JP6328424B6 - 記憶機能の制御および特性化 - Google Patents

Description

関連文献の相互参照
本出願は、２０１０年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６１／４１０，７３２号、および２０１１年９月２９日に出願された第６１／５４０，９２６号の優先権利益を主張し、それらそれぞれの内容は、参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる。

背景
遠隔記憶の固定は、数分から数時間の時間スケールでのシナプス固定プロセス、および数週間から数年にわたる回路固定プロセスの両方に依存する（Ｆｒａｎｋｌａｎｄ ａｎｄ Ｂｏｎｔｅｍｐｉ，２００５、Ｓｑｕｉｒｅ ａｎｄ Ｂａｙｌｅｙ，２００７）。長期文脈的恐怖記憶固定のプロセスは、海馬に続いて新皮質の早期関与を必要とし、このプロセスの過程で、新皮質に対する海馬の影響により、海馬は、記憶自体を安定に蓄積するよりもむしろ、記憶の長期皮質保持を促進できるようにし得る。研究は、海馬損傷が、訓練の翌日に近時記憶を障害するが、訓練から数週間後の遠隔記憶には影響がないことを示した（Ａｎａｇｎｏｓｔａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｂｏｎｔｅｍｐｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｄｅｂｉｅｃ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｆｒａｎｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｋｉｍ ａｎｄ Ｆａｎｓｅｌｏｗ，１９９２、Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｍａｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｍａｖｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｗｉｎｏｃｕｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）。さらなる研究は、海馬記憶および皮質記憶の両方が連続的に相互作用することを示唆する。

記憶回路に関する以前の研究は、身体的、薬理学的、および遺伝的損傷の研究を伴い、それらは神経系に関する我々の理解を著しく増進させたが、ある良く知られた難題も抱えており、例えば、身体的損傷は極めて有効であるが、細胞精度および時間精度の両方を欠失し、また他の方法は、典型的に細胞精度と時間精度との間にトレードオフを伴う。洗練された遺伝的介入は、細胞型特異的であり得るが（ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｎａｋａｓｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．，２００８）、数日の時間スケールであって遅い。薬理学的損傷は、数分の時間スケールでより高度な時間分解能を可能にするが（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｗｉｌｔｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、依然としてニューロンよりも遅く、典型的に細胞特異的ではない。動物における記憶の研究に対して、ミリ秒時間スケールでの細胞型精度および時間制御の両方を可能にする方法およびツールを開発する必要性がある。

記憶回路の障害に起因して、様々な精神状態が起こり得る。例えば、健忘症（例えば、非段階的、段階的逆行性、局所的逆行性健忘症など）は、ある記憶の想起不能を伴うが、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）は、恐怖記憶の望ましくない想起を伴う。ＰＴＳＤは、衝撃的な事象への単回暴露が、心的外傷を繰り返し再経験することに起因して、長年にわたる機能障害をもたらし得る、一般的な消耗性の精神状態である。望ましくない記憶の呼び出しの基礎となる神経経路を理解することは、そのような記憶障害のある患者を治療するための薬物療法の発見およびスクリーニングを援助し得る。

特許出願および公開物を含む、本明細書に引用されるすべての参照文献は、参照することによりそれら全体が組み込まれる。

本開示の態様は、本明細書に記載されるように、生きている動物における記憶機能の制御または特性化に関する。本開示は、必ずしもこれらの文脈に制限されないが、本発明の実施形態は、これらの文脈および他の文脈を使用して、実施例の論考を通して理解され得る。

本開示のある実施形態は、記憶機能と関連付けられる特別に標的とされた回路を対象とする。より特定の実施形態は、記憶機能（複数可）（例えば、記憶形成および／または記憶想起）と関連付けられ、それに対応する特定の回路標的を同定するための神経回路上の空間−時間制御に関する。

本開示の特定の実施形態は、海馬における神経回路（例えば、海馬の背側ＣＡ１野のニューロン）の時間的に正確な抑制を対象とし、その精度は、記憶機能を妨害するのに十分である。神経抑制の時間精度は、遠隔記憶の想起を妨害するのに有効であるが、長期間の抑制は、遠隔記憶の想起に対して重要な効果を有しないことが発見された。したがって、本開示の態様は、そのような抑制の時間態様に関する。代替または付加的に、記憶機能に可逆的に影響を及ぼすための方法は、扁桃体（例えば、扁桃体基底外側部）のニューロンおよび／または帯状皮質（例えば、前帯状皮質）のニューロンを一時的に抑制することを含んでよい。ある実施形態では、この抑制は、神経回路の細胞内で光活性化タンパク質（例えば、オプシン）の発現を伴う光遺伝系を使用して行われる。他の実施形態では、抑制は、直接電気刺激を使用して行われ得る。さらに他の実施形態は、時間的に正確な医薬品の使用を可能にする。

本開示の様々な実施形態は、神経回路上の時間制御を測定可能な基準と相関させる光遺伝系または方法に関する。例えば、特定の記憶機能は、神経学的障害と関連付けられてよい。光遺伝系は、個体内の神経回路をその選択的制御の標的とする。光遺伝系は、神経学的障害と関連付けられる基準（例えば、症状）について個体をモニターすることを伴う。このように、光遺伝系は、神経回路、その機能、および／または神経学的障害に関する詳細な情報を提供することができる。記憶機能に可逆的に影響を及ぼす１つ以上の方法を使用して、ＰＴＳＤおよび／または様々な記憶障害を治療することにおける薬剤の有効性を評価してよい。

本明細書では、光遺伝技法を使用して、記憶機能に関与するニューロンの特定集団内で光活性化タンパク質を発現させることにより記憶に影響を及ぼすための方法、およびそのタンパク質を光で活性化することにより記憶機能に影響を及ぼすための方法が提供される。いくつかの変型例では、光活性化タンパク質は、特定波長を有する光の存在下で、ニューロンの脱分極を抑制するように構成されてよい。いくつかの変型例では、光活性化タンパク質は、特定波長を有する光の存在下で、ニューロンの脱分極化を促進するように構成されてよい。

本明細書では、非ヒト動物の海馬の背側ＣＡ１野内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含む非ヒト動物が提供され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、そのタンパク質の照射が、記憶機能に可逆的に影響を及ぼす。また本明細書では、非ヒト動物の前帯状皮質内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含む非ヒト動物も提供され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、そのタンパク質の照射が、記憶機能に可逆的に影響を及ぼす。また本明細書では、非ヒト動物の扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含む非ヒト動物も提供され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、そのタンパク質の照射が、記憶機能に可逆的に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、ニューロンが照射されると影響を受ける記憶機能は、記憶想起および／または記憶形成であり得る。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、記憶は恐怖記憶および／または遠隔記憶である。

また本明細書では、海馬の背側ＣＡ１野、扁桃体基底外側部、および前帯状皮質からなる群から選択される脳領域を含む、脳組織切片も提供され、光活性化タンパク質は、脳領域の興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、そのタンパク質の照射が、記憶機能に可逆的に影響を及ぼす。

また本明細書では、個体において記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼす方法も提供される。

いくつかの実施形態では、個体において記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための方法は、光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを個体の海馬の背側ＣＡ１野に投与することを含み、光活性化タンパク質は、海馬の背側ＣＡ１野内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、それによりそのタンパク質を光によって活性化することが、個体における記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための方法は、個体における事象の記憶想起または記憶形成の間に、海馬の背側ＣＡ１野内で興奮性ニューロンの脱分極化を抑制することを含み、光活性化タンパク質は、個体の海馬の背側ＣＡ１野内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができる。

いくつかの実施形態では、個体において記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための方法は、光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを個体の前帯状皮質に投与することを含み、光活性化タンパク質は、前帯状皮質内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、それによりそのタンパク質を光によって活性化することが、個体における事象の記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、個体において記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための方法は、個体における事象の記憶想起または記憶形成の間に、前帯状皮質内で興奮性ニューロンの脱分極化を抑制することを含み、光活性化タンパク質は、個体の前帯状皮質内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができる。

いくつかの実施形態では、個体において記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための方法は、光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを個体の扁桃体基底外側部に投与することを含み、光活性化タンパク質は、扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、それによりそのタンパク質を光によって活性化することが、個体における事象の記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、個体において記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための方法は、個体における事象の記憶想起または記憶形成の間に、扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの脱分極化を抑制することを含み、光活性化タンパク質は、個体の扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができる。

また本明細書では、個体において心的外傷後ストレス障害を治療するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、個体において心的外傷後ストレス障害を治療するための方法は、光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを個体の海馬の背側ＣＡ１野に投与することを含み、光活性化タンパク質は、海馬の背側ＣＡ１野内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、それによりそのタンパク質を光によって活性化することが、個体における事象の記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、個体において心的外傷後ストレス障害を治療するための方法は、光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを個体の前帯状皮質に投与することを含み、光活性化タンパク質は、前帯状皮質内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、それによりそのタンパク質を光によって活性化することが、個体における事象の記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼす。

また本明細書では、記憶想起または記憶形成に影響を及ぼす薬剤をスクリーニングする方法も提供され、ａ）非ヒト動物における事象の記憶想起または記憶形成の間に、海馬の背側ＣＡ１野内で興奮性ニューロンを薬剤と接触させることであって、非ヒト動物は、該非ヒト動物の海馬の背側ＣＡ１野内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含み、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制できることと、ｂ）事象の記憶想起または記憶形成の間に、海馬の背側ＣＡ１野内で興奮性ニューロンの脱分極を抑制することと、ｃ）その薬剤が、光の存在下または非存在下で記憶想起または記憶形成に影響を及ぼすか否かを決定することと、を含む。また本明細書では、記憶想起または記憶形成に影響を及ぼす薬剤をスクリーニングする方法も提供され、ａ）非ヒト動物における事象の記憶想起または記憶形成の間に、前帯状皮質内で興奮性ニューロンを薬剤と接触させることであって、非ヒト動物は、該非ヒト動物の前帯状皮質内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含み、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制できることと、ｂ）事象の記憶想起または記憶形成の間に、前帯状皮質内で興奮性ニューロンの脱分極を抑制することと、ｃ）その薬剤が、光の存在下または非存在下で記憶想起または記憶形成に影響を及ぼすか否かを決定することと、を含む。また本明細書では、記憶想起または記憶形成に影響を及ぼす薬剤をスクリーニングする方法も提供され、ａ）非ヒト動物における事象の記憶想起または記憶形成の間に、扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンを薬剤と接触させることであって、非ヒト動物は、該非ヒト動物の扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含み、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制できることと、ｂ）事象の記憶想起または記憶形成の間に、扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの脱分極を抑制することと、ｃ）その薬剤が、光の存在下または非存在下で記憶想起または記憶形成に影響を及ぼすか否かを決定することと、を含む。

光活性化タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、そのタンパク質がニューロンの脱分極化を抑制することができるように構成されてよい。いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質は、本明細書に記載されるＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲ、およびＧｔＲ３からなる群から選択されてよい。いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質は、配列番号３に示される配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＮｐＨＲタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＮｐＨＲタンパク質は、小胞体（ＥＲ）輸出シグナルおよび／または膜輸送シグナルをさらに含む。例えば、ＮｐＨＲタンパク質は、配列番号３に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および小胞体（ＥＲ）輸出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、配列番号３に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列は、リンカーを通してＥＲ輸出シグナルに結合される。いくつかの実施形態では、ＥＲ輸出シグナルは、アミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥを含み、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。別の実施形態では、ＥＲ輸出シグナルは、アミノ酸配列ＶＸＸＳＬを含み、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ＥＲ輸出シグナルは、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶを含む。いくつかの実施形態では、ＮｐＨＲタンパク質は、配列番号３に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルを含む。他の実施形態では、ＮｐＨＲタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号３に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルを含む。他の実施形態では、ＮｐＨＲタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号３に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、膜輸送シグナル、およびＥＲ輸出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含む。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、リンカーにより配列番号３に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列に結合される。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、リンカーを通してＥＲ輸出シグナルに結合される。リンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸長のいずれかを含んでよい。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、それらに限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

本明細書に記載される様々な実施形態の特性の１つ、いくつか、またはすべてを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成してよいことを理解されたい。本発明のこれらの態様および他の態様は、当業者には明らかとなるであろう。

