JP2004501113A - 組み換えパルボウィルスベクターの制御放出のための方法および配合物 - Google Patents
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Abstract
Description
[関連出願]
本出願は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする2000年6月1日提出の米国仮出願第60/208,702号の利益を主張する。
【0002】
本発明は、国立衛生研究所からの補助金番号DK54419の政府援助により実施された。米国政府は本発明について特定の権利を有する。
【0003】
[技術分野]
本発明は、パルボウィルスベクターの制御放出、特に組み換えアデノ関連(rAAV)ウィルスベクターのin vivoでの制御放出に関する。
【0004】
[背景技術]
多くの薬物および治療用タンパク質が凍結乾燥後に調製投与されることは既知である。ポリマー化学と生体材料の進歩により、移植片材料への付着を介する薬物の送達が達成された。例えば、人工血管材料に結合させたヘパリンとウロキナーゼは、代用血管の長期開存を改善する試みに使用されてきた。化学療法剤は、時効性送達のためにカシェ剤に含浸されている。しかし、これらのシステムで、宿主細胞における持続的な治療用タンパク質の発現を目標とするDNAの送達を行うものは皆無である。
【0005】
既知のウィルスおよび非ウィルス(例えば、脂質を介する、エレクトロポレーションにより増強された)遺伝子治療システムは、溶液に含まれた遺伝子ベクターの送達に依存している。溶液は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射が可能で、経口投与も可能である。これらの方法は、ベクターが温度、水和、pHなどの条件の変化に晒された時に、多くの遺伝子治療用ベクターまたは処方が不安定である(すなわち、それらが、細胞を感染させ、DNAを送達する能力を失う)という事実が障害となっている。更に、これらの投与経路は、送達組織から離れた臓器に送達されたウィルスの、望ましくない迅速な生体内分布を引き起こす(例えば、静脈内投与後後数秒以内、または筋肉内投与後数分から数時間以内)。従って、遺伝子送達が時間制御方式により、すなわち遅効性に達成でき、標的組織から離れた部位におけるウィルスの生体分布を遅延できる方法が必要とされている。
【0006】
アデノ関連ウィルス(AAV)は、パルボウィルス科の非病原性、ヘルパー依存性のメンバーである。この群を識別する特徴の一つは、一本鎖DNA(ssDNA)ゲノムを包膜する点である。別々のプラスまたはマイナス鎖が同じ効率でパッケージングされており、いずれも感染性である。ssDNAゲノムの各末端に、パリンドロームの末端反復(TR)構造塩基対がそれ自体に存在し、ヘアピン構造を形成している。これは、細胞のDNAポリメラーゼにとってプライマーの役割を果たし、宿主細胞においてアンコーティング後、相補的鎖を合成する。アデノ関連ウィルスは一般に、生産的感染にヘルパーウィルスを必要とする。アデノウィルス(Ad)が通常この目的を果たすが、AAV感染細胞を紫外線照射法またはヒドロキシ尿素(HU)で処理することによっても、限定された複製は可能である。
【0007】
組み換えAAV(rAAV)遺伝子送達ベクターも、プラスまたはマイナス極性のssDNAをパッケージしており、相補鎖の合成は細胞複製因子に依存しなくてはならない。最初、この段階は、細胞のDNA複製または修復経路により自発的に実施されるものと予測されていたが、事実はそうでないらしい。rAAVベクターを用いる初期の研究により、マーカー遺伝子発現を評点する能力は、細胞をアデノウィルスと同時感染させるか、あるいは遺伝子毒性物質で一過性に前処理すると劇的に増強されることが明らかにされた。同様にrAAVベクターの誘導が、Ad、電離放射線、またはトポイソメラーゼ阻害剤で処理後in vivoで観察されている。しかし、この効果は組織間および細胞種によってかなりばらつきがある。
【0008】
完全に乾燥した後のAAVにより仲介される遺伝子送達効率が、1998年5月第3回国際癌遺伝子治療学会において、Rabinowitz et al.により説明された。その時に、組み換えAAVが、広範囲の温度、pH、水和状態で、感染性と形質導入(トランスジェニックタンパク質の発現を引き起こす遺伝子送達)能力を維持することが示された。それ以来本発明者等は、血流に送達されるウィルスベクターを用いる、あるいは高用量で肺または筋肉の様な組織に局所的に送達されるウィルスベクターを用いる遺伝子治療の限界が、目的の作用部位の範囲を超えた多くの部位にウィルスが拡散することであるという論拠に基づき、ウィルス乾燥後のAAVにより仲介される遺伝子送達の更なる研究を実施してきた。
【0009】
ウィルス拡散の一つの欠点は、目的部位に存在する治療遺伝子が少なすぎる、すなわち送達される治療用遺伝子が少なすぎる点である。例えば、嚢胞性線維症治療薬として、肺に送達されるはずのCFTR遺伝子は、大部分のウィルスが肝臓や脾臓に移動してしまったら、その有用性は低下してしまう。既知の遺伝子送達システムのもう1つの問題点は、所望の治療効果を達成するために必要な遺伝子ベクターの正確な投与量を簡単に判定できない点である。最後に、ウィルスベクターが標的以外の臓器に投与されると毒性作用の可能性がある場合には、治療物質の投与を標的部位にのみ限定し、ウィルス拡散を減少させることが望ましい。遺伝子治療に常につきまとう懸念は、被験対象の生殖腺への望ましくない遺伝子送達ベクター拡散の可能性が理論的に存在する点である。従って、遺伝子治療ベクターの指向性と量を正確にすることは、安全かつ信頼性の高い遺伝子送達システムの開発において常に優先事項となる。
【0010】
[発明の概要]
本発明は、治療用ウィルスベクターを支持マトリクス上で(すなわち支持マトリクスに付着させて)乾燥させる、脱水または乾燥するステップ(すなわち、部分または完全乾燥、凍結乾燥)後、遺伝子治療のために、組み換えパルボウィルス、特に組み換えアデノ関連ウィルス(rAAV)を使用して核酸配列(すなわち、遺伝子とDNA配列)を送達する。有用な支持マトリクスには、パッケージングし、被験対象に輸送するための外科移植用材料(すなわち縫合糸、外科移植片材料、植え込み型装置など)が含まれ、これによって支持マトリクスに付着させたrAAVを介した遺伝子治療が可能となる。
【0011】
本発明者等は、遺伝子転移ベクターとしての、溶液中のアデノ関連ウィルスの利用に関して広範にわたりその特徴を明らかにした。他の遺伝子転移ベクターウィルスと比較してrAAVの並外れた安定性の特徴を明らかにした本研究により、ウィルスの安定輸送を達成する目的で、また、遺伝子治療のために、特定のかつ局所的な組織部位にウィルスを直接に置くために、移植材料(例えば、縫合糸、移植片材料、およびその他の外科移植用材料)の上でrAAVを乾燥する目的で、ウィルスを脱水する方法が開発された。
【0012】
一定範囲の水和、pH、温度条件および溶液の内容(例えば、安定剤、糖、その他の量)にわたりrAAVの安定性の特徴が明らかにされた。これらの研究により、ある脱水状態における経時的なrAAVの安定性の特徴が明らかにされた。最も一般的に利用されているウィルスキャプシド構造(AAVセロタイプ2)を用いて産生されたrAAVが、乾燥後、形質導入能力を維持している事が見いだされた。セロタイプ1、3、4、5のキャプシドを用いて産生されたrAAVも、乾燥後に、遺伝子送達能力を維持していることが見いだされた。
【0013】
本発明により、種々の縫合材料(絹、カットグット、ヴィクリルモノフィラメント等)、正電荷ナイロン膜、泡ゼラチンマトリクス、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)移植材料に適用した状態で、脱水されたウィルスを介する遺伝子送達が可能となる。遺伝子送達およびタンパク質の発現が、これらの材料のそれぞれを用いてin vitroとin vivoで実証された。
【0014】
[好ましい実施形態の説明]
本発明を、本発明の好ましい実施形態が示されている添付の図面と明細書を参照し、この後より詳細に説明する。しかし、本発明は、異なる形態で実施することが可能であり、本明細書に提示されている実施形態に限定されるべきではない。
【0015】
特に定義されていない場合には、本明細書に使用されている全ての技術および科学用語は、本発明の技術において通常の技術を有する者にとって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の説明と添付請求項に使用されている単数形「a」、「an」と「the」は、文章が明示していない限り、複数形も含まれる。本明細書に言及されている全ての出版物、特許明細書、特許およびその他の引用文献は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【0016】
特に表示されている場合を除いて、本発明のrAAVゲノム、相補的パッケージングベクター、一過的および安定的にトランスフェクションされたパッケージング細胞の作製に、本技術に精通する者にとって既知の標準方法を使用できる。そのような技術は本技術に精通する者にとって既知である。例えば、J.Sambrook et al.,分子クローニング:実験マニュアル第二版(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1989)およびF.M.Ausubel et al.,分子生物学の最新プロトコール(Green Publishing Associates,Inc.and Wiley−Interscience,ニューヨーク,1991)を参照。
【0017】
