JP5991796B2 - 胚性幹細胞培養のための自動化された方法および装置 - Google Patents
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Description
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
規定の培地条件下における多能性幹細胞の自動化増殖のための方法であって:
(a)規定の増殖培地において多能性細胞の第一の集団を得る工程と;
(b)自動化分離システムによって該多能性細胞を分離する工程と;
(c)新鮮な規定の増殖培地中に該分離された細胞を懸濁して多能性細胞の増殖した集団を得る工程と、
を包含する、方法。
(項目2)
前記多能性細胞がES細胞または人工多能性細胞(iPS)である項目1に記載の方法。
(項目3)
前記細胞がヒトES細胞である、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記培養された増殖した多能性ES細胞のうち少なくとも97%で分化が全く生じないか、または本質的に生じない、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記増殖培地がTeSR培地を含む、項目1に記載の方法。
(項目6)
多能性細胞の前記第一の集団が細胞培養プレート上に含まれる、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記細胞培養プレートがゲル・マトリックスを含む、項目6に記載の方法。
(項目8)
多能性細胞の前記第一の集団が細胞分離の時点で約50%コンフルエントと約99%コンフルエントとの間である、項目6に記載の方法。
(項目9)
多能性細胞の前記第一の集団が細胞分離の時点で約60%、70%、80%または90%コンフルエントである、項目8に記載の方法。
(項目10)
新鮮増殖培地中の前記分離された細胞を懸濁する工程が、1つ以上の新規な細胞培養プレート(単数または複数)中に該細胞を播種する工程を包含する、項目6に記載の方法。
(項目11)
前記新規な細胞培養プレート(単数または複数)の表面積がES細胞の前記第一の集団を含んでいる該プレートの該表面積よりも約5倍と約35倍との間大きい、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記新規な細胞培養プレート(単数または複数)の前記表面積がES細胞の前記第一の集団を含んでいる該プレートの該表面積よりも約10と約35倍との間大きい、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記自動化分離プロトコールが、多能性細胞の前記第一の集団とタンパク質分解酵素とを接触させる工程を包含する、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記タンパク質分解酵素がトリプシンである、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記タンパク質分解酵素が、組み換えトリプシン、トリプシン様プロテイナーゼ、またはTRYPLEである、項目13に記載の方法。
(項目16)
前記タンパク質分解酵素が、組み換え酵素である、項目13に記載の方法。
(項目17)
前記新鮮増殖培地がタンパク質分解酵素のインヒビターを含む、項目1に記載の方法。
(項目18)
前記新鮮増殖培地が細胞分離のために用いられる前記タンパク質分解酵素のインヒビターを含む、項目13に記載の方法。
(項目19)
前記タンパク質分解酵素インヒビターがトリプシンインヒビターである、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記タンパク質分解酵素インヒビターがダイズトリプシンインヒビターである、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記新鮮増殖培地が約0.5mg/mlのダイズトリプシンインヒビターを含む、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記分離システムがリキッド・ハンドラー・ロボットによって自動化される、項目1に記載の方法。
