JP2000514094A - 脳への遺伝子治療のための送達システム - Google Patents

脳への遺伝子治療のための送達システム

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Abstract

(57)【要約】 安全であり、かつ脳全体で長期間の発現を生じる遺伝子送達システムが開発された。脂質捕捉ポリカチオン縮合DNA（LPD）システムが、その転写ユニットがアデノ随伴ウイルス（「AAV」）の145bpの逆方向末端反復配列（ITR）に隣接されるアデノ随伴ウイルスベクターを使用して、脳の遺伝子送達のために開発された。このAAVプラスミドは、インビボで、非ITR含有プラスミドよりもさらに効果的である。結果は、LPD-AAVプラスミド複合体がニューロンに効率的に導入すること、および遺伝子発現が脳において10ヶ月以上にわたって持続し得ることを示す。さらに、全身性の高浸透圧状態を伴う脳室内送達法は、全体的な遺伝子送達を生じる。実施例は、この代謝性障害を有する子供におけるヒトアスパルトアシクラーゼ（「ASPA」）遺伝子の発現が、機能的な活性を有して、数カ月〜数年の期間にわたって得られ得ることを示す。

Description

【発明の詳細な説明】 脳への遺伝子治療のための送達システム 発明の背景 本発明は、一般に、遺伝子治療の分野、特に、脳への延長された送達および脳 での酵素の発現の分野である。 CNSニューロンへの遺伝子送達のための安全かつ効果的な方法が、神経性障害 の良好な遺伝子治療に必要である。多数のウイルス性および非ウイルス性システ ムの両方が、インビトロおよびインビボの両方でのニューロンへの遺伝子の移入 に使用されている。遺伝子移入に最も有効なシステムはウイルスに基づくベクタ ーであり、最も注目されるのは単純ヘルペスウイルス（HSV）（Gellerら、1995 、Duringら、1994）、アデノウイルス（Davidsonら、1993；La Gal La Salle 19 93）、アデノ随伴ウイルス（AAV）（KaplittおよびDuring、1995；Duringおよび Leone、1996）、およびレンチウイルス（Naldiniら、1996）である。 これらの各システムは、形質導入の効率、パッケージング能力、神経親和性、 および発現の安定性に基づく特異的な利点を有するが、これらの全てが、種々の 程度の炎症性応答、組換えおよび／またはヘルパーウイルス混入の可能性、なら びに複製能力に関する問題を共有する。これらの安全性の問題は、ニューロンの 遺伝子のヒトへの移入のための任意のこれらのシステムの使用を不可能にした。 あるいは、脳の遺伝子送達のための潜在的に安全なアプローチは、裸のプラスミ ドDNAおよびリポソーム-DNA複合体の使用を含む（Ulrichら、1996；GaoおよびHu ang、1995）。プラスミドDNAは、筋肉（Davisら、1993）および肝臓（門脈内投 与による、Wolf、私信）への形質導入のために有効であることが明らかである。 しかし、脳へのプラスミドDNAの直接の注射は、極めて非効率的である。リポソ ーム-DNA複合体はおそらく、裸のDNAよりも僅かにより有効であるが、ウイルス ベクターと比較すると依然として非効率的である。さらに、遺伝子移入は一般に 一過性である（RoesslerおよびDavidson、1994；KozarsdyおよびWilson、1993） 。 現在の遺伝子治療が直面している主要な制限は、形質導入効率の不足、および 本来の毒性、ならびに最も一般的に使用されるベクターの免疫原性である。合成 性超分子複合体が、臨床で使用され得る安全かつ有効な遺伝子送達ビヒクルのた めに提供され得る。脳への遺伝子移入が提起する特有の問題は、ベクターシステ ムおよび全体的な遺伝子移入のための送達方法において両方の改善を必要とする 。 脳の遺伝子移入に関する主要な制限は、有糸***後のニューロンおよびグリア の形質導入の無効性に関連するだけではなく、脳の接近不可能性にも関連する。 神経学的な遺伝子治療が直面している問題は、ほとんどの神経学的障害について 、脳全体にわたる細胞への全体的な送達および効率的な形質導入の必要性である 。ウイルスベクターは、脳の実質の全体に十分に分散されず（Doranら、1995） 、このことはおそらく、細胞膜タンパク質に対する大きさおよび親和性を反映し ている。種々のアプローチが全体的な遺伝子送達のために使用されている。これ らは、複数回の定位的な注射（Boviatsisら、1994）；伝達（convection）アプ ローチ（0ldfieldら、1994）および血液-脳-関門（bbb）（Neuweltら、1994）の 高浸透圧性浸潤を含む。これらの各方法は有意な罹患率と関連し、さらに各方法 の効率は、損傷した血液脳関門を既に有するが、正常な脳の実質へは非常に僅か な浸透を有する腫瘍への、薬物および遺伝子送達についてのbbb浸潤効率によっ て制限される。 従って、本発明の目的は、遺伝子治療（特に、脳での遺伝子治療）の改善した 送達および発現のための手段を提供することである。 発明の要旨 安全であり、かつ長期間の発現を生じる遺伝子送達システムが開発された。こ の方法は、脳全体にわたる広範な遺伝子送達をもたらす。脂質捕捉ポリカチオン 縮合DNA（LPD）システムが、その転写ユニットがアデノ随伴ウイルス（「AAV」 ）の145bpの逆方向末端反復配列（ITR）に隣接されるアデノ随伴ウイルスベクタ ーを使用して、脳の遺伝子送達のために開発された。このAAVプラスミドは、イ ンビボで、非ITR含有プラスミドよりもさらに効果的である。さらに、脳室内送 達システムが、広範な全体的な送達を得るために開発された。 