パルボウィルス(parvovirus)は、線形の一本鎖DNAゲノムを含む比較的小さなDNA動物ウィルスである。本明細書に使用されている「パルボウィルス」という言葉は自己複製するパルボウィルスとデペンドウィルス(dependovirus)類を含むパルボウィルス科を包含する。自己複製するパルボウィルスには、パルボウィルス属、エリトロウィルス属、デンソウィルス属、イテラウィルス属、コントラウィルス属のメンバーが含まれる。自己複製するパルボウィルスの例として、マウスマイニュートウィルス、ウシパルボウィルス、イヌパルボウィルス、ニワトリパルボウィルス、ネコ汎白血球減少症ウィルス、ネコパルボウィルス、ヤギパルボウィルス、B19ウィルスが含まれるが、これらに限定されない。その他の自己複製するパルボウィルスは本技術に精通する者にとって既知である。例えば、ウィルス学第三版(B.M.Fields et al.編、Lippincott−Raven、フィラデルフィア、ペンシルバニア州、1996、pp.2173〜2197)のK.I.Bems et al.,「パルボウィルス:ウィルスとその複製」を参照のこと。
【0018】
パルボウィルス科の中で、デペンドウィルス属にアデノ関連ウィルス(AAV)が含まれる。アデノ関連ウィルス(AAV)は、パルボウィルス科の非病原性、ヘルパー依存性のメンバーである。アデノ関連ウィルスには、AAV1型、AAV2型、AAV3型、AAV4型、AAV5型、AAV6型、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、ヒツジAAVが含まれるが、これらに限定されない。本発明の使用には、AAV1型、AAV2型、AAV3型、AAV4型、AAV5型が好ましく、AAV2型が特に好ましい。
【0019】
このグループのウィルスを識別する特徴は、一本鎖DNAゲノムである。AAVの場合、プラス鎖かマイナス鎖を同じ効率でパッケージでき、いずれも感染性である。アデノ関連ウィルスは一般に、生産的感染にヘルパーウィルスを必要とする。アデノウィルス(Ad)が通常この目的を果たすが、AAV感染細胞を紫外線照射法またはヒドロキシ尿素(HU)で処理することによっても、限定された複製は可能である。
【0020】
組み換えAAV(rAAV)遺伝子送達ベクターも、プラスまたはマイナスの一本鎖としてパッケージされ、相補鎖の合成は細胞複製因子に依存しなくてはならない。この段階は細胞DNA修復合成経路により自発的に実施されると最初考えられていたが、この見解は、現在は単純すぎると考えられている。培養細胞におけるrAAVベクターを用いる初期研究により、細胞をアデノウィルスと同時感染させると、マーカー遺伝子発現を評点する能力が、劇的に増強されることが明らかにされた。この効果は、AAVウィルス遺伝子または既知のAAVシス作用転写調節配列が存在しなくても、観察された。増強効果は、Ad E4またはf6遺伝子の発現により達成されうることを、引き続き2つのグループが証明した。同様の増強作用が、細胞を紫外線照射処理またはその他の細胞ストレスで処理することにより観察された。更に、これらの処理の投与量は、増強レベルと相関しており、これは、一本鎖ビリオンDNA(vDNA)ゲノムの二本鎖への転換とも相関していた。同様のrAAVベクターの誘導がAd、紫外線、電離放射線線またはトポイソメラーゼ阻害剤で処理した後、in vivoでも観察された。しかし、この効果は組織によりかなり差があった。より重要な事に、in vivoでAAVベクターは、二本鎖合成による特徴である至適水準の導入遺伝子の発現が観察できるまでに1週間から2週間を要することが明らかにされている。例えば、ヒト遺伝子治療の発達(T.Friedman編、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1999)のSamulski et al.,「アデノ関連ウィルスベクター」を参照。
【0021】
種々の自己複製するパルボウィルスのゲノム配列とAAVの種々のセロタイプと、TRsの配列、キャプシドのサブユニット、Repタンパク質は、本技術において既知である。このような配列は、文献またはGenBankの様なパブリックデータベースで見ることができる。例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとするGenBank受託番号NC002077、NC001863、NC001862、NC 001829、NC001729、NC001701、NC001510、NC001401、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH339962、AY028226、AY028223、NC001358、NC001540を参照。また、例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとするChiorini et al.(1999)J.Virology 73:1309;Xiano et al.(1999)J.Virology 73:3994;Muramatsu et al.(1996)J.Virology 221:208;国際公開パンフレットWO00/28061、WO99/61601、WO98/11244;米国特許第6,156,303号も参照。AAV1、AAV2、AAV3のTR配列の初期の説明は、Xiano,X.,(1996)「アデノ関連ウィルス(AAV)DNAの複製と組み込み」学位論文、ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、ペンシルバニア州(引用することにより本明細書の一部をなすものとする)により提供されている。
【0022】
好ましくは、rAAVゲノムは、DNA配列または遺伝子の様な異種核酸配列を含む(すなわち「運ぶ」)。どのような異種核酸配列でも、本発明に従って送達できる。目的の核酸には、ペプチドおよびタンパク質、好ましくは治療用(例えば、医療用または獣医科用)または免疫原性(例えば、ワクチン用)ペプチドまたはタンパク質が含まれる。
【0023】
本明細書に使用されている「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」とは、遺伝子送達手段として機能し、パルボウィルス(例えば、AAV)キャプシドに包まれたvDNA(すなわちベクターゲノム)を含むパルボウィルス(例えば、AAV)粒子を意味する。あるいは、状況によっては、「ベクター」という言葉は、ベクターゲノム/vDNAを意味するために使用できる。
【0024】
「異種ヌクレオチド配列」とは、典型的にはウィルスの中に本来存在しない配列である。あるいは、異種ヌクレオチド配列とは、(例えば、そのウィルスにおいて本来結合することのないプロモータと結合させることにより)非自然環境に置かれたウィルス配列を意味する場合もある。
【0025】
本明細書に使用されている「組み換えパルボウィルスベクターゲノム」とは、異種(例えば外来)ヌクレオチド配列が挿入(例えば、遺伝子導入)されたパルボウィルスゲノム(すなわちvDNA)である。「組み換えパルボウィルス粒子」は、パルボウィルスキャプシドにパッケージされた組み換えパルボウィルスベクターゲノムを含む。
【0026】
同様に、「rAAVベクターゲノム」は、異種ヌクレオチド配列を含むAAVゲノム(すなわちvDNA)である。rAAVベクターは、ウィルスを産生するために、シスの145塩基の末端反復のみを必要とする。他のウィルス配列は全てなくてもかまわず、トランスに供給可能である(Muzyczka,(1992)Curr.Topics Microbiol.Immunol.158:97)。典型的には、rAAVベクターゲノムは、ベクターにより効率的にパッケージできる導入遺伝子のサイズを最大限にするために、最小末端反復(TR)配列のみを保持する。「rAAV粒子」は、AAVキャプシドの中にパッケージされたrAAVベクターゲノムを含む。
【0027】
本発明のパルボウィルス粒子は、ウィルスTRとウィルスキャプシドが別のパルボウィルスから得られる「ハイブリッド」粒子が可能である。好ましくは、ウィルスTRとキャプシドは異なるセロタイプのAAVである(例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとする国際公開パンフレットWO00/28004、米国仮出願第60/248,920号;Rabinowitz et al.の米国特許出願第09/438,268号、およびChao et al.(2000)Molecular Therapy 2:619に説明されている。)。同様に、国際公開パンフレットWO00/28004に説明されている様に、パルボウィルスは、「キメラ」キャプシド(例えば、異なるパルボウィルスの配列、好ましくは異なるAAVセロタイプの配列を含む)または「標的」キャプシド(例えば、定方向親和性)を有する。
【0028】
本明細書に使用されている「パルボウィルス粒子」はハイブリッド、キメラ、および標的ウィルス粒子を包含する。好ましくは、パルボウィルス粒子は、AAVキャプシドを有し、これは更に上記に説明されている様にキメラまたは標的キャプシドでもよい。
【0029】
本明細書に使用されている「ポリペプチド」という言葉は、特に記述されていない限り、ペプチドとタンパク質の両方を意味する。
【0030】
本明細書に使用されているAAVによる細胞の「形質導入」または「感染」は、AAVが細胞に侵入し、潜伏性感染および活動性感染(すなわち溶菌感染)をそれぞれ確立することを意味する。例えば、Virology,第三版(B.N.Fields et al.編、Lippincott−Raven,フィラデルフィア、ペンシルバニア州、1966、pp.2173〜2197)を参照。ヌクレオチド配列を細胞に送達する目的で、rAAVベクターが細胞内に導入される本発明の実施形態において、AAVがゲノムに組み込まれ、潜伏性感染を確立することが好ましい。
【0031】