(項目23)
前記自動化分離システムが:
(i)前記第一の多能性細胞集団から前記培地を除去する工程と;
(ii)該多能性細胞とタンパク質分解酵素とを接触させる工程と;
(iii)該細胞とタンパク質分解酵素とをインキュベートして細胞集合を分離する工程と、
を包含する、項目13に記載の方法。
(項目24)
タンパク質分解酵素インヒビターとRho関連キナーゼ(ROCK)インヒビターとを含む規定の培地が工程(iii)の後に溶液に添加される、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記ES細胞が、約2〜約10分の間前記タンパク質分解酵素とともにインキュベートされる、項目23に記載の方法。
(項目26)
前記ES細胞が、約25℃と約40℃との間で前記タンパク質分解酵素とともにインキュベートされる、項目23に記載の方法。
(項目27)
前記ES細胞が、約37℃で前記タンパク質分解酵素とともにインキュベートされる、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記自動化分離システムがさらに:
(iv)前記インキュベートされた細胞を機械的攪拌に供して、細胞集合をさらに分離する工程、
を包含する、項目23に記載の方法。
(項目29)
前記機械的攪拌が、前記ES細胞を剪断力または吸引に供する工程を包含する、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記タンパク質分解酵素インヒビターを含む前記増殖培地を、該インヒビターを実質的に含まない増殖培地で置き換える工程をさらに包含する、項目17に記載の方法。
(項目31)
多能性細胞の前記集団が非多能性細胞を含まないか、または実質的に含まない、項目1に記載の方法。
(項目32)
多能性細胞の前記集団がヒトES細胞であり、ヒトES細胞の集団が非ヒト細胞を含まないか、または実質的に含まない、項目31に記載の方法。
(項目33)
胚性幹(ES)細胞の自動化連続増殖のための方法としてさらに規定され:
(a)増殖培地においてES細胞の第一の集団を得る工程と;
(b)自動化分離システムによって該ES細胞を分離する工程と;
(c)新鮮な増殖培地中に該分離された細胞を懸濁してES細胞の増殖した集団を得る工程と、
(d)細胞増殖を支持する条件下で該増殖したES細胞集団をインキュベートする工程と、
(e)工程b〜dを1回以上反復してES細胞の連続増殖した集団を得る工程と、
を包含する、項目1に記載の方法。
(項目34)
(d)細胞増殖を支持する条件下で前記増殖したES細胞集団をインキュベートする工程が、培地灌流培養で該細胞をインキュベートする工程を包含する、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記増殖培地がRho関連キナーゼ(ROCK)インヒビターの有効量を含む、項目1に記載の方法。
(項目36)
前記Rho関連キナーゼ(ROCK)インヒビターがHA−100である、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記HA−100が約10μMの濃度で存在する、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記Rho関連キナーゼ(ROCK)インヒビターがH−1135である、項目35に記載の方法。
(項目39)
前記H−1135が約1〜3μMの濃度で存在する、項目38に記載の方法。
(項目40)
多能性細胞の自動化した維持および増殖のための装置であって:
a)インキュベーター;
b)リキッド・ハンドラー・ユニット;
c)1つ以上のリザーバであって、i)多能性細胞の生きている集団と、ii)規定の培地であって、多能性細胞が未分化状態で培養および維持され得る培地である、規定の培地と、iii)プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビターおよびRho関連キナーゼ(ROCK)インヒビターのうちの1つ以上とを含むリザーバ;ならびに
