 일 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막에서 유래되거나 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 일 실시 형태에서, 적절한 배양 기재는 매트리젤 (Matrigel)(등록상표) (벡턴 디킨슨(Becton Dickenson))이다. 매트리젤(등록상표)은 실온에서 젤화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈-스왐(Engelbreth-Holm Swarm) 종양 세포 유래의 용해성 제제이다.
다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 증식되는 세포 유형에 따라, 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 적합한 분포로 그리고 세포 생존, 번식, 및 바람직한 특징의 보유를 촉진하는 배지의 존재하에서 기재상에 도말될 수 있다. 모든 이들 특성은 시딩 분포에 세심한 주의를 기울여 이익을 얻으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
적합한 배양 배지는 하기 성분들, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM), 깁코(Gibco) # 11965-092; 넉아웃(Knockout) 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), 깁코 # 10829-018; 햄(Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 깁코 # 15039-027; 비-필수 아미노산 용액, 깁코 11140-050; β-메르캅토에탄올, 시그마(Sigma) # M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 깁코 # 13256-029로부터 제조될 수 있다.
만능 줄기 세포로부터의 췌장 호르몬 생성 세포의 형성
일 실시 형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 만능 줄기세포로부터 췌장 호르몬 생성 세포를 생성하는 방법을 제공한다:
a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계.
본 발명에 사용하기에 적합한 만능 줄기 세포는 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H9 (NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1 (NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7 (NIH 코드: WA07), 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002 (스웨덴 소재의 셀라르티스(Cellartis))를 포함한다. 만능 세포의 특징적인 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 또한 본 발명에 사용하기에 적합하다: ABCG2, 크립토(cripto), CD9, FOXD3, 커넥신(Connexin)43, 커넥신45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA3, SSEA4, Tra1-60, 또는 Tra1-81.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX-17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소데르민(EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 다른 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 다른 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들은 PDX1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, 및 PTF1 알파로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 하기 전사 인자들 중 적어도 하나 및 Pdx1을 발현한다: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 베타, MAFA, PAX4, 또는 PAX6. 본 발명의 일 태양에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662(2004)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[McLean et al, Stem Cells 25 , 29 - 38 (2007)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양하고, 이어서 상이한 농도의 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 다른 농도의 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2005]에 개시된다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A와 Wnt 리간드를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 Wnt 리간드를 제거하고 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인크.(LifeScan, Inc.)에 양도된, 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인크.에 양도된, 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제61/076,889호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제61/076,900호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제61/076,908호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제61/076,915호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 분화
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성은 특정 프로토콜을 이행하기 전후에 마커의 존재에 대해 시험함으로써 결정될 수 있다. 만능 줄기 세포는 전형적으로 그러한 마커를 발현하지 않는다. 따라서, 만능 세포의 분화는 세포가 그들을 발현하기 시작할 때에 검출된다.
분화 효율은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정될 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치(in situ) 혼성화(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
만능 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능 줄기 세포의 추가의 특징은 계속 확인되고 있다. 만능 줄기 세포 마커는 예를 들어, 하기 중 하나 이상의 발현을 포함한다: ABCG2, 크립토, FOXD3, 커넥신43, 커넥신45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA3, SSEA4, Tra1-60, 또는 Tra1-81.
만능 줄기 세포를 본 발명의 방법으로 처리한 후, 분화된 세포는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현된 CXCR4와 같은 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시켜 정제할 수 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 섬유아세포 성장 인자 및 헤지호그 시그널링 경로 억제제 KAAD-사이클로파민으로 처리하고, 이어서 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 세포를 레틴산, 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 라이프스캔 인크.에 양도된, 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 소정 기간 동안 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 라이프스캔 인크.에 양도된, 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 소정 기간 동안 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 검출
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 특성을 획득한 것을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 췌장 내배엽 계통 특이적 마커는 예를 들어, HLXB9, PTF1 알파, PDX1, HNF6, 또는 HNF1 베타와 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다.
분화 효율은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치(in situ) 혼성화(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 개시된 임의의 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내분비 계통의 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내분비 계통의 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 DAPT 및 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하고, 이어서 DAPT와 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하고, 이어서 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 DAPT 및 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제60/953,178호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 본 발명은 미국 특허 출원 제61/110,278호에 개시된 방법에 따라 췌장 내분비 계통과 관련된 마커의 발현을 증가시키기에 충분한 양의 TGF-β 수용체 작용제를 포함하는 배지로 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하는 단계를 포함하는, 췌장 내분비 계통과 관련된 마커의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 검출
췌장 내분비 계통의 세포의 특징적인 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여 췌장 내분비 계통의 특징적인 특성을 획득한 것을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 췌장 내분비 계통 특이적 마커는 예를 들어, NGN3, NEUROD, 또는 ISL1과 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다.
β 세포 계통의 세포의 특징적인 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, β 세포 계통의 특징적인 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여 β-세포 계통의 특징적인 특성을 획득했는지를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. β 세포 계통 특이적 특징은 예를 들어, 다른 것들 중에서도 PDX1, NKX2.2, NKX6.1, ISL1, PAX6, PAX4, NEUROD, HNF1 베타, HNF6, HNF3 베타, 또는 MAFA와 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다. 이들 전사 인자는 내분비 세포의 확인을 위해 당업계에 잘 수립되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002))]을 참조한다.
분화 효율은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다. 대안적으로, 분화의 효능은 처리된 세포군을, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인지하는 제제(예컨대, 항체)에 노출시킴으로써 측정될 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치 혼성화(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
본 발명의 일 태양에서, 분화 효율은 처리 이후의 주어진 세포 배양물 중 인슐린 양성 세포의 백분율을 측정함으로써 결정된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 100% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 90% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 80% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 70% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 60% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 50% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 40% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 30% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 20% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 10% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 5% 인슐린 양성 세포를 생성한다.
본 발명의 일 태양에서, 분화 효율은 세포에 의해 분비된 C-펩티드의 양을 측정함으로써 검출되는 바와 같이, 포도당-자극된 인슐린 분비를 측정함으로써 결정된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 1000 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 900 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 800 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 700 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 600 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 500 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 400 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 500 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 400 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 300 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 200 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 100 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 90 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 80 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 70 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 60 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 50 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 40 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 30 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 20 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 10 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서의 MAFA의 발현 증가
일 실시 형태에서, 본 발명은 MAFA의 발현을 증가시키기에 충분한 양의 사이클린 의존성 키나아제 억제제를 포함하는 배지로 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서 MAFA의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
사이클린 의존성 키나아제 억제제는 사이클린 의존성 키나아제 1을 억제할 수 있다. 대안적으로, 사이클린 의존성 키나아제 억제제는 사이클린 의존성 키나아제 2를 억제할 수 있다. 대안적으로, 사이클린 의존성 키나아제 억제제는 사이클린 의존성 키나아제 4를 억제할 수 있다. 대안적으로, 사이클린 의존성 키나아제 억제제는 사이클린 의존성 키나아제 5를 억제할 수 있다. 대안적으로, 사이클린 의존성 키나아제 억제제는 사이클린 의존성 키나아제 9를 억제할 수 있다. 대안적으로, 사이클린 의존성 키나아제 억제제는 임의의 조합의 사이클린 의존성 키나아제의 다수의 아이소형들을 억제할 수 있다.