ウィルスキャプシドは、上記に説明されている様に自己複製するパルボウィルスでもデペンドウィルスでも、全てのパルボウィルス由来のキャプシドが可能である。好ましくは、ウィルスキャプシドはAAVキャプシド(例えば、AAV1型、AAV2型、AAV3型、AAV4型、AAV5型、AAV6型キャプシド)である。一般に、AAV1キャプシド、AAV5キャプシド、AAV3キャプシドが好ましい。パルボウィルスキャプシドの選択は、例えば、標的細胞の種類、所望の発現レベル、発現される異種ヌクレオチド配列の性質、ウィルス産生に関係する問題の様な、本技術において既知の多くの検討事項に基づくことが可能である。例えば、AAV1キャプシドは、骨格筋、肝臓、中枢神経系の細胞(例えば、脳)に、AAV5は、気道および肺の細胞に、AAV3は骨髄細胞に、AAV4は脳の特定の細胞(例えば、追加可能な細胞)に有利に利用される。
【0032】
好ましい実施形態において、パルボウィルスベクターは更に、(下記に説明されている様に)標的細胞に送達するためにパッケージされる異種ヌクレオチド配列を含む。この特定の実施形態に従って、異種ヌクレオチド配列は、マトリクスの両端にあるウィルスTRの間に配置される。更なる好ましい実施形態において、パルボウィルス(例えば、AAV)cap遺伝子とパルボウィルス(例えば、AAV)rep遺伝子は、ベクターから削除される。この形態は、パルボウィルスにより運ばれる異種核酸配列のサイズを最大限にする。
【0033】
好ましくは、異種ヌクレオチド配列は、約5.0kb長より短く、(より好ましくは約4.8kb長より短く、更に好ましくは約4.4kb長より短く、更に好ましくは約4.4kb長より短い。)。例となるヌクレオチド配列は、第IX因子、エリスロポエチン、スーパーオキシドジムターゼ、グロビン、レプチン、チミジンキナーゼ、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、およびサイトカイン(例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、インターロイキン−2、インターロイキン−4、インターロイキン−12、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン等)、ペプチド成長因子およびホルモン(例えば、ソマトトロピン、インシュリン、インシュリン様成長因子1および2、血小板由来成長因子、神経向性因子3および神経向性因子4、脳由来向神経性因子、グリア成長因子、形質転換成長因子αおよび形質転換成長因子βなど)をコードする。
【0034】
本発明は、例えばワクチン接種のために、被験対象において免疫原性ペプチドまたはタンパク質を発現するためベクターの送達にも使用できる。好ましくは、ベクターは、本技術において既知の、目的の全ての免疫原をコードする核酸を含み、これらにはヒト免疫不全ウィルス、インフルエンザウィルス、gagタンパク質、腫瘍抗原、癌抗原、細菌抗原、ウィルス抗原等由来の免疫原が含まれるが、これらに限定されない。
【0035】
更に他には、異種核酸配列は、リポーターポリペプチド(例えば、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼの様な酵素)をコードできる。
【0036】
あるいは、本発明の特定の実施形態において、目的の核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム(例えば、米国特許第5,877,022号に説明されている)、スプライセオソームにより仲介されるトランス−スプライシングに影響を及ぼすRNA(Puttaraju et al.(1999)Nature Biotech.17:246;米国特許第6,013,487号;米国特許第6,083,702号参照)、遺伝子サイレンシングを仲介する妨害RNA(RNAi)(Sharp et al.(2000)Science 287:2431)または「ガイド」RNAの様なその他の非翻訳RNA(Gorman et al.(1998)Proc.Nat.Acad,Sci.USA 95:4929;Yuan et al.の米国特許第5,869,248号)等をコードできる。
【0037】
異種核酸は、転写/翻訳調節シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボゾーム侵入シグナル(IRES)、プロモーター、エンハンサー等の発現調節成分と機能的に結合できる。本技術に精通する者にとって、所望のレベルの発現と組織特異的な発現に基づいて、種々のプロモーター/エンハンサー成分を使用できることは明らかである。プロモーター/エンハンサーは、所望の発現パターンによって、構成成分であっても誘導可能であってもよい。プロモーター/エンハンサーは対象に固有のものでも外来のものでもよく、また天然配列でも合成配列でもよい。
【0038】
投与される被験対象固有のプロモーター/エンハンサーが最も好ましい。異種核酸固有の天然のプロモーター/エンハンサーも好ましい。プロモーター/エンハンサーは、目的の標的細胞で機能する様に選択される。哺乳動物のプロモーター/エンハンサーも好ましい。
【0039】
誘導性発現調節成分は、異種核酸配列の発現を調節することが望ましい応用例において好ましい。遺伝子送達のための誘導性プロモーター/エンハンサーには、好ましくは組織特異性プロモーター/エンハンサー成分で、筋肉特異性(心筋、骨格筋および/または平滑筋を含む)、神経組織特異性(脳特異性を含む)、肝臓特異性、骨髄特異性、膵臓特異性、脾臓特異性、網膜特異性、および肺特異性プロモーター/エンハンサー成分が含まれる。その他の誘導性プロモーター/エンハンサー成分には、ホルモン誘導性および金属誘導性成分が含まれる。誘導性プロモーター/エンハンサー成分の例として、tetオン/オフ成分、RU486誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、メタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0040】
標的細胞において異種核酸配列が転写され、次いで翻訳される本発明の実施形態において、挿入されるタンパク質コーディング配列の効率的な翻訳には一般に特異的な開始シグナルが必要とされる。これらの外因性の翻訳調節配列は、ATG開始コドンと隣接する配列を含むことができるが、種々の供給源が可能で、天然でも合成でもよい。
【0041】
ベクターは、パルボウィルス(例えば、AAV)のcapおよびrep遺伝子の一部または全てを含むことができる。しかし、好ましくは、capおよびrep機能の一部または全ては、キャプシドおよび/またはRepタンパク質をコードするパッケージングベクターを細胞内に導入することにより、トランスに供給される。最も好ましくは、ベクターはキャプシドまたはRepタンパク質をコードしない。あるいは、安定的に形質転換されて、capおよび/またはrep遺伝子を発現するパッケージング細胞系が使用される(例えば、Gao et al.(1998)Human Gene Therapy 9:2353;Inoue et al.(1998)J.Virol.72:7024;米国特許第5,837,484号;WO98/27207;米国特許第5,658,785号;WO96/17947を参照)。
【0042】
「治療用ポリペプチド」は、細胞または被験対象に不在または欠損しているため生じる症状を緩和または軽減できるポリペプチドである。あるいは、「治療用ポリペプチド」は、被験対象に抗ガン作用または移植片生存率の改善の様な利益を提供する。
【0043】
パルボウィルスベクターは、宿主染色体の遺伝子座と相同性を有し、遺伝子組み換えする異種ヌクレオチド配列をコードすることも可能である。この方法は、宿主細胞の遺伝子欠損を修正するために利用できる。
【0044】
本発明は、例えばワクチン接種のために、被験対象において免疫原性ポリペプチドを発現するためにも使用できる。核酸は、本発明において既知の、目的の全ての免疫原をコードでき、これらにはヒト免疫不全ウィルス、インフルエンザウィルス、gagタンパク質、腫瘍抗原、癌抗原、細菌抗原、ウィルス抗原等の免疫原が含まれるが、これらに限定されない。
【0045】
ワクチンとしてのパルボウィルスの利用は本技術分野において既知である(例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとするMiyamura et al.(1994)Proc.Nat.Acad.Sci USA 91:8507;Young et al.の米国特許第5,916,563号、Mazzara et al.の第5,905,040号,米国特許第5,882,652号、Samulski et al.の米国特許第5,882,652号を参照)。抗原は、パルボウィルスキャプシドに存在することができる。あるいは、抗原は、組み換えベクターゲノムに導入された異種核酸からも発現し得る。目的の免疫原は全て、パルボウィルスベクターにより提供される。目的の免疫原は本技術分野において既知であり、これらには、ヒト免疫不全ウィルス、インフルエンザウィルス、gagタンパク質、腫瘍抗原、癌抗原、細菌抗原、ウィルス抗原等由来の免疫原が含まれるが、これらに限定されない。
【0046】