d)該リキッド・ハンドラー・ユニットと連絡したコントローラであって、該多能性細胞の自動化された増殖および維持を達成するように該リキッド・ハンドラー・ユニットに仕向けるように構成されている、コントローラ;
を備える、装置。
(項目41)
前記コントローラが操作プログラムを含むコンピューター読み取り可能な媒体を備える、項目40に記載の装置。
(項目42)
前記コントローラが:前記リキッド・ハンドラー・ユニット、1つ以上の前記リザーバ、および前記インキュベーターのうちの少なくとも1つをi)多能性細胞集団から培地を除去するように;ii)多能性細胞とタンパク質分解酵素とを接触させるように;およびiii)多能性細胞とタンパク質分解酵素とをインキュベートさせて細胞集合を分離するように仕向ける、項目40に記載の装置。
(項目43)
前記装置がさらに機械的攪拌装置および吸引装置を備え、かつ前記コントローラがさらに:前記リキッド・ハンドラー・ユニット、1つ以上の前記リザーバ、および前記インキュベーターのうちの少なくとも1つを、該多能性細胞が機械的攪拌または吸引に供されるように仕向けて、細胞集合をさらに分離する、項目40に記載の装置。
(項目44)
前記コントローラがさらに:前記リキッド・ハンドラー・ユニット、1つ以上の前記リザーバ、および前記インキュベーターのうちの少なくとも1つを、インキュベートされた多能性細胞がプロテアーゼインヒビターと接触するように仕向ける、項目40に記載の装置。
(項目45)
前記コントローラがさらに:前記リキッド・ハンドラー・ユニット、1つ以上の前記リザーバ、および前記インキュベーターのうちの少なくとも1つを、インキュベートされた多能性細胞がRho関連キナーゼ(ROCK)インヒビターと接触するように仕向ける、項目44に記載の装置。
(項目46)
前記リキッド・ハンドラー・ユニットが少なくとも第一のリザーバおよび第二のリザーバを備え、該第一のリザーバがTeSR培地を含み、かつ該第二のリザーバがTeSR培地、Rho関連キナーゼ(ROCK)インヒビター、およびプロテアーゼインヒビターを含む、項目40に記載の装置。
(項目47)
前記Rho関連キナーゼ(ROCK)インヒビターがH−1152またはH−100である、項目40に記載の装置。
(項目48)
前記多能性細胞がES細胞または人工多能性細胞(iPS)である、項目40に記載の装置。
(項目49)
前記リキッド・ハンドラーが、グリッパー・ツールおよびリキッド・ハンドリング・ツールを備える、項目40に記載の装置。
(項目50)
前記多能性細胞がヒトES細胞である、項目40に記載の装置。
(項目51)
前記リキッド・ハンドラー・ユニットと前記インキュベーターとの間の流体連絡を容易にするように構成されたロボット様デバイスをさらに備える、項目40に記載の装置。
(項目52)
前記リキッド・ハンドラー・ユニットと連絡した第二のまたはそれ以上のリザーバをさらに備える、項目40に記載の装置。
(項目53)
前記第二のリザーバが細胞培養プレート、細胞増殖培地、またはタンパク質分解酵素溶液を備える、項目52に記載の装置。
(項目54)
前記リキッド・ハンドラーが少なくとも第一のリザーバおよび第二のリザーバと連絡しており、該第一のリザーバがTeSR培地を含み、かつ該第二のリザーバがTeSR培地を含み、該培地がさらに、Rho関連キナーゼ(ROCK)インヒビター、およびプロテアーゼインヒビターを含む、項目40に記載の装置。
(項目55)
前記コントローラがコンピューター中に含まれる、項目40に記載の装置。
(項目56)
前記インキュベーターが前記多能性細胞の一部を含み、前記装置が該増殖された多能性細胞のうち少なくとも97%で該細胞のさらなる分化を伴わないかまたは本質的に伴わずに、前記多能性細胞の増殖をもたらすように構成されている、項目40に記載の装置。
(項目57)
前記インキュベーターが前記多能性細胞の一部を含み、かつ前記多能性細胞がヒトES細胞である、項目40に記載の装置。