記憶機能に影響を及ぼすように選択された波長の光を適用するために使用され得るデバイスまたはシステムの一変型例を表す。 記憶機能を修正するためのフロー図を表す。 記憶機能の基礎となる神経回路に対する試験薬剤の効果を評価するための方法の変型例を表す。 記憶機能の基礎となる神経回路に対する試験薬剤の効果を評価するための方法の変型例を表す。 背側ＣＡ１内の興奮性ニューロンの特定の光遺伝的抑制が、ニューロンの活動を低減することを示す実験データを表す。図４Ａは、レンチウイルスの二重注入が、ＣＡ１のみを通してｅＮｐＨＲ３．１発現をもたらしたことを示す。図４Ｂは、ｅＮｐＨＲ３．１が、体細胞周囲のニューロン膜内、ならびにＣＡ１ニューロンの先端および基底樹状突起内で発現することを示す。図４Ｃは、ＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲ３．１は、ＣＡ１錐体ニューロンの９４％（４５８／４８６細胞、３匹のマウスから）で発現され、１００％の特異性があることを実証するデータを示す（すべてのｅＮｐＨＲ３．１−ＥＹＦＰ細胞は、ＣａＭＫＩＩα陽性であった）。図４Ｄは、タングステン電極に結合された光ファイバーを、麻酔を受けたマウスのＣＡ１（ｅＮｐＨＲ３．１を発現）に挿入することにより行われる、インビボ「オプトロード」光投与および記録によるデータを表す（左）。これらのマウスにおけるＣＡ１ニューロンの５６１ｎｍ照明は、平均スパイク振幅（３３．５５±４．９４μＶ、２９．２０±４．４μＶ、および３３．３２±５．４５μＶ、光投与前、間、および後）に影響することなく、スパイク頻度の可逆的かつ顕著な低減をもたらした（４．９３±１．６Ｈｚ、１．３１±０．１５Ｈｚ、および６．４５±２．４Ｈｚ、それぞれ光投与前、間、および後、２匹のマウスから１５トレース、Ｐ＜０．０２）。代表的なオプトロード記録トレース、ならびに平均頻度および振幅が示される（平均±ＳＥＭ）。 実時間ＣＡ１光遺伝的抑制は、文脈的な恐怖の取得および想起を遮断することを示す実験データを表す。図５Ａは、両側インビボ光が、両側カニューレガイドを通して二重光ファイバーを自由に移動するマウスに挿入することによりＣＡ１に投与されてよいことを示す。図５Ｂ（上）は、恐怖条件付け訓練の間に連続的な５６１ｎｍ照射が投与され、光なしに２４時間後の記憶についてマウスを試験した実験シーケンスを表す。１日後、マウスを光なしで再訓練し、４日目に光なしで再試験して、５日目に光を用いて再試験した。（下）恐怖条件付け訓練（光オン）の間のＣＡ１光遺伝的抑制は、対照（ｎ＝４）と比較して、ｅＮｐＨＲ３．１マウス（ｎ＝５）の取得を防止した（３９±５．４対７．６±４．３％硬直、平均±ＳＥＭ、Ｐ＜０．００５）。照射なしに再訓練したとき（光オフ）、同一のマウスは、正常な文脈的記憶を示した（６４．６±６．６対４９．７±１１．７％硬直、Ｐ＞０．５）。この文脈的恐怖記憶は、ｅＮｐＨＲ３．１マウスにおいて、試験中（光オン）の光投与時の呼び出しに利用できなくなった（４２．６±１０．１対５．９４±４．１％硬直、Ｐ＜０．０１）。図５Ｃは、対照（ｎ＝４）と比較して、ｅＮｐＨＲ３．１マウス（ｎ＝５）において、ＣＡ１光遺伝的抑制が、海馬非依存性の聴覚刺激による恐怖記憶の取得（左）または呼び出し（右）のいずれにも影響がなかったことを示す。図５Ｄは、光遺伝的抑制が、対照（ｎ＝４）と比較して、ｅＮｐＨＲ３．１マウス（ｎ＝５）において、条件付け前の文脈の探査に影響がなかったことを示すデータを表す。ＣＡ１光遺伝的抑制は、新規環境の探査にも影響がなかった。図５Ｅおよび５Ｆは、対照（ｎ＝６）およびｅＮｐＨＲ３．１（ｎ＝４）マウスが、同様の路長（それぞれ５６４±９および６１８±１１４ｃｍ）および同様の速度（それぞれ３．３±０．１対３．４３±０．６ｃｍ／秒）でフィールドを探索したことを示す。図５Ｇは、対照マウスおよびｅＮｐＨＲ３．１マウスがオープンフィールドの中心で過ごした時間の割合が類似するため（２３．８±２．７６％対２０．４６±５．９７％、Ｐ＞０．５）、不安に対する影響がなかったことを示す。代表的な探索トレースが提示される。図５Ｈは、扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）内のｅＮｐＨＲ３．０発現を表す。図５Ｉは、ＢＬＡに対する光投与が、対照（ｎ＝９）と比較して、ｅＮｐＨＲ３．０（ｎ＝４）マウスにおいて、文脈的（６５．５±７．２対９．６±５．５％硬直、Ｐ＜０．００１）およびキューによる（６９．５±９．６対２４．５±１３％硬直、Ｐ＜０．０５）記憶取得の障害をもたらしたことを示す。 ＣＡ１光遺伝的抑制が遠隔恐怖記憶の呼び出しを可逆的に干渉することを示す実験データを表す。図６Ａは、ＣＡ１光遺伝的抑制が、２８日前に取得され、以前に誘発されていない遠隔記憶の呼び出しを可逆的に防止することを示すデータを表す（Ｐ＜０．０００１、対照ｎ＝１４、６９．８±５．３％硬直、ｅＮｐＨＲ３．１ ｎ＝６、１４±６．４％硬直）。同一マウスが照明なしに翌日に条件付け文脈に再導入されると、正常な恐怖応答を示したため（５２．４５±６．０対４５．１８±１１．５％硬直、Ｐ＞０．５）、この呼び出し妨害は可逆的であった。図６Ｂは、条件付けから２８日後に試験された聴覚キューによる恐怖が影響されなかったことを示すデータを表す（新しい文脈において対照ｎ＝１４、２２．３±６．８％、ｅＮｐＨＲ３．１ ｎ＝６、１１．８±３．５％硬直、および音に対して７２．４±８．４対５８．７７±７．９％硬直、Ｐ＞０．５）。図６Ｃは、ＣＡ１光遺伝的抑制が、６３日前に取得され、以前に誘発されていない超遠隔記憶の呼び出しを障害したことを示す（Ｐ＜０．００５、対照ｎ＝９、３１．８±３．８％硬直、ｅＮｐＨＲ３．１ ｎ＝６、１．３±３．６％硬直）。図６Ｄは、条件付けから１日後にＴＴＸおよびＣＮＱＸ投与による薬理学的海馬抑制が、近時恐怖呼び出しを防止したことを示すデータを表す（生理食塩水ｎ＝５、５６．８６±１．９％硬直、ＴＴＸ＋ＣＮＱＸ ｎ＝４、２６．０５±１０．２３％硬直、Ｐ＜０．０５）。図６Ｅは、条件付けから１ヶ月後のＴＴＸおよびＣＮＱＸの投与が、遠隔恐怖呼び出しに影響しなかったことを示す（生理食塩水ｎ＝８、９３．９３±２．５４％硬直、ＴＴＸ＋ＣＮＱＸ ｎ＝９、８３．８±４．４％硬直、Ｐ＞０．０５）。 正確であるが、長期ではないＣＡ１光遺伝的抑制が、遠隔文脈的恐怖呼び出しを遮断することを示す実験データを表す。図７Ａは、試験前３０分、ならびに試験中に光が連続的にオンであったときではなく（長期群、中間、対照ｎ＝３、７０．１３±１２．２％硬直、ｅＮｐＨＲ３．１ ｎ＝４、６７．７±５．６％硬直、Ｐ＞０．０５）、試験の間に光が正確に投与されたときに限り（正確な群、対照ｎ＝４、７２．６５±１１．５％硬直、ｅＮｐＨＲ３．１ ｎ＝８、２６．９±１０．４％硬直、Ｐ＜０．０１）、ＣＡ１光遺伝的抑制が、２８日前に取得された記憶の遠隔恐怖呼び出しを防止することを示す。長期群のマウスを試験の間にのみ光で翌日再試験したとき、それらの呼び出しは妨害された（長期群、左、５５．５±８．５対２７．６±８．６％硬直、Ｐ＜０．０５）。図７Ｂは、長期光が、条件付けから２４時間後、近時記憶の呼び出しを防止することを示す（対照ｎ＝７、３２．２±１０．６％硬直、ｅＮｐＨＲ３．１ ｎ＝３、４±２．６％硬直、Ｐ＜０．０５）。図７Ｃは、記録トレースに示されるように、ｅＮｐＨＲ３．１が３０分間、誘発されたスパイクを連続的かつ完全に防止した。セクション１（抑制開始）、２（連続抑制の間）、および３（抑制の最後および回復）の詳細なトレースは、左下に提示される。光投与前、光投与の間（光オンの５分および３０分後）に良好に誘発されたスパイクの平均化した割合、および光オフ後の回復が提示される（右下、ｎ＝４マウス、１０細胞）。 ＣＡ１光遺伝的抑制が継続する恐怖呼び出しを干渉することを示す実験データを表す。左：５週間前に取得され、効率的に呼び出された遠隔恐怖記憶（対照ｎ＝８、７９．０±８．９％硬直、ｅＮｐＨＲ３．１ ｎ＝６、６７．８±１２．１％硬直、Ｐ＞０．５）は、ＣＡ１光遺伝的抑制下で呼び出しに使用できなくなった（７７．２±４．３％対１２．８±４．４％硬直、Ｐ＜０．０００１）。右：同一マウスが照明なしに翌日に条件付け文脈に再導入されると、正常な恐怖応答を示したため、この呼び出し妨害は、記憶消去をもたらさなかった（６１．５±６．７対５８．３±３．５％硬直、Ｐ＞０．５）。照明は試験の中間で再導入され、記憶が呼び出された後、恐怖応答は突然停止した（６５．２±６．９対１５．９±５．２％硬直、Ｐ＜０．００１）。 遠隔呼び出し中に海馬により制御された回路活動の脳全体のマッピングを示す実験データを表す。図９Ａは、マウスが光送達下で恐怖条件付けされ、訓練の９０分後に脳が採取された実験を表す。図９Ｂは、ｃ−ＦｏｓおよびＤＡＰＩについて染色された脳切片を示す。ＹＦＰ対照およびｅＮｐＨＲ３．１の発現が示される。これらの画像が撮影されたＣＡ１領域は、図９Ｃにおいて白い正方形によりマークされる。図９Ｃは、ＣＡ１、ＡＣＣ、およびＢＬＡの代表的な画像を表す。生体構造は、ＤＡＰＩ核染色により示され、扁桃体の辺縁部は、黄色の点線でマークされる。白色スケールバー：１５０μｍ。図９Ｄは、ＦＣ中のＣＡ１光遺伝的抑制が、ＡＣＣまたはＢＬＡにおいてではなく、ＣＡ１においてニューロン活性マーカーｃ−Ｆｏｓの発現を低減した（ｎ＝２〜４マウス、６〜１５切片／群、Ｐ＜０．０１）。ＢＬＡにおいて、活動レベルは、対照およびｅＮｐＨＲ３．１マウスの両方において同様に上昇した（ｐ＜０．０００１）。図９Ｅは、別のマウス群が訓練された後、条件付けから２８日後に条件付け文脈に再度暴露された実験を表す。試験の９０後、染色のために脳を採取した。図９Ｆは、遠隔記憶が示された後、代表的なＣＡ１、ＡＣＣ、およびＢＬＡを表す。白色スケールバー：１５０μｍ。図９Ｇは、条件付けの２８日後の遠隔呼び出しが、対照マウス（Ｐ＜０．００５）においてＣＡ１ｃ−Ｆｏｓ発現のわずかだが重要な増加をもたらし、ＡＣＣ（ｐ＜０．０００１）およびＢＬＡ（ｐ＜０．０００１）において非常に高い活性レベルをもたらしたことを示す。文脈に対する暴露中の光抑制は、対照と比較して、ＣＡ１の活動を完全に遮断し（Ｐ＜０．０５）、ＡＣＣおよびＢＬＡの活動を著しく低減した（それぞれＰ＜０．０００１およびＰ＜０．０００１）。図９Ｈは、条件付け（０日目）と遠隔呼び出し（２８日目）の間の脳活動の全体パターンを示す。ＣＡ１の活動レベルは、対照（Ｐ＜０．００５）マウスにおいて、０日目から２８日目まで著しく減少した。ＡＣＣの活動レベルは、対照（Ｐ＜０．０００１）およびｅＮｐＨＲ３．１（Ｐ＜０．００１）マウスの両方において、０日目から２８日目まで著しく増加した。ＢＬＡの活動レベルは、ｅＮｐＨＲ３．１マウスではなく、対照（Ｐ＜０．００１）において著しく増加した。 正確な長期前帯状皮質（ＡＣＣ）光遺伝的抑制は、近時ではなく遠隔恐怖記憶の呼び出しを妨害することを示す実験データを表す。図１０Ａは、前帯状皮質（ＡＣＣ）におけるｅＮｐＨＲ３．０の発現を表す。図１０Ｂは、正確な光投与が、近時ではなく（７５．９±５．４対７６±２．９％硬直）、遠隔（対照ｎ＝５、８１．６±４．９％硬直、ｅＮｐＨＲ３．０ ｎ＝５、５３．８±１１％硬直、Ｐ＜０．０５）記憶呼び出しの抑制をもたらした実験を示す。図１０Ｃは、ＡＣＣにおける長期光が、近時ではなく（７８．５±１２．７対７４．３±４．３％硬直）、遠隔（対照ｎ＝３、７８．０±６．２％硬直、ｅＮｐＨＲ３．０ ｎ＝８、４５．０±５．２％硬直、Ｐ＜０．０５）記憶呼び出しの抑制ももたらした別の実験を表す。

詳細な説明
本開示は、時間ベースで記憶機能を修正するのに有用であると考えられる。本発明の特定の適用は、記憶想起および／または記憶想起に結合される感情応答の妨害を促進する。本明細書に開示される例示の実施形態の多くの態様は、この分野のこれまでの開発に関し、それらを基礎とするため、以下の論考は、そのようなこれまでの開発をまとめて、実装の詳細および修正が描かれ得る基礎および根底をなす教示に関する強固な理解を提供する。この文脈において、以下の論考は、参照することにより本明細書に組み込まれるこれらの参考文献における教示とともに提供される。本発明は、必ずしもそのような適用に限定されないが、発明の様々な態様は、この文脈を使用して様々な実施例の考察を通して理解されてよい。

背側ＣＡ１海馬回路の（時間的）妨害は、文脈的恐怖記憶の取得を防止するために有効であることが発見された。それと一致して、一般的な神経ネットワーク理論は、記憶の固定のプロセスが、海馬と皮質との間の接続における短期修飾から開始し、海馬が記憶自体を保存するよりもむしろ、完全な記憶に寄与する関連皮質部位を活性化するのを可能にする。これらの皮質トレースは、繰り返し共活性化され、それらの間の段階的な長期変化は、最終的にこれらの接続が海馬の関与なしに記憶を支持するために十分強力となるまで起こる。

意外にも、背側ＣＡ１海馬回路の妨害は、皮質再組織化が発生したと考えられた後であっても、恐怖記憶の呼び出しを遮断するのに有効であることが発見された。

本開示の様々な実施形態に従って、神経回路の制御に関連する方法、システム、またはデバイスが論じられる。神経回路に対する制御は、抑制または励起を含むことができ、それぞれ調製された発火、および／または外部回路入力に対する修正された感受性を含み得る。例えば、抑制はイオンチャネルおよび／またはイオンポンプ（例えば、ＮｐＨＲおよびＮｐＨＲ変異型）などの光活性化タンパク質を使用して達成され得る。そのようなイオンチャネルは、ニューロンの膜電位をその閾値電圧から離し、活動電位を中断または抑制させる。別の例では、励起は、イオンチャネル（例えば、ＣｈＲ２およびＣｈＲ２変異型）などの光活性化タンパク質を使用して達成され得る。そのようなイオンチャネルは、膜電位を閾値電圧に向かって移動、および／または通過させることができ、それにより活動電位を励起または促進する。様々な実施形態に従って、光活性化タンパク質を使用して、ニューロンの静止電位を（時間的に）移行させて、外部回路入力に対するその感受性を増減させる。これらの様々なオプションは、組み合わせて使用することもできる。

本明細書に提供されるデバイスおよび方法は、記憶機能に可逆的に影響し得る。例えば、以下に記載される方法を使用して、長期および短期記憶、ならびに恐怖記憶またはストレス記憶を含む様々な種類の記憶の基礎となる神経回路を制御および／または特性化してよい。方法は、様々な段階の記憶機能（例えば、記憶の取得、固定、および呼び出し）にも影響し得る。記憶機能（例えば、記憶形成および／または記憶想起）に影響を及ぼすためのいくつかの変型例では、記憶機能は、光活性化タンパク質を発現する、海馬の背側ＣＡ１領域、扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）、および／または前帯状皮質（ＡＣＣ）のニューロンに光を印加することにより影響される。光の存在下で、これらの光活性化タンパク質は、ニューロンの脱分極化を抑制してよく、それにより記憶の形成および／または想起を妨害する。例示的な方法は、文脈的遠隔および近時恐怖ベースの記憶の取得および呼び出しの文脈において記載されるが、本明細書に開示されるデバイスおよび方法は、記憶機能の他の段階、ならびに他の種類の記憶（例えば、キュー記憶）に影響するように使用されてよいことを理解されたい。

本明細書に記載され、図面に示される様々な実施形態は、一緒におよび／または他の方法で実装されてよい。図面／図に表される項目の１つ以上は、より個別のまたは統合された方法で実装することもでき、または特定の適用に従って有用であるように、ある例では除去され、および／または動作不能にされ得る。例えば、本明細書に論じられるＰＴＳＤの治療を伴う実施形態は、時間的に制御された薬物放出を使用して実装され得る。本明細書の記載を参照して、当業者は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、多くの変化がそこに行われてよいことを認識するであろう。

標的細胞における光活性化タンパク質の発現
ニューロン（例えば、記憶機能に関与するニューロン）の活動は、多様な機序を使用して影響されてよい。ニューロン活動に影響する決定論的な方法を使用して、様々な脳機能の基礎となる神経回路を制御および／または特性化してよい。例えば、ニューロン応答は、薬剤（例えば、テトロドトキシン（ＴＴＸ）、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン（ＣＮＱＸ）、ピクロトキシン、ストリキニーネなど）を適用することにより、および／または電気刺激（例えば、電極）により影響され得る。いくつかの変型例では、ニューロン活動は、ニューロンの膜上である種類のタンパク質を活性化することにより影響される場合があり、細胞膜を過分極化または脱分極化し得る。例えば、ある波長を有する光の存在下で、あるイオン（例えば、カチオン、アニオン）に透過性となる光活性化タンパク質は、ニューロン内で発現され得る。光活性化タンパク質の例には、以下でさらに説明される、光活性化イオンチャネルおよび／またはポンプが挙げられ得る。

いくつかの変型例では、微生物オプシン遺伝子は、神経科学において使用するために適合され得る。これらのオプシンは、正常な哺乳類の脳内で特定細胞型のミリ秒時間スケールの膜電位変化への光パルス列の形質導入を可能にする（例えば、チャネルロドプシン（ＣｈＲ２）、Ｖｏｌｖｏｘチャネルロドプシン（ＶＣｈＲ１）、およびハロロドプシン（ＮｐＨＲ））。ＣｈＲ２は、単細胞緑藻クラミドモナスに由来するロドプシンである。本明細書で使用される、用語「ロドプシン」は、少なくとも２つの構築ブロックである、オプシンタンパク質、および共有結合された共因子、通常レチナール（レチンアルデヒド）を含むタンパク質である。ロドプシンＣｈＲ２は、クラミドモナスゲノム内で、本来はクラミオプシン−４（Ｃｏｐ４）と呼ばれるオプシンチャネルオプシン−２（Ｃｈｏｐ２）に由来する。１つの脱分極チャネルロドプシン、ＣｈＲ２の時間特性は、活性化および非活性化の高速反応速度を含み、正確な時間活動電位列の生成を可能にする。長い時間スケールの活性化を求める適用の場合、チャネルロドプシンの通常高速のオフ反応速度が減速され得ることが発見された。例えば、チャネルロドプシンのある実装は、事実上脱分極化が望ましい時間全体で、１ｍＷ／ｍｍ^２光を適用し、これは望ましいとは言えない。

ある波長（複数可）を有する光に応答して、膜の過分極化を生成するか、または脱分極化を抑制する光活性化タンパク質は、海馬の背側ＣＡ１領域（ＣＡ１）、扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）、および前帯状皮質（ＡＣＣ）領域内の、興奮性ニューロン（例えば、グルタミン酸作動性ニューロン）内で発現されてよい。以下の表１は、ある波長の光の存在下で、脱分極化を抑制するか、またはニューロンを過分極化させるように、興奮性ニューロン内で発現され得る光活性化タンパク質の様々な例を示す。これらおよび他の光活性化タンパク質に関するさらなる説明は、２０１１年３月１７日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２８８９３号、表題「ＬＩＧＨＴ ＳＥＮＳＩＴＩＶＥ ＩＯＮ ＰＡＳＳＩＮＧ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ」において見出され得、参照することによりその全体が組み込まれる。本明細書で使用される、「ＮｐＨＲ」、「ＢＲ」、「ＡＲ」、および「ＧｔＲ３」は、野生型タンパク質および機能的変異型（自然発生する変異型を含む）が挙げられる。

本発明の実施形態は、自然発生する配列の比較的軽度のアミノ酸変異型を含む。一例では、変異型は、自然発生する配列のタンパク質配列に対して約７５％を超えて相同性である。他の変異型では、相同性は約８０％超である。さらに他の変異型は、約８５％超、９０％超、またはさらには約９３％〜約９５％、もしくは約９８％もの高い相同性を有する。この文脈において相同性は、配列類似性または同一性を意味し、同一性を伴うことが好ましい。この相同性は、配列解析の分野で既知の標準的な技法を使用して決定され得る。本発明の実施形態の組成物は、本明細書に提供されるタンパク質および核酸配列を含み、提供される配列に対して約５０％を超えて相同、提供される配列に対して約５５％を超えて相同、提供される配列に対して約６０％を超えて相同、提供される配列に対して約６５％を超えて相同、提供される配列に対して約７０％を超えて相同、提供される配列に対して約７５％を超えて相同、提供される配列に対して約８０％を超えて相同、提供される配列に対して約８５％を超えて相同、提供される配列に対して約９０％を超えて相同、または提供される配列に対して約９５％を超えて相同の変異型を含む。

本明細書では、非ヒト動物の海馬の背側ＣＡ１野、前帯状皮質、および／または扁桃体基底外側部内に興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含む非ヒト動物が提供され、このタンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、このタンパク質の照射は、記憶機能に可逆的に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質は、本明細書に記載されるＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲ、およびＧｔＲ３からなる群から選択される。例えば、本明細書に記載されるＮｐＨＲタンパク質のいずれかは、標的ニューロンの細胞膜上に発現されてよい。

また本明細書では、海馬の背側ＣＡ１野、扁桃体基底外側部、および前帯状皮質からなる群から選択される脳領域を含む脳組織切片も提供され、光活性化タンパク質は、脳領域の興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、このタンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、このタンパク質の照射は、記憶機能に可逆的に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、脳組織切片は、本明細書に記載される非ヒト動物から採取した培養組織切片である。いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質は、本明細書に記載されるＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲ、およびＧｔＲ３からなる群から選択される。例えば、本明細書に記載されるＮｐＨＲタンパク質のいずれかは、標的ニューロンの細胞膜上に発現されてよい。

いくつかの実施形態では、ＣＡ１、ＢＬＡ、および／またはＡＣＣ領域のニューロンは、ＣｈＲ２を発現し得る。特に指定のない限り、発明は、多数の類似する変異型を含む。例としては、これらに限定されないが、Ｃｈｏｐ２、ＣｈＲ２−３１０、Ｃｈｏｐ２−３１０、およびＶｏｌｖｏｘチャネルロドプシン（ＶＣｈＲ１）が挙げられる。ＶＣｈＲ１に関するさらなる詳細は、参照することにより本明細書に完全に組み込まれる、「Ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔｅｄ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｆａｓｔ ｎｅｕｒａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ」，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｊｕｎｅ ２００８，１１（６）：６３１−３．Ｅｐｕｂ ２００８ Ａｐｒ．２３を参照することができる。他の実装では、同様の修飾を他のオプシンまたは光活性化分子に行うことができる。例えば、修飾／変異をＣｈＲ２またはＶＣｈＲ１変異型に行うことができる。さらに、修飾された変異型は、光活性化イオンポンプと組み合わせて使用することができる。

本明細書で使用される、標的細胞の刺激は、一般に細胞の特性の修正を説明するように使用される。例えば、標的細胞の刺激は、細胞膜の特性の変化をもたらす場合があり、標的細胞の脱分極化または分極化に至り得る。特定の例では、標的細胞はニューロンであり、ニューロンによるインパルス（活動電位）の生成を促進または抑制することにより、刺激はインパルスの伝送に影響し得る。