免疫原性ポリペプチドまたは免疫原は、被験対象を疾患から守るのに適した全てのポリペプチドが可能で、疾患には、微生物、細菌、プロトゾア、寄生虫、ウィルス疾患が含まれるが、これらに限定されない。例えば、免疫原は、オルソミクソウィルス免疫原(例えば、インフルエンザウィルスヘマグルチニン(HA)表面タンパク質またはインフルエンザウィルス核単遺伝子、またはウマインフルエンザウィルス免疫原等のインフルエンザウィルス免疫原)、またはレンチウィルス免疫原(例えば、ウマ伝染性貧血ウィルス免疫原、HIVまたはSIVエンベロープGP160タンパク質、HIVまたはSIVマトリクス/キャプシドタンパク質、HIVまたはSIVgag、pol、env遺伝子産物等のサル免疫不全ウィルス(SIV)免疫原またはヒト免疫不全ウィルス(HIV)免疫原)が可能である。免疫原はまた、アレナウィルス免疫原(例えば、ラサ熱ウィルスヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子およびラサ熱エンベロープ糖タンパク質遺伝子等のラサ熱ウィルス免疫原)、ポックスウィルス免疫原(例えば、ワクシニアL1またはL8遺伝子等のワクシニア)、フラビウィルス免疫原(例えば、黄熱病ウィルス免疫原または日本脳炎ウィルス免疫原)、フィロウィルス免疫原(例えば、NPおよびGP遺伝子の様なエボラウィルス免疫原、またはマールブルク病ウィルス免疫原)、またはブンヤウィルス免疫原(例えば、RVFV、CCHF、SFSウィルス)、またはコロナウィルス免疫原(例えば、ヒトコロナウィルスエンベロープ糖タンパク質遺伝子の様な感染性ヒトコロナウィルス免疫原、またはブタ伝染性胃腸炎ウィルス免疫原、またはトリ伝染性気管支炎ウィルス免疫原の様なヒトコロナウィルス免疫原)が可能である。免疫原は更に、ポリオ免疫原、ヘルペス抗原(例えば、CMV、EBV、HSV免疫原)、流行性耳下腺炎免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、ジフテリア毒素またはその他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎(例えば、A型肝炎またはB型肝炎)免疫原、または本技術において既知のその他のあらゆるワクチン免疫原が可能である。
【0047】
あるいは、免疫原は腫瘍または癌細胞抗原の全てが可能である。好ましくは、腫瘍または癌抗原は、ガン細胞標的細胞表面で発現される。例となる癌および腫瘍細胞抗原は、S.A.Rosenberg,(1999)Immunity 10:281に説明されている。その他の癌および腫瘍抗原の例として、BRCA1遺伝子産物、BRCA2遺伝子産物、チロシナーゼ、GAGE−1/2、BAGE、RAGE、NY−ESO−1、CDK−4、β−カテニン、MUM−1、カスパーゼ−8、KIAA0205、HPVE、SART−1、PRAME、p15、メラノーマ腫瘍抗原(Kawakami et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3515);Kawakami et al.(1994)J.Exp.Med.,180:347);Kawakami et al.(1994)Cancer Res.54:3124)が含まれ、MAET−1(Coulie et al.(199)J.Exp.Med.180:35)、gp100(Wick et al.(1988)J.Cutan.Pathol.4:201)およびMAGE抗原、MAGE−1、MAGE−2およびMAGE−3(Van der Bruggen et al.(1991)Science,254:1643);CEA、TRP−1、TRP−2、P−15およびチロシナーゼ(Brichard et al.(1993)Science,254;1643)J.Exp.Med.178:489);HER−2/neu遺伝子産物(米国特許第4,968,603号)、CA 125、LK26、FB5(エンドシアリン)、TAG 72、AFP、CA19−9、NSE、CU−PAN−2、CA50、SPan−1、CA72−4、HCG、STN(シアリルTn抗原)、c−erbB−2タンパク質、PSA、L−CanAg、エストロゲンレセプター、乳脂肪グロブリン、p53腫瘍抑制タンパク質(Levine,(1993)Ann.Rev.Biochem.62:623)、ムチン抗原(国際公開パンフレットWO90/05142)、テロメラーゼ、核マトリクスタンパク質、前立腺酸性ホスファターゼ、乳頭腫ウィルス抗原、および以下の癌、メラノーマ、転移、腺癌、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、大腸癌、非ヒジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳ガン、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、その他(例えば、Rosenberg,(1996)Ann.Rev.Med.47:481−91に関係する抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【0048】
従って、本発明は、例えば、抗癌剤または癌抗原を送達する事による癌または腫瘍の治療方法における利用方法を見いだした。特定の実施形態において、本発明の方法は、例えば、原発腫瘍の外科的切除後の転移予防に、抗癌剤または癌抗原を投与するために使用される。
【0049】
本発明の方法およびマトリクスは、代謝異常(例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症)患者の治療にも有利に使用できる。このような異常には、典型的には、遺伝子送達ベクターによる治療用ポリペプチドの発現を比較的迅速に開始する必要がある。さらに別の利用法として、本発明のベクターは、移植片の生存率(例えば、スーパーオキシドジスムターゼ)を改善する、または敗血症を治療する薬剤を供給するために投与できる。
【0050】
本発明のrAAVベクターは、本明細書に説明されている外科移植用マトリクスへの送達に応用される。本発明の方法において、溶液中のrAAVベクターを外科移植用マトリクスまたは材料に接触させ、外科移植用材料またはマトリクス上で、またはその中で乾燥または脱水させる。溶液中のベクターは、マトリクスまたは材料を溶液に浸すことにより、移植マトリクスまたは材料と接触させることができる。あるいは、溶液中のベクターは、滴下方式で移植用マトリクスと接触させるか、あるいは移植用マトリクスに噴霧できるか、あるいは本技術に精通する者により容易に決定できる方法を用いて、マトリクスと接触させることができる。
【0051】
本発明の好ましい実施形態において、乾燥前に、パルボウィルス(例えば、rAAV)ベクターは安定剤を含む溶液(例えば、保存液)中にあるかおよび/またはその中に維持されている。換言すれば、好ましい実施形態において、rAAVベクターは、乾燥時に安定剤を含む溶液中にある。少なくとも1種類の安定剤を含む溶液中のrAAVベクターは、乾燥および再水和/再懸濁後により安定であることは、本発明者等により思いがけず発見された。更に、乾燥後、初めから安定剤を含む溶液から乾燥させたrAAVベクターは、安定剤を含む溶液から乾燥させなかったベクターと比較すると(例えば、PBS緩衝液だけに含まれたウィルスと比較すると)、形質導入効率がより高い。好ましい安定剤は、糖および糖アルコールで、より好ましい安定剤はソルビトール、スクロース、デキストロースで、ソルビトールが特に好ましい。好ましい実施形態において、安定剤(例えば、ソルビトール)は、少なくとも約10%の溶液で、より好ましくは少なくとも約15%、特に好ましい実施形態において、少なくとも約25%である。好ましい一実施形態において、ベクター/ウィルスを含む保存溶液は、25%のソルビトールを含む。図6は、種々の濃度の異なる安定剤を含む保存溶液を比較したグラフで、乾燥ベクターの遺伝子送達後7日目と30日目のrAAV2ベクターの安定性が表されている(対照ベクターに対するパーセンテージとして)。
【0052】
乾燥または脱水段階は、既知の技術(乾燥脱水、真空乾燥、凍結乾燥、蒸発、その他)。乾燥は、好ましくは完全(すなわち、0%の溶液または水であるか、それに近似すること)であるが、部分的であってもよい。
【0053】
外科移植用マトリクスまたは材料は、細胞、および/または組織、および/または被験対象の体の体外または体内に、挿入、移植、縫い込み可能か、あるいはそれらと接触させることができるものである。本発明の外科移植用マトリクスまたは材料は、多孔性でも非多孔性でも、軟性でも非軟性でも、織物でも非織物でも、被吸収性でも被吸収性でなくてもよい。
【0054】
好ましくは、外科移植用マトリクスは、被吸収性である。すなわち、マトリクスは被験対象の体内に経時的に吸収される。そのようなマトリクスには、縫合糸、外科移植用装置および材料、移植用材料が含まれる。材料および/またはrAAVベクターの吸収が望ましい場合には、吸収時間または吸収速度は材料の選択、ウィルス投与量、移植用材料の部位等により調節できる。本発明に使用される縫合糸は、皮膚、筋肉、腹膜または被験対象のその他の身体内または身体外表面で縫合したり、あるいは縫い込んだりすることができる。本発明において特に有用な外科移植用材料(移植片、縫合糸、その他)には、ビクリルおよびモノクリル(Johnson and Johnson社の子会社、Ethicon社から入手可能)、Nytran(登録商標)、Gortex(登録商標)(ポリテトラフルオロエチレンまたは「PTFE」)、Marlex(登録商標)、ポリプロピレン、カットグット(クローミックカットグット、体内に吸収されるまで約1〜2週間)、ポリグラクチン(吸収に3〜4週間)、PDS(吸収に約6週間)、Dacron(登録商標)が含まれるが、現在カットグットとGortex(登録商標)が好ましい。
【0055】
本発明の一実施形態において、外科移植用材料はコーティングされている。適切なコーティング剤は、本技術において既知であり、コラーゲン、グルタルアルデヒドを結合させたコラーゲンが含まれる。血管の内側(移植された異物材料に繊維形成が生じることが望ましくない部位)に使用される移植片に関して実施された別の方法は、へパリンを移植片の移植後、最初の数週間にゆっくりと遊離される移植片材料と結合させる方法である。アルブミンコーティングと、本技術において既知の特定のコーティングゲルも使用された。本発明の別の一実施形態において、へパリンが外科移植用材料のコーティングに使用され、rAAVを移植用材料に「保持」すなわち結合させるために使用される(引用することにより本明細書の一部をなすものとするSamulski et al.の米国特許出願第09/228,203号)。次いで、移植片からへパリンが吸収されるにつれて、細胞レセプターとrAAVを交換する事により、移植された材料からrAAVを遊離させることができる。
【0056】