ES細胞培養物のための種々の培地および培養条件が当該分野で公知である。特定の局面では、細胞は、線維芽細胞などのフィーダー細胞とともにまたは線維芽細胞馴化培地中で増殖され得る。しかし、ある場合には、ES細胞がフィーダー細胞の非存在下で増殖されることが好ましい場合がある。さらにより好ましい局面では、細胞はTeSR(例えば、BD Biosciencesから入手可能なMTESR(商標)1)などの規定の培地中で増殖され得る(Ludwigら、2006a、米国特許出願公開第2006/0084168号)。このような培地は、ES細胞の無血清培地について用いられ得る。例えば、ある場合には増殖培地は、表1に規定される培地であってもよい。しかし、特定の場合には無血清システムの高いコストのせいで、無血清培養物に用いられる増殖因子は、コストを減じるために、Ludwigら(2006b)に記載されるようにゼブラフィッシュからクローニングされたFGFなど別の供給源から得る場合がある。さらに、特定の局面では、培地には必須の増殖因子を供給するためにウシまたはヒトの血清を補充する(Ludwigら、2006b)。従って、特定の場合には、ES増殖培地は、表1に示される成分を含んでもよく、この培地は本明細書に例示されるように、示された「増殖因子およびタンパク質」の代わりにウシ血清を補充される。
本発明のなおさらなる局面では、細胞が解離されるとき(例えば、細胞集団の分割の間)ES細胞のアポトーシスを軽減する分子など、追加の培地成分がES細胞増殖培地に含まれてもよい。例えば、本発明での使用のための培地は、1つ以上のRho関連キナーゼ(ROCK)インヒビター、例えばY−27632またはその誘導体を含んでもよい。さらに、ある局面では、本発明の培地はHA−100;またはその誘導体を含んでもよい。
ある局面では、本発明は、バイオリアクター技術を利用し得る。バイオリアクター中の本発明による細胞増殖によって、最終用途のためのさらなる分化が可能な完全に生物学的に活性な細胞の大規模産生が可能になる。バイオリアクターは、懸濁および固着の両方に依存した動物細胞培養からの生物学的産物の産生のために広範に用いられている。攪拌されたタンクバイオリアクターにおけるマイクロキャリア細胞培養によって、極めて高い容積に対する培養表面積比が得られ、かつウイルスワクチンの産生のために用いられている(Griffiths,1986)。さらに、攪拌されたタンクバイオリアクターは産業的に拡大可能であることが証明されているが、このような技術は、固着とは独立した培養で細胞が増殖され得るときにのみ使用され得る。Corning−Costarnによって増殖されるマルチプレートCELLCUBE(商標)細胞培養システムはまた、極めて高い、容積に対する培養面積比をもたらす。培養プレートの両側で増殖する細胞は緻密な立方の形状で一緒に密閉された。攪拌タンクバイオリアクターと異なり、CELLCUBE(商標)培養ユニットは使い捨て可能である。これは臨床産物の初期の産生では、使い捨て可能なシステムに関連する設備投資、品質管理および品質保証コストの軽減の理由で極めて望ましい。
伝統的に、固着に依拠した細胞培養は、本明細書に記載の小型のガラスまたはプラスチックの容器の底で増殖される。実験室規模に適切である、古典的かつ伝統的な技術によって得られる限定された表面対容積比が、大規模での細胞の産生および細胞産物における障壁を生じている。小さい培養容積で増殖される細胞の大きいアクセス可能な表面をもたらすシステムを提供する試みでは、多数の技術が提唱されている:ローラー・ボトル・システム、スタック・プレート・プロパゲータ、スパイラル・フィルム・ボトル・システム、ホロー・ファイバー・システム、充填層、プレート交換システム(plate exchanger system)、および膜チューブ・リール(membrane tubing reel)。これらのシステムは自然には均一ではなく、時には複数のプロセスに基づくので、それらは以下の欠点を被る−−大規模化能力の制限、細胞サンプルを採取することが困難、重要なプロセスパラメーターを測定および制御する能力の限界、ならびに培養全体にわたって均一な環境条件を維持することの困難性。