結果は、LPD-AAVプラスミド複合体がニューロンを効率的に形質導入すること 、 および遺伝子発現がラットの脳において10ヶ月にわたって持続し得ることを示す 。さらに、全身性の高浸透圧状態を伴う脳室内送達法は、全体的な遺伝子送達を 生じる。実施例は、ヒトアスパルトアシクラーゼ（「ASPA」）遺伝子の発現が延 長された期間にわたって得られ得ることを示す。この代謝性障害を有する子供に おける試験は、遺伝子の発現が、機能的な活性を有して、数カ月から１年の期間 にわたって得られ得ることを示す。 発明の詳細な説明 安全であり、かつ長期間の発現を生じる遺伝子送達システムが開発された。さ らに、脳全体にわたって広範な遺伝子送達を得るための方法が開発された。 Ｉ．送達システム 脂質キャリア 脳の遺伝子送達のための脂質捕捉ポリカチオン縮合DNA（LPD）システムが開発 された。LPD粒子は小さく（約60〜80nm）、単分散性であり、そしてコロイド状 で安定である（GaoおよびHuang、1996）。これらの粒子が、形質導入効率におい て高く効率的であること（アデノウイルスベクターの効率に近い）および安全で あること（Huang、1997）がインビトロで示されている。 LPD複合体は、非ウイルス性の合成の送達システムにおいて前進的な、有意な 工程を示す： １）CD-Chol/DOPEリポソーム骨格は安全であり、そして２つの公開された臨床試 験（Kaplenら、1995；Nabelら、1993）および３つの他の進行中のプロトコルに 使用されている。 ２）ポリ-L-リジンおよびプロタミンの両方が臨床的に使用されており、そして 臨床的なヘパリンアンタゴニストとして広範に使用されるプロタミンに関しては 安全であることが明らかである。 ３）AAVプラスミドは、形質導入効率および安定性を増強することが以前に示さ れている（Viewegら、1995；Philipら、1994）。 ４）プロタミンおよびポリ-1-リジンは両方とも、さらに形質導入効率を改善し 得る核局在化シグナルを有する。 ５）プロタミンおよびポリ-1-リジンは両方とも、プラスミドDNAと効率的に複合 体化し、そしてDNAの縮合を生じる。この縮合DNAは、カチオン性リポソームとさ らに複合体化した場合、約200nmから50〜100nmのサイズの外部直径に変化する。 これらのナノ-LPD粒子は、ニューロンおよびグリアを含む有糸***後の細胞を効 率的に形質導入する。 他のキャリア（例えば、リポソーム、ポリカチオン性複合体およびポリマーキ ャリア）も用いられ得るが、好ましくはない。 AAVベクター 送達されるべき遺伝子は、アデノ随伴ウイルスベクター中に配置される。好ま しい実施態様において、転写ユニットは、アデノ随伴ウイルスの145bpの逆方向 末端反復配列（ITR）に隣接する。これらのITRは、インビトロで前立腺の細胞系 統およびリンパ球細胞系統の両方で遺伝子発現を増強および延長することが示さ れている（Vieweg Jら、1995;Philip Rら、1994）。ベクターはまた、CMVプロモ ーターを含む。このAAVプラスミドは、インビボで、非ITR含有プラスミドよりも 有効である。 他のウイルスベクターも使用され得、これにはレトロウイルスベクターおよび アデノウイルスベクターが挙げられるが、これらは、制御の問題のために好まし くない。 投与手段 本技術に好ましい適用において、ウイルスベクターは、シリンジまたはカテー テルを用いて脳に投与される。脳室内送達は、広範な全体的な送達を得るために 使用される。 取り込みは、マンニトールのような薬剤を用いて増強され、これは全身性の高 浸透圧状態を引き起こす。例えば、実質内浸透は、全身性マンニトールの使用に よって脳間質内圧を低下させることによって増強される（Rosenberg GAら、1980 ）。 II．実施例 結果は、LPD-AAVプラスミド複合体が、ニューロンを効率的に形質導入するこ と、および遺伝子発現が、ラットおよびヒトの脳において10ヶ月間にわたって持 続し得ることを示す。全身性の高浸透圧状態をともなう脳室内送達法は、全体的 な遺伝子送達をもたらす。LPD複合体はまた、長期間発現をもたらし、そして引 き続く脳室内高浸透圧性投与は全体的な遺伝子発現を導き得る。LPD複合体は、 優れた効率/毒性の比を提供する。 本実施例は、ヒトアスパルトアシクラーゼ（aspartoacyclase「ASPA」）遺伝 子の発現が、延長された期間にわたって得られ得ることを示す。ASPAにおける欠 損は、キャナヴァン病、または脳の海綿状変性を引き起こす。ヒトASPA遺伝子は 、Kaulら、Genomics 21(2)，364-370(1994)によって記載されるように、クロー ン化されている。Ashkenazi Jewにおいて優性に見出された３つの点変異は、発 現される酵素を完全に不活性させる。Kaulら、Am.J.Hum.Genet ．55(1)，34-41(1 994)。他の変異が、Jewでない患者において見出されている。Kaulら、Am.J.Hum. Genet ． 59(1),95-102(1996)。 この酵素が欠損している子供は、脳機能を急速に喪失し、２，３年齢までに植 物状態に悪化し、その後まもなく死亡する。これらの子供に対する処置は存在し ない。 実施例１：AAVベクターの構築 材料および方法 研究用に用いた組換えDNAは、３つの一般的なエレメントを含んでいた。プラ スミド骨格は、pEMBLに由来し、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびE.Coliの 複製起点を有する高コピー数E.coliベースプラスミドである。このプラスミドは 、ヒト非病原性パルボウイルスアデノ随伴ウイルス（AAV）由来の145塩基の末端 反復配列を含む（KaplittおよびDuring，1995）。