光活性化タンパク質（例えば、オプシン）に関するさらなる詳細については、参照することにより本明細書に完全に組み込まれる、ＤｅｉｓｓｅｒｏｔｈらのＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０５６９７０号、表題「ＯＰＴＩＣＡＬＬＹ−ＢＡＳＥＤ ＳＴＩＭＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＴＡＲＧＥＴ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮＳ ＴＨＥＲＥＴＯ」を参照されたい。

本開示の実施形態は、標的とされる集団の励起性の双安定変化の実装を対象とする。これには、二重変異ＣｈＲ２−Ｃ１２８Ｓ／Ｄ１５６Ａが挙げられるが、必ずしもこれに限定されない。この二重変異ＣｈＲ２−Ｃ１２８Ｓ／Ｄ１５６Ａは、培養海馬ニューロン内で十分に耐性があり、青色光の単一短パルスによる急速な段階的活性化、および緑色もしくは黄色光による非活性化の本質的なＳＦＯ特性を保存することがわかった。特に、ＣｈＲ２−Ｃ１２８Ｓ／Ｄ１５６Ａの活性化スペクトルは、４４５ｎｍにおいてピークであった。第２の非活性化ピークは、３９０〜４００ｎｍにおいて認められ、５９０ｎｍ非活性化ピークと比較して、より高速であるが、不完全な非活性化であった。ＣｈＲ２−Ｃ１２８Ｓ／Ｄ１５６Ａを発現する細胞におけるピーク光電流は、ロバストであり、ＣｈＲ２−Ｄ１５６Ａのそれに匹敵することがわかった（それぞれ２３１．０８±３１．１９ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝９細胞および３２０．９６±７８．２６ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝７細胞）。

個別のトランスフェクトおよびパッチクランプされたニューロンは、次に４７０ｎｍ光の１００ｍｓパルスで活性化した。電流減衰が細胞減少に起因しないという極めて長期の記録を保証するために、各細胞を別個の間隔で長期の５９０ｎｍ光パルスで非活性化し、各時点で残りのＳＦＯ電流の程度を決定する。意外にも、ＣｈＲ２−Ｃ１２８Ｓ／Ｄ１５６Ａを発現するニューロンは、いずれかの単一変異体単独を発現する細胞からのものよりも安定した持続性光電流を生じた。単一指数関数減衰曲線を経時的なＩ非活性化／Ｉ活性化の比率に適合させることは、ＣｈＲ２−Ｃ１２８Ｓ／Ｄ１５６Ａの２９．３分の自然減衰時定数を明らかにし、Ｃ１２８およびＤ１５６変異が、相乗的に作用して、ＣｈＲ２の開放状態の減衰を遅延させることを示す。複雑な哺乳類の行動に対して予期される適用に必要な改善に従って、二重変異ＳＦＯ電流のかなりの部分は、依然として単一光活性化パルス後２０分まで存在した。

これらの驚くほど遅い減衰反応速度に基づいて、二重変異体遺伝子は、ＳＳＦＯ（安定化ステップ−機能オプシン）遺伝子と呼ばれる。ＳＳＦＯは、活性タンパク質の短縮形としても使用される。いずれの残渣もＣｈＲ２チャネル閉鎖（ゲーティング）に関与する可能性があり、いずれの変異もチャネルの開放状態構成を安定化させる可能性がある。

理論に拘束されることなく、本開示の態様は、ＳＳＦＯが光反応サイクルの進行において完全に遮断され得、したがって、光反応サイクル工学で可能な最大安定性を呈し得るという発見に関する。例えば、ＣｈＲ２ Ｃ１２８ＸおよびＣｈＲ２−Ｄ１５６Ａとは対照的に、ＳＳＦＯ光反応サイクルは、この変異体において到達されなかった後期光反応サイクル段階において、光反応サイクルを分離する可能性がある付加的な非活性脱プロトン化副産物にアクセスするように見られず、そのため、親単一変異よりも、インビボでの繰り返し使用におけるＳＳＦＯの信頼性をさらに高める。

本開示の実施形態は、光に対するＳＳＦＯの感受性を対象とする。例えば、遅い減衰定数を有するチャネルロドプシンは、光子積分器として有効に作用する。これは、光遺伝的回路変調に対する高感受性、低侵襲性のアプローチに特に有用であり得、光パルス長の変調を介して、標的ニューロン集団に対する容易に滴定可能な動作を依然として伴う。異常に低い光強度であっても（８μＷｍｍ^−２まで低い）、数百ピコアンペアの全細胞光電流は、ＳＳＦＯを発現するニューロンから得ることができ、全照射時間の間に、４７０ｎｍの光に応答して、単一指数関数的反応速度で増加することが発見された。他の態様は、べき乗関係を示す、両対数スケールで活性化光パワーと線形的に相関した活性化時定数の使用に関し、ＳＳＦＯが純積分器であることを示唆し、光電流の唯一の決定因子として経過時間に対する総光子暴露を用いる。例えば、光電流が所与の最大下活性に到達するために必要とされる膜面積当たりの光子の数（τまでの時間）は、活性化光パワーに関わらず一定である。

本開示の例示的実施形態は、ハイブリッドＣｈＲＩ／ＶＣｈＲＩキメラの使用に関し、ＣｈＲ２配列をまったく含有せず、個別に良好に発現しない２つのオプシン遺伝子に由来し、本明細書ではＣ１Ｖ１と呼ばれる。本開示の実施形態は、Ｋ_ｉｒ２．１チャネルに由来する膜輸送シグナルの付加を通して、ＶＣｈＲ１の膜標的の改善にも関する。ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰを発現する培養ニューロンからの共焦点像は、ＣｈＲ２と比較して細胞内タンパク質の大部分を明らかにし、したがって、ＶＣｈＲ１の膜標的を改善し、Ｋ_ｉｒ２．１チャネルに由来する膜輸送シグナルを付加した。このＶＣｈＲ１−ｔｓ−ＥＹＦＰの膜標的は、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰと比較してわずかに強化されたが、ＶＣｈＲ１−ｔｓ−ＥＹＦＰを発現する培養海馬ニューロンから記録された平均光電流は、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰのそれよりもわずかに大きいだけであった。したがって、本開示の実施形態は、らせんを他のＣｈＲからの対応するらせんと交換することにより修飾されるＶＣｈＲ１に関する。例えば、らせん１および２がＣｈＲ１からの相同セグメントと置き換えられた２つのキメラにおいて、ロバスト改善が認められた。スプライス部位が、らせん２と３との間に（ＣｈＲ１残渣Ａｌａ１４５において）細胞内ループ内にあるか否か、またはらせん３内にあるか否か（ＣｈＲ１残渣Ｔｒｐ１６３において）に関わらず、得られるキメラは、いずれもロバストに発現され、同様に光電流およびスペクトル特性を強化した。ＣｈＲ１が弱く発現され、大部分の哺乳類宿主細胞の膜に不良に統合されるに過ぎないため、この結果は望ましくなかった。得られるハイブリッドＣｈＲ１／ＶＣｈＲ１キメラは、本明細書においてＣ１Ｖ１と呼ばれる。

本開示の態様は、培養ニューロン（例えば、海馬ニューロン）におけるＣ１Ｖ１の発現に関する。実験的試験は、多数の意外で有用な結果を示し、これらは以下でさらに詳述される。Ｃ１Ｖ１−ＥＹＦＰは、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰと比較して、驚くほど改善された平均蛍光を呈する。Ｃ１Ｖ１を発現するニューロンにおける全細胞光電流は、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰおよびＶＣｈＲ１−ｔｓ−ＥＹＦＰのそれよりもはるかに大きく、イオン選択性は、ＣｈＲ２およびＶＣｈＲ１のそれに類似した。Ｃ１Ｖ１とＹＦＰとの間のＫｉｒ２．１輸送シグナルの付加は、光電流をさらに４１％強化した。（Ｃ１Ｖ１−ｔｓ−ＥＹＦＰ平均光電流は極めて大きく、野生型（ＷＴ）ＶＣｈＲ１のほぼ１０倍であった）。平均蛍光レベルは、測定された光電流とほぼ一致し（ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰ、ＶＣｈＲ１−ｔｓ−ＥＹＦＰ、Ｃ１Ｖ１−ＥＹＦＰ、およびＣ１Ｖ１−ｔｓ−ＥＹＦＰの平均蛍光はそれぞれ９．３±１、１９．６±３．４、１９．８±２．８および３６．３±３．８）、光電流の大きさの増加が、哺乳類ニューロンにおけるこれらのチャネルの発現の改善から主に生じたことを示唆する。総体細胞蛍光（統合されたピクセル密度として測定される）は、異なる構成（ＶＣｈＲ１、ＶＣｈＲ１−ｔｓ−ＥＹＦＰ、Ｃ１Ｖ１、Ｃ１Ｖ１−ｔｓ−ＥＹＦＰ）にわたって個別の記録／撮像された細胞内の光電流の大きさと線形的に相関した。これは、Ｃ１Ｖ１の光電流の増加が、ニューロンにおける機能発現の変化に起因することを示唆する（理論に制限されない）。

本開示の様々な実施形態は、高速減衰定数を有するオプシンまたは光活性化タンパク質に関する。この特性は、スパイクに対して正確な制御を提供するため、例えば、内因性コンダクタンスを最小限に干渉し、光パルス当たり単一スパイクをトリガーし、および／または光パルス列の間のプラトー電位を最小化するために特に有用であり得る。実験結果は、Ｃ１Ｖ１−ｔｓ−ＥＹＦＰにおいて記録された光誘発光電流が、ＶＣｈＲ１のそれに類似する時定数により減衰されたことを示唆する。したがって、本開示の態様は、低非活性化、考えられるさらなる赤色寄りの吸収、および／または、光反応サイクルの反応速度を改善するための発色団領域における修飾を対象とする。

一実施形態は、対応するＣｈＥＴＡ変異Ｅ１６２Ｔを対象とし、この実験は、加速した光反応サイクル（例えば、約３倍）を提供することを示唆する（参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｇｕｎａｙｄｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｕｌｔｒａｆａｓｔ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１０を参照することができる）。意外にも、この変異は、作用スペクトルを５３０ｎｍまで浅色に偏移することが示されたが、ＣｈＲ２または他の微生物ロドプシンにおける類似変異は、赤色寄りの偏移をもたらした。

別の実施形態は、グルタミン酸塩−１２２のトレオニンへの変異を対象とする（Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ）。実験的試験は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔが、ＣｈＲ２の４６％不活性化と比較して、わずか２６％だけ不活性化したこと、加えてスペクトルが５４６ｎｍまでさらに赤色寄りに偏移したことを示した。

本開示の別の実施形態は、Ｅ１２２ＴおよびＥ１６２Ｔ変異の両方を含む、Ｃ１Ｖ１の二重変異を対象とする。実験的試験は、電流の不活性化がＥ１２２Ｔ変異の場合より低く、光反応サイクルがＥ１６２Ｔと比較して速いことを示した。これは、個別の変異の複数の有用な特性が、二重変異体内で一緒に保存されたことを示唆する。

光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド
本明細書に記載される光活性化タンパク質またはオプシンは、当該技術分野において既知の方法により、例えば、タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドによりニューロンに送達されてよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクターであり、例えば、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＨＳＶベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである。

例えば、ニューロンは、細胞特異的プロモータに動作可能に結合された光活性化タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターと接触されてよく、該ニューロンは、細胞膜上に光活性化タンパク質を発現する。いくつかの変型例では、細胞特異的プロモータは、カルシウム／カルモデュリン依存性タンパク質キナーゼＨａ（ＣａＭＫＩＩａ）プロモータである。いくつかの変型例では、光活性化可能なｅＮｐＨＲ３．１またはｅＮｐＨＲ３．０をコードする核酸配列は、ベクター内のＣａＭＫＩＩａプロモータに動作可能に結合される。いくつかの変型例では、光活性化タンパク質は、ＣＡ１領域、ＢＬＡおよび／またはＡＣＣにおいて、興奮性グルタミン酸作動性ニューロン内で発現される。遺伝子送達に使用され得る任意のベクターが使用されてよい。いくつかの変型例では、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス）が使用されてもよい。

いくつかの実施形態において、ベクターは、組み換えＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、それらが感染する細胞のゲノム内に安定した部位特異的な様式で組み込むことができる、比較的小さい寸法のＤＮＡウイルスである。これらは、細胞の成長、形態、または分化に対するいずれの影響も誘発することなく幅広い細胞に感染することができ、またこれらはヒトの病理には関与していないと考えられる。ＡＡＶゲノムは、クローニングされ、シークエンシングされ、特徴付けられてきた。該ゲノムは、約４７００塩基を包含し、ウイルスの複製開始点としての役割を果たす約１４５塩基の末端逆位配列（ＩＴＲ）領域を各末端に含む。ゲノムの残りの部分は、キャプシド形成の機能を担う２つの必須領域に分割される：ウイルスの複製およびウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含む、ゲノムの左側部分、ならびにウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む、ゲノムの右側部分。

ＡＡＶベクターは、当該技術分野における標準的な方法を使用して調製されてもよい。いずれの血清型のアデノ随伴ウイルスも好適である（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ，“Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ”Ｊ． Ｒ． Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．（１９８８）ｐｐ．１６５−１７４、Ｒｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１，１９７４、Ｐ．Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ“Ｔｈｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ”Ｉｎ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＪＲ Ｋｅｒｒ，ＳＦ Ｃｏｔｍｏｒｅ．ＭＥ Ｂｌｏｏｍ，ＲＭ Ｌｉｎｄｅｎ，ＣＲ Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｅｄｓ．）ｐ５−１４，Ｈｕｄｄｅｒ Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（２００６）、およびＤＥ Ｂｏｗｌｅｓ，ＪＥ Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，ＲＪ Ｓａｍｕｌｓｋｉ“Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ”（ＪＲ Ｋｅｒｒ，ＳＦ Ｃｏｔｍｏｒｅ．ＭＥ Ｂｌｏｏｍ，ＲＭ Ｌｉｎｄｅｎ，ＣＲ Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｅｄｓ．）ｐ１５−２３，Ｈｕｄｄｅｒ Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（２００６）を参照されたく、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ベクターを精製するための方法は、例えば、米国特許第６５６６１１８号、第６９８９２６４号、および第６９９５００６号、ならびにＷＯ／１９９９／０１１７６４号（標題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｈｉｇｈ Ｔｉｔｅｒ Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ」）に見出すことができ、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ハイブリッドベクターの調製は、例えば、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７０９１号に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。インビトロおよびインビボで遺伝子を移動させるためのＡＡＶに由来するベクターの使用が記載されている（例えば、国際特許出願公開第９１／１８０８８号およびＷＯ９３／０９２３９号、米国特許第４，７９７，３６８号、同第６，５９６，５３５号、および同第５，１３９，９４１号、ならびに欧州特許第０４８８５２８号を参照されたく、これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これらの刊行物は、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が欠失し、対象となる遺伝子によって置換された種々のＡＡＶ由来構築物、ならびにインビトロ（培養細胞内）またはインビボで（生物内で直接的に）対象となる遺伝子を移動させるためのこれらの構築物の使用について記載している。本発明による複製欠損組み換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）領域によって隣接された対象となる核酸配列を含むプラスミドと、ＡＡＶキャプシド形成遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を持つプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）に感染させた細胞株内にコトランスフェクトすることによって調製することができる。生成されたＡＡＶ組み換え体は、次いで、標準的な技術によって精製される。

いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用するためのベクター（複数を含む）は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５，ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、およびＡＡＶ１６を含むがこれらに限定されないＡＡＶウイルス粒子）中にキャプシド形成される。したがって、本発明は、本明細書に記載のベクターのいずれかを含む組み換えウイルス粒子（組み換えポリヌクレオチドを含むため、組み換え体である）を含む。このような粒子を生成する方法は、当該技術分野で既知であり、米国特許第６，５９６，５３５号に記載されている。

本明細書に記載の動物細胞について、１つ以上のベクターを、神経細胞、心臓細胞、または幹細胞に投与することができることを理解されたい。１つ以上のベクターが使用される場合、それらは、同時または異なる時点で、動物細胞に投与することができることを理解されたい。

例えば、いくつかの変型例では、ニューロン内のＣ１Ｖ１オプシン遺伝子は、Ｃ１Ｖ１−ｔｓ−ＥＹＦＰをコードするレンチウイルスベクターおよび本明細書で論じられる様々な点変異の組み合わせを生成することにより実行された。次いでオプシンは、培養された海馬ニューロン内で発現され、同一の刺激条件下（２ｍｓパルス、５４２ｎｍ光、５．５ｍＷ／ｍｍ^２）、全細胞光電流を記録した。Ｃ１Ｖ１、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２Ｔ、およびＣ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔを発現する細胞内の光電流は、すべてロバストであり、ＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒの光電流よりも大きく流れた。実験は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔを発現する細胞から、およびＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒを発現する細胞からの統合体細胞ＹＦＰ蛍光および光電流の比較も含んだ。意外にもＣ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ細胞は、等しい蛍光レベルでＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒ細胞よりも強い光電流を示した。これは、Ｃ１Ｖ１が、ＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒと比較して、より高い単位コンダクタンスを有し得ることを示唆する。試験結果は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔの反応速度が、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔのそれよりも遅かったこと、およびＣ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔを発現する細胞が、二重変異体を発現する細胞よりも強く赤色光（６３０ｎｍ）に応答したことを示唆する。これは、赤色光に応答して、光遺伝的スパイクを生成するために特に有用であり得る。

本開示の様々な実施形態と一致して、同一のマイクロ回路内に常駐する抑制性および／または興奮性ニューロンは、様々な光活性化タンパク質（例えば、オプシン）の導入に際して標的とされる。実験的試験は、培養された海馬ニューロン内のＣａＭＫＩＩａプロモータ下で、別個に発現されたＣ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２ＴおよびＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒにより行われた。Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔを発現する細胞は、２ｍｓ緑色光パルス（５６０ｎｍ）に応答してスパイクしたが、紫色光パルス（４０５ｎｍ）にはスパイクしなかった。対照的に、ＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒを発現する細胞は、２ｍｓ ４０５ｎｍ光パルスに応答してスパイクしたが、２ｍｓ ５６１ｎｍ光パルスにはスパイクしなかった。

本開示の様々な実施形態は、生きている脳切片内の２つのニューロン集団の独立した活性化に関する。実験的な試験は、２０ＰＶ：：ＣｒｅマウスのｍＰＦＣ内でＣａＭＫＩＩａ−Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔｔｓ−ｅＹＦＰおよびＥＦｌａ−ＤＩＯ−ＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒ−ＥＹＦＰにより行った。非発現ＰＹＲ細胞では、４０５ｎｍ光パルスは、ＰＶ細胞の直接活性化に起因して、ロバストかつ高速な抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）をトリガーしたが、５６１ｎｍ光パルスは、局所抑制性ニューロンのＣ１Ｖ１−発現錐体細胞から生じる予期される長潜時多シナプスＩＰＳＣのみをトリガーした。