伝統的な固着に依拠する培養プロセスの欠点を克服する試みでは、van Wezel(1967)はマイクロキャリア培養系の概念を発展させた。このシステムでは、細胞はゆっくりした攪拌によって増殖培地中で懸濁される小さい固体粒子の表面で増殖される。細胞はマイクロキャリアに結合して、そのマイクリキャリア表面上で徐々にコンフルエンシーまで増殖する。実際には、この大規模培養システムは、単一のディスクプロセスから単層および懸濁培養物の両方が一緒にされている単位プロセスまで固着依存性培養をアップグレードする。従って、細胞が増殖するために必須の表面を組み合わせて、均質な懸濁培養物の利点によって産生を増大する。
哺乳動物細胞を培養するために特に有用であることが示されている1方法は、マイクロカプセル化である。哺乳動物細胞は、半透過性のヒドロゲル膜の内側に保持される。多孔性の膜は細胞の周囲に形成され、このカプセルを囲んでいるバルク培地との栄養物、ガスおよび代謝産物の交換を可能にする。穏やかで、急速でかつ非毒性であり、得られた膜が培養の期間全体にわたって増殖中の細胞塊を維持するために十分多孔性であってかつ強力であるいくつかの方法が開発されている。これらの方法は全て、カルシウム含有溶液と接触した液滴によってゲル化される可溶性のアルギン酸塩に基づく。Lim(参照によって本明細書に援用される、1982、米国特許第4,352,883号)は、液滴を形成し、かつ約1%の塩化カルシウム溶液中に自由にさせる、小さい開口部を通じて強制されるアルギン酸ナトリウムの約1%の溶液中で濃縮した細胞を記載している。次いで、この液滴は表面のアルギン酸塩に対してイオン的に結合するポリアミノ酸の層にキャスティングされる。結局、このアルギン酸塩はカルシウムイオンを除去するためにキレート剤で液滴を処理することによって再液化される。他の方法はカルシウム溶液中で細胞を用いてアルギン酸溶液中に滴下させ、これによって中空のアルギン酸塩の球を作製する。同様のアプローチは、アルギン酸塩中に滴下されたキトサン溶液中に細胞を含み、これによっても中空の球を作製する。
灌流される固着システムは、本発明の好ましい形態である。灌流とは、(生理学的な栄養溶液の)細胞のある集団全体にわたるかまたはそれを覆う一定速度御での連続的な流れをいう。これは回収(withdrawn)培地(例えば、ケモスタット)で細胞を洗浄する連続流培養とは対照的に培養ユニット内の細胞の保持を意味する。灌流のアイデアは今世紀の初めから公知であって、拡大された顕微鏡観察のために生きている組織の小片を保持するために適用されている。この技術は、インビボで細胞環境を模倣するために始まり、ここでは細胞は血液、リンパ液または他の体液を連続的に供給される。灌流がなければ、培養中の細胞は、フィーディングおよび枯渇されているという交互の段階を経ることになり、これによってその増殖および代謝能力の完全な発現が制限される。
本発明の特定の局面は、図2Aおよび図2Bに図形として示され、かつ図3A〜図3Dに市販のハードウェア構成要素で図示される、ES細胞などの多能性細胞の自動化増殖のための装置またはシステムに関する。従って、理解できるとおり、例示的なデバイスは、生きているES細胞集団(102)、インキュベーター(104)と液体連絡しているリキッド・ハンドラー・ユニット(100)、および細胞分離のための操作プログラムを備えるコントローラ(106)を備え得る。
(実施例1)
幹細胞の自動化継代および増殖
H1細胞継代185および62を、TeSR培地を用いて培養し、Beckman Coulter Biomek2000リキッド・ハンドラー(B2K),Gibco TrypLE Trypsin,TeSR培地およびTeSR Plus(10μMのHA−100および0.5mg/mlのInvitrogen Soybean Trypsin Inhibitorを含有)を用いて分割した。H1細胞(ほぼ70%コンフルエント)を、8.6μg/cm2のMATRIGEL(商標)(BD Bioscience)でコーティングした6ウェルのプレートおよびTRYPLE(商標)トリプシンを含有するリザーバとともにB2K作業表面に置いた。グリッパー・ツールを用いて、分割すべきプレートからのリッドを取り出した。このロボットはグリッパー・ツールを廃棄して、Wash1ツールをロードして細胞を含むプレートから培地を吸引した。次に、P1000ツールを用いてTRYPLE(商標)酵素を分割すべきプレートに移した。このリッドをプレートにおいて、そのプレートを37℃のCYTOMAT(商標)インキュベーターに移動し7分間細胞をプレートから解離させた。