これらの配列は、非コード性 であり、そしてプラスミドの形質導入効率ならびに隣接する転写ユニットの発現 の安定性の両方に重要であるヘアピン二次構造を形成する（Philipら、1994;Vie wi gら、1995）。AAV末端反復配列によってさしわたしされる第３のプラスミドの成 分は、CMVプロモーター（650塩基）、およびE.Coli lacZ遺伝子（マーカータン パク質、β-ガラクトシダーゼ、AAVlacをコードする）または全長ヒトASPA cDNA （1.4kb、Miami Children's HospitalのKaulおよびMatalon博士から得た、pAAVa spa）のいずれか、およびSV40初期ポリアデニル化シグナル（400塩基）からなる 転写ユニットである。 調節エレメント： プロモーターは、市販（Invitrogen，Inc.）のプラスミドpcDNA1から得られる 650塩基対の初期サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターである。このプロモ ーターは、全ての真核細胞型において活性な非常に強力な構成的なプロモーター である。遺伝子導入の研究におけるこのプロモーターの使用に関連して、いくつ かの可変性の発現の損失が存在し、これはメチル化を反映し得る。しかし、この プロモーターは、臨床的遺伝子導入実験において広範に使用されている。時間経 過にともなう発現の損失は、脳におけるレンチウイルスベクター（Naldiniら、1 996）および筋肉におけるAAVベクター（Xiaoら、1996）においては観察されてい ない。ポリアデニル化シグナルは、InvitrogenプラスミドpREP4に由来するXV40 ポリAであった。 DNA 構築物を誘導するために使用される工程： ブラスミドpSub201（Samulskiら、1989）をXbaIで消化し、ほぼ全体のAAVゲノ ムを除去し、末端反復配列のみを残す。CMVプロモーター-lacZ遺伝子-SV40ポリA シグナルカセットを、SpeIおよびXbaIでの消化によってプラスミドpHCL（Kaplit tら、1994）から単離し、そしてこれをXbaI消化pSub201に挿入して、pAAVlacを 作製した。第２のプラスミドを、lacZ遺伝子およびポリAシグナルを除去するた めのHindIIIおよびXbaIでのpAAVlacの消化、およびそれに続くpREP4（Invitroge n）由来のHindIII-XbaIフラグメント（ポリリンカーおよびSV40ポリAシグナルを 含む）の挿入によって作製した（pAAV-CMV-ポリA）。このプラスミドを、NheIお よびNotIで消化し、続いてXbaI-NotI消化によってプラスミドpGCMV-ASPA（Kaul ら、1993）から放出されたヒトASPA cDNAを挿入した。最終構築物の配列を、ABI Model 377シークエンサーにおける自動配列決定によって確認した。プラスミド を、University of Pittsburghの施設内で、E.Coli株DH5αを用いてアンピシリ ンの存在下で無菌状態で作製し、そして精製した。 実施例２：β-ガラクトシダーゼの動物への送達および動物での発現。 材料および方法 リポソームおよびポリカチオン リポソームを、滅菌の、適正製造規準（「GMP」）条件下で作製した。このリ ポソームは、中性脂質のDOPE（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン） と、カチオン性リポソームのDC-Chol(3b-[N-(N',N'ジメチルアミノエタン)カル バモイル]コレステロール)との混合物である。使用したポリカチオンは、ポリ-L -リジン(18,900m.w.，Sigma，St．Louis)および硫酸プロタミン(USPグレード，E li Lilly)を含んでいた。 遺伝子発現の評価 Ｘ-gal組織化学 動物を深く麻酔し、そしてPBS、続いて5mM EGTAを有する２％パラホルムアル デヒドによって経心臓的に（transcardially）灌流した。この固定化方法は、内 因性酵素による染色を完全に除去する（Kaplittら、1991;Kaplittら、1994）。 脳切片を、先に記載された（Duringら、1994;Kaplittら、1994）ように組織化学 基質Ｘ-galで染色した。 NF 、GFAP、およびB-ガラクトシダーゼ免疫細胞化学 脳切片の免疫細胞化学（ICC）分析のために、ラットを抱水クロラールで深く 麻酔し、そして１Ｍ PBS(ph 7.3)、続いて４％パラホルムアルデヒド(PF)で灌流 した。脳を取り出し、そして４％PF、続いて漸増するショ糖溶液(PBS中、10/15/ 30％)中で後固定した（３〜４時間）。切片(７〜30μｍ)を、低温保持装置(cyro stat)(Reichert-Jung)内で切断し、そしてポリリジンコートスライド上に取り付 けた。最初に、切片を、ブロッキング緩衝液（１Ｍのリン酸緩衝化生理食塩水(P BS)中、５％ヤギ血清(GS)／５％正常ウマ血清(NHS)）中でインキュベートし、続 いて室温で２〜４時間、マウスIg抗体でインキュベートした。 脳内遺伝子送達 ラットの群を、University of Auckland School of Medicineのハウジング施 設にて、制御した照明（12時間昼／光周期）、温度および湿度の下で、自由に食 物に接近できるようにして維持した。動物プロトコルは、Yale Animal Careおよ びUse CommitteeおよびUniversity of Auckland Animal Ethics Committeeによ って承認された。すべての手術を、腹腔内に投与するケタミン／キシラジン(70/ 7mg kg-1)を使用して、全身麻酔下で実施した。