ニューロン内で発現したタンパク質の光活性化
ニューロン内で発現した光活性化タンパク質を活性化する波長を有する光を適用することができる任意のデバイスを使用して、ニューロンを脱分極化および／または過分極化してよい。例えば、図１に表される１つ以上のニューロンの膜電圧に影響を及ぼすイオンチャネルおよび／またはイオンポンプを活性化するための光送達デバイス（１００）が使用されてもよい。そこに示されるように、光送達デバイス（１００）は、光刺激を脳の標的領域に提供するように構成される。光送達デバイス（１００）は、基部（１０２）、基部に取り付けられるカニューレガイド（１０４）、およびカニューレガイドを介して基部に取り付けられた１つ以上の光学導管（１０６）を含んでよい。基部（１０２）は、光学導管（１０６）から標的組織領域（１０１）、例えば、ＣＡ１領域（１０３）に光を送達するように位置付けられた１つ以上の光送達ポート（１０８）を含む。光学導管（１０６）は、ファイバーの近位端が、光学光源（図示せず）に取り付けられ、遠位端が、光送達ポート（１０８）と連通している光ファイバーであってよい。光学光源は、連続光および／またはパルス光を提供することができ、既定のパルス配列で光を提供するようにプログラム可能であってよい。光送達デバイス（１００）は、任意の数の光学導管（１０６）を有してよく、望ましくは、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０などであってよい。光学導管（１０６）は、それぞれ同一または異なる波長の光を運んでよい。送達された光は、４５０ｎｍ〜６００ｎｍの間の波長、例えば、黄色光または緑色光を有してよい。光送達デバイス（１００）は、任意の数の光送達ポート（１０８）を有してよく、望ましくは、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０などであってよい。いくつかの変型例では、光学導管と同数の光送達ポートであってよいが、他の変型例では、異なる数の光学導管および光送達ポートであり得る。例えば、２つ以上の光送達ポートに光を運ぶ単一の光学導管であってもよい。代替または付加的に、単一の光学導管は、単一の光送達ポートに接続してよい。カニューレガイド（１０４）は、光学導管（１０６）を光送達ポート（１０８）に固定および整列するのを助けるように構成されてよい。いくつかの実施形態では、光送達デバイス（１００）は、記憶の形成および想起に影響を及ぼすように、両側光をＣＡ１領域（１０３）に送達するように構成される。光送達デバイスは、ニューロン活性を測定するために構成され得る、１つ以上の測定電極を含んでもよい。例えば、測定電極は、ニューロンが刺激に応答するとき、１つ以上のニューロンの膜全体の膜電位（例えば、活動電位）および／または電流の変化を記録し得る。いくつかの変型例では、測定電極は、光学刺激に対する１つ以上のニューロンの電気応答を測定し得る。測定電極は、細胞外または細胞内電極であり得る。

記憶機能に影響を及ぼす方法
本明細書に記載されるように、標的組織領域（１０１）は、光に応答して細胞の膜電圧を修正するように設計された光活性化タンパク質を有する細胞を持つ神経組織を含んでよい。いくつかの変型例では、光活性化タンパク質を使用して、脳のＣＡ１、ＢＬＡ、およびＡＣＣ領域におけるニューロンの脱分極化を抑制することにより記憶の形成および／または想起を妨害してよい。本開示の実施形態は、記憶の取得、呼び出し、および／または記憶と感情的な反応、例えば恐怖との関連付けを妨害することを対象とする。特定の実施形態では、記憶に関与する神経回路の機能は、光活性化イオンチャネル（例えば、ＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲなど）および／またはポンプ（例えば、プロトンポンプＧｔＲ３）の活性化により妨害される。ある実装では、この妨害は、記憶形成の間に実装され得る。他の実装では、この妨害は、記憶想起前またはその間に実装され得る。これは、記憶の呼び出しを伴う精神疾患または神経疾患、例えばＰＴＳＤに特に有用であり得る。ある実施形態と一致して、妨害は、その妨害に対して提示される、および／または制御される記憶トリガー事象または他の外部刺激に応答してトリガーされ得る。例えば、妨害は、トリガーに応答するように条件付けられた個体に対して、記憶のトリガーに応答して提供され得る。別の例では、個体は、妨害を活発にトリガーし得る。例えば、個体は、ＰＴＳＤと関連付けられた記憶を経験するとき、妨害をトリガーし得る。本開示の他の実施形態は、記憶の取得、呼び出し、および／または記憶と感情的な反応との関連付けを促進することを対象とする。本明細書に記載される方法は、記憶機能におけるニューロン（複数可）および／または神経回路の役割を確認するように、および／または記憶障害と関連付けられる疾患を治療するように使用され得る。

いくつかの実施形態では、個体において記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための本明細書に提供される方法は、光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、個体の海馬の背側ＣＡ１野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部に投与することを含み、光活性化タンパク質は、海馬の背側ＣＡ１野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、それによりそのタンパク質を光によって活性化することが、個体における事象の記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、個体において記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための本明細書に提供される方法は、個体における事象の記憶想起または記憶形成の間に、海馬の背側ＣＡ１野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの脱分極化を抑制することを含み、光活性化タンパク質は、個体の海馬の背側ＣＡ１野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができる。いくつかの実施形態では、事象は恐怖事象である。

本明細書では、個体において心的外傷後ストレス障害を治療するための方法が提供され、光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、個体の海馬の背側ＣＡ１野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部に投与することを含み、光活性化タンパク質は、個体の海馬の背側ＣＡ１野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、それによりそのタンパク質を光によって活性化することが、個体における事象の記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼす。

本明細書では、記憶想起または記憶形成に影響を及ぼす薬剤をスクリーニングする方法が提供され、ａ）非ヒト動物における事象の記憶想起または記憶形成の間に、海馬の背側ＣＡ１野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンを薬剤と接触させることであって、非ヒト動物は、該非ヒト動物の海馬の背側ＣＡ１野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含み、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制できることと、ｂ）事象の記憶想起または記憶形成の間に、海馬の背側ＣＡ１野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの脱分極を抑制することと、ｃ）その薬剤が、光の存在下または非存在下で記憶想起または記憶形成に影響を及ぼすか否かを決定することと、を含む。

本明細書において使用される「個体」は、ヒトを含む哺乳類である。哺乳類には、これらに限定されないが、農場動物、スポーツ動物、ペット、霊長類、マウス、およびラットが挙げられる。個体には、コンパニオン動物も挙げられ、これらに限定されないが、イヌおよびネコが挙げられる。一態様では、個体はヒトである。別の態様では、個体は非ヒト動物である。本明細書において使用される「非ヒト動物」には、非ヒト哺乳類が挙げられる。

本開示の実施形態に従って記憶機能を制御または修正するための方法の一例は、図２に表される。時間トリガー事象（２０２）は、記憶機能に対して制御を実装するための基準点を提供する。本明細書で論じられるところの、制御の時間性質は特に有用であり得る。それに制限されないが、記憶トリガー事象（２０２）は、訓練事象に結合され得る。例えば、個体（例えば、非ヒト動物、哺乳類、ヒト）は、特定の刺激に応答するように個体を訓練するために設計された刺激を導入される。記憶トリガー事象（２０２）は、個体に対する特定刺激の導入であり得る。別の例では、記憶トリガー事象は、個体の反応または動作に応答し得る（例えば、個体がＰＴＳＤ事象を経験しているという表示）。制御命令（２０４）は、刺激源（２０６）がどのように刺激（２０８）を細胞集団（２１０）に適用するかを決定する。これらの制御命令は、所望の標的の機能として決定および適用され得る。所望の標的は、例えば、時間属性、空間位置、および／または細胞型の１つ以上により定義され得る。刺激（２０８）は、記憶機能（２１２）の修正をもたらす。次いで刺激の効果は、モニター、観察、および／または評価され得る（２１４）。モニタリングを使用して、制御命令（２０４）を調整することができ（２１６）、それにより意図された結果に対する刺激を微調整することができる。本明細書で論じられる様々な実施形態は、記憶機能の基礎となる神経回路を制御および特性化するためのそのようなプロセスと関連して（または加えて）使用され得るさらなる例を提供する。

ＣＡ１およびＡＣＣのニューロンを抑制することにより記憶想起に影響を及ぼす
記憶想起を妨害するための方法の一変型例は、ＣＡ１領域の興奮性ニューロンを抑制することを含んでよい（例えば、膜脱分極化を遮断または低減することにより、および／または膜過分極を促進することにより）。光活性化イオンチャネル、例えば、ｅＮｐＨＲ３．１またはＮｐＨＲ３．０は、チャネルタンパク質をコードするポリヌクレオチドを領域に投与することにより個体のＣＡ１領域内に位置するニューロン上に発現されてよい。ｅＮｐＨＲ３．１またはＮｐＨＲ３．０イオンチャネルは、黄色光の存在下で活性化される（例えば、約５９１ｎｍの波長を有する）。個体には、上述される光送達デバイス（１００）などの光送達デバイスが提供されてよい。光送達デバイスは、黄色光がＣＡ１ニューロンに送達され得るように個体上に位置付けられてよい。記憶（例えば、恐怖記憶またはストレス記憶などの任意の望ましくない記憶）の想起後または想起中に、光送達デバイスは、黄色光をＣＡ１ニューロンに送達するように活性化されてよく、それによりそれらの脱分極化を抑制し、記憶の呼び出しを妨害する。記憶の呼び出しが十分に妨害されると、光送達デバイスは非活性化され得る。光送達デバイスの非活性化時に、個体は、妨害なしに記憶を想起する能力を再取得し得る。この方法を使用して、近時記憶（例えば、過去１日未満に起こった事象の記憶）の呼び出しおよび遠隔記憶（例えば、過去１日、過去１週間、過去２週間、過去４週間を超えて、過去８週間以前に起こった事象の記憶）の呼び出しを妨害してよい。いくつかの変型例では、ＡＣＣの興奮性ニューロンは、同様の光活性化タンパク質を発現してよく、遠隔記憶の想起を妨害するように同様に抑制されてよい。

ＣＡ１領域のニューロンを抑制することを含む記憶想起を妨害するための方法は、マウスなどの非ヒト動物において使用されてよい。例えば、ＣＡ１領域のニューロンにおいてｅＮｐＨＲ３．１またはＮｐＨＲ３．０を発現するマウスは、カスタマイズされたＦＣチャンバ内で訓練され、それらのマウスは文脈Ａに導入された後、音に続いて足衝撃を２回提示された。試験セッションにおいて、ｅＮｐＨＲ３．１またはＮｐＨＲ３．０ＣＡ１ニューロンに送達された緑色光は、硬直（例えば、文脈的硬直）の低減により測定されるように、マウスが記憶（すなわち、恐怖記憶またはストレス記憶）を呼び出す能力と干渉した。ｅＮｐＨＲ３．１またはＮｐＨＲ３．０ＣＡ１ニューロンが光に暴露されない別個の試験において、マウスは、正常な硬直率により測定されるように、訓練セッション中に形成された恐怖記憶を呼び出すことができる。いくつかの変型例では、試験セッションは、訓練セッション後１日以内に起こり得るが、他の変型例では、試験セッションは、訓練セッションから４週間以上後に起こり得る。緑色光をマウスのｅＮｐＨＲ３．１ＣＡ１ニューロンに適用することは、ニューロンの脱分極化を可逆的に抑制し、それにより近時および／または遠隔の文脈的恐怖記憶の呼び出しを妨害する。ｅＮｐＨＲ３．１またはＮｐＨＲ３．０ＣＡ１ニューロンから緑色光を除去することは、マウスが近時および／または遠隔の文脈的恐怖記憶を呼び出す能力を回復させる。

遠隔記憶の呼び出しまたは想起を可逆的に妨害するための方法は、記憶が繰り返し呼び出されて強固になった後に使用されてもよい。例えば、ｅＮｐＨＲ３．１またはＮｐＨＲ３．０を発現するＣＡ１ニューロンを有するマウスは、上述のように訓練され得る。訓練セッションから５週間後の試験セッションでは、マウスは、訓練中に形成された記憶を呼び出すことができたが、ｅＮｐＨＲ３．１またはＮｐＨＲ３．０ＣＡ１ニューロンが緑色光に暴露されると、それらはもはや記憶を呼び出すことができなかった。ｅＮｐＨＲ３．１またはＮｐＨＲ３．０ＣＡ１ニューロンの緑色光への後次暴露は、恐怖記憶の想起を妨害した。いくつかの方法では、記憶呼び出しの開始時および／または記憶呼び出しの間にｅＮｐＨＲ３．１またはＮｐＨＲ３．０ＣＡ１ニューロンを光に暴露することにより妨害され得る。例えば、呼び出し開始と同時に（例えば、試験セッションの開始時に）緑色光をｅＮｐＨＲ３．１またはＮｐＨＲ３．０ＣＡ１ニューロンに適用することは、記憶の呼び出しを妨害する。記憶呼び出しの間に緑色光がｅＮｐＨＲ３．１またはＮｐＨＲ３．０ＣＡ１ニューロンに適用されるとき（例えば、試験セッションが開始されてからいくらか経過した後で光を適用するとき、例えば、試験セッションの中間）、マウスは最初に恐怖記憶を呼び出して応答したが（硬直により）、次いで光が適用された後、速やかに恐怖応答を呈しなくなった。これらの方法は、ｅＮｐＨＲ３．１を発現するＣＡ１ニューロンを有するＰＴＳＤのある個体において使用されてよく、恐怖記憶の呼び出しを可逆的に妨害および／または中断するために、恐怖記憶の想起と同時および／またはその間に、光送達デバイスは活性化されてよい。光送達デバイスの後次非活性化は、個体がこの記憶および他の記憶を呼び出す能力を回復し得る。

ＡＣＣ領域のニューロンを抑制することを含む記憶想起を妨害するための方法は、マウスなどの非ヒトにおいて使用されてよい。例えば、ＡＣＣのニューロンにおいてｅＮｐＨＲ３．１を発現するマウスは、上述のように訓練されてよい。訓練セッションから４週間後の試験セッションにおいて、ｅＮｐＨＲ３．１ＡＣＣニューロンに送達される緑色光は、マウスが訓練中に形成された記憶を呼び出す能力を干渉した。緑色光をｅＮｐＨＲ３．１ＣＡ１ニューロンから除去することは、遠隔恐怖記憶に対するマウスの能力を回復させる。

ＣＡ１海馬を抑制することにより記憶形成に影響を及ぼす
ＣＡ１領域における興奮性ニューロンの脱分極化を抑制すること（および場合によってはこれらのニューロンを過分極化すること）は、記憶想起を抑制し得るが、そのような抑制は、記憶形成も妨害し得る。記憶形成を妨害するための方法の一変型例は、文脈的記憶などの記憶の形成中にＣＡ１領域のニューロンを抑制することを含んでよい。光活性化イオンチャネル、例えば、ｅＮｐＨＲ３．１は、前述される個体のＣＡ１領域内に位置するニューロン上に発現されてよい。個体には、本明細書に記載される光送達デバイス（１００）などの光送達デバイスが提供されてよい。記憶（例えば、恐怖記憶またはストレス記憶）の形成の間に、光送達デバイスは活性化されて、緑色光をＣＡ１ニューロンに送達し、それによりそれらの脱分極化を抑制し、記憶の形成を妨害し得る。記憶形成が十分に妨害されると、光送達デバイスは、非活性化され得る。光送達デバイスの非活性化時に、個体は、妨害なしに記憶を形成する能力を再取得する場合がある。

ＣＡ１領域のニューロンを抑制することを含む記憶形成を妨害するための方法は、マウスなどの非ヒト動物において使用されてよい。例えば、ＣＡ１領域のニューロン内でｅＮｐＨＲ３．１を発現するマウスは、緑色光をｅＮｐＨＲ３．１ＣＡ１ニューロンに送達しながら、カスタマイズされたＦＣチャンバ内で訓練された。訓練の間に、マウスは、第１の文脈に導入された後、音に続いて足衝撃に暴露された。光の適用のない後次試験セッションでは、マウスは、文脈的硬直の低減により測定されるように、訓練の記憶を呈しなかった。同一のマウスは、ｅＮｐＨＲ３．１ＣＡ１ニューロンが光に暴露されない別個の訓練セッションを受けた。次いでマウスは、後次試験セッションにおいて記憶を呼び出すことができた。いくつかの変型例では、試験セッションは、訓練セッション後１日以内に起こり得るが、他の変型例では、試験セッションは、訓練セッションから４週間後に起こり得る。緑色光をマウスのｅＮｐＨＲ３．１ＣＡ１ニューロンに適用することは、ニューロンの脱分極化を可逆的に抑制し、それにより近時および／または遠隔記憶の形成を妨害した。緑色光をｅＮｐＨＲ３．１ＣＡ１ニューロンから除去することは、マウスが恐怖記憶を形成する能力を回復させた。

扁桃体基底外側部を抑制することにより記憶形成に影響を及ぼす
記憶形成を妨害するための方法のいくつかの変型例は、記憶形成の間にＢＬＡ内でｅＮｐＨＲ３．１を発現するニューロンに光を送達することを含んでよい。ｅＮｐＨＲ３．１などの光活性化イオンチャネルは、個体のＢＬＡ内に位置するニューロン上に発現されてよい。個体には、上述される光送達デバイス（１００）などの光送達デバイスが提供されてよい。光送達デバイスは、緑色光がＢＬＡニューロンに送達され得るように、個体上に位置付けられてよい。記憶（例えば、恐怖記憶またはストレス記憶）の形成後またはその間に、光送達デバイスは活性化されて、緑色光をＢＬＡニューロンに送達し、それによりそれらの脱分極化を抑制し、記憶の形成を妨害し得る。記憶形成が十分に妨害されると、光送達デバイスは非活性化され得る。光送達デバイスの非活性化時に、個体は、妨害なしに記憶を取得する能力を再取得する場合がある。
ＢＬＡ領域のニューロンを抑制することを含む、記憶取得を妨害するための方法は、マウスなどの非ヒト動物において使用されてよい。例えば、緑色光は、上述される恐怖条件付け訓練セッションの間に、ＢＬＡのニューロン内でｅＮｐＨＲ３．１を発現するマウスに送達され得る。次いでマウスは、訓練セッションの恐怖記憶を取得したか否かを決定するように試験され得る。訓練セッションの間にＢＬＡに送達される緑色光は、マウスが恐怖またはストレス記憶を取得する能力を妨害し得る。