사이클린 의존성 키나아제 억제제는 단백질일 수 있다. 대안적으로, 사이클린 의존성 키나아제 억제제는 펩티드일 수 있다. 대안적으로, 사이클린 의존성 키나아제 억제제는 소분자일 수 있다. 일 실시 형태에서, 소분자형 사이클린 의존성 키나아제 억제제는 7-n-부틸-6-(4-하이드록시페닐)[5H]피롤로[2,3-b]피라진, 9-니트로-7,12-다이하이드로인돌로[3,2-d][1]벤즈아제핀-6(5H)-온, 3-(6-옥소-9-니트로-5,6,7,12-테트라하이드로인돌로[3,2-d][1]벤즈아제핀-2-일)프로피오니트릴, (2R)-2-((6-((3-아미노-5-클로로페닐)아미노)-9-(1-메틸에틸)-9H-퓨린-2-일)아미노)-3-메틸-1-부탄올, 아르사이리아플라빈(Arcyriaflavin) A, [6-벤질아미노-2-(3-하이드록시프로필아미노)-9-아이소프로필퓨린, 부티로락톤 I, (Z)-1-(3-에틸-5-메톡시-2,3-다이하이드로벤조티아졸-2-일리덴)프로판-2-온, 2-(3-하이드록시프로필아미노)-6-(o-하이드록시벤질아미노)-9-아이소프로필퓨린, 1-(2,6-다이클로로페닐)-1,5-다이하이드로-6-((4-(2-하이드록시에톡시)페닐)메틸)-3-(1-메틸에틸)-4H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-온, Cdk/ 사이클린 억제 펩티드 III, 3-(2-클로로-3-인돌릴메틸렌)-1,3-다이하이드로인돌-2-온, 에틸-(6-하이드록시-4-페닐벤조[4,5]푸로[2,3-b])피리딘-3-카르복실레이트, RO-3306, N-(시스-2-아미노사이클로헥실)-N-(3-클로로페닐)-9-에틸-9H-퓨린-2,6-다이아민, 6-사이클로헥실메톡시-2-(4′-설파모일아닐리노)퓨린, 5-아미노-3-((4-(아미노설포닐)페닐)아미노)-N-(2,6-다이플루오로페닐)-1H-1,2,4-트라이아졸-1-카르보티오아미드, 3-아미노-1H-피라졸로[3,4-b]퀴녹살린, Cdk2 억제제 I, Cdk2 억제제 II, 2(비스-(하이드록시에틸)아미노)-6-(4-메톡시벤질아미노)-9-아이소프로필퓨린, 4-(6-사이클로헥실메톡시-9H-퓨린-2-일아미노)-N,N-다이에틸벤즈아미드, N4-(6-아미노피리미딘-4-일)-설파닐아미드, (4-(2-아미노-4-메틸티아졸-5-일)피리미딘-2-일)-(3-니트로페닐)아민, 2-브로모-12,13-다이하이드로-5H-인돌로[2,3-a]피롤로[3,4-c]카르바졸-5,7(6H)-다이온, 1,4-다이메톡시아크리딘-9(10H)-티온, 5-(N-(4-메틸페닐)아미노)-2-메틸-4,7-다이옥소벤조티아졸, 4-(3,5-다이아미노-1H피라졸-4-일아조)-페놀, 2-(2-하이드록시에틸아미노)-6-(3-클로로아닐리노)-9-아이소프로필퓨린, 파스카프라이신(Fascaplysin), 인디루빈-3′-모녹심, 인디루빈-3′-모녹심, 5-요오도-, 인디루빈-3′-모녹심-5-설폰산, 아이소그라눌라티미드(Isogranulatimide), 2-(2-하이드록시에틸아미노)-6-벤질아미노-9-메틸퓨린, 6-(2-하이드록시벤질아미노)-2-((1R)-(하이드록시메틸)프로필)아미노)-9-아이소프로필퓨린, 5-브로모-3-(2-(4-플루오로페닐)-2-옥소에틸리딘)-1,3-다이하이드로인돌-2-온, N6,N6-다이메틸아데닌, 2-(1R-아이소프로필-2-하이드록시에틸아미노)-6-(3-클로로아닐리노)-9-아이소프로필-퓨린, 라파마이신, 2-(R)-(1-에틸-2-하이드록시에틸아미노)-6-벤질아미노-9-아이소프로필퓨린, 사이토네민(Scytonemin), 3-[1-(3H-이미다졸-4-일)-메트-(Z)-일리덴]-5-메톡시-1,3-다이하이드로인돌-2-온, 및 4-(3′-하이드록시페닐)아미노-6,7-다이메톡시퀴나졸린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서, 사이클린 의존성 키나아제 억제제는 에틸-(6-하이드록시-4-페닐벤조[4,5]푸로[2,3-b])피리딘-3-카르복실레이트이다. 일 실시 형태에서, 에틸-(6-하이드록시-4-페닐벤조[4,5]푸로[2,3-b])피리딘-3-카르복실레이트는 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 약 0.1 μM 내지 약 10 μM의 농도로 약 1일 내지 7일 동안 첨가된다.
일 실시 형태에서, 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 에틸-(6-하이드록시-4-페닐벤조[4,5]푸로[2,3-b])피리딘-3-카르복실레이트로 약 1일 내지 약 7일 동안 처리된다.
본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시하지만 하기 실시예에 의해 한정되지는 않는다.