定位フレーム(Kopf)を、すべて の手術のために使用した： 実質内注射を、海馬（Ａ-Ｐ＝-2.9;Ｍ-Ｌ＝1.6;Ｄ-Ｖ＝2.0）、綿条（Ａ-Ｐ＝ 0.6;Ｍ-Ｌ＝2.4;Ｄ-Ｖ＝5.0）、または脳室内Ａ-Ｐ＝0.9;Ｍ-Ｌ＝1.5;Ｄ-Ｖ＝3. 2）に実施した。 以下の群の動物を研究した： １）実質内LPD(ポリ-L-リジン） ２）実質内リポフェクトアミン(lipofectamine) ３）実質内LPD（プロタミン） ４）実質内LPD（AAV ITRなしのプラスミド） ５）脳室内LPD（ポリ-L-リジン） ６）脳室内LPD（プロタミン） ７）脳室内LPD（プロタミンおよび全身性マンニトール） ８）脳室内LPD（AAVaspa;全身性マンニトールを有するポリ-L-リジン） ９）LPDの繰り返し投与 結果 リポフェクトアミンを共に有するAAV発現プラスミドの実質内送達は、組織内 へほとんど浸透せずに、針路(needletract)の周囲で限られた発現を生じた。さ らに、いくつかのポジティブな細胞が手術後１ヶ月で見られたが、発現は時間の 経過につれて減少した。比較すると、ポリ-L-リジンでの縮合およびCD-Chol/DOP Eの複合体化後の同じプラスミドの送達は、１ヶ月におよぶ発現における顕著な 増加を生じた。ポリ-L-リジンの代わりのプロタミンの使用は、１週間および１ ヶ月の両方で、さらなる発現の増強を生じた。リポフェクトアミンでの局所的な 針路発現を生じた２〜４マイクロリットルの量で、より広範な発現がLPD複合体 で得られた。さらに、注射容量を８マイクロリットルに増加した場合、ずっと広 範な発現が、複合体の優先的な広がり、ならびに白質路および血管に沿った遺伝 子発現と供に得られた。 AAV ITR含有プラスミドの使用は、ITRに隣接していない同一の発現カセットを 使用するLPD複合体と比較した場合、１週間では類似の発現を、しかし１ヶ月お よび８ヶ月ではより多くの発現を生じた。 LPD複合体の脳室内投与は、実質内に広がる室周細胞内の発現を生じた。実質 の広がりは、間質内圧力を低下させ、そして脳室からのCSF流を増加させる全身 性マンニトールの使用によって増強された。 ラットでは、LPD/AAVlac複合体を脳実質ならびに脳室内の両方に注射した。LP Dの１ml当たり300μgのDNAの濃度での２〜６マイクロリットルの複合体の投与後 、最初の週（３〜７日目）では、103細胞が、針路下、ならびに脳内の白質路お よび脳領域と細胞核群との間の面に沿った路に続くLPD拡散（LPD/プラスミド複 合体）の近傍で形質導入されることを、結果は示した。２ヶ月目および６ヶ月目 で、102〜103は、Ｘ-gal染色で容易に検出可能なままであり、このことは、この 期間にわたる発現の減少が最小であることを示す。 実施例３：ヒト細胞での機能的ASPAの発現。 インビトロ研究で、293ヒト胚腎臓細胞株を使用した。免疫細胞化学的分析ま たはイムノブロット分析に適切なASPA抗体がないので、インビトロおよびインビ ボの両方の効力を、標識遺伝子を有するLPD（β-ガラクトシダーゼを発現するE. coli lacZプラスミド）を使用して、最初に評価した。 インビトロの効力は、DNA、リポソーム、およびプラスミドの相対濃度に依存 し、そして最適濃度の下では80％の効率が得られる。２〜50マイクロリットルの 注射容量を使用したインビボ効力（300μｇ/mlのLPDのDNA濃度で）は、103〜105 細胞の形質導入を示す。 培養した細胞の結果は、293ヒト胚腎臓細胞の約５％の形質導入効力でのLPD/A SPA形質導入後の、タンパク質１mg当たり0.40±0.12mUのASPA酵素活性の平均レ ベルを示す。これは、ラット皮質内のタンパク質１mg当たり1.04±0.04mUの活性 に匹敵する。１％の酵素活性が、疾患の進行に影響を及ぼすのに十分である場合 、規定した（室周囲の）領域での約0.1％の形質導入効率を目的とする。 実施例４：ラットでの安全性および効力の研究。 実施例１のベクターをラットおよびサルに投与するために、実施例２に記載し た技術と同じ技術を使用した。 脳室内投与に続くLPD/AAVaspa構築物を使用する、10.5ヶ月までの発現が観察 された。免疫組織化学分析に適切なASPAに対する抗体がないので、導入遺伝子コ ードASPAを天然の酵素から、タンパク質レベルで区別し得ない。それゆえ、ASPA 導入遺伝子発現の後にRT-PCRを使用した。脳室内投与後10.5ヶ月目までおよぶ、 脳全体での広範な発現を得た。このことは、LPD/AAVlacの脳室内後のB-ガラクト シダーゼ発現についての発現データを支持する。間質内圧力を低下する全身性マ ンニトールと共に脳室内アプローチを使用して、脳室表面から数ミリメートルに 広がる広範な発現が観察された。 全脳細胞（標的細胞）の割合としての形質導入細胞の数は低いが、これは、高 容量（10〜20マイクロリットル）の脳室内注射の後に106細胞に到達し得る。イ ンビトロでの研究から、比較的低い形質導入効率は野生型レベルの酵素を生じ得 ること、およびタンパク質は機能的に活性であることが理解される。 神経外科的定位注射を、AAVaspaまたはAAVlacプラスミドのいずれか、DC-Chol /DOPE、およびプロタミン(LPD)複合体ならびにPBS処理コントロールを用いて、 計400匹のラットでラットの行動、摂食、または全身的健康に何の毒性も有害な 効果も有さずに実施した。これらのラット全てを、１週間に２回の基準で体重を 測定し、そして毛質（毛づくろい行動）ならびに結膜炎（おそらく、総ストレス の最も敏感な指標）ならびに摂食および飲水行動を観察した。