記憶形成または想起を修復する薬物をスクリーニングする
記憶機能の基礎となる神経回路を制御することは、記憶想起に対する薬剤の効果を評価するためのツールを提供し得る。例えば、ＣＡ１領域および／またはＡＣＣおよび／またはＢＬＡのｅＮｐＨＲ３．１を発現するニューロンの抑制を使用して、記憶の呼び出しを回復させるための様々な薬剤の効果を評価してよい。Ａ１領域および／またはＡＣＣおよび／またはＢＬＡ内で非ヒト動物興奮性ニューロンの脱分極化または励起を活性化する薬剤を識別するための方法の一例は、図３Ａに表される。方法（３００）は、光活性化タンパク質を脳（３０２）のＣＡ１領域および／またはＡＣＣおよび／またはＢＬＡに送達すること、ならびにＣＡ１および／またはＡＣＣ領域（３０３）の興奮性ニューロンの脱分極化を抑制することを含んでよい。上述されるように、脱分極化を抑制することは、活動電位の生成を防止するために、選択された波長（例えば、黄色または緑色）を有する光をＣＡ１および／またはＡＣＣ領域のニューロン上に発現されたｅＮｐＨＲ３．１イオンチャネルに適用することを含んでよい。他の型の光活性化チャネルは、ＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲの変異型などのこれらの興奮性細胞およびＧｔＲ３などのプロトンポンプの脱分極化を抑制するように発現されてもよい。ｅＮｐＨＲ３．１イオンチャネルの活性化を抑制する効果は、遊離細胞または全細胞パッチクランプ法（３０４）を使用することにより電気的に測定され得る。いくつかの変異型では、ＣＡ１および／またはＡＣＣ領域の興奮性細胞の電気活動は、単一電極および／または多電極配列を使用して測定されてよい。ＣＡ１および／またはＡＣＣ領域の抑制されたニューロンは、次に試験薬剤（３０６）と接触されてよい。ニューロンの電気活動は、同様に測定されてよい（３０８）。試験薬剤と接触させる前および後のＣＡ１領域および／またはＡＣＣおよび／またはＢＬＡの興奮性ニューロンの電気測定値を比較して、試験薬剤が、ニューロンの脱分極化を活性化および／または回復したか否かを決定してよい（３１０）。この方法（３００）は、必要に応じて繰り返し使用し、任意の数または様々な薬剤をスクリーニングしてよい。

非ヒト動物における記憶の形成または想起を回復するために有効であり得る薬剤を識別するための方法の一例は、図３Ｂに表される。この方法（３２０）は、光活性化タンパク質を脳のＣＡ１領域および／またはＡＣＣおよび／またはＢＬＡに送達すること（３２２）および活動電位の生成を防止するために、選択された波長（例えば、黄色または緑色）を有する光をＣＡ１および／またはＡＣＣおよび／またはＢＬＡ領域のニューロン上に発現されたｅＮｐＨＲ３．１イオンチャネルに適用すること（３２３）を含んでよい。他の型の光活性化チャネルは、ＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲの変異型などのこれらの興奮性細胞およびＧｔＲ３などのプロトンポンプの脱分極化を抑制するように発現されてもよい。記憶形成または想起の間に、光の存在下で、非ヒト動物の応答が測定されてよい（３２４）。いくつかの変型例では、記憶は、個体が文脈Ａに導入され、足衝撃を伴う音に暴露される訓練セッションの間に形成される場合があり、記憶想起に対する応答は、文脈Ａに導入されるとき、および／または音が再生されるときに硬直し得る。ＣＡ１および／またはＡＣＣ領域の抑制されたニューロンは、次に試験薬剤と接触されてよい（３２６）。非ヒト動物の応答は、同様に測定されてよい（３２８）。試験薬剤と接触する前および後の非ヒト動物の応答を評価して、試験薬剤が光の存在下で記憶形成または記憶想起に影響を及ぼすか否かを決定し得る（３３０）。いくつかの変型例では、方法（３２０）を記憶形成（例えば、訓練セッション）の間に使用して、記憶形成に対する薬剤の効果を評価してよい。また方法（３２０）を記憶想起（例えば、訓練セッションからいくらか経過した後の試験セッション）の間に使用して、記憶想起に対する薬剤の効果を評価してもよい。方法（３２０）は、必要に応じて繰り返し使用し、任意の数または様々な薬剤をスクリーニングしてよい。

すべての上記方法に適用し得る時間精度の変動
上述される方法のいくつかの変型例では、光活性化タンパク質（例えば、ｅＮｐＨＲ３．１またはｅＮｐＨＲ３．０）を発現するニューロンの抑制は、正確な時点で適用され得る。例えば、ＣＡ１領域内でｅＮｐＨＲ３．１を発現するニューロンは、試験セッションの間だけ光を照射されてよい。ｅＮｐＨＲ３．１を発現するニューロンの時間精度抑制は、記憶の呼び出しを妨害し得る。試験セッションの間にマウスのＣＡ１領域内でｅＮｐＨＲ３．１を発現するニューロンに光を正確に適用することは、動物において遠隔および／または近時恐怖記憶想起を抑制し得る。上述される方法の他の変型例では、ｅＮｐＨＲ３．１を発現するニューロンの抑制は、長期間にわたって適用されてよい。例えば、ＣＡ１領域内でｅＮｐＨＲ３．１を発現するニューロンは、試験セッション前（例えば、試験セッションの３０分以上前）に光が照射されてよい。海馬のＣＡ１領域内でｅＮｐＨＲ３．１を発現するニューロンの長期抑制は、ＣＡ１ニューロンの正確な抑制とは異なって記憶の想起に影響し得る。例えば、ＣＡ１ニューロンに対する長期の光適用（すなわち、長期抑制）は、近時の文脈的恐怖呼び出しに影響し得るが、遠隔の文脈的記憶の呼び出しには影響しなかった。

ＰＴＳＤを治療する方法
上述される方法の１つ以上を使用してＰＴＳＤのある個体を治療してよい。本開示の態様を使用して、ＰＴＳＤ患者を治療することができ、再強化前後の実時間、または記憶が既に想起された後の実時間に、遠隔恐怖記憶を可逆的にシャットダウンすることにより、再発する妨害記憶が現れると、それが停止され得る。いくつかの変型例では、ＰＴＳＤを治療するための方法は、光活性化タンパク質をコードするウイルスベクターを個体に投与することを含んでよい。光活性化タンパク質は、特定波長を有する光の存在下で、ニューロンの脱分極を抑制するように構成され得る。そのような光活性化タンパク質の例には、ＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲ、およびＧｒＲ３が挙げられ得る。前述のように、ウイルスベクターは、任意のニューロン集団または型に送達され得る（例えば、ＣＡ１、ＡＣＣ、およびＢＬＡ脳領域の興奮性ニューロン）。望ましくない記憶（例えば、恐怖またはストレス記憶）を呼び出す間に、光活性化タンパク質を発現するニューロン（複数可）は、脱分極化から抑制され、それにより望ましくない記憶の想起を妨害し得る。いくつかの変型例では、ニューロン（複数可）の脱分極化を抑制することは、特定波長の光を光活性化タンパク質を発現するニューロンに適用することを含んでよい。続いて（例えば、望ましくない記憶の呼び出しが妨害された後）、光は除去されてよい。これは、記憶が妨害なしに呼び出され得るように、記憶機能を回復させ得る。これらのステップは、ＰＴＳＤ治療の経過において所望され得るだけ反復されてよい。

本開示の別の実施形態に従って、薬物の乱用に関連する記憶を抑制して、薬物探索行動を低減することができる。他の実施形態は、記憶プロセスにおける特定のニューロン集団の役割を研究するために、異なる脳領域の変調により認知に直ちに影響を及ぼす能力を対象とする。ある光活性化タンパク質によるニューロンの抑制および他の光活性化タンパク質による活性化は、様々な脳機能および行動の基礎となる神経回路の精密な時間的、遺伝的、および空間的解析を可能にし得る。

本明細書において、記憶の呼び出しを妨害する方法が提供され、この方法は、遠隔記憶想起の効果を妨害するのに十分な抑制の時間精度を用いて、背側ＣＡ１海馬回路の機能を抑制することを含む。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、記憶トリガー事象に応答性である。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、背側ＣＡ１海馬回路の細胞内で発現された光応答性オプシンを活性化することを含む。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、背側ＣＡ１海馬回路付近に位置付けられた１つ以上の電極を通して電気パルスを印加することを含む。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、背側ＣＡ１海馬回路に近位の位置で薬物を放出することを含む。いくつかの実施形態では、遠隔記憶想起の効果は、遠隔記憶に対する感情的な応答を含む。

また本明細書では、記憶の形成を妨害する方法を提供する。この方法は、遠隔記憶の形成を妨害するのに十分な抑制の時間精度を用いて、背側ＣＡ１海馬回路の機能を抑制することを含む。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、記憶トリガー事象に応答性である。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、背側ＣＡ１海馬回路の細胞内で発現される光応答性オプシンを活性化することを含む。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、背側ＣＡ１海馬回路付近に位置付けられた１つ以上の電極を通して電気パルスを印加することを含む。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、背側ＣＡ１海馬回路に近位の位置で薬物を放出することを含む。いくつかの実施形態では、遠隔記憶想起の効果は、遠隔記憶に対する感情的応答を含む。

また本明細書では、記憶機能を促進する方法も提供され、この方法は、背側ＣＡ１海馬回路の機能を励起して、遠隔記憶の形成または遠隔記憶の呼び出しを促進することを含む。

また本明細書では、遠隔記憶の呼び出しと関連付けられる神経疾患の治療の方法が提供され、この方法は、遠隔記憶の想起に応答して、遠隔記憶の想起の効果を妨害するのに十分な抑制の時間精度を用いて、背側ＣＡ１海馬回路の機能を抑制することを含む。

本明細書の開示による様々な実験および実施例が以下に提供される。

光遺伝的方法を使用して、遠隔記憶に対する定義された細胞型の寄与を探求する際に（以前の方法よりもオンセットおよびオフセットが桁違いに速い）、文脈的条件付けから何週間も経過した後であっても（「遠隔」段階に及ぶ）、文脈的恐怖記憶の呼び出しが、海馬のＣＡ１領域内の興奮性ニューロンの光遺伝的抑制により排除されることがわかったが、以前の研究では、海馬の検出可能な影響は認められなかった。この干渉の効果は、運動、不安、またはキューによる記憶形成に関して認められず、顕著に遠隔文脈的記憶は、自由に移動する行動セッションの途中であっても、ＣＡ１抑制により直ちに抑制され得る。しかしながら、以下に記載される実験は、以前の観察が、典型的な薬理学的時間スケールに一致するように海馬の光遺伝的抑制を延長するにつれて、遠隔海馬依存性から遠隔海馬非依存性に変換したことを確認し、光遺伝的方法もまた、前帯状皮質（ＡＣＣ）の遠隔時間スケールの重要性を確認し、海馬が遠隔呼び出しのためのＡＣＣの採用に関与することを示した。これらの見解は、薬物および病変データの解釈に対して広範な意味を有し、臨床海馬文献の不可解な側面に焦点を当て、記憶想起における顕著なダイナミズムを明らかにし、基礎となる神経回路は、通常、遠隔時点であっても海馬に応じて記憶に関与するデフォルト構造を適応的に移行させるが、数分の時間スケールで代替機序に柔軟に移動させる。

様々な型の光活性化タンパク質は、記憶機能の基礎となる神経回路を制御および特性化するように使用されてよい。例えば、ＮｐＨＲの変異型は、ニューロンの脱分極化および／または過分極化を抑制してよい。第３世代のｅＮｐＨＲは、遺伝子と蛍光色素分子との間に輸送シグナルを有し、改善した膜標的および増加した光誘起された過分極化を示した。この第３世代ｅＮｐＨＲを使用して、近時および遠隔記憶取得および呼び出しの両方におけるそれらの役割を決定するように、海馬のＣＡ１領域におけるニューロンを動揺させた。強化された黄色蛍光タンパク質（ｅＮｐＨＲ３．１−ＥＹＦＰ）にインフレーム融合されたｅＮｐＨＲ３．１をコードするレンチウイルスベクターは、海馬内の興奮性グルタミン酸作動性ニューロンに選択的なカルシウム／カルモデュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩα（ＣａＭＫＩＩα）プロモータの制御下で使用した。ｅＮｐＨＲ３．１は、ニューロンに誘導された光電流および過分極化の両方において、ｅＮｐＨＲ３．０に類似する内因性Ｎ末端シグナルペプチドの欠失を伴うｅＮｐＨＲ３．０の切断バージョンである。

実験手順
対象。 ６〜８週齢のＣ５７ＢＬ６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手した。マウスは、逆１２時間明／暗サイクルで維持され、食餌および水が自由に与えられるコロニー内にケージ当たり４〜５匹収容した。実験プロトコルは、スタンフォード大学ＩＡＣＵＣにより承認され、国立衛生研究所実験動物の管理と使用に関する指針のガイドラインに適合する。

ウイルス製造。 インビボ注入のためのＣａＭＫＩＩα−ｅＮｐＨＲ３．１−ＥＹＦＰレンチウイルスは、前述のように製造した（Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ＣａＭＫＩＩα−ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰプラスミドは、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を使用して、ＣａＭＫＩＩαプロモータを運ぶＡＡＶ骨格にｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰをクローン化することにより構成した。組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ５コートタンパク質で血清型化され、ノースカロライナ大学のＶｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによりパッケージ化され、滴定は２×１０１２粒子／ｍＬであった。ＡＡＶ ＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲ３．０およびレンチＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲ３．１のマップは、ｗｗｗ．ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｏｒｇでオンライン入手できる。

定位ウイルス注入、カニューレ／パッチコード移植、および光送達。 マウスをイソフルランで麻酔をかけ、頭部を定位装置内に配置した（Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｕｊｕｎｇａ，ＣＡ、Ｌｅｉｃａ実体顕微鏡）。眼の乾燥を防止するために眼軟膏を適用した。正中線頭皮切開を行った後、小開頭術を行い、１０μＬシリンジおよび薄い３４ゲージ金属針を使用してウイルスを送達した（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）。注入容積および流速（０．１μＬ／分で１μＬ）を注入ポンプ（ＷＰＩ）により制御した。注入後、針をさらに５分間留置し、次いでゆっくり引き抜いた。ＣＡ１光遺伝的抑制の場合、２μＬのＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲ３．１−ＥＹＦＰを担持する濃縮レンチウイルスを、左および右成人海馬の両方のＣＡ１内の２つの部位（１μＬ／部位）に顕微注入した。部位１：前後（ＡＰ）ブレグマから−１．５ｍｍ、中外側（ＭＬ）±１ｍｍ、背腹（ＤＶ）−１．５、部位２：ＡＰ−２．５ｍｍ、ＭＬ±２ｍｍ、ＤＶ−１．５ｍｍ。次に両側ガイドカニューレ（中心から中心まで２．５ｍｍ、ＰｌａｓｔｉｃｓＯｎｅ，Ｒｏａｎｏｋｅ，ＶＡ）をＣＡ１の０．５ｍｍ上に置き（ＡＰ−１．９４ｍｍ、ＭＬ±１．２５ｍｍ、ＤＶ−１ｍｍ）、および歯科セメントを使用して頭蓋骨に固定した（Ｃ＆Ｂメタボンド、Ｐａｒｋｅｌｌ，Ｅｄｇｗｏｏｄ，ＮＹ）。皮膚は、Ｖｅｔｂｏｎｄ組織接着剤を用いて糊付けした。動物は、麻酔から回復するまで加熱パッド上に維持した。外科処置の開始時に、ブプレノルフィン（０．０３ｍｇ／ｋｇ）を皮下的に付与して、不快感を最小化した。ニューロン活性を抑制するために、緑色光（５６１ｎｍ、記述レーザなど）は、０．５ｍｍ突出部を有するガイドカニューレを通して挿入された２つの３００μｍ厚光ファイバー（Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＪ）を通して両側に送達した。対照マウスは、ｅＮｐＨＲ３．１に非感染であるが、ＣＡ１に光を送達するカニューレがさらに埋め込まれるか、またはｅＮｐＨＲ３．１に感染し、埋め込まれるが、脳の表面で光送達を終結させたダミーファイバーに接続された。したがって対照マウスは、レーザー光送達と関連付けられる実験マウスと同一の視覚キューおよび文脈的情報を経験した。扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）光遺伝的抑制の場合、１．５μＬのＡＡＶ５ ＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰを左および右ＢＬＡの両方に顕微注入した（ＡＰ−１．５ｍｍ、ＭＬ±３．４７ｍｍ、ＤＶ−５ｍｍ）。次にパッチコード（金属フェルール、直径２．５ｍｍ、厚さ２００μｍ、長さ５ｍｍ、切断された裸の光ファイバー、Ｄｏｒｉｃ ｌｅｎｓｅｓ Ｉｎｃ．，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）を各ＢＬＡ（ＡＰ−１．５ｍｍ、ＭＬ±３．４７ｍｍ、ＤＶ−４．８ｍｍ）内に配置し、歯科セメントを使用して頭蓋骨に固定した。緑色光は、接続するプラスチックスリーブを使用してパッチコードに取り付けられた２つの２００μｍ厚の光ファイバー（Ｄｏｒｉｃ ｌｅｎｓｅｓ）を通して両側送達した。前帯状皮質（ＡＣＣ）光遺伝的抑制の場合、１．０μＬのＡＡＶ５ ＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰを左および右ＡＣＣの両方に顕微注入した（ＡＰ＋１ｍｍ、ＭＬ±０．３５ｍｍ、ＤＶ−２．２ｍｍ）。次にパッチコード（Ｄｏｒｉｃ ｌｅｎｓｅｓ Ｉｎｃ．）を１つのＡＣＣ上に正中線にできる限り近く片側配置し（ＡＰ＋１ｍｍ、ＭＬ±０．２ｍｍ、ＤＶ−１．２５ｍｍ）、歯科セメントを使用して頭蓋骨に固定した。緑色光は、パッチコードに取り付けられた２００μｍ厚の光ファイバー（Ｄｏｒｉｃ ｌｅｎｓｅｓ）を通して送達された。嗅球（ＯＢ）光遺伝的抑制の場合、１．０μＬのＡＡＶ５ ＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰを、左および右ＯＢの両方に顕微注入した（ＡＰ＋４．５ｍｍ、ＭＬ±０．７５ｍｍ、ＤＶ−３．２５および−２ｍｍ）。次にパッチコード（Ｄｏｒｉｃ ｌｅｎｓｅｓ Ｉｎｃ．）を１つのＯＢ上に正中線にできる限り近く片側配置し（ＡＰ＋４．５ｍｍ、ＭＬ±０．１５ｍｍ、ＤＶ−１．４ｍｍ）、歯科セメントを使用して頭蓋骨に固定した。緑色光は、パッチコードに取り付けられた２００μｍ厚の光ファイバー（Ｄｏｒｉｃ ｌｅｎｓｅｓ）を通して送達された。