실시예
실시예 1
소 태아 혈청의 부재 하에서의 세포주 H1의 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화
52 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤(등록상표) 코팅된 디쉬 상에서 배양하고 (1:30 희석), 하기 분화 프로토콜에 노출시켜 상기 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시켰다.
a. 1일 동안 2% BSA (카탈로그 번호 152401, 엠피 바이오메디칼(MP Biomedical), 미국 오하이오주) 및 100 ng/㎖ 액티빈-A(알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미국 미네소타주)에 더하여 20 ng/㎖ WNT-3a(카탈로그 번호 1324-WN-002, 알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 8 ng/㎖의 bFGF(카탈로그 번호 100-18B, 페프로테크(PeproTech), 미국 뉴저지주)가 보충된 RPMI 배지, 이어서 2% BSA 및 100 ng/㎖ 액티빈-A에 더하여 8 ng/㎖의 bFGF가 보충된 RPMI 배지로 추가 2일간 처리 (제1기), 이어서
b. 2일 동안 DMEM/F12 + 2% BSA + 50 ng/㎖ FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민(Cyclopamine)- KAAD (#239804, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) (제2기), 이어서
c. 4일 동안 DMEM/F12 + 1% B27 (인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주) + 50 ng/㎖ FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레틴산(Retinoic acid; RA) (시그마, 미국 미주리주) + 100 ng/㎖의 노긴 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주) (제3기), 이어서
d. 3일 동안 DMEM/F12 + 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM DAPT (감마-시크리타아제(gamma-secretase) 억제제) (카탈로그 번호 565784, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) + 1 μM ALK5 억제제 II (카탈로그 번호 616452, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/㎖의 네트린(Netrin)-4 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주) (제4기), 이어서
e. 7일 동안 DMEM/F12 + 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 1 μM ALK5 억제제 II (칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) (제5기).
배지를 매일 교환하였다. 각 시기에서 세포 개수를 혈구계(hemocytometer)를 이용해 계산하였고 PCR 분석을 위해 RNA를 수집하였다. 모든 샘플을 삼중으로 수집하였다.
실시예 2
실시예 1에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리한 세포에 대한 이엠디 키나아제 억제제 라이브러리 II로부터의 화합물의 영향의 스크리닝
44 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 24-웰 디쉬 상에 접종하고 (1:30 희석), 제5기까지 실시예 1에 설명한 방법에 따라 분화시켰다. 이것 이후, 1 μM의 최종 농도의, 이엠디 칼바이오켐 화합물 라이브러리 (카탈로그 번호 539745, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터의 화합물을 함유하는 DMEM/F12 + 1% B27에서 4일 동안 세포를 처리하였다. 비히클을 함유하는 웰을 대조군으로서 포함시켰다. 프로토콜 전체에 걸쳐 배지를 매일 교환하였다. 모든 샘플을 이중으로 처리하였다. 이 처리의 완료시에 RNA를 PCR 분석을 위하여 수집하였다. 샘플을 실시간 PCR에 의해 인슐린, 글루카곤, MAFA, 및 Arx4의 발현에 대하여 분석하였다. 실시간 PCR에 의해 측정할 때 미처리 대조군에 비하여 처리된 샘플의 인슐린/글루카곤 (도 1, 패널 a), 또는 MAFA 대 ARX4 (도 1, 패널 b)의 비로서 결과를 표현한다. 각각의 웰 번호에 대하여 상응하는 펍켐 화합물 ID#를 표 1에 열거한다.
1 μM 농도의 화합물 A6, B7, B8, 또는 C2로 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하면 인슐린/글루카곤 발현 비가 대략 3.0 이상이 된다 (도 1, 패널 a 참조).
다음, MAFA/ARX4 비에 대한 이들 화합물의 영향을 조사하였으며, 몇몇의 상기 화합물로 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하면 라이브러리 중 시험한 다른 화합물보다 MAFA 대 ARX4의 비의 변화가 더욱 더 커진다는 것을 관찰하였는데, 화합물 C2로 처리한 세포는 대략 1000의 MAFA/ARX4 비를 나타내었다. 화합물 C2로 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하면 MAFA/ARX4 비가 대략 100이 되었다 (도 1, 패널 b 참조).
실시예 3
실시예 1에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리한 세포에서의 인슐린 및 MAFA 발현에 대한 사이클린 의존성 키나아제 억제제 처리의 영향
실시예 2에서 MAFA 대 ARX4 발현의 비 또는 인슐린 대 글루카곤 발현의 비를 증가시킨 화합물들 중 몇몇은 사이클린 의존성 키나아제 억제제였다. 한 가지 이러한 화합물은 펍켐 화합물 ID# 5330797 (5-아미노-3-((4-(아미노설포닐)페닐)아미노)-N-(2,6-다이플루오로페닐)-1H-1,2,4-트라이아졸-1-카르보티오아미드) (카탈로그 번호 217714; 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주 샌디에고)였다. 이들 관찰을 확인하기 위하여, 42 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 10 ㎠ 매트리젤(등록상표)-코팅된 디쉬에서 배양하고, 실시예 1에 설명된 방법에 따라 제5기까지 처리하였다. 제5기 후, 1 μM 펍켐 화합물 ID# 5330797를 함유하는 1% B27을 함유하는 DMEM/F12로 6일 동안 상기 세포를 처리하였다. 배지를 격일로 교환하였다. 상기 화합물로 처리하기 전, 및 화합물을 처리한지 2일 및 5일에 실시간 PCR을 위하여 세포 샘플을 취하였다.
화합물을 처리한지 4일 또는 6일에서의 세포 대 미처리 대조군의 특징적인 현미경 사진이 도 2에 예시되어 있다. 미처리 세포는 고도로 패킹되어 있으며 (도 3, 패널 a 및 d) 개개의 세포를 구별하는 것은 어렵다. 그러나, 0.5 μM 또는 1 μM의 펍켐 화합물 ID#5330797로 6일 동안 처리한 후, 개개의 핵은 미처리 대조군 (도 2, 패널 d)에 비하여 가시적이게 되었으며 (도 2, 패널 e 및 f), 이는 세포 집단에서 분화가 일어나고 있음을 나타내는 것이다. 또한 이는 일부 세포 사멸이 동반되며, 이것은 도 2의 패널 b 및 c에 예시된 바와 같이 세포 층의 갭으로 알 수 있다.
세포를 펍켐 화합물 ID# 5330797로 처리하면 인슐린, 글루카곤, MAFA, MAFB 및 소마토스타틴의 발현이, 비록 상이한 정도이기는 하지만 증가되었다. 0일 (사전 처리) 배양과 비교한 처리 당 유전자 발현의 상대적인 유도가 도 3의 패널 a-v에 예시되어 있다. 1 μM 펍켐 화합물 ID# 5330797로 처리한 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 처리한지 48시간에 글루카곤 발현이 대략 1.5배 증가하였다. 이러한 발현은 처리한지 5일 후에는 사전 처리 수준 미만으로 감소하였다. 0.5 μM 펍켐 화합물 ID# 5330797의 처리에서 글루카곤 발현의 증가는 관찰되지 않았다 (도 3, 패널 a 참조).