動物研究の要旨は 、以下の通りである： この高用量群における全てのラット（レポーター遺伝子および滅菌リン酸緩衝 化生理食塩水を注射した、コントロールラットを含む）は、手術後24時間の間に 、眠気および低運動性を呈した（オープンフィールド試験および毛づくろい行動 によって測定した）。直腸温は、手術後10時間、すべての動物で２℃上昇した。 すべての動物で手術後に緩やかに減少した摂食率は、48時間後にベースラインに 戻った。 ５匹の動物のさらなるサブセットに、留置脳室カニューレを介してAAVaspa/LP Ｄ（50マイクロリットル)を注入した。これらの動物に、毎日の体重、体温、お よび行動テストを続けた。動物に、朝とタ方との両方に直腸温の計温を続けた。 行動分析は、以下を含んでいた： １）オープンフィールド行動および移動運動； ２）Banes環状プラットホームを使用する空間路決定行動； ３）新しい環境への応答； ４）硬直／緊張性昏迷試験； ５）傾斜梁試験を使用する運動協調性および登上。 有害な効果は、１ヶ月の期間にわたって見出されなかった。屠殺後に組織学的 分析を実施した。動物を安楽死させ、そして脳をパラホルムアルデヒドで灌流し た。脳は、30ミクロンの厚さの切片であった。切片をH＆Eで染色し、そして顕微 鏡評価を行った。炎症性応答／ニューロンの損傷はなかった。 H＆E染色した組織の光学顕微鏡評価は、脳に浸潤する炎症性細胞、ならびに組 織の完全な統合性を有する正常なニューロンおよびグリアの形態を、全く示さな かったが、Byrnesら(1995)による最近の研究は、アデノウイルスベクターが、炎 症を生じ、そしてMHCクラスＩ発現およびＴ細胞浸潤を含む免疫学的標識の発現 を増加させたことを示している。それゆえ、６匹のラットの群にAAVaspa/LPD複 合体を脳室内で(20μｌ)、そして６匹のラットの群に実質内で（８μｌ）注射し 、LPD複合体がＴ細胞浸潤およびMHC発現における変化を生じたかどうかを決定し た。コントロールの６匹の動物の生理食塩水(PBS)処置群を、両方の群について のコントロールとして使用した。４日目におよび１ヶ月目に動物を屠殺し、脳を 灌流し、そして固定した。40ミクロンの冠状切片を低温保持装置上で切断し、そ して 一次抗体OX-18（ラットMHCクラスＩ抗原の非多型決定基と反応する、精製した抗 体）およびOX-35（Ｔヘルパー細胞、胸腺細胞、ならびに活性化されたマクロフ アージおよびミクログリア細胞上のCD4抗原と特異的に反応する）を適用した（ 両方ともPharmaciaから入手した）。どの脳室内処置した動物でもCD4-IR細胞は 確認されず、またニューロンのMHCクラスＩ発現も全くなかった。４日目に屠殺 した、実質内注射した動物では、少数のCD4iIR細胞ならびにOX-18染色は針路の すぐ近傍に存在したが、この増加は、PBSおよびLPDを注射した動物の両方で見ら れた。１ヶ月目では、どの群の動物でも、OX-18またはOX-35のいずれでも実質内 染色はなかった。研究は、アデノウイルスベクター処置群を含まなかったが、ア デノウイルス(Byrnesら、1995)およびHSV(Woodら、1994)についてCharltonによ って提示されたデータ（ここで、ベクターはMHCI抗原の高度の広範な発現を生じ た）と比較して、かわりにLPDおよびPBSで処置した動物はこれらの標識の染色が 有意に少なく、４日目では注射位置のすぐ周りにOX-18での中程度の染色しかな く、そして１ヶ月目では炎症が完全に回復したCD4ポジティブ細胞はほとんど無 かった。さらに、脳室内注射は、実質の炎症を全く生じなかった。10ヶ月目での 持続的な発現と共に、（１〜３ヶ月にわたって著しく発現が低下するアデノウイ ルスベクターとは対照的に）このデータは、LPD複合体が、現世代のウイルスベ クターより免疫原性が有意に少ないことを示唆する。 試験のPCR分析を、10匹のLPD処置したラットおよび他のベクターで処置（ポリ -L-リジン／リポソーム複合体を有する組換えAAVおよびAAVプラスミドの、実質 内注射および脳室内注射）した15匹のカニクイザル群で実施した。外来DNAは、 生殖腺で検出されなかった。さらにPCRシグナルは、肝臓、脾臓、および腎臓を 含む他のCNSでない組織で検出されなかった。 実施例５:初期ヒト臨床試験での発現 第Ｉ期臨床プロトコルの承認が、以下の委員会から得られた：Yale Universit y School ofMedicine Human Investigation Committee;North Health（Auckland Hospital，New Zealand）Ethics Committee;University of Auckland Ethics C ommittee Biosafety Committee(Auckland Hospital);およびNew Zealand Ge ne Technology Advisory Committee。 ２人の子供（L.K．(19ヶ月齢)およびA.M．(24ヶ月齢)）を、LPD/ASPA複合体を 使用する初期の第Ｉ期試験に参加させた。 ６ヶ月での臨床報告概要 外科的手順は、72時間未満しか続かない、両方の子供における軽度の一過性の 手術後の発熱（＜40℃）以外は合併症を伴わなかった。１人の子供（A.M.）は、 推定硬膜CSF漏出の完全な消散とともに、72〜96時間にわたって存在した顔面就 下性水腫に関連したバーホール(burrhole)部位にわたって、何回かの小さな拍動 を有した。手術後のCTスキャンは完全に正常であった。両方の子供は、手術後最 初の24〜48時間は眠気があったが、３日目までにベースラインと同じくらい（ま たはそれよりも）鋭敏であった。血液学的および生化学的の両方の血液試験は、 正常範囲内のままだった。両方の子供は、手術後１週間で退院した。