本発明の別の実施形態において、ヘルパーウィルスの機能が、好ましくは送達部位において、選択によりパルボウィルスベクターに供給される。好ましい実施形態において、遺伝子送達の標的組織または細胞は、本発明のrAAV/外科移植用マトリクスの移植前に、ヘルパー機能により処理される(すなわち、ヘルパーウィルスの溶液により処理される)。アデノウィルスと単純疱疹ウィルスの両者がAAVのヘルパーウィルスとして機能できる。例えば、BERNARD J.FIELDS et al.,Virology,第2巻69章(第3版、Lippincott−Raven Publishers)参照。ヘルパーウィルスの例として、単純疱疹(HSV)水痘帯状疱疹、サイトメガロウィルス、エプスタインバーウィルスが含まれるが、これらに限定されない。感染多重度(MOI)と感染期間は、使用されるウィルスの種類と使用されるパッケージング細胞系によって異なる。好ましくは、ヘルパーベクターは、例えば、Xiao et al.(1988)J.Virology 72:2224によって説明されている様にプラスミドである。ベクターは上記に説明されている様に、本技術において既知の適切なあらゆる方法により、パッケージング細胞内に導入できる。
【0057】
ヘルパー機能を供給する好ましい方法は、効率的AAV産生に必要なヘルパー遺伝子の全てを持つ非感染性アデノウィルスミニプラスミドを使用する(Ferrari et al.(1997)Nature Med.3:1295; Xiao et al.(1988)J.Virology 72:2224)。アデノウィルスミニプラスミドを使用して得られるrAAVの力価は、従来の野生型アデノウィルス感染方法により得られるよりも40倍高い(Xiao et al.(1988)J.Virology 72:2224)。この方法により、アデノウィルスとの同時トランスフェクションを実施する必要がなくなる(Holscher et al.(1994),J.Virology 68:7169;Clark et al.(1995)Hum.Gene Ther.6:1329;Trempe and Yang,(1993)、第5回パルボウィルスワークショップにおいて、クリスタルリバー、フロリダ州)。
【0058】
単純疱疹ウィルスは、AAVのヘルパーウィルスとしても使用できる。AAV Repタンパク質をコードするハイブリッド単純疱疹ウィルスは、より計測し易いAAVベクター産生法を有利に促進できる。AAV−2repおよびcap遺伝子を発現するハイブリッド単純疱疹ウィルス1型(HSV−1)ベクターが説明されている(引用することにより本明細書の一部をなすものとするConway et al.(1999)Gene Therapy 6:986およびWO00/17377)。前記の観点から、本発明は、細胞、組織または被験対象の身体を、rAAVで処理された外科移植用材料と接触させる事により、遺伝子およびその他の核酸配列を、in vitro(細胞に)またはin vivo(被験対象に)で送達するのに有用である。適切な被験対象には鳥類と哺乳類の両者が含まれ、哺乳類が好ましい。本明細書に使用されている「鳥類」という言葉には、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、キジが含まれるが、これらに限定されない。本明細書に使用されている「ほ乳類」という言葉には、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ等が含まれるが、これらに限定されない。ヒト被験対象には、胎児、新生児、乳児、小児、成人が含まれる。
【0059】
生物学的有効量の組み換えウィルスベクターが、標的組織に送達されるのが好ましい。「生物学的有効量」のウィルスベクターは、標的組織において感染(すなわち形質導入)と異種核酸配列の発現を引き起こすのに十分な量である。ウィルスがin vivoで投与される場合(例えば、ウィルスが下記に説明されている被験対象に投与される場合)、「生物学的有効量」のウィルスベクターは、標的細胞において感染と異種核酸配列の発現を引き起こすのに十分な量である。
【0060】
被験対象に投与されたパルボウィルスベクターは、全ての許容細胞または組織に形質導入できる。本発明のパルボウィルスベクターによる形質導入に適した細胞には、神経細胞(末梢および中枢神経系の細胞、特に脳細胞を含む)、肺細胞、網膜細胞、上皮細胞(例えば、腸上皮および気道上皮細胞)、筋細胞、樹状細胞、膵臓細胞(島細胞を含む)、肝細胞、心筋細胞、骨細胞(例えば、骨髄幹細胞)、造血幹細胞、脾臓細胞、表皮細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞等が含まれるが、これらに限定されない。更なる代替物として、細胞は、幹細胞(例えば、神経幹細胞、肝幹細胞)でもよい。更なる代替物として、細胞は癌または腫瘍細胞でもよい。更に、細胞は上記に示すように、あらゆる種に由来できる。
【0061】
本発明のパルボウィルス粒子の投与量は、投与方法、治療される疾病または状態、個々の被験対象の状態、特定のウィルスベクター、送達される遺伝子によって異なり、ルーチンの方法により決定できる。治療効果を達成するために投与量の例は、ウィルス力価で少なくとも約105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015形質導入単位またはそれ以上で、好ましくは約108〜1013形質導入単位DNA、更に好ましくは1012形質導入単位である。
【0062】
本発明の方法は、異種核酸配列を、***細胞および/または非***細胞から成る組織を含む広範囲の組織と細胞の中に送達する手段も提供する。本発明は、例えば、in vitroでポリペプチドを生成するために、あるいは生体外遺伝子治療のために、目的のヌクレオチド配列をin vitroで細胞に送達するために利用できる。細胞、医薬製剤および本発明の方法は、例えば、免疫原性ポリペプチドまたは治療用ポリペプチドを発現するために、それを必要とする被験対象にヌクレオチド配列を送達する方法において更に有用である。従って、この方法においては、ポリペプチドは被験対象においてin vivoで産生できる、被験対象は、被験対象がポリペプチド欠乏状態にあるためか、あるいは被験対象におけるポリペプチドの産生が治療またはそれ以外の方法として、また下記に更に説明されている様に、治療効果を伝える可能性があるため、ポリペプチドの必要性があるものと思われる。
【0063】
一般に、本発明は遺伝子発現に関係するあらゆる疾患に関係する症状を治療または改善するために生物学的効果を持つあらゆる外来核酸を送達するために使用できる。疾患の例として、嚢胞性線維症(およびその他の肺疾患)、血友病A、血友病B、地中海貧血症、貧血およびその他の血液疾患、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、およびその他の神経疾患、癌、糖尿病、筋ジストロフィー(例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型)、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、糖原病およびその他の代謝障害、網膜変性症(およびその他の眼疾患)、実質性臓器の疾患(例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓)等が含まれるが、これらに限定されない。
【0064】
遺伝子導入は、疾病状態の理解と治療において実質的で潜在的な利用法がある。欠損遺伝子が知られており、クローニングされている多くの遺伝病が存在する。一般に、上記の疾患状態は、2種類に分類される。すなわち、通常は酵素の欠損状態で、一般に劣性遺伝する欠損状態と、調節または構造タンパク質が関与していると思われ、典型的には優性遺伝するアンバランス状態の2種類である。欠損状態の疾患に関しては、置換療法のために罹患組織に正常遺伝子を導入するために、またアンチセンス突然変異を用いる動物の疾病モデルを作るために遺伝子導入を利用できる。アンバランス疾患状態に関しては、モデル系において疾患状態を作製するために遺伝子導入を利用でき、次いでその疾患状態を解消するために利用できる。このように、本発明の方法により、遺伝病の治療が可能となる。本明細書に使用されている疾患状態は、疾患を引き起こし、あるいは疾患をより重度にする欠損またはアンバランスを完全または部分的に緩和することにより、治療される。突然変異を引き起こす、あるいは欠損を修正するための核酸配列の部位特異的組み換えも可能である。
【0065】
本発明は、アンチセンス核酸をin vivoで細胞に供給するためにも使用できる。標的細胞におけるアンチセンス核酸の発現により、細胞により特定のタンパク質の発現が減少する。従って、アンチセンス核酸を、それを必要とする被験対象において特定のタンパク質の発現を減少させるために投与することができる。
【0066】
パッケージングと輸送のためにrAAVを乾燥し、次いで溶解後、あるいは移植用物理的天然マトリクスに付着させて、送達後に投与する応用方法は、広範囲の治療状況で応用できる。明確な応用例は、ワクチン開発において認められる。免疫応答(および宿主の先天性免疫、例えば、肝炎または免疫不全ウィルスに対する先天性免疫)を誘発し、維持する様にデザインされたrAAVベクターは、厳格な保存方法を必要とせずに、発展途上国に輸送され、更に沿革地域にも送られる。
【0067】
本発明の更なる実施形態と説明を下記に示す。
【0068】
rAAVを含浸させたGortex(登録商標)またはその他の移植片材料は、経時的に大きな筋肉塊に送達するために、筋肉またはその他の組織に直接重ねることができる。この実施形態が特に有効なその他の治療方法には、大きな面積の組織を浸透させることにより肺機能に劇的な違いをもたらす横隔膜の様な大きな薄い筋肉に形質導入すること、および腫瘍を外科的に摘出後、術野の残りの腫瘍を死滅させるために(例えば、アンジオスタチン/エンドスタチンと共に)抗癌遺伝子を局所的に送達するための使用が含まれる。
【0069】