1 μM 펍켐 화합물 ID# 5330797로 5일 동안 처리한 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 인슐린 발현이 대략 1.5배 증가하였다 (도 3, 패널 b 참조).
1 μM 펍켐 화합물 ID# 5330797로 5일 동안 처리한 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 MAFA 발현이 대략 200배 증가하였다 (도 3, 패널 d 참조).
0.5 μM 펍켐 화합물 ID# 5330797로 5일 동안 처리한 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 MAFB 발현이 대략 1.5배 증가하였다 (도 3, 패널 c 참조). 소마토스타틴 발현의 용량-의존적 증가가 관찰되었다 (도 3, 패널 e).
펍켐 화합물 ID# 5330797로 5일 동안 처리한 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서 아밀라아제 발현의 변화는 관찰되지 않았다 (도 3, 패널 f 참조). 그러나, PAX4 (도 3, 패널 h), NKX6.1 (도 3, 패널 k), PDX1 (도 3, 패널 l), NEUROD (도 3, 패널 o), 및 BRN4 (도 3, 패널 q)의 발현 수준 감소가 관찰되었다.
실시예 4
사이클린 의존성 키나아제 억제제 처리는 췌도-유사 클러스터에서의 MAFA의 발현을 증가시켰다.
52 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤(등록상표) 코팅된 디쉬 상에서 배양하고 (1:30 희석), 실시예 1에 설명된 방법에 따라 분화시켰다. 추가 시기 (제6기)를 부가하여, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 추가로 성숙시켰다. 이 실시예에서 제6기는 DMEM/F12 + 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주)에서의 7일간 처리로 이루어졌다. 배지를 매일 교환하였다.
제6기 후, 세포를 실온에서 5분 동안 1X 아큐타아제(accutase) (시그마, 미국 미주리주)로 처리하였다. 아큐타아제를 제거하고, DMEM/12 + 1% B27을 세포에 첨가하였다. 부착된 세포를 세포 스크레이퍼를 이용하여 제거하고, 부드럽게 재현탁시키고, 40 ㎛ 세포 여과기에 통과시켰다. 상기 여과기 상에 보유된 세포를 기본 배지에서의 린스에 의해 제거하고, 울트라-로우(Ultra-Low) 배양 플레이트 (카탈로그 번호 3471, 코닝(Corning), 미국 매사추세츠주)에서 현탁 배양하였다. 이어서 세포를 하기와 같이 처리하였다: 20 ng/㎖의 액티빈 A(AA), 1 ㎛의 CDK 억제제 III (카탈로그 번호 217714, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주)을 함유하는 DMEM/F12 + 1 % B27에서 10일 동안 세포를 배양하였다 (제7기). 비히클로 처리한 세포를 대조군으로서 포함시켰다. PCR 분석 및 디티존 염색을 위하여 7일 내지 10일에 샘플을 수집하였다. 이 실시예에 약술된 방법에 따라 현탁 배양한 세포는 췌도 클러스터와 유사한 형태를 지녔다. CDK 억제제 III을 이용한 처리는 췌도 유사 클러스터의 형태에 영향을 주지 않는 것으로 보였다.
도 4, 패널 a-i는 상기 세포 클러스터의 유전자 발현 프로파일에 대한 CDK 억제제 III 처리의 영향을 보여준다. CDK 억제제 III을 이용한 처리는 췌장 내분비 계통과 관련된 마커의 발현을 증가시켰으며 특히 프로-인슐린 전사 인자, MAFA의 발현을 증가시켰다.
도 5, 패널 a-b는 클러스터의 디타존(DTZ) 염색에 대한 CDK 억제제 III의 영향을 보여준다. CDK 억제제로 처리하고 DTZ로 염색시킨 세포 클러스터는 CDK 억제제 III으로 처리하지 않은 클러스터에 비하여 더욱 불그스름한 염색 패턴을 나타내었다.
실시예 5
본 발명의 방법에 의해 생성된 인슐린 생산 세포의 FACS 분석.
42 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤(등록상표) 코팅된 플레이트 상에서 배양하고, 하기 프로토콜을 이용하여 인슐린 생산 세포로 분화시켰다.
a. 1일 동안 2% BSA (카탈로그 번호 152401, 엠피 바이오메디칼, 미국 오하이오주) 및 100 ng/㎖ 액티빈-A(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 20 ng/㎖ WNT-3a(카탈로그 번호 1324-WN-002, 알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 8 ng/㎖의 bFGF(카탈로그 번호 100-18B, 페프로테크(PeproTech), 미국 뉴저지주)가 보충된 RPMI 배지, 이어서 2% BSA 및 100 ng/㎖ 액티빈-A에 더하여 8 ng/㎖의 bFGF가 보충된 RPMI 배지로 추가 2일간 처리 (제1기), 이어서
b. 2일 동안 DMEM/F12 + 2% BSA + 50 ng/㎖ FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD (#239804, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) (제2기), 이어서
c. 4일 동안 DMEM/F12 + 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/㎖ FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레틴산(RA) (시그마, 미국 미주리주) + 100 ng/㎖의 노긴 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주) (제3기), 이어서
d. 3일 동안 DMEM/F12 + 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM DAPT (감마-시크리타아제 억제제) (카탈로그 번호 565784, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) + 1 μM ALK5 억제제 II (카탈로그 번호 616452, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/㎖의 네트린-4 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주) (제4기), 이어서
e. 7일 동안 DMEM/F12 + 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 1 μM ALK5 억제제 II (칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) (제5기), 이어서
f. 7일 동안 DMEM/F12 + 1% B27 (제6기), 이어서
g. 5분 동안 아큐타아제를 이용한 처리, 이어서 긁어내어서 임의의 잔류하는 부착된 세포를 제거. 이어서 세포 현탁물을 40 ㎛ 세포 여과기에 통과시켰다. 여과기 상에 보유된 세포를 기본 배지에서의 린스에 의해 제거하고, 울트라-로우 배양 플레이트에서 DMEM-고 글루코스 (카탈로그 번호 11995-073, 인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 1 % B27 + 20 ng/㎖의 액티빈 A(AA) 1 ㎛의 CDK 억제제 III (카탈로그 번호 217714, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주)에서 5일 동안 현탁 배양하였다 (제7기).