(実施例2)
自動化したHES細胞培養および維持のシステム
HES細胞の労力および時間集約的な維持を改善するために、本発明者らは、HES細胞のフィーディングをまず自動化した。この提唱された実験は、滅菌および再生可能な条件を確立するために自動化培地交換による継代の間10個の6ウェルプレートを維持することであった。本発明者らは、確立されたリキッド・ハンドリング・システムを用いる首尾よい自動的な培地交換によってその目標を達成した。これは、この実施形態でのHES細胞培養の自動化に向かう重要な段階であった。
(実施例3)
hES細胞の自動化された継代および増殖
HES細胞の継代はHES細胞培養において最も労働集約的であってかつ変動する工程であるので、技術者の技術に極めて依存して実験の結果に膨大な変動がもたらされる。本発明者らは、継代の自動化がさらに堅調であってかつ再現可能なHES細胞培養をもたらすということを仮定した。本発明者らは、現行のシステムでかつこのプロジェクトで利用可能な限られた時間に起因してこの理論が確認できないが、本発明者らは、そうでなければ一人ではほぼ不可能な作業である、3週にわたる1000倍の増殖に等しい、HES細胞の6ウェルプレートのうちの1ウェル(約250万個の細胞)から160プレートという最終数(約20〜30億個の細胞)までの増殖によって原理の証明を示すことができた。
細胞ベースのスクリーニングのための96ウェルの形式についてのHES細胞培養の自動化播種
本発明者らは、個別化された細胞からTeSR1培地中でHES細胞のコロニー形成を活発に増大した、HA−100由来の第二世代の低分子に相当する、新規な化合物H1152を用いた。HA−100は、フォローアップ研究においてH1152のような関連の化合物の発見をもたらした、第一のHES細胞ベースの低分子スクリーニングのうちの1つで発見された。H−1152は、96ウェルのプレート中の個別化されたHES細胞の極めて効率的な播種を可能にし(HA−100と同様であるが、10分の1の濃度である)、HES細胞ベースの低分子スクリーニングを可能にする。そうでなければ細胞集塊中で継代される個別化されたHES細胞によって、細胞ベースの低分子スクリーニングのストリンジェントな必要条件である1ウェルあたりについてさらに均一な細胞密度が可能になる。本発明者らはまた、現在の低分子(HA−100)および関連の化合物H1152がヒトES細胞を継代するために十分であると判断した。
以下の引用文献は、それらが例示的な手順上のまたは他の詳細な補遺をそこに示す引用文献に対して提供する程度まで、参照によって本明細書に詳細に援用される。
Claims (33)
- 規定の増殖培地条件下における多能性幹細胞の自動化増殖のための方法であって:
(a)規定の増殖培地において多能性細胞の第一の集団を得る工程であって、該規定の増殖培地が、多能性細胞が未分化状態で培養および維持され得る培地である、工程と;
(b)自動化分離システムによって該多能性細胞を化学的または機械的に分離する工程であって、該自動化分離システムがリキッド・ハンドラー・ロボットを含み、該分離する工程が該リキッド・ハンドラー・ロボットによって自動化され、該分離する工程が、以下:
(i)該多能性細胞の第一の集団から該培地を除去する工程と;
(ii)該多能性細胞とタンパク質分解酵素とを接触させる工程と;
(iii)該細胞を該タンパク質分解酵素と共にインキュベートして細胞集合を分離する工程と;
(iv)タンパク質分解酵素インヒビターとRho関連キナーゼ(ROCK)インヒビターとを含む規定の増殖培地を工程(iii)の後に該細胞集合を含む溶液に添加する工程と;