更に、大きな筋肉塊は、rAAVを含浸させた人工血管(またはウィルスベクターの血管内ボーラス投与を組み合わせたrAAV人工血管)を含む方法により人工血管から形質導入できる。この実施形態は、例えば、大腿四筋頭に供給する動脈の同定が関与する。rAAVを含浸させた移植片をこの動脈に移植すると、筋注投与された筋肉部分、または人工血管が移植された表面に単に送達されるのではなく、筋肉の最終毛細血管床全体に持続的に遊離される。これは、門脈への直接注入と類似しているが、必ずしも投与量全てが一度に投与されるとは限らない。実際のところ、個々の四肢からの静脈流出は、一時的に(30分以上)閉鎖することも可能であり、これによって大量のウィルスを送達して、当面の結合部を飽和し、その後人工血管が吸収あるいは癒合されると、人工血管から長期的にウィルスが遊離される。
【0070】
本発明の方法は、血管平滑筋(すなわち、冠動脈への形質導入/再狭窄に対するガンシクロビル治療)におけるAAVの形質導入にも有用と思われる。
【0071】
本発明は、注入法では分散が困難と思われる広い表面に遺伝子を送達するために、永久的または被吸収性マトリクスにフィルムとして既知量のrAAVウィルスを適用または投与する方法において特に有用である。一例として、ヒトの横隔膜筋は数層の細胞層の厚さであるが、その全表面積は平方フィートで測定される。横隔膜筋の機能不全は、呼吸不全を引き起こし、これは最終的には筋ジストロフィーによる死に寄与する。AAV遺伝子治療ベクター(例えば、ミニ−ジストロフィン遺伝子を持つPTFE)の迅速な放出が可能な移植用マトリクス材料は、横隔膜筋に適用でき、遺伝子治療ベクターを複数回注入することにより達成することは困難と思われる方法において大きな表面積全体に形質導入を均質に行うことができると思われる。
【0072】
同様に、rAAVのシートまたはフィルムを平らな、あるいは複雑な解剖学的表面に直接、均質に投与することが可能である。例えば、本発明は、局所的な腫瘍の再発を予防するために、抗癌剤を含むか、あるいはコードするrAAVベクターを、完全または部分的に切除した腫瘍床に直接送達するために利用できるであろう。多くの種類の充実性腫瘍が、最初は原発腫瘍部位で増殖するが、原発腫瘍の切除後、微小転移病変が遠隔部位に出現することが証明されている。局所または遠隔転移の再発に影響を与える血管形成阻害物質(例えば、エンドスタチン(好ましい実施形態)、アンジオスタチン)、直接的な腫瘍抗代謝産物、インターロイキン、およびその他の免疫仲介物質の遺伝子を含む多くの抗腫瘍遺伝子のどれでもこの様に送達できる。
【0073】
別の実施形態において、本発明は骨または軟部組織の再建を命令するために、被吸収性または永久的組織の「足場」に載せた成長因子の送達を促進する。例えば、骨形態形成タンパク質(BMP)または骨形態形成タンパク質を仲介する上流因子の遺伝子をコードするrAAVベクターは、生分解性ポリマーの足場の上に安定的に固定できるであろう。AAVウィルスと医用生体材料の組み合わせは、骨または靱帯の修復を促進するために骨移植片代用品として、骨誘導性機序または軟骨形成機序として臨床場面で利用できる。骨新形成の構造支持物として現在使用されている合成材料には、ポリ乳酸ホモポリマー(PLA)、ポリ乳酸−ポリエチレングリコールブロックコポリマー(PLA−PEG)およびポリグリコリド(PGA)が含まれる。安定して固定された乾燥rAAVを介して送達できる候補遺伝子には、成長因子(形質転換成長因子−β1)、骨形態形成タンパク質(BMP)が含まれる。新しい骨または靱帯が、rAAVにより送達される成長因子に反応し、足場に浸潤するにつれ、足場は分解し、新しい骨または靱帯は、ウィルス遺伝子治療により刺激され、欠損に成長して入り込み、欠損を修復することができる。
【0074】
同様の方法を用いて、神経再生を惹起し、命令するために使用できるであろう。rAAVは、中枢神経系(例えば、グリア細胞系由来の神経栄養性因子GDNF)の中に成長因子を送達できることが既に証明されている。この成長因子とその他の成長因子NGFsは、不活性な移植用材料の上で乾燥させたrAAV/NGFsによる神経細胞再生を誘導するために、例えば脊髄再生のために局在させることが可能であろう。
【0075】
本発明の更なる別の実施形態において、表面にrAAV遺伝子治療ベクターを付着させた、あるいはrAAV遺伝子治療ベクターを含浸させた人工血管材料(例えば、GoreTex(登録商標))が開発されている。多くの人工血管の問題点は、内皮細胞の内部への成長(血管形成成長因子により部分的に命令されるプロセス(好ましい実施形態))とアテローム血栓症のプロセスにより、それらが再閉塞する傾向がある点である。血管内皮成長因子、局所接着キナーゼ(FAK)、または種々のその他の因子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現を命令するrAAVにより、特に遺伝子送達が長時間にわたりゆっくりと起こる様に調節できる場合には、人工血管設置後の長期的血管開存性が可能となる。一実施形態は、シャントの開存性の喪失を市街するrAAVベクターと腎不全のエリスロポエチン欠乏性貧血を強制する更なるrAAVにより調節されるエリスロポエチンベクターを用いて調製された人工透析用動静脈シャントのための人工血管材料である。
【0076】
あるいは、乾燥治療用rAAVは、冠動脈(心臓)または末梢血管の開存性を回復後、時間をかけてよりゆっくりと遊離し、血管形成成長因子を送達し、心筋症または末梢筋障害を逆転するために調製できる。血管への遺伝子送達は、血管を一時的に完全に閉塞し、遺伝子治療ベクターを注入しおて試みられてきた。ベクターとの接触時間は、血管を遮断できる時間により必然的に制限される。ウィルスの遊離に特徴を持たせた人工血管材料に付着させた乾燥rAAVそのものを送達できれば、この制限は有利に回避される。
【0077】
10〜25%の安定剤(例えば、ソルビトール)溶液から乾燥させたrAAVの安定性が証明されている事により、いくつかの実施形態が示唆されており、形質導入能を保持したrAAVの、緩和された、糖を主成分とする固体練剤または「ボール」が作製された。例えば、局所治療の送達が命令されるrAAVのビーズを作製できる。特定の癌治療法に関して、本発明によりソルビトールビーズからのrAAV遊離が促進され、直接注入を用いた場合よりも、rAAVベクターにより長時間曝露することができる。より長時間の曝露により、抗癌または自殺遺伝子産物に影響を受けやすい細胞周期を巡回しているより大きな割合の細胞、すなわちより多くの細胞との接触が生じる。
【0078】
子宮頚癌患者は、後充填アプリケーターを膣腔および子宮腔に配置し、アプリケーターが癌に近接して配置されていることをレントゲン検査で確認する近接照射療法により通常治療される。カプセルに包まれた放射性線源が後にアプリケーターの中に挿入され、物質(通常137Csまたは226Ra)が数日間にわたり崩壊するにつれ、解剖学的に限局された放射線照射療法が行われる。放射線の代わりに、非常に限局された乾燥rAAV「ボール」または「ビーズ」を、病変に解剖学的に近接して配置し、抗癌剤を送達する、および/またはrAAV溶液を単に注入することによっては実現不可能な「待機中の」腫瘍死滅を達成できる可能性がある。このような方法は、(現在、近接照射療法により治療されている)一連の癌に関して実現可能であり、それには肛門/直腸癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、膣癌、胸膜中皮腫、鼻咽頭癌、前立腺癌が含まれる。
【0079】
乾燥状態のウィルスの安定性が証明されていることにより、特に三次医療病院外の環境において、分子薬剤の配達が促進される。セロタイプ1、2、3、4、5のrAAVを安定化するためにこの応用法に関して開発された方法は、いわゆるキメラまたはハイブリッドキャプシド構造rAAVベクターにも応用できる(引用することにより本明細書の一部をなすものとするRabinowitz et al.の米国特許出願第09/438,268号を参照。)
【0080】
現在、遺伝子治療ベクターの溶液は細心の保存条件を要する(一般に、−20℃または−80℃の凍結状態で維持する必要がある)。rAAVベクターが室温乾燥により効率的な形質導入能を維持できることが証明された事により、発展途上国を含む地理的または技術的遠隔地域への分子薬剤の配達が実現可能となる。例えば、似通った応用例は、今世紀初期における発展途上国に配達されるワクチンの生存能力を維持するためのシステムの開発である。このシステムは、電気があてにならない国々においては、灯油または太陽エネルギーに依存していた冷蔵の「低温流通方式(cold chain)」を確立することに依存している。乾燥状態で室温保存後のrAAVの効率が確立され、遊離の調節を操作出来ることは、本発明の方法が、rAAVワクチンの広範な開発にとって重要であることを示唆している。免疫応答(および宿主の先天性免疫、例えば、肝炎またはヒト免疫不全ウィルスに対する先天性免疫)を惹起し、維持する様にデザインされたrAAVベクターは、厳格な保存方法を必要とせずに、発展途上国に輸送され、更に遠隔地域にまで配達できるものと考えられる。
【0081】
一般に、遺伝子治療は、対症療法の治療法が利用可能な疾患状態の矯正に有望であるが、世界人口の大多数にとって高価過ぎる。例えば、米国血友病患者の凝固IXまたはVII因子による平均治療費は、1年にあたり50,000から100,000米国ドルである。低開発国においては、治療製剤の冷蔵が必要なため、この費用では殆どの血友病患者のどの様な治療も無理である。最近のrAAVの前臨床試験および臨床試験により、rAAV遺伝子治療による血友病の長期矯正が達成されることが示唆されている。本発明により説明されている様にrAAVを調製し、輸送できることにより、発展途上国における従来の治療法の利用制限が、乾燥された移植可能なrAAVの安定性により克服可能な可能性が示唆されている。
【0082】