췌도-유사 클러스터를 트립엘이 익스프레스(TrypLE Express) (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 단일 세포로 분산시키고, 냉 PBS에서 세척하였다. 고정을 위하여, 세포를 200-300 μl의 사이토픽스(Cytofix)/사이토펌(Cytoperm) 완충액 (비디(BD) 554722, 캐나다 BD)에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1 ㎖ 펌/와시(Perm/Wash) 완충액 (비디 554723)에서 2회 세척하고, 펌/와시 완충액 중 2% 정상 염소 혈청을 함유하는 100 μl 염색/차단 용액 중에 재현탁시켰다. 유세포 분석을 위하여, 세포를 하기 일차 항체로 염색하였다: 항-인슐린 (토끼 mAb, 셀 시그널링(Cell Signaling) 번호 C27C9; 1:100 희석); 항-글루카곤 (생쥐 Mab, 시그마 번호 G2654, 1:100); 항-시납토피신 (토끼 다클론 항체, 다코사이토메이션(DakoCytomation) 번호 A0010, 1:50). 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 펌/와시 완충액에서 2회 세척하고, 하기와 같이 적절한 이차 항체에서 추가로 30분간 인큐베이션하였다: 염소 항-토끼 알렉사(Alexa) 647 (인비트로젠 번호 A21246) 또는 염소 항-생쥐 647 (인비트로젠 번호 A21235); 염소 항-토끼 R-PE (바이오소스(BioSource) 번호 ALI4407). 모든 이차 항체를 1:200으로 희석하여 사용하였다. 세포를 펌/와시 완충액에서 적어도 1회 세척하고, 비디 팩스어레이(FACSArray)를 사용하여 분석하였다. 적어도 10,000개의 성과(event)를 분석용으로 획득하였다. 대조군은 미분화 H1 세포 및 β-TC (CRL-11506™ ATCC, 미국 버지니아주) 세포주를 포함하였다.
도 6, 패널 a-c는 비히클을 함유하는 배지에서의 제7기의 처리 이후의 세포 중 인슐린 양성, 시납토피신 양성 및 글루카곤 양성 세포의 백분율을 보여준다. 도 7, 패널 a-c는 1 μM CDK 억제제 III을 함유하는 배지에서 5일 동안 단계 7의 처리 이후의 인슐린 양성, 시납토피신 양성 및 글루카곤 양성 세포의 백분율을 보여준다. 단일 호르몬 인슐린 양성 세포의 개수는 CDK 억제제를 이용한 처리 이후 3%로부터 8%까지 증가하였다. 부가적으로, 다중호르몬 (인슐린 및 글루카곤 양성) 세포의 백분율은 CDK 억제제를 이용한 처리 이후 감소하였다.
실시예 6
CDK 억제제-유도된 MAFA 발현의 동력학적 특성.
42 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤(등록상표) 코팅된 플레이트 상에서 배양하고, 하기 프로토콜을 이용하여 인슐린 생산 세포로 분화시켰다.
a. 1일 동안 2% BSA (카탈로그 번호 152401, 엠피 바이오메디칼, 미국 오하이오주) 및 100 ng/㎖ 액티빈-A(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 20 ng/㎖ WNT-3a(카탈로그 번호 1324-WN-002, 알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 8 ng/㎖의 bFGF(카탈로그 번호 100-18B, 페프로테크, 미국 뉴저지주)가 보충된 RPMI 배지, 이어서 2% BSA 및 100 ng/㎖ 액티빈-A에 더하여 8 ng/㎖의 bFGF가 보충된 RPMI 배지로 추가 2일간 처리 (제1기), 이어서
b. 2일 동안 DMEM/F12 + 2% BSA + 50 ng/㎖ FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD (#239804, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) (제2기), 이어서
c. 4일 동안 DMEM/F12 + 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/㎖ FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레틴산(RA) (시그마, 미국 미주리주) + 100 ng/㎖의 노긴 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주) (제3기), 이어서
d. 3일 동안 DMEM/F12 + 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM DAPT (감마-시크리타아제 억제제) (카탈로그 번호 565784, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) + 1 μM ALK5 억제제 II (카탈로그 번호 616452, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/㎖의 네트린-4 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주) (제4기), 이어서
e. 7일 동안 DMEM/F12 + 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 1 μM ALK5 억제제 II (칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) (제5기), 이어서
f. 7일 동안 DMEM/F12 + 1% B27 (제6기), 이어서
g. 5분 동안 아큐타아제를 이용한 처리, 이어서 긁어내어서 임의의 잔류하는 부착된 세포를 제거. 이어서 세포 현탁물을 40 μm 세포 여과기에 통과시켰다. 여과기 상에 보유된 세포를 기본 배지에서의 린스에 의해 제거하고, 울트라-로우 배양 플레이트에서 DMEM-고 글루코스 (카탈로그 번호 11995-073, 인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 1 % B27 + 20 ng/㎖의 액티빈 A(AA) 2 ㎛의 CDK 억제제 III (카탈로그 번호 217714, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주)에서 1-8일 동안 현탁 배양하였다 (제7기).
샘플을 PCR 분석을 위하여 1일, 2일, 3일 및 4일에 수집하였다. CDK 억제제로 4일간 처리한 후, CDK 억제제를 배양물로부터 제거하고, 세포를 DMEM-F12 + 1% B27 + 20 ng/㎖의 액티빈 A에서 추가로 4일간 배양하였다. 4일의 마지막에, 샘플을 PCR 분석을 위하여 삼중으로 수집하였다.
도 8, 패널 a-b는 제7기의 다양한 시점에서의 MAFA 및 인슐린의 발현 패턴을 보여준다. CDK 억제제로 처리하면 MAFA 및 인슐린 발현이 유의하게 증가하였으며, 이는 시간의 함수로서 증가하였다. 그러나, CDK 억제제를 제거하면 상기 화합물의 제거 후 4일에 얻은 샘플에서 MAFA 및 인슐린 둘 모두의 발현이 유의하게 강하되었다.
실시예 7
실시예 1에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리한 세포에 대한 바이오몰(BIOMOL™) 키나아제 억제제 라이브러리로부터의 화합물의 영향의 스크리닝.
51 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤(등록상표) 코팅된 24-웰 디쉬 상에 접종하고 (1:30 희석), 제5기까지 실시예 1에 설명한 방법에 따라 분화시켰다. 이것 이후, 세포를 DMEM/F12 + 1% B27에서 1일 동안 성장시키고, 이어서 4 μM의 최종 농도의, 바이오몰™ 화합물 라이브러리 (카탈로그 번호 2832, 바이오몰, 미국 펜실베이니아주 플라이마우스 미팅)로부터의 화합물을 함유하는 DMEM/F12 + 1% B27에서 6일 동안 처리하였다. 비히클을 함유하는 웰을 대조군으로서 포함시켰다. 처리 프로토콜 전체에 걸쳐 비히클 또는 화합물을 함유하는 배지를 격일로 교환하였다. 모든 샘플을 이중으로 처리하였다. 이 처리의 완료시에 RNA를 PCR 분석을 위하여 수집하였다. 샘플을 실시간 PCR에 의해 인슐린, 글루카곤, MAFA, 및 ARX4의 발현에 대하여 분석하였다. 실시간 PCR에 의해 측정할 때 미처리 대조군에 비하여 처리된 샘플의 인슐린/글루카곤 (VY 2)), 또는 MAFA 대 Arx4 (VY 2)의 비로서 결과를 표현한다. 각각의 영숫자 웰 번호에 대하여 상응하는 카탈로그 번호, CAS#, 및 화합물 명칭 또는 ID#가 표 3에 열거되어 있다.