(v)該インキュベートされた細胞を機械的攪拌に供して、細胞集合をさらに分離する工程と、
を包含する、工程と;
(c)新鮮な規定の増殖培地中に該分離された細胞を懸濁して多能性細胞の増殖した集団を得る工程と、
を包含する、方法。 - 前記多能性細胞が人工多能性細胞(iPS)である請求項1に記載の方法。
- 前記人工多能性細胞がヒト人工多能性細胞である、請求項2に記載の方法。
- 前記多能性細胞がヒトES細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記培養された増殖した多能性幹細胞のうち少なくとも97%で分化が全く生じない、請求項1に記載の方法。
- 前記増殖培地がTeSR培地を含む、請求項1に記載の方法。
- 多能性細胞の前記第一の集団が細胞分離の時点で50%コンフルエントと99%コンフルエントとの間である、請求項1に記載の方法。
- 多能性細胞の前記第一の集団が、細胞分離の時点で60%、70%、80%または90%コンフルエントである、請求項7に記載の方法。
- 新鮮な規定の増殖培地中の前記分離された細胞を懸濁する工程が、1つ以上の新規な細胞培養プレート(単数または複数)中に該細胞を播種する工程を包含し、ここで該新規な細胞培養プレート(単数または複数)の表面積が多能性細胞の前記第一の集団を含んでいるプレートの表面積よりも5倍と35倍との間大きい、請求項1に記載の方法。
- 前記新規な細胞培養プレート(単数または複数)の表面積が、多能性細胞の前記第一の集団を含んでいるプレートの表面積よりも10倍と35倍との間大きい、請求項9に記載の方法。
- 前記タンパク質分解酵素がトリプシン、組み換えトリプシン、トリプシン様プロテイナーゼ、またはTRYPLE(商標)である、請求項1に記載の方法。
- 前記新鮮な規定の増殖培地がタンパク質分解酵素のインヒビターを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質分解酵素のインヒビターが、細胞分離のために用いられるタンパク質分解酵素のインヒビターである、請求項12に記載の方法。
- 前記タンパク質分解酵素のインヒビターがトリプシンインヒビターまたはダイズトリプシンインヒビターである、請求項13に記載の方法。
- 多能性細胞の前記集団が非多能性細胞を含まない、請求項1に記載の方法。
- 多能性細胞の前記集団がヒトES細胞の集団であり、該ヒトES細胞の集団が非ヒト細胞を含まない、請求項15に記載の方法。
- 胚性幹(ES)細胞の自動化連続増殖のための方法としてさらに規定され:
(a)規定の増殖培地においてES細胞の第一の集団を得る工程と;
(b)前記自動化分離システムによって該ES細胞を分離する工程と;
(c)新鮮な規定の増殖培地中に該分離された細胞を懸濁してES細胞の増殖した集団を得る工程と、
(d)細胞増殖を支持する条件下で該増殖したES細胞集団をインキュベートする工程と、
(e)工程b〜dを1回以上反復してES細胞の連続増殖した集団を得る工程と、
を包含する、請求項1に記載の方法。 - 前記規定の増殖培地がRho関連キナーゼ(ROCK)インヒビターの有効量を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記Rho関連キナーゼ(ROCK)インヒビターがHA−100またはH−1135である、請求項18に記載の方法。
- 異なる灌流速度で前記培地における栄養濃度をモニターする工程をさらに包含する、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モニターに基づいて操作パラメータを決定する工程をさらに包含する、請求項20に記載の方法。
- 多能性細胞の自動化した維持および増殖のための装置であって:
(a)インキュベーター;
(b)該インキュベーターと液体連絡しているリキッド・ハンドラー・ユニット;