ワクチン開発または(血友病の矯正における)治療用タンパク質の宿主分泌のための応用は、一般に全身効果をもたらすが、本発明の一利点は遺伝子を局所的に(すなわち全身ではなく、特定の組織、臓器、部位等に限局して)送達できる点である。例えば、局所的に再発することが知られている種類の癌の切除後、不活性な網細工に載せた抗癌作用を持つrAAV(すなわち、抗癌化合物をコードする核酸を含むrAAVベクター)を、局所再発を予防するために腫瘍床の部分に、手術および化学療法の補助療法として適用することができるであろう。腫瘍床に治療が限局され、抗癌遺伝子が局所的に発現される可能性があるため、(全身効果を及ぼす)全身投与または局所投与後迅速に拡散する化学療法よりも特異的と思われる。血中タンパク質ではなく、特定の組織細胞種におけるタンパク質欠乏により引き起こされる疾患は、ウィルスベクターを含浸させた移植マトリクスを用いて、標的を定めることができるであろう。例えば、横隔膜筋に直接貼付されたマトリクス上のジストロフィン遺伝子の送達により、肺機能が改善され、筋ジストロフィーの死亡率が低下する可能性がある。
【0083】
以下の例は、本発明を説明するために提供されており、本発明を限定することを意図するものではない。
【0084】
[例1]
トリプルトランスフェクションプロトコールを用いて作製され、緑色蛍光タンパク質(GFP)の遺伝子を発現する組み換えAAV2を、3.0ビクリル縫合糸(Ethicon社製、サマヴィル、ニュージャージー州)、または正に荷電されたナイロン膜(GeneScreen Plus,NEN Life Science,ボストン、マサチューセッツ州)の円に適用し、室温真空で風乾した。HeLa細胞を単層組織培養において約80〜90%の集密度に成長させ、AAV/GFP縫合糸またはAAV/GFPナイロンを重ね、ウィルス含浸材料を除去するまで、30分間まで感染させた。一晩培養後、Leita DM IRB蛍光顕微鏡(ライカ社、ヘールブルグ、スイス)を用いる蛍光細胞の直接可視化により、細胞のGFPによる形質導入を検査した。
【0085】
続いて、3.0ビクリル縫合糸(Ethicon社製、サマヴィル、ニュージャージー州)をオートクレーブで処理したビーカーのへりに掛けて、適用されたrAAVの正確な力価が判るように、縫合糸にウィルスを滴下して適用することにより、rAAV/縫合糸(3−0または4−0被覆ポリグラクチン編み糸または4−0クローミック腸線)を、陰圧組織培養フード内で、無菌条件で作製した。次に適用量の判明している縫合糸の長さを切り取り、数日から数ヶ月までの種々の期間、室温において、乾燥無菌状態で保存した。連続した時点で、遺伝子lacZをコードするrAAV/縫合糸の長さを、以前にアデノウィルス2型と共に1時間培養された組織培養の293細胞に載せた。縫合糸/rAAVlacZによる1時間の感染後、縫合糸を除去した。翌日、特異的な染色条件において細胞を青く変色させるマーカー遺伝子、lacZの形質導入と発現を検討するために細胞を染色した。説明された様に作製され、室温で保存された縫合糸は、作製後最初の1週間にわたり明らかな形質導入効率の低下を認めず、少なくとも3ヶ月間感染性を保持した。
【0086】
[例2]
例1に概説された実験と並行して、Nytran(登録商標)(正に荷電されたニトロセルロース膜)がウィルスのプラットフォームとして適切かどうかを検討した。同じ大きさの円形のNytran(登録商標)を作製し、オートクレーブで滅菌した。総容量が10mlの、種々の用量のウィルス(106、5×105、105、5×104、104、5×103形質導入単位)を膜に加え、加熱せずに真空で乾燥した。Nytran(登録商標)ディスクの裏に置いた紙は、10μlで濡れて見えた。Nytran(登録商標)ディスクと裏紙を、前にAdで感染させた(マトリクス/rAAVの4時間前)ほぼ集密状態の293細胞の上に逆さに置いた。培養皿上のディスクの位置を、培養皿の下面に印を付け、感染1時間後にディスクを取り出した。翌日、細胞の培養皿をlacZに関して染色し、マトリクス/rAAVを置いたすぐ下の細胞に青色染色が主に観察された。
【0087】
[例3]
上記実験のそれぞれを、マーカー緑色蛍光タンパク質(GFP)の遺伝子を有するrAAV/縫合糸またはrAAV/マトリクスを用いて繰り返し、HeLa細胞で実施した。ウィルス含浸材料を重ねられた細胞に観察されるマーカー緑色蛍光タンパク質により、相対的結果が得られた。
【0088】
[例4]
rAAV/GFP/縫合糸技術のin vivo応用の最初の試みがマウス筋肉において実施されたが、バックグラウンド蛍光を上回るGFPを介する蛍光の検出を不可能にするマウス筋肉の自己蛍光により制限された。生理学的に重要な遺伝子を用いる本発明の方法の有用性を証明するために、エリスロポエチンのマウス遺伝子を保持する組み換えAAV(rAAV/mEpo)が作製された。エリスロポエチンは通常腎臓により分泌され、ヘマトクリット(赤血球により占められる血液容積のパーセンテージ)増加に反映される骨髄に赤血球の産生を増大させる様に命令する。rAAV/mEpoは、ヘルパーアデノウィルスタンパク質によるrAAV調製品の汚染を最小限にとどめるトリプルプラスミドトランスフェクションプロトコールを用いて産生された。ウィルスは、イオジキシノル(iodixinol)勾配で遠心分離により、また硫酸へパリンカラムでFPLCカラム精製により更に精製された。放射性ドットブロット法によるrAAVベクターゲノムの力価を測定後、ウィルスを滅菌したリン酸緩衝食塩水(PBS)に対して透析し、8×1011ベクターゲノム/ml(vg/ml)の濃度に希釈した。上記に説明されている技術(整数倍希釈された既知容量のウィルスを滴下により付着させた縫合糸を懸垂)を用いて調製された別々の縫合糸に以下が投与された。
1本のモノフィラメントポリグラクチン(Monocryl(登録商標)ブランドEthicon縫合糸)に2.4×1010vg
1本のMonocril縫合糸に7.2×1010vg
1本のMonocril縫合糸に9.6×1011vg
1本のMonocril縫合糸に1.9×1011vg
1本の5−0クローミックカットグット縫合糸と1本のMonocryl縫合糸に5×1011vgを分けて。
【0089】
各縫合糸は、ウィルスが配置された縫合糸の長さを線引きするために印がつけられた。縫合糸は低温で真空状態に置かれ、全てのウィルスが24時間以内に吸収された。
【0090】
[例5]
4週令のBalbCマウス5匹から血液試料を採血し、ベースラインの正常ヘマトクリット値を測定した。4匹のマウス全てのヘマトクリット値は、ベースラインで43から46%であった。各マウスにアベルチンを腹腔内投与して麻酔をかけ、切開を行い、大腿四頭筋を露出した。マーカー部分が筋肉床内部に位置するまで縫合糸が筋肉を貫通する様に引っ張り、適所で結んた。切開の両端を再度向かい合わせて、1から2個のスキンステープルを用いて皮膚を閉鎖した。眼窩後方から血液試料を10日おきに採血した。縫合糸を配置後、20日までに、最高用量を投与されたマウスは、より低用量を投与されたマウスよりも有意に高いヘマトクリット値を示した。より低用量を投与された全マウスは、非注入対照マウスと同等のヘマトクリット値を示した。この上昇は注入後105日間持続し、その時点で最高用量を投与されたマウスは65〜74%の範囲のヘマトクリット値を維持し、それ以外のマウスはそれぞれ44〜50%の範囲であった(すなわち、ベースラインまたは非注入対照群と有意差はなかった)。マウスを屠殺し、赤血球増加マウスの骨髄を調製し、血液病理学者により分析された。それによって生理学的に説明できないほど高い赤血球新生が確認され、これはエリスロポエチンの発現増加と一致していた。これらの結果を図2に要約する。
【0091】
[例6]
上記の結果を支持するために、2つの更なる実験を実施した。一つの実験において、標準的に作製された(透析された溶液を−20℃の標準条件で保存し、使用前に乾燥しない)rAAV/mEpoウィルスを広範囲の投与量でBalbCマウスに筋肉内注射した。投与量は、ヘマトクリットを上昇させる閾値投与量と思われた。8×109vg、8×1010vgの投与量を投与されたマウスは、滅菌生理食塩水またはrAAV/lacZウィルスを注射されたマウスと同等の結果を示し、ヘマトクリットはベースラインを超えなかった。8×1011vgを投与されたマウスは、ヘマトクリットが80%以上の顕著な上昇を示した。従って、最高用量のスーパー縫合糸マウスの反応は、筋肉内注射マウスの結果と一致していた。これらの結果を図3に示す。
【0092】
更に、乾燥rAAV/lacZを含浸させた編んだモノフィラメント縫合糸を用いて筋肉内に縫合糸を配置されたマウスは実際に縫合糸が配置された周囲により顕著な非特異的瘢痕反応を示した様に見え、これは発現に負の影響を及ぼすものと思われた。
【0093】
[例7]
Gortex(登録商標)(PTFE)移植片材料を、乾燥AAVを送達するためのプラットフォームとして利用した。GFP遺伝子とヒト第IX因子遺伝子は、AAV/Gortexを用いて組織培養中の細胞にうまく送達された。
【0094】
HeLa細胞を、6ウェルプレートの1×105細胞/ウェルで平板培養した。細胞に使用した培地は全て、ウシ第IX因子を含むビタミンK依存性凝固因子の全てを除去するために硫酸バリウムを用いて調製された子ウシ血清を用いて調製された。0.5×0.5cmまたは1.0×1.0cmの四角形にカットされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)でコーティングされた人工血管材料(Gore−Tex(登録商標),GORE、フラグスタッフ、アリゾナ州)をオートクレーブ処理した。
【0095】
トリプルトランスフェクションプロトコールにより調製され、インヂキシノール遠心分離とカラムクロマトグラフィーにより精製されたAAV2を、ヒト第IX因子の遺伝子発現を惹起するCMVプロモーターと共に使用した。1×104ウィルスベクターゲノム(vg)/細胞または1×106vg/細胞を送達する用量のウィルスを、PTFEマトリクスに適用した。PTFE/AAVを細胞の上に1時間重ね、除去し、細胞を一晩培養した。感染の翌日に、培地を1.5mlの第IX因子を含まない培地と交換した。24時間後、培地を除去し、部分標本を取り、培地に分泌された第IX因子を、前述の様に(Monahan,et al.,Gene Therapy 5,40〜49(1998))、ヒト第IX因子に特異的な抗体を用いてサンドイッチELISA法により定量した。2つのAAV/マトリクス標的細胞面積(0.25cm2と1.0cm2)とウェル全体(表面積9.5cm2)に適用されたウィルスの比較を24時間あたりの発現されたヒト第IX因子のナノグラムとして図4に示す。