4 μM 농도의 화합물 C8 또는 F1로 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하면 인슐린/글루카곤 발현 비가 대략 10.0 이상이 된다. D9로 처리한 세포는 인슐린/글루카곤 비가 대략 1840.0이었다 (표 2).
다음, MAFA/ARX4 비에 대한 이들 화합물의 영향을 조사하였으며, 몇몇 화합물로 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하면 라이브러리 중 시험한 다른 화합물보다 MAFA 대 ARX4의 비의 변화가 더욱 더 커진다는 것을 관찰하였는데, 화합물 B6 또는 F1로 처리한 세포는 대략 10 초과의 MAFA/ARX4 비를 나타내었다. 화합물 C8로 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하면 MAFA/ARX4 비가 대략 84가 된 반면, D9로 처리한 세포는 MAFA/ ARX4 비가 대략 212였다 (표 2).
실시예 8
실시예 1에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리한 세포에서의 인슐린 및 MAFA 발현에 대한 사이클린 의존성 키나아제 억제제의 영향.
51 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 24-웰 디쉬 상에 접종하고 (1:30 희석), 제5기까지 실시예 1에 설명한 방법에 따라 분화시켰다. 이것 이후, 세포를 DMEM/F12 + 1% B27에서 8일 동안 성장시키고, 이어서 0.6125, 1.25, 또는 5.0 μM의 최종 농도의 사이클린 의존성 키나아제 억제제를 함유하는 DMEM/F12 + 1% B27에서 4일 동안 처리하였다. 하기 6가지의 억제제를 시험하였다: 펍켐 ID# 5330812 (이엠디 카탈로그 번호 217714), 펍켐 ID# 4566 (이엠디 카탈로그 번호 217713), 펍켐 ID# 5330797 (이엠디 카탈로그 번호 219476), 펍켐 ID# 73292 (이엠디 카탈로그 번호 341251), 펍켐 ID# 4592 (이엠디 카탈로그 번호 495620), 및 펍켐 ID# 160355 (이엠디 카탈로그 번호 557360). 비히클을 함유하는 웰을 대조군으로서 포함시켰다. 처리 프로토콜 전체에 걸쳐 비히클 또는 화합물을 함유하는 배지를 격일로 교환하였다. 모든 샘플을 이중으로 처리하였다. 이 처리의 완료시에 RNA를 PCR 분석을 위하여 수집하였다. 샘플을 실시간 PCR에 의해 인슐린, 글루카곤, MAFA, 및 ARX4의 발현에 대하여 분석하였다. 실시간 PCR에 의해 측정할 때 비히클 처리 대조군과 비교한 변화 배수로서 결과를 표현한다.
화합물 펍켐 ID# 5330812, 펍켐 ID# 4566, 펍켐 ID# 5330797, 및 펍켐 ID# 73292 전부가 시험한 농도에서 MAFA 발현을 촉진함을 관찰하였다 (표 4). 펍켐 ID# 4592 및 펍켐 ID# 160355는 시험한 농도에서 MAFA를 촉진하지 않았다 (표 4). 화합물 펍켐 ID# 5330812, 펍켐 ID# 4566, 펍켐 ID# 5330797, 펍켐 ID# 4592 및 펍켐 ID# 160355 전부는 인슐린 발현을 촉진하는 것으로 보였다 (표 4). 화합물 펍켐 ID# 5330797은 MAFA 발현을 촉진하면서 글루카곤 및 Arx4 둘 모두의 발현은 감소시켰다 (표 4).
실시예 9
소 태아 혈청이 결여된, 25 mM 글루코스를 함유하는 DMEM ( DMEM - HG )을 이용한 세포주 H1 의 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화
인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤(등록상표) 코팅된 디쉬 상에서 배양하고 (1:30 희석), 하기 프로토콜을 사용하여 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시켰다:
a. 1일 동안 2% BSA (카탈로그 번호 152401, 엠피 바이오메디칼, 미국 오하이오주) 및 100 ng/㎖ 액티빈-A(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 20 ng/㎖ WNT-3a(카탈로그 번호 1324-WN-002, 알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 8 ng/㎖의 bFGF(카탈로그 번호 100-18B, 페프로테크, 미국 뉴저지주)가 보충된 RPMI 배지, 이어서 2% BSA 및 100 ng/㎖ 액티빈-A에 더하여 8 ng/㎖의 bFGF가 보충된 RPMI 배지로 추가 2일간 처리 (제1기), 이어서
b. 2일 동안 2% BSA + 50 ng/㎖ FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD (#239804, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주)로 보충된 RPMI 배지 (제2기), 이어서
c. 6일 동안 DMEM-HG + 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/㎖ FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레틴산(RA) (시그마, 미국 미주리주) + 100 ng/㎖의 노긴 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주) (제3기), 이어서
d. 3일 동안 DMEM-HG + 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/㎖의 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II (카탈로그 번호 616452, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) (제4기), 이어서
e. 7일 동안 DMEM-HG + 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 1 μM ALK5 억제제 II (칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) (제5기).
배지를 매일 교환하였다. 각 시기에서 세포 개수를 혈구계를 이용해 계산하였고 PCR 분석을 위해 RNA를 수집하였다. 모든 샘플을 삼중으로 수집하였다.
실시예 10
실시예 9에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리한 세포에 대한 이엠디 키나아제 억제제 라이브러리 I로부터의 화합물의 영향의 스크리닝
45 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤(등록상표) 코팅된 24-웰 디쉬 상에 접종하고 (1:30 희석), 제5기까지 실시예 9에 설명한 방법에 따라 분화시켰다. 이것 이후, 세포에 DMEM-HG, 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주), 1 μM ALK5 억제제 II (칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) 및 DMSO에 용해시킨 이엠디 칼바이오켐 화합물 라이브러리 1로부터의 화합물 (카탈로그 번호 539744, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 포함하는 배지를 제5기의 1일, 3일 및 5일에 공급하여 처리하고, 2.5 μM의 최종 농도로 처리하였다. 비히클을 함유하는 웰을 대조군으로서 포함시켰다. 배지를 격일로 교환하는 제5기를 제외하고는 상기 프로토콜 전체에 걸쳐 배지를 매일 교환하였다. 모든 샘플을 이중으로 처리하였다.