手術前、な らびに手術後１、２、４、および６ヶ月の評価についての知見を報告する。 手術前、L.K.を、Gesell-Provence Developmental Schedules(GPDS)、５つの 領域（粗いおよび細かい運動、順応性または問題解決、言語、ならびに社会性の 発達）にまたがる機能のプロフィールに基づいた発生年齢相当量を提供する神経 発生学的道具を使用して評価した。L.K.の発達の遅れが重篤であったことは、彼 女が発達領域にまたがる彼女の行動に無視できない変動を示し、そして基本の行 動レベルを得られなかったので、正確な年齢相当量または発達指数を予め排除し た。しかし、この警告に注意しておくと、彼女の機能の最高レベルは、12週齢相 当量より低く、そしていくつかの領域では、８週齢相当量より低かった。特にL. K.は、完全な頭の支えを必要とし、動く場合は伸長して彼女の背中を反り返らせ 、目標に到達せず、そして最小のつかみおよび非常に制限された視覚的追跡を行 った。手術後１ヶ月で、L.K.を同じ観察者によって再評価した。最も顕著な差異 は、全体的なより大きい認知(awareness)および敏捷性であった。彼女は、より 反応し、そしてより多くかつ頻繁に自発的に微笑した。彼女はまた、彼女自身で 社会的対話を開始した。顔の表情は、より明るくなり、そしてより多彩であった 。彼女は、筋肉の協調による様式で固形食物を噛み、そして飲み込むことが出来 た。彼女は、支えなしに彼女の頭を数秒間支えることが出来、そして彼女の側面 から 彼女の背中に向きを変えることが出来、そして彼女の足の上のいくらかの重みに 耐えることが出来た。L.K.はまた、言語および社会的技能に顕著な進歩を示した 。彼女は、子音の音を含む、多くの多彩な声を発しはじめた。彼女は、「私は飲 み物が欲しい」のような簡単な言い方に対して彼女の口を開けることによって応 答し、そして「もっと」を示すために開けた口を使用した。彼女の発声は、異な る要求を示すようであり、そして彼女は多くの語句を理解し、そして（頭を振る こと、微笑すること、視覚的な凝視によって）それに応答するようであった。彼 女の発生年齢相当量は、３ヶ月であるようであった。手術後６ヶ月目に、さらな る技能が達成された。K.K.は、支えなしで彼女の頭を８分間まで支えることが出 来た。彼女は、物をつかむことが出来、そして彼女の欲求および不満を表現する 際にずっと明瞭であった。 A.M.を、彼女が著しい頭部退行（head lag）を有し、そして支えなしに彼女の 頭を持ち上げることが出来ない19ヶ月齢（手術の５ヶ月前）で、GPDSを用いて評 価した。彼女は目標にたどり着くことが出来なかったが、彼女の手の中に置くと 、簡単に物を掴むことが出来た。彼女は目新しい物に興味を示し、そして音のす る方向を向くようであった。彼女は笑い、クックと喜んだが、ふさわしい音は出 さなかった。彼女の発生年齢は12〜16週齢の間であった。手術の直前の再評価で 、A.M.は、環境的剌激に対するより低い反応、より不十分な頭の制御、および著 しい全身硬直を伴うより増強された筋肉の緊張を含む多くの発育技術を欠いてい た。手術直前に相当する彼女のベースライン発生年齢は、12週齢未満であった。 手術の１ヶ月後、A.M.は、彼女の周りを取り囲むものにさらに興味を示し、そし て認知（aware）し、顔の表情がより多彩になり、そしてより視覚に頼った歩行 をし、そして話しかけると視線を合わせた。彼女は振り向き、そして彼女の頭を 前後に動かした。彼女はまたよだれをたらすことが少なく、より筋肉の協調によ る飲み込みをし、そして正常な腸運動を行った。A.M.は、顕著に硬直が減り、よ り自発的であり、そして目的を持った行動をした。彼女は抱かれると彼女の両親 の首のまわりに彼女の両腕をまわすことが出来、そしてまた、いくつかの出来事 に対して、彼女の手を互いに握り合しめることにより明らかである、中線上での いくつかの運動的行動を示した。その時期に相当する彼女の発生年齢は、約12〜 16週の 間であった。手術の２ヶ月後、A.M.は、いくつかの目立たない（minor）発達を 伴って発達状態を維持した。特に、彼女は彼女の周りの環境により大きな興味を 示し、そして認知し、より多彩な顔の表情をつくり、そしてより多くの社会的対 話をした。彼女はまた、より良くかみ、そしてより良好に飲み込んだ。しかし、 彼女の神経性状態は引き続きプラトーであり、手術後2〜6ヶ月の間、有意な変化 を示さなかった。 発達および神経の評価に加えて、２人の子供について反復性の視覚誘発電位（ VEDP）および局部脳NAAのプロトン分光を行った。L.K.は、パターンに対してベ ースラインにあり、VEP単眼試験に耐えられないので、両眼に逆の試験を行った 。P100（正常では100msで観察されるポジティブ波長）で両眼に顕著な遅延が見 られ、潜伏期は154.4msであった。さらに、P1からN2までの振幅は、0.83uV正常 ＞1.5uV）であった。この試験は、両眼の視覚的経路症状（optic pathway patho logy）を示唆した。手術の２ヶ月後での再試験では、両眼について、潜伏期85.8 Kmsおよび振幅2.39uVで、VEPは正常であった。手術の５ヶ月後では、VEPは正常 な範囲内に留まっていた。L.K.をまた、遠視および乱視の点から眼科医により判 定した。手術の前に、顕著な悪化が起こり、固視、弱視、外斜視、水平位めまい 、および閉塞眼振が減少した。再評価では、手術の２ヶ月後、L.K.は良い固視を 示し、弱視の徴候がなく、外斜視の部分的な回復を示し、そして閉塞眼振が完全 に回復した。A.M.は手術の前および後の両方で、判断し得るVEPを十分に得るこ とができなかった。 