免疫組織化学。 ＣａＭＫＩＩα陽性ニューロン内のｅＮｐＨＲ−ＥＹＦＰ発現の拡散を測定し、特異性を決定するために、マウスをケタミン／キシラジンで麻酔にかけ、冷たいＰＢＳに続いて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に溶解された４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて経心臓的に還流させた。脳を除去し、ＰＢＳ中４％ＰＦＡにおいて４℃で３時間後置した後、ＰＢＳ中３０％スクロースにおいて平衡させた。４０μｍ厚の冠状断面は、凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）上で切断され、免疫組織化学のために処理されるまで抗凍結剤中（２５％グリセロール、３０％エチレングリコール、ＰＢＳ中）４℃で保管した。浮遊する断片をＰＢＳ中で洗浄した後、３０分間０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｔｘ１００）および２％正常ロバ血清（ＮＤＳ）中で培養した。切片は、２％ ＮＤＳ中で一次抗体とともに一晩培養した（マウス抗ＣａＭＫＩＩα １：５００、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、ウサギ抗ＧＡＢＡ １：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ、ウサギ抗ｃ−Ｆｏｓ １：５００、ＥＭＤ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。次に切片をＰＢＳで洗浄し、室温で２時間、二次抗体を用いて培養した（Ｃｙ３に共役されたロバ抗マウス、Ｃｙ３またはＣｙ５のいずれかに共役されたロバ抗ウサギ、すべて１：１０００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）。次に切片を洗浄し、ＤＡＰＩ（１：５０，０００）で２０分間培養して、再洗浄し、ＰＶＡ−Ｄａｂｃｏ（Ｓｉｇｍａ）とともにスライド上に載置した。共焦点蛍光画像は、５Ｘもしくは１０Ｘ空気対物レンズ、または４０Ｘ油浸対物レンズを使用して走査レーザー顕微鏡上で取得した。ウイルス変換率を決定するため、ｅＮｐＨＲ−ＥＹＦＰ陽性でもある４０倍野当たりのＣａＭＫＩＩα免疫活性ニューロンの割合を計算した。

インビボオプトロード記録。 ＣＡ１における同時光学刺激および電気記録は、光ファイバー（核直径２００μｍ、０．２Ｎ．Ａ．）できつく結束され、ファイバー端を超えて（約０．４ｍｍ）わずかに突出する電極の先端を有する細胞外タングステン電極（１ＭΩ、約１２５μｍ）からなるオプトロードを使用して、前述のとおり実行し（Ｇｒａｄｉｎａｒｕら、２００７）、記録されたニューロンの照明を保証する。記録は、ＣＡ１（ＡＰ−１．９４ｍｍ、ＭＬ１．４ｍｍ、ＤＶ−１．１）の境界に最初に配置され、徐々に０．１ｍｍ増分で低下するオプトロードを用いて行った。光ファイバーは、２００μｍファイバーからの約２０ｍＷ出力とともに４７３ｎｍ固体レーザーダイオードに結合した。単一ユニット記録は、ＰＢＳ中に希釈したケタミン／キシラジン混合物で麻酔をかけたマウスにおいて行った（ケタミン８０ｍｇ／ｋｇ、キシラジン１５〜２０ｍｇ／ｋｇ）。シグナルを記録し、１８００微小電極ＡＣ増幅器を使用して、３００Ｈｚ低／５ｋＨｚ高で帯域通過ろ過した。

恐怖条件付けパラダイムにおける学習および記憶の測定。 恐怖条件付け装置は、平方条件付けケージ（１８ｘ１８ｘ３０ｃｍ）で構成され、衝撃生成器および周波数帯変換器にワイヤ接続されたグリッドフロアを有し、聴覚チャンバに取り囲まれた（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＰＡ，ＵＳＡ）。装置は、訓練および／または試験の間に光の送達を可能にするように修正した。恐怖条件付けを導入するために、マウスを１２０秒間ケージに入れ、純音（２．９ｋＨｚ）を２０秒間鳴らした後、２秒間の足衝撃を与えた（短期記憶の場合は０．５ｍＡ、長期記憶の場合は１ｍＡ）。次にこの手順を繰り返し、２回目の衝撃の送達から３０秒後、マウスをホームケージに戻した。恐怖条件付けは、硬直（完全な不動性）の連続測定、優勢行動恐怖応答により評価した（Ｆａｎｓｅｌｏｗ，２０００）。硬直は、治療群に左右されない経験を積んだ実験者により試験を通して連続的に測定した。文脈的恐怖条件付けを試験するために、マウスを基の条件付けケージに入れ、硬直を５分間測定した。聴覚キューによる恐怖条件付けを試験するために、マウスを異なる文脈−平坦な床の錐体形状のケージに入れた。新規環境の影響の対照として、この新しいケージ内で硬直を２．５分間測定した後、２．９ｋＨｚの音を２．５分間鳴らし、その間に条件付けされた硬直を測定した。この基本パラダイムを異なる実験の可変条件下で適用した。第１の実験では（図５）、マウスを以下のように訓練および試験した。１日目−連続５６１ｎｍ光投与により訓練する（光オン）。２日目−光投与なしに文脈的試験およびキュー試験を行う（２時間間隔）（光オフ）。３日目−訓練、光オフ。４日目−試験、光オフ。５日目−文脈的試験およびキュー試験、光オン。第１の遠隔記憶実験では（図６Ａ）：１日目−訓練、光オフ。２９日目−文脈的およびキュー試験、光オン。３０日目−試験、光オフ。第２の遠隔記憶実験では（図６Ｃ）：１日目−訓練、光オフ。６４日目−文脈的試験、光オン。第３の実験では（図８）：１日目−訓練、光オフ。３６日目−試験、光オフ。３７日目−試験、光オン。３８日目−試験、３分間光オフ、続いて３分間光オン。

ＢＬＡ実験では（図５Ｈ〜Ｉ）、マウスを１日目に光オンで訓練し、２日目に光オフで文脈的恐怖およびキューによる恐怖について試験した。ＡＣＣ（図１０Ａ−Ｂ）およびＯＢ実験では、マウスを１日目に光オフで訓練し、２日目に光オンで試験した後、２９日目に光オンで試験した。長期の光暴露の場合（図７Ａ、Ｂ、１０Ｃ）、光ファイバーを、条件付けケージを通して寝床を有する通常のハウジングケージの中に通し、光をこのケージ内に３０分間送達した。次に光の送達を妨害なしに継続しながら、マウスを５分間の試験の間条件付けケージに入れた。文脈的およびキューによる条件付け試験の結果は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定または２方向ＡＮＯＶＡにより解析し、続いて必要に応じて事後試験を行った。

薬物送達。 薬理学実験（図６Ｄ−Ｅ）の場合、マウスのＣＡ１上に二重カニューレを埋め込んだ。カニューレ、外科処置および位置は、光送達実験と同一であった。Ｋｉｔａｍｕｒａらにより説明されるように（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９）、ＴＴＸ（Ｓｉｇｍａ，２０μＭ）およびＣＮＱＸ（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ。３ｍＭ）または生理食塩水は、ガイドカニューレよりも０．５ｍｍ長い２８ゲージステンレス鋼内部カニューレ（ＰｌａｓｔｉｃｓＯｎｅ）を通して１μＬの容積で注入した。内部カニューレは、ＰＥ２０管によりマイクロシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）に接続した。溶液は、２００ｎＬ／分の定速で投与し、ガイドカニューレからの漏出を避けるために、注入の終了から２分後に注入カニューレを除去した。

オープンフィールド試験。 オープンフィールド試験は、オープンプラスチックアリーナ内で行った（長さ５０ｃｍ×幅５０ｃｍ×深さ４０ｃｍ）。チャンバの中央にマウスを個別に配置し、３分間自由に探索させた。野の中央および周縁の両方における活動は、自動ビデオ追跡システム（Ｂｉｏｂｓｅｒｖｅ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。中央の時間の割合は、オープンフィールドの中央３５×３５ｃｍの領域で費やした合計時間の割合として定義される。

ｅＮｐＨＲ３．１により誘発されたスパイクの連続抑制の電気生理学的測定。 長期光暴露実験からの４匹のマウスに上述のとおり注射し、行動試験を行った後、絶命させて生理学実験のために切片化した。２６ＮａＨＣＯ３、２．５ＫＣｌ、１．２５ＮａＨ２ＰＯ４、１０ＭｇＳＯ４Ｈ１４Ｏ７、．５ＣａＣｌ２Ｈ４Ｏ２、１１グルコースおよび２３４スクロースを（ｍＭで）含有する氷冷スクロース溶液を経心臓的に還流させ、続いて同一の氷冷スクロース溶液中で３００ミクロン切片を切断することにより、背側ＣＡ１を含有する冠状切片を調製した。電気生理学的記録は、１２６ＮａＣｌ、２６ＮａＨＣＯ３、２．５ＫＣｌ、１．２５ＮａＨ２ＰＯ４、１ＭｇＣｌ２、２ＣａＣｌ、および１０グルコースを（ｍＭで）含有するａＣＳＦの一定還流下で行った。すべての記録は、３２℃で行った。パッチ電極（先端抵抗＝２〜６ＭΩ）は、（ｍＭで）１３０Ｋ−グルコン酸塩、１０ＫＣｌ、１０Ｈｅｐｅｓ、１０ＥＧＴＡ、および２ＭｇＣｌ（ｐＨはＫＯＨで７．３に調整）で充填した。直列抵抗は、通常１０〜２０ＭΩであり、実験は、３０ＭΩを超えると中断した。膜電位は、７ｍＶの測定液間電位に対して訂正した。活動電位の導入は、１０ｈｚで２００ｐＡからの範囲の電流を注入することにより行った。ｅＮｐＨＲ３．１の活性化のための光は、５３１±２０ｎｍフィルターを通るＸ−Ｃｉｔｅ１２０Ｗハロゲン光源および４０ｘ／０．８ＮＡ水対物レンズを７ｍＷ／ｍｍ^２で使用して送達した。

培養ニューロンにおけるｅＮｐＨＲ３．１とｅＮｐＨＲ３．０との間の電気生理学的比較。 海馬培養：一次培養海馬ニューロンは、Ｐ０Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ子ラットから調製した。ＣＡ１およびＣＡ３領域を単離し、０．４ｍｇ／ｍＬパパインで消化し（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）、１：３０マトリゲル（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）でプレコーティングしたガラスカバースリップの上に６５，０００／ｃｍ^２の密度で配置した。培養物は、１．２５％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、４％ Ｂ−２７補助剤（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＧＩＢＣＯ）、およびＦＵＤＲ（２ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とともに、５％ ＣＯ２加湿培養器内で維持した。

リン酸カルシウムトランスフェクション。 ６〜１０区分の海馬ニューロンを、２４ウェルプレートにおいて６５，０００細胞／ウェルで増殖させた。各ウェルのＤＮＡ／ＣａＣｌ２混合物は、１５μＬの総Ｈ２０中１．５〜３μｇ ＤＮＡ（ＱＩＡＧＥＮエンドトキシンを含まない調製物）＋１．８７５μＬ ２Ｍ ＣａＣｌ２（最終Ｃａ２＋濃度２５０ｍＭ）。ＤＮＡ／ＣａＣｌ２に１５μＬの２Ｘ ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０５）を添加し、最終容積をピペットにより十分に混合した。室温で２０分後、３０μＬのＤＮＡ／ＣａＣｌ２／ＨＢＳ混合液を各ウェルに滴下し（そこから成長培地が一時的に除去され、４００μＬの温かいＭＥＭと置き換えられた）、３７℃で４５〜６０分間トランスフェクションを進行させた。次に各ウェルを３Ｘ１ｍＬの温かいＭＥＭで洗浄し、成長培地を置き換えた。オプシン発現は、一般に２０〜２４時間以内に観察された。

電気生理学。 全細胞パッチクランプ記録は、前述のとおり行った（細胞内溶液：１２９ｍＭ Ｋ−グルコン酸塩、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ、０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰ、ｐＨ７．２に滴定；細胞外タイロード：１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコース、および２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３に滴定）。電圧固定記録の場合、細胞は−７０ｍＶで保持した。光は、３００Ｗ ＤＧ−４ランプ（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）から５９３／４０ｎｍフィルター（Ｓｅｍｒｏｃｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）およびＬｅｉｃａ ４０Ｘ／０．８ＮＡ水対物レンズを通して送達し、試料における光パワーは、３ｍＷ／ｍｍ^２であった。全細胞パッチクランプデータは、レンチウイルスｅＮｐＨＲ３．０およびｅＮｐＨＲ３．１にトランスフェクションした、または形質導入されたかのいずれかであり、１週間発現させた培養海馬ニューロンから得た。発現は、ヒトＣａＭＫＩＩαプロモータにより駆動され、ＥＹＦＰに対する融合により可視化した。

ｃＦｏｓ染色によるニューロン活性化撮像。 ＹＦＰ対照およびｅＮｐＨＲ３．１マウスは、条件付けの間に光投与で訓練され（音の提示なし、文脈の恐怖のみが導入されるようにする）、９０分後に絶命させた、ｃ−Ｆｏｓレベルを試験した（上記免疫組織化学のセクションにおいて詳述される）。訓練されていない対照およびｅＮｐＨＲ３．１マウスの２つの他の群を、それらのホームケージから絶命させた。遠隔記憶の場合、ＹＦＰ対照およびｅＮｐＨＲ３．１マウスは、光なしで恐怖条件付けされ、２８日後に光を用いる条件付け文脈に暴露され、９０分後に絶命させてｃＦｏｓレベルを試験した。この時点で対照群は、対照およびｅＮｐＨＲ３．１マウスであり、訓練された後、条件付け文脈に再度暴露されることなく、２８日後にホームケージから絶命させた。

結果
背側ＣＡ１における興奮性ニューロンの特異的光遺伝的抑制はニューロン活性を低減する。 ＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲ３．１ベクターの定位送達は、ＣＡ１特異的発現をもたらすことがわかった（図４Ａ）。ｅＮｐＨＲ３．１は、膜電位に対して同等の効果を有する内因性Ｎ末端シグナルペプチドの欠失を伴うｅＮｐＨＲ３．０の切断バージョンである。ｅＮｐＨＲ３．１は、ニューロン膜を標的とし、体細胞の周囲、ならびにＣＡ１ニューロンの先端および基底樹状突起内で発現される（図４Ｂ）。トランスフェクションした領域内で、ＣａＭＫＩＩα細胞の９４％（４５８／４８６細胞、３匹のマウスから）がｅＮｐＨＲ３．１を発現し、プロモータは完全な特異性を提供した。すべてのｅＮｐＨＲ３．１−ＥＹＦＰ細胞は、ＣａＭＫＩＩα陽性でもあった（図４Ｃ）。ｅＮｐＨＲ３．１タンパク質は、ＣＡ１内で発現されたが、これらの発現条件下で、単海馬部分体内、注入部位の上の頭頂葉皮質内、視床内、または手綱内では発現しなかった。カニューレ追跡は（ブレグマ−１．９４）、発現部位の上で見ることができた。感染の容積は、背側ＣＡ１のかなりの割合を占めた（０．８７５±０．０５ｍｍ^３、Ｎ＝１２マウス）。

ＣＡ１ニューロン活性に対するｅＮｐＨＲ３．１の生理学的効果を検証するために、麻酔を受けたマウスにおいて、ＣＡ１ニューロンの「オプトロード」記録（光ファイバーケーブルに結合された細胞外電極を使用する同時光学刺激および電気記録）を行い（図４Ｄ左）、実験は、興奮性ＣＡ１ニューロンの連続した５６１ｎｍの照明が、スパイク振幅に影響することなく、時間的に正確かつ可逆的な方法で、インビボでスパイクを強力に抑制したことを確認した（図４Ｄ）。これらのマウスにおけるＣＡ１ニューロンの５６１ｎｍ照明は、平均スパイク振幅に影響することなく（３３．５５±４．９４μＶ、２９．２０±４．４μＶ、および３３．３２±５．４５μＶ、光投与前、間、および後）スパイク頻度の可逆的かつ顕著な低減をもたらした（４．９３±１．６Ｈｚ、１．３１±０．１５Ｈｚ、および６．４５±２．４Ｈｚ、それぞれ光投与前、間、および後、２匹のマウスから１５トレース、Ｐ＜０．０２）。代表的なオプトロード記録トレース、ならびに平均頻度および振幅が示される（平均±ＳＥＭ）。

ＣＡ１光遺伝的抑制は文脈的恐怖の取得および想起を遮断する。 文脈的恐怖条件付けにおける海馬の関与は、この構造に対する身体的、薬理学的、および遺伝的病変に基づき、病変と試験との間の間隔は、数十分から数週間に及ぶ（Ａｎａｇｎｏｓｔａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｋｉｍ ａｎｄ Ｆａｎｓｅｌｏｗ，１９９２、Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｗｉｌｔｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、関連神経回路内の適合および補償を可能にし得る。第１の試験に対して、ＣＡ１の実時間光遺伝的抑制が記憶形成を変調し得る場合、二重カニューレシステムを通して挿入された２つの光ファイバーを介して両側連続緑色（５６１ｎｍ）光は、カスタマイズされたＦＣチャンバ内で自由に移動するマウスにおいて、標的とする背側ＣＡ１（図５Ａ）に送達された。光は、すべてのマウスに送達され、ｅＮｐＨＲ３．１においてＣＡ１抑制を伴ったが、対照マウス（感染しなかったがカニューレとともに埋め込まれ、ＣＡ１の中に光を受信したマウス、または感染し、脳の中に伸長しなかったが、ダミーファイバーに接続されて埋め込まれたマウスのいずれか）では伴わなかった。恐怖条件付け訓練の間、マウスは、両側連続５６１ｎｍ光送達下で、文脈Ａに導入された後、音に続いて足衝撃を２回提示され、光なしで２４時間後の記憶についてマウスを試験した。次に光学抑制の非存在下で、翌日に恐怖記憶を評価した。訓練の間の背側ＣＡ１光遺伝的抑制は、対照（ｎ＝４）と比較して、ｅＮｐＨＲ３．１マウス（ｎ＝５）において文脈的恐怖取得を完全に防止した（３９±５．４対７．６±４．３％硬直、平均±ＳＥＭ、Ｐ＜０．００５（図５Ｂ、左）。光遺伝的抑制の効果が可逆的か否かを試験するために、次にすべてのマウスを光投与なしに同一文脈において再訓練し、翌日に再試験した。実際にｅＮｐＨＲ３．１マウスは、訓練中に光が投与されなかったとき、正常な文脈的記憶を呈した（６４．６±６．６対４９．７±１１．７％硬直、Ｐ＞０．５）（図５Ｂ、中間）。