이 처리의 완료시에 RNA를 PCR 분석을 위하여 수집하였다. 샘플을 실시간 PCR에 의해 MAFA의 발현에 대하여 분석하였다. 실시간 PCR에 의해 측정할 때 미처리 H1 인간 배아 줄기 세포에 대한 MAFA 발현 증가 배수로서 결과를 표현한다 (표 5).
2.5 μM 농도의 화합물 A4 (카탈로그 번호, 124001, Akt 억제제 IV), E8 (카탈로그 번호 527450, PKR 억제제), 및 F9 (카탈로그 번호 539648, 스타우로스포린, N-벤조일-)로 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하면 MAFA 발현이 비히클 처리 대조군보다 적어도 4배 더 증가하였다 (표 5). 2.5 μM 농도의 화합물 E6 (카탈로그 번호 521233, PDGF 수용체 타이로신 키나아제 억제제 IV)으로 처리하면 MAFA 발현이 비히클 처리 대조군보다 적어도 2.5배 더 증가하였다 (표 5).
실시예 11
실시예 9에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리한 세포에 대한 이엠디 키나아제 억제제 라이브러리 II로부터의 화합물의 영향의 스크리닝
46 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤(등록상표) 코팅된 24-웰 디쉬 상에 접종하고 (1:30 희석), 제5기까지 실시예 9에 설명한 방법에 따라 분화시켰다. 이것 이후, 세포에 DMEM-HG, 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주), 1 μM ALK5 억제제 II (칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) 및 DMSO에 용해시킨 이엠디 칼바이오켐 화합물 라이브러리 II로부터의 화합물 (표 1 및 표 6, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 포함하는 배지를 제5기의 1일, 3일 및 5일에 공급하여 처리하고, 2.5 μM의 최종 농도로 처리하였다. 비히클을 함유하는 웰을 대조군으로서 포함시켰다. 배지를 격일로 교환하는 제5기를 제외하고는 상기 프로토콜 전체에 걸쳐 배지를 매일 교환하였다. 모든 샘플을 이중으로 처리하였다.
이 처리의 완료시에 RNA를 PCR 분석을 위하여 수집하였다. 샘플을 실시간 PCR에 의해 MAFA의 발현에 대하여 분석하였다. MAFA의 발현을 촉진한 화합물에 대한 결과는 실시간 PCR에 의해 측정할 때 대조 샘플에 대한 MAFA 발현 증가 배수로서 예시하고 표현한다 (표 9).
2.5 μM 농도의 알스테르파울론(Alsterpaullone), 2-시아노에틸; SU9516; 알스테로파울론; Cdk1/2 억제제 III; 카제인 키나아제 I 억제제, D4476; 또는 MEK1/2 억제제 중 어느 하나로 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하면 미처리 대조군에 대하여 MAFA 발현이 4.5배 증가하였다 (표 7).
실시예 12
소분자 억제제를 이용하여 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서의 세포 주기 진행을 억제하면 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서의 MAFA 발현이 촉진된다
세포 주기 진행에서 생기는 세포 성장을 세포외 성장 인자에 의한 세포의 자극에 의해 활성화 및 유지시킬 수 있다. 성장 인자는 성장 인자 수용체의 세포외 도메인에 결합하여, 상기 수용체의 세포내 도메인에서 배좌 스위치를 유도한다. 이러한 이동은 상기 수용체의 세포내 도메인 상에 위치한 타이로신 키나아제의 수용체 이량체화 및 활성화를 개시하여 다수의 세린/트레오닌 키나아제 하류의 인산화 및 활성화에 이르게 되어, 궁극적으로는 세포 주기 진행 및 세포 증식으로 이어진다.
보통의 생리학적 조건 하에서, 인슐린 및 전사 인자 MAFA의 발현을 특징으로 하는 성숙 췌장 베타 세포는 휴면 상태이며 세포 주기의 G0에 남아있는 경향이 있다. 그러나, 기능성 기관을 형성하기에 충분한 세포를 생성하여 성숙 동물의 필요성을 충족시키기 위하여, 본 발명의 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 세포 사이클링성(cell cycling)이어야 한다. 따라서, 배아 발생의 일부 시점에서, 본 발명의 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 베타 세포로 분화되어 능동적 세포-사이클링 증식 세포로부터 휴면 세포로 전환된다.
본 출원인의 데이터는 소분자 키나아제 억제제로 시그널링 캐스케이드(cascade)를 차단함으로써 세포 주기 진행을 억제함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 성숙 췌장 베타 세포의 마커인 MAFA를 발현하도록 유도할 수 있음을 나타낸다. 성장 인자 수용체를 표적으로 하는 키나아제 억제제, (PDGF 수용체 타이로신 키나아제 억제제 IV), 또는 타이로신 키나아제 수용체의 하류의 키나아제를 방해하는 억제제 (MEK1/2 억제제, PKR 억제제, 또는 Akt 억제제 IV)는 증식 성장 인자/키나아제 기반의 시그널링을 방해하여 세포 주기를 저지하고 MAFA 발현을 유도한다. 스타우로스포린과 같은 광범위 스펙트럼의 억제제의 사용은 MAFA를 효과적으로 유도할 수 있지만, 이것은 또한 유효 농도에서 세포독성을 갖는다. 더욱 유도성인 화합물, 예를 들어 사이클린 의존성 키나아제 억제제 (알스테르파울론, 2-시아노에틸; SU9516; 알스테르파울론; 또는 Cdk1/2 억제제 III)는 스타우로스포린과 같은 광범위 스펙트럼의 억제제보다 더 작은 독성으로 MAFA를 유도한다.
광범위 스펙트럼의 키나아제 억제제가 MAFA 발현 및 본 발명의 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 있어서의 더욱 성숙한 표현형을 유도할 수 있는지를 결정하기 위하여, H1 인간 ES 세포를 실시예 9에 설명한 방법에 따라 분화시키고, 인간 및 쥐과 세포주에서 G2기 저지를 유도하고 다수의 키나아제를 억제하는 것으로 밝혀진 단백질-타이로신 키나아제 억제제, 제니스테인을 이용하여 상기 세포를 제5기의 1일, 3일 및 5일에 처리하였다. 10 및 30 ng/㎖의 용량에서, 내분비 호르몬인 인슐린, 소마토스타틴 및 전사 인자 MAFA 전부는 미처리 대조군에 대하여 증가된 발현을 나타낸 반면, 10 ng/㎖에서 내분비 호르몬 글루카곤의 발현이 증가하였다 (도 10). 제니스테인의 100 ng/㎖의 용량에서 상당한 독성을 관찰하였으며, 이는 인슐린, 글루카곤 및 소마토스타틴 발현의 손실과 상관 관계가 있었다.