(c)該リキッド・ハンドラー・ユニットと連絡した1つ以上のリザーバであって、(i)多能性細胞の生きている集団と、(ii)規定の増殖培地であって、多能性細胞が未分化状態で培養および維持され得る培地である、規定の増殖培地と、(iii)該リキッド・ハンドラー・ユニットのための試薬とを含むリザーバであって、該リキッド・ハンドラー・ユニットのための試薬が、タンパク質分解酵素、タンパク質分解酵素インヒビターおよびRho関連キナーゼ(ROCK)インヒビターを含む、リザーバ;
(d)該インキュベーター、該リキッド・ハンドラー・ユニットおよび該リザーバのうちの少なくとも1つに供されるように配置される機械的攪拌装置および吸引装置;ならびに
(e)該リキッド・ハンドラー・ユニットと連絡したコントローラであって、該コントローラが操作プログラムを含むコンピュータ読み取り可能な媒体を含み、該操作プログラムは、該多能性細胞の自動化された増殖および維持を達成するように構成されている、コントローラ;
を備え、
該操作プログラムは、
(i)該多能性細胞の第一の集団から該培地を除去する工程と;
(ii)該多能性細胞とタンパク質分解酵素とを接触させる工程と;
(iii)該細胞を該タンパク質分解酵素と共にインキュベートして細胞集合を分離する工程と;
(iv)タンパク質分解酵素インヒビターとRho関連キナーゼ(ROCK)インヒビターとを含む規定の増殖培地を工程(iii)の後に該細胞集合を含む溶液に添加する工程と;
(v)該インキュベートされた細胞を機械的攪拌に供して、細胞集合をさらに分離する工程と、
を包含する方法を実現する、装置。 - 前記コントローラがコンピュータ中に含まれる、請求項22に記載の装置。
- 前記コントローラが、前記リキッド・ハンドラー・ユニット、1つ以上の前記リザーバ、および前記インキュベーターのうちの少なくとも1つを、(i)多能性細胞集団から増殖培地を除去し;多能性細胞とタンパク質分解酵素とを接触させ;そして多能性細胞をタンパク質分解酵素と共にインキュベートして細胞集合を分離し、(ii)インキュベートされた多能性細胞がタンパク質分解酵素インヒビターおよびRho関連キナーゼ(ROCK)インヒビターと接触し、そして(iii)多能性細胞を機械的攪拌または吸引に供して、細胞集合をさらに分離するように仕向ける、請求項22に記載の装置。
- 前記リキッド・ハンドラー・ユニットが少なくとも第一のリザーバおよび第二のリザーバを備え、該第一のリザーバがTeSR培地を含み、かつ該第二のリザーバがさらにTeSR培地、Rho関連キナーゼ(ROCK)インヒビター、およびタンパク質分解酵素インヒビターを含む、請求項22に記載の装置。
- 前記リキッド・ハンドラーが、グリッパー・ツールおよびリキッド・ハンドリング・ツールを備える、請求項22に記載の装置。
- 前記リキッド・ハンドラー・ユニットと前記インキュベーターとの間の流体連絡を容易にするように構成されたロボット様デバイスをさらに備える、請求項22に記載の装置。
- 前記リキッド・ハンドラー・ユニットと連絡した第二のまたはそれ以上のリザーバをさらに備える、請求項22に記載の装置。
- 前記リキッド・ハンドラー・ユニットと連絡した第二のリザーバが、細胞培養プレート、TeSR培地、またはタンパク質分解酵素溶液を備える、請求項28に記載の装置。
- 前記リキッド・ハンドラーが少なくとも第一のリザーバおよび第二のリザーバと連絡しており、該第一のリザーバがTeSR培地を含み、かつ該第二のリザーバがTeSR培地を含み、該培地がさらに、Rho関連キナーゼ(ROCK)インヒビターおよびタンパク質分解酵素インヒビターを含む、請求項28または29に記載の装置。
- 前記インキュベーターが前記多能性細胞の一部を含み、前記装置が前記増殖された多能性細胞のうち少なくとも97%で該細胞のさらなる分化を伴わずに、前記多能性細胞の増殖をもたらすように構成されており、ここで該多能性細胞がヒトES細胞である、請求項22に記載の装置。
- 異なる灌流速度で前記培地における栄養濃度をモニターする手段をさらに包含する、請求項22〜31のいずれか1項に記載の装置。
- 前記操作プログラムは、前記モニターに基づいて操作パラメータを決定する工程をさらに包含する、請求項32に記載の装置。
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