ベースラインNMRSをYaleで行ったが、システムの向上は、手術後のNMRSがフィ ラデルフィアの小児病院(CHOP)で行われることを必要とし、そしてさらなるコン トロール群の５人のキャナヴァン病の子供（未処置および６〜30ヶ月齢）もまた CHOPで研究した。 L.K.のNAAベースライン濃度を、後頭部において15.4mMで定量した。頭頂葉お よび前頭葉での濃度はまた、プロトン分光画像上の前に低い値での後方-前方勾 配にもかかわらず、コントロール値を有意に上回った。前頭葉、頭頂葉、および 後頭葉から測定した８コントロールスペクトル（８検体における）からのNAAの 平均濃度および標準偏差（S.D.）は、9.8+0.6mM（有意な領域性差異はない）で ある。手術の１ヶ月後、後頭部は14.5mMで正常値を上回って上昇したままだった が、頭頂葉および前頭葉は共に、ここで、低い正常範囲内で、それぞれNAA=9.4 および8.4mMであった。４ヶ月で、後頭葉、頭頂葉、および前頭葉のNAA濃度は、 それぞれ16.2、10.0、および9.1mMであった。それゆえ、NAAの正常レベルが頭頂 葉および前頭葉の両方の領域で維持され、後頭葉ではNAAの高レベルが維持され た。 A.M.のベースラインNAA濃度は、後頭葉において15.6mMであった。１ヶ月での 後頭部、頭頂部、および前頭部のCHOPでのNMRSは、12.8、10.0、9.6mMのNAAの濃 度を示した。４ヶ月では、レベルはそれぞれ12.7、12.6、および12.9mMであった 。 同じ磁石（magnet）およびパラメーターを用いたCHOPでスキャンされた未処置 のキャナヴァン病の子供は、それぞれ後頭葉、頭頂葉、および前頭葉について15 .7+1.5、13.9+2.0、13.6+1.８mMの平均＋S.D.値を示した。 これらのNMRS結果は、１ヶ月で、２人の子供の前頭部および頭頂部の両方にお いて正常なNAA濃度を示し、L.K.については４ヶ月でこれらの領域における正常 値の維持が見られたが、A.M.についてはこの時点でキャナヴァン病への逆戻りが 見られ、A.M.の後頭のNAA濃度の12.7mMは、他の全てのキャナヴァン病の子供（ 範囲14.7〜18.0mM）より低いままであった。 12ヶ月での臨床報告概要 L.K.についての報告 生化学 ８コントロールスペクトル（８検体における）からの前頭葉、頭頂葉、および 後頭葉から測定されるNAAの平均濃度および標準偏差（S.D.）は、9.8+0.6mM（有 意な領域性差異はない）であった。L.K.のベースラインNAAレベル（Yaleで行っ た）は、全ての脳の領域で上昇した（後方-前方勾配での後頭皮質で15.4mMであ ったが、前頭葉レベルは有意にコントロール値を上回った）。手術の１ヶ月後、 後頭部のNAAは正常を上回って14.5mMで上昇したままだったが、頭頂葉および前 頭葉は共に低い正常範囲内で、それぞれNAA=9.4および8.4mMであった。 ４ヶ月では、後頭、頭頂、および前頭のNAA濃度はそれぞれ16.2、10.0、およ び9.1mMであり、そして９ヶ月ではそれぞれ16.5、10.2、および10.4mMであった 。プロトンNMRS分光スキャンを、1997年２月末の手術の12ヶ月後に行った。報告 は、後頭葉における彼女のNAAレベルが16.9mM、頭頂葉では10.4mM、および前頭 皮質では9.8mMであったことを示す。これらの値は、９ヶ月後で得られた値と基 本的に変化がなく、そして前頭葉および頭頂葉は共に同じ年齢の子供の正常範囲 内に留まっている。 MRI 脳の連続的MRI研究を、プロトンNMRSと同じ時に行った1.5テスラの磁石を使用 して行った。増強されていないT1-重みつき（weighted）画像が、矢状面および 横断面において得られたベースライン研究（手術の３週間以内）は、皮質下およ び深部白質内で、T1シグナルの拡散した、異常な延長（prolongation）を示した 。白質において増加したT1緩和時間を伴うこれらの多平面画像は、キャナヴァン 病の乏突起膠細胞特性の海綿状変性と一致する。手術後４ヶ月で再試験を行い、 そして前の研究と比較した。再度、皮質下および深部白質内のT1シグナルの拡散 、異常な延長が見られた。この延長は、最初の研究と変化がなかった。９ヶ月で は、T1-重みつき結果は、前の研究よりも低い明白な低強度を示した。特に、皮 質下白質は、T1シグナルの異常な延長において減少を示した。手術後12ヶ月で、 ミエリン定量MRI研究を、矢状T1重みつき、軸性T1およびT2、軸性FLAIR、および 冠状T2を用いて繰り返した。試験を前の研究と比較した。今度は、明確な間隔的 髄鞘形成があることが留意された。特に、脳梁の改善された髄鞘形成（正常では ないが）、ならびに脳幹神経節および内包の後方肢が示された。この最近の時点 での髄鞘形成パターンは、４ヶ月齢の乳児において予想されるものよりも雑であ る。ベースラインおよび３ヶ月の研究における髄鞘形成は、生まれた日により近 いと予想されるパターンの、より示唆的なものであった。この評価および解釈は 、フィラデルフィアの小児病院の認定議会の神経放射線科医であるLarissa Bili anuk,M.D.博士およびRobert Zimmerman博士により行われた。MRIにおけるこれら の変化は、より発達したミエリンパターン（すなわち、再髄鞘形成および／また は乏突起膠細胞の減少した海綿状変性）を予期させる。さらに、最近のプロトン NRMSデータは、いくつかのレベルの導入遺伝子発現が、L.K.の12ヶ月齢で維持さ れる ことを示唆する。さらに、MRIデータは、新しいミエリン形成が劇的であること を示唆するが、これは、神経学的機能において観察された獲得（彼女の頭を持ち 上げることが出来る）および視覚誘発電位の正常化に関して矛盾がなく、そして おそらく予想されるべきである。