翌日に、背側ＣＡ１光遺伝的抑制が記憶の呼び出しも干渉し得たか否かを試験した。そのため、同一のマウスを試験し、今回は呼び出しの間に光送達を用いたところ、前日に提示された記憶は、照明下での呼び出しが不可能になったことがわかった（図５Ｂ、右、４２．６±１０．１対５．９４±４．１％硬直、Ｐ＜０．０１）。これらの実験は、これらのプロセスにおいてＣＡ１興奮性細胞の実時間重要性を直接示すことにより、近時文脈的恐怖記憶の取得および呼び出しに海馬が必要とされるという以前の理解を支持する。これらの効果が一般に文脈的恐怖記憶に特異的であり、恐怖取得および恐怖発現機序に特異的でないことを検証するために、同一のマウスをそれらの音の記憶について異なる文脈で試験した。ｅＮｐＨＲ３．１マウス（ｎ＝５）は、対照（ｎ＝４）と比較して、訓練中のＣＡ１光抑制に続く正常な聴覚キューによる恐怖記憶の取得（図５Ｃ、左）、ならびに試験中の照明を用いた正常なキューによる恐怖の呼び出しを示した（図５Ｃ、右）。これらの見解は、海馬依存性タスクのみに影響を及ぼすことにおいて、光遺伝的操作の機能特異性を示す。

光遺伝的システムをさらに有効化するために、多数の付加的制御実験を行った。空間探索は文脈的恐怖取得に重要であるため（ＭｃＨｕｇｈ ａｎｄ Ｔｏｎｅｇａｗａ，２００７）、光刺激下で訓練中に、条件付けチャンバ内の探索時間を測定したところ、ｅＮｐＨＲ３．１発現動物（ｎ＝５）と対照動物（ｎ＝５、図５Ｄ）との間に差異は認められなかった。ＣＡ１光遺伝的抑制は、新規環境の探索にも影響がなかった。ＣＡ１光遺伝的抑制が抗不安作用を有しなかったことを検証するために、光投与の間のオープンフィールド探索についてマウスを試験したところ、ｅＮｐＨＲ３．１発現（ｎ＝６）と対照マウス（ｎ＝４、図５Ｇ、２３．８±２．７６％対２０．４６±５．９７％、Ｐ＞０．５）との間に、路長（図５Ｅ、５６４±９および６１８±１１４ｃｍ、それぞれｅＮｐＨＲ３．１および対照）、速度（図５Ｆ、３．３±０．１対３．４３±０．６ｃｍ／秒、それぞれｅＮｐＨＲ３．１および対照）、または野の中央で費やした時間の割合（不安関連行動のサインとしての役割を果たす）に差異は認められなかった。

最後に、マウスの海馬の代わりに、扁桃体基底外側部（ＢＬＡ、図５Ｈ）に両側注入し、恐怖自体の取得および近時および遠隔恐怖の発現が扁桃体に依存するという以前の見解から予測されるように、対照（ｎ＝９）と比較して、ｅＮｐＨＲ３．０（ｎ＝４）マウスにおいて文脈的（図５Ｉ、６５．５±７．２対９．６±５．５％硬直、Ｐ＜０．００１）および聴覚キューによるＦＣ取得（図５Ｉ、６９．５±９．６対２４．５±１３％硬直、Ｐ＜０．０５）の両方を光遺伝的に抑制することが可能であることがわかった（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｊｏｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｋｉｌｌｃｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７、ＬｅＤｏｕｘ，２０００、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｍａｒｅｎ ａｎｄ Ｑｕｉｒｋ，２００４）。この様々な見解はともに、実時間、高速、細胞型特異的、可逆的光遺伝的システムの有効性を確認し、取得および呼び出しにおける海馬の実時間の役割を直接示すことにより、記憶文献における以前の一連の主な見解を支持する。

ＣＡ１光遺伝的抑制は遠隔恐怖記憶の呼び出しを可逆的に干渉する。 遠隔記憶の呼び出しにおける海馬の役割を探索した。前述のように文脈的ＦＣを有するマウス群を訓練し、被検体を、海馬の関与が予測されない遠隔段階に及ぶ４週間後に試験した（図６Ａ）。意外にも、呼び出しの間のＣＡ１抑制は、遠隔恐怖記憶を完全に遮断したことがわかった（Ｐ＜０．０００１、対照ｎ＝１４、６９．８±５．３％硬直ｅＮｐＨＲ３．１ ｎ＝６、１４±６．４％硬直）。この呼び出しの干渉は可逆的であり、同一のマウスを照明なしに翌日再試験したところ、恐怖記憶は対照と同様に完全に発現された（図６Ａ、５２．４５±６．０対４５．１８±１１．５％硬直、Ｐ＞０．５）。さらに、ｅＮｐＨＲ３．１マウスは、キューによる試験の間に、照明を用いた場合、正常な遠隔聴覚キューによる恐怖記憶の呼び出しを示し（図６Ｂ、新しい文脈において、対照ｎ＝１４、２２．３±６．８％、ｅＮｐＨＲ３．１ｎ＝６、１１．８±３．５％硬直 ；および音に対して７２．４±８．４対５８．７７±７．９％硬直；Ｐ＞０．５）、恐怖発現機序は正常のままであったことをさらに示す。はるかに長い時間間隔においても文脈的恐怖の呼び出しに海馬が依然として関与するか否かを試験するために、別のマウス集団を訓練し、この集団を文脈的ＦＣから９週間後に試験した。呼び出しの間のＣＡ１抑制は、この非常に長い間隔後も遠隔恐怖記憶を遮断し、事前に引き起こされることはなかったことがわかった（図６Ｃ、Ｐ＜０．００５、対照ｎ＝９、３１．８±３．８％硬直、ｅＮｐＨＲ３．１ｎ＝６、１１．３±３．６％硬直）。

これらの結果は、遠隔文脈的恐怖記憶における海馬の継続的な関与を指摘し、正常な海馬は依然として記憶トレースのデフォルト活性化因子であることを示唆する。それらは、海馬に対する洗練された先駆的な身体的、薬理学的、または遺伝的病変に基づく一般的な理論に対照的であり、病変と呼び出し試験との間の間隔は、数十分から数週間に及ぶ（Ａｎａｇｎｏｓｔａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｋｉｍ ａｎｄ Ｆａｎｓｅｌｏｗ，１９９２、Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｗｉｌｔｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。実際に、実験は、以前に報告されたように（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９）、ＴＴＸおよびＣＮＱＸを使用して、海馬の薬理的抑制が、ＦＣプロトコルを使用するとき、近時（図６Ｄ、生理食塩水ｎ＝５、５６．８６±１．９％硬直、ＴＴＸ＋ＣＮＱＸｎ＝４、２６．０５±１０．２３％硬直、Ｐ＜０．０５）恐怖呼び出しだけを妨害し、遠隔（図６Ｅ、生理食塩水ｎ＝８、９３．９３±２．５４％硬直、ＴＴＸ＋ＣＮＱＸｎ＝９、８３．８±４．４％硬直、Ｐ＞０．０５）恐怖呼び出しを妨害しなかったことを示し、以前の結果を確認した。したがって、代わりに光遺伝の速度および特異性は、行動する動物において用いられると、補償機序の発現を可能にしないことにより、細胞および回路の因果的役割の試験を可能にし得る。この仮説は次に明示的に試験した。

精密であるが長期でないＣＡ１光遺伝的抑制は遠隔文脈的恐怖呼び出しを遮断する。 時間精度が光遺伝的見解と薬理学的見解との間の相違を説明する重要な要因であるという仮説を検証するために、遠隔光遺伝的実験は、前述のように試験の期間に限定された照明（図７Ａ「正確」）または低速介入を模倣し、推定補償機序が関与する時間を許すように、試験前３０分間および試験中の長期照明（図７Ａ「長期」）のいずれかを用いて反復した。正確な光遺伝的抑制は、遠隔記憶を著しく抑制したが、長期抑制は、遠隔記憶想起に対して検出可能な効果を有しなかった（図７Ａ）。さらに、長期群からのマウスを、正確な光投与（試験のみの間）を用いて翌日に再試験したとき、同一のマウスは、抑制された恐怖の呼び出しを示した（図７Ａ右）。つまり、ＣＡ１光遺伝的抑制は、光が試験の間正確に投与されたときにのみ（正確群、対照ｎ＝４、７２．６５±１１．５％硬直、ｅＮｐＨＲ３．１ ｎ＝８、２６．９±１０．４％硬直、Ｐ＜０．０１）、２８日前に取得された記憶の遠隔恐怖呼び出しを防止するが、試験前ならびに試験の間に光が３０分間連続的にオンであったときは防止しなかった（長期群、中間、対照ｎ＝３、７０．１３±１２．２％硬直、ｅＮｐＨＲ３．１ ｎ＝４、６７．７±５．６％硬直、Ｐ＞０．０５）。長期群のマウスを試験の間だけ光を用いて翌日に再試験したとき、それらの呼び出しは妨害された（長期群、左、５５．５±８．５対２７．６±８．６％硬直、Ｐ＜０．０５）。

これらの結果を有効化するために、行動的および生理学的対照の両方を行った。第１に、遠隔記憶に対して影響がない長期ｅＮｐＨＲ３．１媒介性ＣＡ１抑制が、近時記憶を依然として遮断し得ることを確認した。つまり、新しいマウスの群を訓練し、翌日の試験前３０分間、次に試験中に長期照明を用いて試験した。長期光遺伝的抑制は、薬理学的効果（図６Ｄ）と同様に、近時恐怖記憶の呼び出しを著しく抑制したことがわかった（図７Ｂ、対照ｎ＝７、３２．２±１０．６％硬直、ｅＮｐＨＲ３．１ ｎ＝３、４±２．６％硬直、Ｐ＜０．０５）。第２に、全細胞パッチクランプ記録（図４Ａの長期群から調製された切片において）を行ったところ、ｅＮｐＨＲ３．１がスパイクを抑制する能力は、予測されるとおり、３０分の記録期間を通して安定し（Ｇｒａｄｉｎａｒｕら、２０１０）、完全に可逆的であった（図７Ｃ）。セクション１（抑制開始）、２（連続的な抑制の間）、および３（抑制の最後および回復）の詳細なトレースは、左下に提示される。光投与前、光投与中（光オンの５分後および３０分後）の良好に誘発されたスパイクの平均割合、ならびに光オフ後の回復が提示される（右下、ｎ＝４マウス、１０細胞）。

ＣＡ１光遺伝的抑制は継続的な恐怖の呼び出しを干渉する。 別のマウス集団を訓練し、その集団を、遠隔光オンおよび光オフ呼び出しプローブ順序を逆にして、文脈的ＦＣから５週間後に試験し、最初に記憶トレースの持続性を実証した（試験中に光なし、予測のとおり、ｅＮｐＨＲ３．１群および対照群の両方で同様のパフォーマンスを観察する、図８左、対照ｎ＝８、７９．０±８．９％硬直、ｅＮｐＨＲ３．１ ｎ＝６、６７．８±１２．１％硬直、Ｐ＞０．５）。翌日、同一マウスを照明下で試験したところ、ｅＮｐＨＲ３．１群は、文脈的記憶の呼び出しに失敗した（図８左、７７．２±４．３％対１２．８±４．４％硬直、Ｐ＜０．０００１）。この効果は、完全に可逆的であり、翌日と同様に、光送達なしに試験したとき、ｅＮｐＨＲ３．１マウスは、正常な文脈的記憶を示した（図８右、６１．５±６．７対５８．３±３．５％硬直、Ｐ＞０．５）。最も重要なことに、このセッション内で光が再度ＣＡ１に送達されるとすぐに、マウスが既に嫌悪文脈を呼び出し、恐怖を表現した後、ｅＮｐＨＲ３．１において恐怖応答は即時に停止したが（図８右、６５．２±６．９対１５．９±５．２％硬直、Ｐ＜０．００１）、対照動物では停止しなかった。

これらのデータはともに、ある異種の見解を統合することができ、遠隔記憶トレースが海馬のみに保管されないことを明らかにすることにより以前の研究を支持するが（海馬の非活性化を補償するのに十分な時間が与えられると、記憶トレースは、以前の報告と一致して、他の構造により依然として想起され得る）、同時に正常な海馬が、遠隔記憶トレースのデフォルト活性化因子であってよく、呼び出しセッションを通してその維持に積極的に関与するという意外な見解を明らかにする。

遠隔呼び出しの間に海馬により活発に制御される回路の脳全体のマッピング。 前初期遺伝子生成物の発現（例えば、ｚｉｆ２６８およびｃ−Ｆｏｓ）およびニューロン活性の他の広範囲の対策に関する以前の研究は、近時記憶から遠隔記憶への移行が、海馬活性の減少および新皮質活性の増加を伴い得ることを示した（ＡＣＣおよび前頭前皮質内、Ｂｏｎｔｅｍｐｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｆｒａｎｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｍａｖｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４）。この活性マッピングアプローチをＣＡ１光遺伝的制御の設定に拡張するために、ｅＮｐＨＲ３．１媒介性の抑制を、訓練または遠隔呼び出しの間に送達し、脳全体にわたる前初期遺伝子生成物ｃ−Ｆｏｓの導入を評価した。マウスは、光送達下で恐怖条件付けし、訓練の９０分後に脳を採取した（図９Ａ）。脳切片は、ｃ−ＦｏｓおよびＤＡＰＩについて染色した（図９Ｂ）。ＹＦＰ対照およびｅＮｐＨＲ３．１の発現が示される。これらの画像が撮影されたＣＡ１領域は、図９Ｃにおいて白い正方形でマークされる。訓練後、ｅＮｐＨＲ３．１発現マウスは、訓練された対照動物と比較して、ＣＡ１内で特異的なｃ−Ｆｏｓ発現の顕著な低減を示したが（図９Ｃ〜Ｄ、ｎ＝２〜４マウス、６〜１５切片／群、Ｐ＜０．０１）、訓練された対照に等しいＢＬＡ活性を示し（図９Ｃ〜Ｄ、ｐ＜０．０００１）、訓練中の恐怖回路の予測される海馬非依存性の関与を明らかにした。（９００）により参照される図９Ｄ、９Ｇ、および９Ｈの棒および線は、「対照−なし」群のデータであり、（９０２）は、「ＮｐＨＲ−なし」群のデータであり、（９０４）は「対照−恐怖」群のデータであり、（９０６）は「ＮｐＨＲ−恐怖」群のデータであることに留意されたい。ＡＣＣ活性レベルの著しい変化は、この時点で認められなかった。ＣＡ１、ＡＣＣ、およびＢＬＡの代表的な画像が示される。生体構造は、ＤＡＰＩ核染色により示され、扁桃体の辺縁部は破線でマークされる。白いスケールバー：１５０μｍ。

別のマウス群を条件付けした後、ＣＡ１光遺伝的抑制の存在下または非存在下で、条件付けから２８日後に文脈に再度暴露させたところ、前述のように、ｅＮｐＨＲ３．１発現マウスは、遠隔呼び出しの障害を示した。９０分後、脳を採取し、ｃ−Ｆｏｓを染色して（図９Ｅ）、この時点で海馬の制御下の推定記憶関連の脳全体活性パターンを捕捉した。興味深いことに、ＣＡ１ｃ−Ｆｏｓのわずかだが重要な増加は、遠隔呼び出し後に対照において認められたが、ｅＮｐＨＲ３．１マウスでは認められなかった（図９Ｆ〜Ｇ、Ｐ＜０．００５）。遠隔記憶後の代表的なＣＡ１、ＡＣＣ、およびＢＬＡ画像が示される。白いスケールバー：１５０μｍ。対照動物において認められたこの遠隔時点でのＡＣＣ活性の増加（Ｐ＜０．０００１）は、ｅＮｐＨＲ３．１／ＣＡ１抑制マウスにおいて低減したため（Ｐ＜０．０００１）、このＣＡ１細胞の集団は、脳全体の遠隔記憶関連活性の採用に因果的に関与すると考えられた。さらにより驚くことには、ＢＬＡ内の活性化細胞集団（Ｐ＜０．０００１）は、対照マウスにおいて認められたが（文脈的かつ表現された恐怖を認識した）、ＣＡ１抑制されたｅＮｐＨＲ３．１マウスでは認められなかった（さらに文脈を記憶することができないことがわかった、図９Ｆ〜Ｇ、Ｐ＜０．０００１）、図９Ｇに表されるように、条件付けから２８日後の遠隔呼び出しは、対照マウスにおいてＣＡ１ｃ−Ｆｏｓ発現のわずかだが重要な増加をもたらし、ＡＣＣおよびＢＬＡにおいて非常に高い活性レベルをもたらした。文脈に対する暴露の間の光抑制は、対照と比較して、ＣＡ１活性を完全に遮断し（Ｐ＜０．０５）、ＡＣＣおよびＢＬＡ活性を著しく低減した。

付加的観察は、遠隔時点でのこのＣＡ１採用集団の特異性を指摘する。ｅＮｐＨＲ３．１発現マウスは、対照のそれに等しい前頭前皮質活動の上昇を示し、頭頂葉皮質活動レベルの著しい変化は、いずれの群においても認められなかった。対照的に、上記のとおり、ＡＣＣにおける活動レベルは、遠隔記憶のみにおいて著しく採用され、それよりも低い程度でｅＮｐＨＲ３．１媒介性ＣＡ１抑制（図９Ｈ中間）の設定に採用され、また以前の報告と一致した（Ｂｏｎｔｅｍｐｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｆｒａｎｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｍａｖｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４）。図９Ｈは、条件付け（０日目）と遠隔呼び出し（２８日目）との間の脳活動の全体パターンを表す。ＣＡ１の活動レベルは、対照（Ｐ＜０．００５）マウスにおいて、０日目〜２８日目まで著しく減少した。ＡＣＣの活動レベルは、対照（Ｐ＜０．０００１）およびｅＮｐＨＲ３．１（Ｐ＜０．００１）マウスの両方において、０日目〜２８日目まで著しく増加した。ＢＬＡの活動レベルは、ｅＮｐＨＲ３．１マウスではなく、対照（Ｐ＜０．００１）マウスにおいて著しく増加した。これらのデータはともに、遠隔文脈的記憶と関連付けられた脳全体の活動パターンを組織化することにおけるＣＡ１ニューロンのこの小集団の役割を指摘する。

ＡＣＣの光遺伝的抑制は近時ではなく遠隔文脈的記憶を抑制する。 遠隔文脈的記憶の間に活性なＣＡ１ニューロンの集団は、上で示されるように、ＡＣＣニューロン活性を完全に組織化することにおいて因果的に関与することがわかったため、また以前の研究は、遠隔恐怖記憶の保存においてＡＣＣを関与させるため（Ｂｏｎｔｅｍｐｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｆｒａｎｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｍａｖｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４）、記憶の光遺伝的抑制は、文脈的ＦＣから１日後または１ヶ月後のいずれかにＡＣＣを直接標的とすることにより探索した。図１０Ａは、前帯状皮質（ＡＣＣ）内のｅＮｐＨＲ３．０発現を表す。以前の研究と完全に一致して（Ｆｒａｎｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００４）、ＡＣＣの光遺伝的抑制は、近時記憶に影響がなかったが（７５．９±５．４対７６±２．９％硬直）、遠隔記憶を著しく障害した（図１０Ｂ、対照ｎ＝５、８１．６±４．９％硬直、ｅＮｐＨＲ３．０ ｎ＝５、５３．８±１１％硬直、Ｐ＜０．０５）。