【0096】
これらの実験により、ウィルスがGortex(登録商標)(テフロン(登録商標))の表面から遊離される時間が非常に速いことが示唆され、更に遺伝子導入の種々のタイムコースと分布を達成する種々の応用例に適した種々の送達用プラットフォームを選択できることが示唆された。
【0097】
[例8]
前記と異なる方法を用いて得られたrAAV2/マウスエリスロポエチンcDNAウィルスの調整品を用いた:ウィルス産生には同じトリプルトランスフェクションプロトコールを用いたが、rAAVの精製はrAAVとほぼゲノム長さの鎖(いわゆる「自己相補性rAAV」)をパッケージしたrAAVビリオンのみを分離する様に実施された。主に自己相補性rAAV/mEpoビリオンを含むrAAVのプールされた分画を使用して、5.0被吸収性カットグット縫合糸を調製するか、あるいは感染用ウィルス粒子総数が同じになる様に(=5×1010vg)、溶液に含めたウィルスとして等分した。
【0098】
4〜5mmの皮膚切開から直接視認しながら、縫合糸を移植するか、あるいはウィルス溶液をBalb/cByJマウスの右大腿四頭筋に筋肉内注射した。対照マウスは溶液に含めたrAAV/LacZウィルス(上記記載の様に生産)を注射するか、mEpoウィルスと同じ方法で縫合糸に調製後投与した。縫合糸は、適所に縫い込む少なくとも48時間前に調製した。全血を眼窩後方静脈叢から0日目とその後10日おきに採血した。ヘマトクリットは、微細毛管中の血液の遠心分離により決定した。これらの結果は、移植用材料により送達されたAAVベクターにより長期的な遺伝子発現が可能であることを示している。
【0099】
[例9]
GFPを含むAAVセロタイプ1、2、3、4、5ウィルスベクターを、糖、塩および/またはタンパク質を含む種々の可能な安定化緩衝液中で乾燥させた。乾燥状態で7日後、ウィルスを再懸濁し、単層組織培養の細胞に感染させるために使用した。形質導入効率を、凍結/溶解せずに氷上の溶液中で維持したウィルスと比較した(すなわち、対照に対するパーセンテージとして比較した)。主に25%デキストロース溶液から成る緩衝液に乾燥状態で保存後のrAAVセロタイプ1、2、3、4、5の比較性能を図5に示した。
【0100】
前記は、本発明の説明であり、本発明を制限することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1Aは、本発明の基本的方法を示す図である。縫合糸の様な外科移植用マトリクスを、AAVベクター、好ましくは異種核酸を含むrAAVベクターと接触させる。次にベクターを外科移植用マトリクス上で乾燥させる。図1Bに示す様に、乾燥させたAAVベクターを含むマトリクスが、好ましくは、マトリクス材料が被験対象の体内に吸収される様に、被験対象(例えば、ヒトまたはヒト以外の動物)に移植されるか、縫い込まれる。図1Cは、エリスロポエチン(EPO)を運ぶウィルスベクターを筋肉内注射したマウスのヘマトクリットが、EPOを運ぶウィルスベクターを含む縫合糸で処理されたマウスのヘマトクリットよりも実験時間を通して低いことを示すグラフである。
【図2】
下記例5に説明されている本発明の実施形態のグラフである。この図において、「SS」は「スーパー縫合糸」を意味し、EPO遺伝子を運ぶrAAVベクターで処理された縫合糸である。y軸は、被験対象(ここではマウス)のヘマトクリットを示す。x軸は、rAAV投与後の日数を示す。凡例は、どのデータポイントがEPO遺伝子を運ぶrAAVベクターの筋肉内注射のものか、どれがEPO遺伝子を運ぶrAAVベクターを付着させた縫合糸のものか、また各方法により投与されたベクターの投与量を詳細に説明している。図1Cに示すように、EPOを運ぶrAAVベクターを筋肉内注射されたマウスのヘマトクリットは、EPOを運ぶrAAVベクターを含む縫合糸で処理されたマウスよりも実験時間を通して低い。
【図3】
筋肉内投与とrAAV/mEPO/縫合糸により投与された場合のrAAV/mEpoの形質導入を比較するグラフである。
【図4】
AAV/Gortex(登録商標)による組織培養における細胞へのGFP遺伝子とヒト第IX因子遺伝子の送達の成功を示すグラフである。
【図5】
最初に、25%のデキストロース溶液の緩衝液に入れてから、乾燥状態で保存後、rAAVセロタイプ1、2、3、4、5の性能を比較した試料プロットのグラフである。
【図6】
種々の濃度の異なる安定剤を含む保存液のrAAVタイプ2の安定性に及ぼす影響を比較したグラフである。
Claims (54)
- 外科移植用マトリクス上でベクターを乾燥させるステップと、該マトリクスを細胞と接触させるステップとを含むウィルスベクターの細胞への送達方法。
- 前記ウィルスベクターが組み換えパルボウィルスベクターである請求項1記載の方法。
- 前記ウィルスベクターが組み換えAAV(rAAV)ベクターである請求項1記載の方法。
- 前記rAAVベクターが組み換えAAV2型ベクターである請求項3記載の方法。
- 前記rAAVベクターが組み換えAAV3型ベクターである請求項3記載の方法。
- 前記rAAVベクターが組み換えAAV4型ベクターである請求項3記載の方法。
- 前記rAAVベクターが組み換えAAV5型ベクターである請求項3記載の方法。
- 前記rAAVベクターが組み換えAAV1型ベクターである請求項3記載の方法。
- 前記ウィルスベクターが異種核酸配列を含む請求項1記載の方法。
- 前記ウィルスベクターがin vitroで送達される請求項1記載の方法。
- 前記ウィルスベクターがin vivoで被験対象に送達される請求項1記載の方法。
- 前記被験対象がヒト患者である請求項11記載の方法。
- 前記外科移植用材料が縫合糸である請求項1記載の方法。
- 前記外科移植用材料がカットグットである請求項1記載の方法。
- 前記外科移植用材料がPTFEである請求項1記載の方法。
- 前記乾燥するステップが前記ウィルスベクターの完全な乾燥を含む請求項1記載の方法。
- 前記ベクターが乾燥前に溶液に保存されている請求項1記載の方法。
- 前記溶液がソルビトールを含む請求項17記載の方法。
- 前記溶液が少なくとも25%のソルビトールを含む請求項17記載の方法。
- 前記ベクターがハイブリッドパルボウィルスベクターである請求項1記載の方法。
- 前記ベクターがキメラパルボウィルスベクターである請求項1記載の方法。
- 前記異種核酸が第IX因子をコードする核酸を含む請求項9記載の方法。
- 外科移植用材料上でウィルスベクターを乾燥させるステップと、該材料を被験対象に移植するステップとを含む被験対象へのウィルスベクターの送達方法。
- 前記ウィルスベクターが組み換えパルボウィルスベクターである請求項23記載の方法。
- 前記ウィルスベクターが組み換えAAV(rAAV)ベクターである請求項23記載の方法。
- 前記rAAVベクターが組み換えAAV2型ベクターである請求項25記載の方法。
- 前記rAAVベクターが組み換えAAV3型ベクターである請求項25記載の方法。
- 前記rAAVベクターが組み換えAAV4型ベクターである請求項25記載の方法。
- 前記rAAVベクターが組み換えAAV5型ベクターである請求項25記載の方法。
- 前記rAAVベクターが組み換えAAV1型ベクターである請求項25記載の方法。
- 前記ウィルスベクターが異種核酸配列を含む請求項23記載の方法。
- 前記被験対象がヒト患者である請求項23記載の方法。
- 前記外科移植用材料が縫合糸である請求項23記載の方法。
- 前記外科移植用材料がカットグットである請求項23記載の方法。
- 前記外科移植用材料がPTFEである請求項23記載の方法。
- 前記乾燥するステップが前記ウィルスベクターの完全な乾燥を含む請求項23記載の方法。
- 前記ベクターが乾燥前に溶液に保存されている請求項23記載の方法。
- 前記溶液がソルビトールを含む請求項37記載の方法。
- 前記溶液が少なくとも25%のソルビトールを含む請求項37記載の方法。
- 前記ベクターがハイブリッドパルボウィルスベクターである請求項23記載の方法。
- 前記ベクターがキメラパルボウィルスベクターである請求項23記載の方法。
- 前記異種核酸が第IX因子をコードする核酸を含む請求項31記載の方法。
- 組み換えアデノ関連ウィルス(rAAV)が外科移植用マトリクス上で乾燥されていることを特徴とする外科移植用マトリクス。
- 前記rAAVベクターが組み換えAAV2型ベクターである請求項43記載の外科移植用マトリクス。
- 前記rAAVベクターが組み換えAAV3型ベクターである請求項43記載の外科移植用マトリクス。
- 前記rAAVベクターが組み換えAAV4型ベクターである請求項43記載の外科移植用マトリクス。
- 前記rAAVベクターが組み換えAAV5型ベクターである請求項43記載の外科移植用マトリクス。
- 前記rAAVベクターが組み換えAAV1型ベクターである請求項43記載の外科移植用マトリクス。
- 前記rAAVベクターが異種核酸配列を含む請求項43記載の外科移植用マトリクス。
- 前記異種核酸配列が第IX因子をコードする異種核酸配列である請求項49記載の外科移植用マトリクス。
- 前記外科移植用マトリクスが、縫合糸、カットグット、PTFEからなる群から選択される請求項43記載の外科移植用マトリクス。
- 前記rAAVベクターが乾燥前に溶液に保存されている請求項43記載の方法。
- 前記溶液がソルビトールを含む請求項52記載の方法。
- 前記溶液が25%のソルビトールを含む請求項52記載の方法。
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