이들 데이터는 세포내 시그널링 키나아제를 통한 성장 인자 수용체 타이로신 키나아제로부터의 핵 및 사이클린 의존성 키나아제로의 신호 전달을 억제하도록 표적화된 소분자 키나아제 억제제로 시그널링 캐스케이드를 차단함으로써 세포 주기 진행을 억제함에 의해 본 발명의 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 성숙 췌장 베타 세포의 마커인 MAFA를 발현하도록 유도할 수 있음을 나타낸다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 태양은 실시예 및 바람직한 실시 형태를 참조로 하여 상기 예시되었지만, 본 발명의 범주는 전술한 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 의해서가 아니라 특허법의 원리 하에 적절하게 해석되는 하기 특허청구범위에 의해 정의되는 것으로 이해될 것이다.
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Claims (14)

  1. 사이클린-의존성 키나아제 억제제를 첨가한 배지에서 배양되지 않은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포와 비교하여 인슐린 및 MAFA의 발현을 증가시키기 위해 사이클린-의존성 키나아제 억제제를 첨가한 배지에서 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하며,
    상기 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, PTF1 알파 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    상기 사이클린-의존성 키나아제 억제제는 5-아미노-3-((4-(아미노설포닐)페닐)아미노)-N-(2,6-다이플루오로페닐)-1H-1,2,4-트라이아졸-1-카르보티오아미드, 6-사이클로헥실메톡시-2-(4′-설파모일아닐리노)퓨린, 13-옥소-12,13-디하이드로피리도[1,2-a:3,4-b']디인돌-5-이움 클로라이드, 및 2-브로모-12,13-디하이드로-5H-인돌로[2,3-a]피롤로[3,4-c]카바졸-5,7(6H)-디온으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서 인슐린 및 MAFA의 발현을 증가시키는 방법.
  2. a. 인간 만능 줄기 세포를 순차적으로 분화시켜 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 수득하는 단계; 그리고
    b. 사이클린-의존성 키나아제 억제제를 첨가한 배지에서 배양되지 않은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포와 비교하여 인슐린 및 MAFA의 발현을 증가시키기 위해 사이클린-의존성 키나아제 억제제를 첨가한 배지에서 상기 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하며,
    상기 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, PTF1 알파 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    상기 사이클린-의존성 키나아제 억제제는 5-아미노-3-((4-(아미노설포닐)페닐)아미노)-N-(2,6-다이플루오로페닐)-1H-1,2,4-트라이아졸-1-카르보티오아미드, 6-사이클로헥실메톡시-2-(4′-설파모일아닐리노)퓨린, 13-옥소-12,13-디하이드로피리도[1,2-a:3,4-b']디인돌-5-이움 클로라이드, 및 2-브로모-12,13-디하이드로-5H-인돌로[2,3-a]피롤로[3,4-c]카바졸-5,7(6H)-디온으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서 인슐린 및 MAFA의 발현을 증가시키는 방법.
  3. 사이클린-의존성 키나아제 억제제를 첨가한 배지에서 배양되지 않은 췌장 내분비 세포 집단과 비교하여 인슐린 및 MAFA의 발현을 증가시키기 위해 사이클린-의존성 키나아제 억제제를 첨가한 배지에서 췌장 내분비 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하며,
    상기 사이클린-의존성 키나아제 억제제는 5-아미노-3-((4-(아미노설포닐)페닐)아미노)-N-(2,6-다이플루오로페닐)-1H-1,2,4-트라이아졸-1-카르보티오아미드, 6-사이클로헥실메톡시-2-(4′-설파모일아닐리노)퓨린, 13-옥소-12,13-디하이드로피리도[1,2-a:3,4-b']디인돌-5-이움 클로라이드, 및 2-브로모-12,13-디하이드로-5H-인돌로[2,3-a]피롤로[3,4-c]카바졸-5,7(6H)-디온으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 췌장 내분비 세포를 포함하는 집단에서 인슐린 및 MAFA의 발현을 증가시키는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이클린-의존성 키나아제 억제제는 5-아미노-3-((4-(아미노설포닐)페닐)아미노)-N-(2,6-다이플루오로페닐)-1H-1,2,4-트라이아졸-1-카르보티오아미드인, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이클린-의존성 키나아제 억제제는 6-사이클로헥실메톡시-2-(4′-설파모일아닐리노)퓨린인, 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이클린-의존성 키나아제 억제제는 13-옥소-12,13-디하이드로피리도[1,2-a:3,4-b']디인돌-5-이움 클로라이드인, 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이클린-의존성 키나아제 억제제는 2-브로모-12,13-디하이드로-5H-인돌로[2,3-a]피롤로[3,4-c]카바졸-5,7(6H)-디온인, 방법.
  8. 에틸-(6-하이드록시-4-페닐벤조[4,5]푸로[2,3-b])피리딘-3-카르복실레이트를 포함하는 배지에서 배양되지 않은 췌장 내분비 세포 집단과 비교하여 인슐린 및 MAFA의 발현을 증가시키기 위해 에틸-(6-하이드록시-4-페닐벤조[4,5]푸로[2,3-b])피리딘-3-카르복실레이트를 첨가한 배지에서 췌장 내분비 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는, 췌장 내분비 세포를 포함하는 집단에서 인슐린 및 MAFA의 발현을 증가시키는 방법.
  9. a. 인간 만능 줄기 세포를 순차적으로 분화시켜 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 수득하는 단계; 그리고
    b. 에틸-(6-하이드록시-4-페닐벤조[4,5]푸로[2,3-b])피리딘-3-카르복실레이트를 첨가한 배지에서 배양되지 않은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포와 비교하여 인슐린 및 MAFA의 발현을 증가시키기 위해 에틸-(6-하이드록시-4-페닐벤조[4,5]푸로[2,3-b])피리딘-3-카르복실레이트를 첨가한 배지에서 상기 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하며,
    상기 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, PTF1 알파 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서 인슐린 및 MAFA의 발현을 증가시키는 방법.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 세포의 집단을 1 일 내지 7 일 동안 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 췌장 내분비 세포를 포함하는 집단에 에틸-(6-하이드록시-4-페닐벤조[4,5]푸로[2,3-b])피리딘-3-카르복실레이트가 1 일 내지 7 일 동안 0.1 μM 내지 10 μM 첨가되는 것인, 방법.
  12. 제 1 항, 제 2 항 및 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 췌장 내분비 세포인, 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
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