同一の実験を新しいマウス群において繰り返したが、今回は、試験前３０分間、次に試験の間に長期照射を送達した。ここでもＡＣＣの光遺伝的抑制は、遠隔記憶を著しく障害したが（対照ｎ＝３、７８．０±６．２％硬直、ｅＮｐＨＲ３．０ ｎ＝８、４５．０±５．２％硬直、Ｐ＜０．０５）、近時記憶には影響がなかった（図１０Ｃ、７８．５±１２．７対７４．３±４．３％硬直）。対照的に、別の主要な皮質入力領域が対照目的で標的とされるとき、近時および遠隔恐怖呼び出しの両方の間に、嗅球（ＯＢ）、および光遺伝的抑制の効果を試験したところ、いずれの時点においても呼び出しに影響がなかったことがわかった。この結果は、同時に、皮質へのシナプス入力の主要な源の突然の低下が非特異的に呼び出しに影響しないことを示し、また遠隔記憶におけるＡＣＣの特異性を指摘する（以前の研究と一致する）。これらの見解はともに、新皮質の遠隔重要性を支持し、皮質の再組織化後であっても、遠隔記憶トレースを呼び出すことにおける海馬のデフォルト要件が存在する。

遠隔記憶の不可逆的消去は、近年、ＰＫＷ投与による海馬および皮質において（Ｍｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ、Ｐａｓｔａｌｋｏｖａ ｅｔ ａｌ ２００６、Ｓｈｅｍａ ｅｔ ａｌ ２００９、Ｓｈｅｍａ ｅｔ ａｌ ２００７）、およびタグ付け前ニューロンの選択的切除により扁桃体において示された（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ ２００９）。一方、ニューロンの損傷に起因して喪失されると推定される遠隔記憶トレースは、環境強化およびクロマチン修飾後の呼び出しに使用可能になった（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ ２００７）。一方、光遺伝は、永久的な記憶の消去なしに、可逆的呼び出しの防止を可能にする。海馬が、依然として文脈的恐怖記憶呼び出しのデフォルト活性化因子であるという見解は、ＣＡ１内の多くの場所細胞（Ｍｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ ２００８）が、恐怖条件付けに応答してリマップするという事実に起因する場合があり（Ｍｏｉｔａ ｅｔ ａｌ ２００４）、文脈のより高速な認識に寄与し得る。実際に、海馬の損傷は、空間記憶の逆行性健忘を誘導することが繰り返し示された（Ｂｒｏａｄｂｅｎｔ ｅｔ ａｌ ２００６、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ ２００５）。

遠隔記憶が想起されると、それらは再強化に使用可能になり、崩壊の影響を受け易くなるが、トレースを強化し得る（Ｄｕｄａｉ ２００６、Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ ２００６、Ｎａｄｅｒ ａｎｄ Ｈａｒｄｔ ２００９、Ｔｒｏｎｓｏｎ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ ２００７、Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓ）。遠隔恐怖記憶を実時間で、再強化前後に、さらにはそれが既に想起された後であっても遠隔恐怖記憶を可逆的にシャットダウンする能力は、ＰＴＳＤ患者にとって胸躍る治療手段を提供し得、再発する妨害記憶が現れると、他の記憶に永久に影響することなくその妨害記憶が停止され得る。付加的に、薬物乱用に関連する記憶を抑制して、薬物探索行動を低減することができる（Ｅｖｅｒｉｔｔ ｅｔ ａｌ ２００１、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ ２００５、Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ ２００８）。異なる脳領域の光遺伝的変調により認知に即時に影響を及ぼす能力は、記憶プロセスにおける特定のニューロン集団の役割を再試験する、今後の研究の基礎としての役割を果たし、それらの基礎となる神経回路のより微細な時間的、遺伝的、および空間的解析を可能にし得る。

前述の発明は、理解を明確にする目的で、図および実施例によりある程度詳細に説明されたが、この説明および実施例は、発明の範囲を限定するものと見なされてはならない。

参考文献
Adamantidis, A.R., Zhang, F., Aravanis, A.M., Deisseroth, K., and de Lecea, L. (2007). Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature 450, 420-424.
Anagnostaras, S.G., Maren, S., and Fanselow, M.S. (1999). Temporally graded retrograde amnesia of contextual fear after hippocampal damage in rats: within-subjects examination. J N eurosci 19, 1106-1114.
Aravanis, A.M., Wang, L.P., Zhang, F., Meltzer, L.A., Mogri, M.Z., Schneider, M.B., and Deisseroth, K. (2007). An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. J Neural Eng 4, S143-156.
Bolhuis, J.J., Stewart, C.A., and Forrest, E.M. (1994). Retrograde amnesia and memory reactivation in rats with ibotenate lesions to the hippocampus or subiculum. Q J Exp Psychol B 47, 129-150.
Bontempi, B., Laurent-Demir, C., Destrade, C., and Jaffard, R. (1999). Timedependent reorganization of brain circuitry underlying long-term memory storage. Nature 400, 671-675.
Boyden, E.S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., and Deisseroth, K. (2005). Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci 8, 1263-1268.
Broadbent, N.J., Squire, L.R., and Clark, R.E. (2006). Reversible hippocampal lesions disrupt water maze performance during both recent and remote memory tests. Learn Mem 13, 187-191.
Cipolotti, L., and Bird, C.M. (2006). Amnesia and the hippocampus. Curr Opin Neurol 19, 593-598.
Debiec, J., LeDoux, J.E., and Nader, K. (2002). Cellular and systems reconsolidation in the hippocampus. Neuron 36, 527-538.
Deisseroth, K., Feng, G., Majewska, A.K., Miesenbock, G., Ting, A., and Schnitzer, M.J. (2006). Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. J Neurosci 26, 10380-10386.
Dudai, Y. (2006). Reconsolidation: the advantage of being refocused. Curr Opin Neurobiol 16, 174-178.
Everitt, B.J., Dickinson, A., and Robbins, T.W. (2001). The neuropsychological basis of addictive behaviour. Brain Res Brain Res Rev 36, 129-138.
Fanselow, M.S. (2000). Contextual fear, gestalt memories, and the hippocampus. Behav Brain Res 110, 73-81.
Fischer, A., Sananbenesi, F., Wang, X., Dobbin, M., and Tsai, L.H. (2007). Recovery of learning and memory is associated with chromatin remodelling. Nature 447, 178-182.
Frankland, P.W., and Bontempi, B. (2005). The organization of recent and remote memories. Nat Rev Neurosci 6,119-130.
Frankland, P.W., Bontempi, B., Talton, L.E., Kaczmarek, L., and Silva, A.J. (2004). The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science 304, 881-883.
Gradinaru, V., Thompson, K.R., Zhang, F., Mogri, M., Kay, K., Schneider, M.B., and Deisseroth, K. (2007). Targeting and readout strategies for fast optical neural control in vitro and in vivo. J Neurosci 27, 14231-14238.
Gradinaru, V., Zhang, F., Ramakrishnan, C., Mattis, J., Prakash, R., Diester, 1., Goshen, 1., Thompson, K.R., and Deisseroth, K. (2010). Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell 141, 154-165.
Hall, J., Thomas, K.L., and Everitt, B.J. (2001). Cellular imaging of zif268 expression in the hippocampus and amygdala during contextual and cued fear memory retrieval: selective activation of hippocampal CA1 neurons during the recall of contextual memories. J Neurosci 21, 2186-2193.
Han, J.H., Kushner, S.A., Yiu, A.P., Hsiang, H.L., Buch, T., Waisman, A., Bontempi, B., Neve, R.L., Frankland, P.W., and Josselyn, S.A. (2009). Selective erasure of a fear memory. Science 323, 1492-1496.
Johansen, J.P., Hamanaka, H., Monfils, M.H., Behnia, R., Deisseroth, K., Blair, H.T., and LeDoux, J.E. (2010). Optical activation of lateral amygdala pyramidal cells instructs associative fear learning. Proc Natl Acad Sci U S A 107,12692-12697.
Killcross, S., Robbins, T.W., and Everitt, B.J. (1997). Different types of fearconditioned behaviour mediated by separate nuclei within amygdala. Nature 388, 377-380.
Kim, J.J., and Fanselow, M.S. (1992). Modality-specific retrograde amnesia of fear. Science 256, 675-677.
Kitamura, T., Saitoh, Y., Takashima, N., Murayama, A., Niibori, Y., Ageta, H., Sekiguchi, M., Sugiyama, H., and Inokuchi, K. (2009). Adult neurogenesis modulates the hippocampus-dependent period of associative fear memory. Cell 139, 814-827.
LeDoux, J.E. (2000). Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci 23, 155-184.
Lee, J.L., Di Ciano, P., Thomas, K.L., and Everitt, B.J. (2005). Disrupting reconsolidation of drug memories reduces ***e-seeking behavior. Neuron 47, 795-801.
Lee, J.L., Milton, A.L., and Everitt, B.J. (2006). Reconsolidation and extinction of conditioned fear: inhibition and potentiation. J Neurosci 26, 10051-10056.
Maren, S. (2001). Neurobiology of Pavlovian fear conditioning. Annu Rev Neurosci 24, 897-931.
Maren, S., Aharonov, G., and Fanselow, M.S. (1997). Neurotoxic lesions of the dorsal hippocampus and Pavlovian fear conditioning in rats. Behav Brain Res 88, 261-274.
Maren, S., and Quirk, G.J. (2004). Neuronal signalling of fear memory. Nat Rev Neurosci 5, 844-852.
Martin, S.J., de Hoz, L., and Morris, R.G. (2005). Retrograde amnesia: neither partial nor complete hippocampal lesions in rats result in preferential sparing of remote spatial memory, even after reminding. Neuropsychologia 43, 609-624.
Maviel, T., Durkin, T.P., Menzaghi, F., and Bontempi, B. (2004). Sites of neocortical reorganization critical for remote spatial memory. Science 305, 96-99.
McHugh, T.J., Jones, M.W., Quinn, J.J., Balthasar, N., Coppari, R., Elmquist, J.K., Lowell, B.B., Fanselow, M.S., Wilson, M.A., and Tonegawa, S. (2007). Dentate gyrus NMDA receptors mediate rapid pattern separation in the hippocampal network. Science 317, 94-99.
McHugh, T.J., and Tonegawa, S. (2007). Spatial exploration is required for the formation of contextual fear memory. Behav Neurosci 121, 335-339.
Moita, M.A., Rosis, S., Zhou, Y., LeDoux, J.E., and Blair, H.T. (2004). Putting fear in its place: remapping of hippocampal place cells during fear conditioning. J Neurosci 24, 7015-7023.
Morris, R.G., Inglis, J., Ainge, J.A., Olverman, H.J., Tulloch, J., Dudai, Y., and Kelly, P .A. (2006). Memory reconsolidation: sensitivity of spatial memory to inhibition of protein synthesis in dorsal hippocampus during encoding and retrieval. Neuron 50, 479-489.
Moscovitch, M., Nadel, L., Winocur, G., Gilboa, A., and Rosenbaum, R.S. (2006). The cognitive neuroscience of remote episodic, semantic and spatial memory. Curr Opin Neurobiol 16, 179-190.
Moser, E.l., Kropff, E., and Moser, M.B. (2008). Place cells, grid cells, and the brain's spatial representation system. Annu Rev Neurosci 31, 69-89.
Nadel, L., and Moscovitch, M. (1997). Memory consolidation, retrograde amnesia and the hippocampal complex. Curr Opin Neurobiol 7, 217-227.
Nader, K., and Hardt, O. (2009). A single standard for memory: the case for reconsolidation. Nat Rev Neurosci 10, 224-234.
Nakashiba, T., Young, J.Z., McHugh, T.J., Buhl, D.L., and Tonegawa, S. (2008). Transgenic inhibition of synaptic transmission reveals role of CA3 output in hippocampal learning. Science 319, 1260-1264.
Phelps, E.A., and LeDoux, J.E. (2005). Contributions of the amygdala to emotion processing: from animal models to human behavior. Neuron 48, 175-187.
Riedel, G., Micheau, J., Lam, A.G., Roloff, E.L., Martin, S.J., Bridge, H., de Hoz, L., Poeschel, B., McCulloch, J., and Morris, R.G. (1999). Reversible neural inactivation reveals hippocampal participation in several memory processes. Nat Neurosci 2, 898-905.
Robbins, T.W., Ersche, K.D., and Everitt, B.J. (2008). Drug addiction and the memory systems of the brain. Ann NY Acad Sci 1141, 1-21.
Shimizu, E., Tang, Y.P., Rampon, C., and Tsien, J.Z. (2000). NMDA receptordependent synaptic reinforcement as a crucial process for memory consolidation. Science 290, 1170-1174.
Squire, L.R., and Alvarez, P. (1995). Retrograde amnesia and memory consolidation: a neurobiological perspective. Curr Opin Neurobiol 5, 169-177.
Squire, L.R., and Bayley, P.J. (2007). The neuroscience of remote memory. Curr Opin Neurobiol 17, 185-196.
Sutherland, R.J., O'Brien, J., and Lehmann, H. (2008). Absence of systems consolidation of fear memories after dorsal, ventral, or complete hippocampal damage. Hippocampus 18, 710-718.
Sutherland, R.J., Sparks, F.T., and Lehmann, H. (2010). Hippocampus and retrograde amnesia in the rat model: a modest proposal for the situation of systems consolidation. Neuropsychologia 48, 2357-2369.
Tronson, N.C., and Taylor, J.R. (2007). Molecular mechanisms of memory reconsolidation. Nat Rev Neurosci 8, 262-275.
Wang, H., Shimizu, E., Tang, Y.P., Cho, M., Kyin, M., Zuo, W., Robinson, D.A., Alaimo, P.J., Zhang, C., Morimoto, H., et al. (2003). Inducible protein knockout reveals temporal requirement of CaMKII reactivation for memory consolidation in the brain. Proc Natl Acad Sci USA 100, 4287-4292.
Wang, S.H., and Morris, R.G. (2010). Hippocampal-neocortical interactions in memory formation, consolidation, and reconsolidation. Annu Rev Psychol 61, 49-79, C41-44.
Wang, S.H., Teixeira, C.M., Wheeler, A.L., and Frankland, P.W. (2009). The precision of remote context memories does not require the hippocampus. Nat Neurosci 12, 253-255.
Wiltgen, B.J., Zhou, M., Cai, Y., Balaji, J., Karlsson, M.G., Parivash, S.N., Li, W., and Silva, A.J. (2010). The Hippocampus Plays a Selective Role in the Retrieval of Detailed Contextual Memories. Curr Biol 20, 1336-1344.
Winocur, G., Frankland, P.W., Sekeres, M., Fogel, S., and Moscovitch, M. (2009). Changes in context-specificity during memory reconsolidation: selective effects of hippocampal lesions. Learn Mem 16, 722-729.
Winocur, G., Moscovitch, M., and Bontempi, B. (2010). Memory formation and long-term retention in humans and animals: convergence towards a transformation account of hippocampal-neocortical interactions. Neuropsychologia 48, 2339-2356.
Winocur, G., Moscovitch, M., and Sekeres, M. (2007). Memory consolidation or transformation: context manipulation and hippocampal representations of memory. Nat Neurosci 10, 555-557.
Zhang, F., Wang, L.P., Brauner, M., Liewald, J.F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P.G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., et al. (2007). Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature 446, 633-639.

Claims (18)

1. 個体において記憶想起または記憶形成を可逆的に抑制するための薬剤であって、光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなり、
   前記タンパク質がＮｐＨＲ（配列番号３）と９０％を超えて同一であるアミノ酸配列を含み、
   このとき前記薬剤が、
   個体の海馬の背側ＣＡ１野、前帯状皮質または扁桃体基底外側部に投与されるものであって、このとき前記光活性化タンパク質が、個体の海馬の背側ＣＡ１野、前帯状皮質または扁桃体基底外側部の興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、前記タンパク質が光に応答性であり、前記ニューロンが光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を抑制することができるものである、薬剤。
2. 前記タンパク質が、ＮｐＨＲ（配列番号３）と９５％を超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の薬剤。
3. 前記タンパク質が、配列番号３に示される配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の薬剤。
4. 前記タンパク質が、小胞体（ＥＲ）輸出シグナルおよび／または膜輸送シグナルをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の薬剤。
5. 前記アミノ酸配列が、リンカーを通して前記ＥＲ輸出シグナルに連結される、請求項４に記載の薬剤。
6. 前記ＥＲ輸出シグナルがアミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶを含むか、前記膜輸送シグナルがアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含む、請求項４に記載の薬剤。
7. 前記タンパク質が、配列番号５または配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の薬剤。
8. 前記ポリヌクレオチドが、ベクターである、請求項１から７のいずれか一項に記載の薬剤。
9. 前記ベクターが、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＨＳＶベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項８に記載の薬剤。
10. 前記事象が恐怖事象である、請求項１から９のいずれか一項に記載の薬剤。
11. 前記個体が心的外傷後ストレス障害を有している、請求項１から１０のいずれか一項に記載の薬剤。
12. 前記個体がヒトまたは非ヒト動物である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬剤。
13. 記憶想起または記憶形成に影響を及ぼす薬剤をスクリーニングする方法であって、
    ａ）事象の記憶想起または記憶形成の間に、マウスの海馬の背側ＣＡ１野、前帯状皮質または扁桃体基底外側部内の興奮性ニューロンを薬剤と接触させることであって、このとき前記マウスが、その海馬の背側ＣＡ１野、前帯状皮質または扁桃体基底外側部内の興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含み、前記タンパク質が、ＮｐＨＲ（配列番号３）と９０％を超えて同一であるアミノ酸配列を含み、光に応答性であり、前記ニューロンが光で照射されると前記ニューロンの脱分極を抑制することができ、そのタンパク質の照射が記憶想起または記憶形成を可逆的に抑制することと、
    ｂ）事象の記憶想起または記憶形成の間に、前記海馬の背側ＣＡ１野、前帯状皮質または扁桃体基底外側部内で、前記興奮性ニューロンの脱分極を抑制することと、
    ｃ）光の存在下または非存在下で、前記薬剤が記憶想起または記憶形成に影響を及ぼすか否かを決定する、方法。
14. 前記タンパク質が、ＮｐＨＲ（配列番号３）と９５％を超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記タンパク質が、配列番号３に示される配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記タンパク質が、小胞体（ＥＲ）輸出シグナルおよび／または膜輸送シグナルをさらに含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記アミノ酸配列が、リンカーを通して前記ＥＲ輸出シグナルに連結される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ＥＲ輸出シグナルがアミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶを含むか、前記膜輸送シグナルがアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含む、請求項１６または１７に記載の方法。