さらに、異常なTl緩和時間における変化を検出 するための可視閾値に達する時間は、生化学的正常化の後の新しいミエリン形成 についての本発明者らの評価と一致する、 神経-眼の評価 手術の数カ月前では、固視、弱視、外斜視、水平位めまい、および閉塞眼振の 欠失とともに、有意な悪化が起こった。再評価時、手術の２ヶ月後、６ヶ月後、 ９ヶ月後、および再度12ヶ月後では、L.K.は良好な固視を示し、弱視の徴候はな く、外斜視の部分的回復を示し、そして閉塞眼振が完全に回復した。 視覚誘発電位 視覚誘発電位は、外科的処置の前に顕著に遅延した潜伏、および減少した振幅 を有した。手術の２ヶ月後の再試験では、VEPは正常範囲内にあった。最も最近 （1997年3月12日）の評価では、VEPならびにAEP（聴覚誘発電位）は、正常であ った。 神経発達の評価 神経発達の評価は、L.K.において持続的なさらなる回復を示した。彼女は手術 の12ヶ月後（暦年齢33ヶ月）で再評価され、そして特定の認知領域において散乱 した技術発達、言語表現、そして社会的対話における彼女の機能レベルは、正常 な18〜24ヶ月齢の子供と等価である。L.K.の言語療法士は、彼女が理解し得、英 語とスペイン語（彼女の母親の母国語はスペイン語である）で簡単な要求に対し て適切にそして選択的に応答し得ることを決定した。L.K.の神経学的状態におい て、他の非常に明らかな改善があった。彼女の頭を長時間持ち上げることに加え て、改善された視覚的認識および両手を伸ばして物を掴む運動機能により、彼女 はずっと多く対話した。 A.M. に関する報告 生化学 プロトンMR分光試験を、１ボクセル（vowel）のSTEAMを用いるMagneto Sで行 った。手術の１ヶ月後で、CHOPでの後頭部、頭頂部、前頭部のMRSは、それぞれ1 6.6mM、10.1mM、および9.9のNA濃度を示した。手術の４ヶ月後、レベルはそれぞ れ11.6mM，11.5mM、および12mMであった。手術の６ヶ月後、レベルは11.7mM、11 .7mM、および11.8mMであった。手術の９ヶ月後、レベルは12.7mM、13.8mM、およ び12.５mMであった。１ヶ月で、頭頂葉および前頭葉のNAレベルは共に正常範囲 内であった。しかし、４ヶ月までに、これらの値は上昇し、そしてそれ以来上昇 したままであった。A.M,の後頭の12.７mMのNA濃度のみが、キャナヴァン範囲よ りも低いままであった。実際、同じ磁石およびパラメーターを用いたCHOPでスキ ャンした未処置のキャナヴァン病の子供は、それぞれ後頭葉、頭頂葉、および前 頭葉について15.7+1.5、13.9＋2.0、13.6＋1.８mMの平均＋S.D.値を示した。 MRI A.M.の脳のMRIを、L.K.のMRIと同じ磁石およびパラメーターを用いて行った。 ９ヶ月MRIの報告は、皮質下および皮質下白質においてT1およびT2シグナルの拡 散した延長を示した。これは、心房、および側脳室の後角の周辺で、わずかによ り顕著である。異常なシグナルが、淡蒼球ならびに視床内で見られる。背側の中 脳および脳橋、ならびに大脳脚を含む脳幹の下行路内に、異常なシグナルがある 。ex vacuo変化に基づく様に、心房および側脳室の後角の拡張がある。手術以来 、悪化は認められなかったが、L.K.とは違って、白質シグナルにおける有意な変 化はなかった。A.M.の12ヶ月の追跡MRI報告は、感覚的な髄鞘形成を示さなかっ た。 神経学的試験 A.M.は手術の前に、硬直が増強しており、神経学的悪化の証拠を示していた。 遺伝子移入の後、彼女を１ヶ月で再評価した。A.M.では顕著な改善が見られ、そ して彼女を12〜16週齢に相当すると評価した（手術の８〜12週間前）。６ヶ月で は、A.M.の臨床状態においてはプラトーであったが、彼女は手術の前よりも高い レベルの神経機能を維持した。神経学的状態および発達状態における改善は、所 定の脳領域における脳NAの一時的な正常化と一致した。A.M.は、手術後の一時的 なCSFリークを反映すると推測されるNAに関して、L.K.よりも小さいおよび比較 的短期間の変化を有し、そしてそれゆえ、より少ないCNS遺伝子移入を有したよ うである。これはまた、L.K.で観察されるよりも少ない臨床的改善と一致する。 彼女の12ヶ月の追跡試験において、有意な変化は測定されず、彼女の臨床的状態 は、最後の９ヶ月にわたって基本的に安定である。 神経-眼（neuropthalmic)の評価 手術後12ヶ月にわたって、弱視、外斜視、または眼振の徴候はなかった。 視覚誘発電位 A.M.は、手術の前および３ヶ月後の両方で判断できるVEPを得ることに、十分 に協力出来なかった。12ヶ月で、A.M.は十分に協力し得た。この時点で、彼女の パターン逆戻りVEPは、再現性のある二分皮質電位（bifid cortical potential ）を示す。この二分応答は、異常性を示し得るが、第２のネガティブおよびポジ ティブな動揺の潜伏は正常範囲内である。二分パターンの有意性は、この年齢の 子供において解決され得ず、そしてより低い刺激のみを必要とする。 神経発達の評価 全ての機能分野において相当するA.M.の現在の発生年齢は、12〜16週齢である （８〜12週齢と比較した）。しかし、手術の６ヶ月後で安定である遺伝子治療手 法以来、彼女はいくつかの顕著な変化を示した。この変化には、彼女を取りまく ものに対する彼女の興味および認識の増加、視覚的追跡によるより多く眼を合わ せること、より多彩な顔の表情、より多くの社会的対話、そして規則正しい腸運 動、そしてよだれをたらすことが減ったより筋肉の協調による飲み込みが挙げら れる。手術の６ヶ月後での神経学的評価以来、さらなる改善は見られなかった。 要約すると、A.M.の改善はL.K.と同様に顕著ではなかったが、彼女はまた幾つか のわずかな獲得（例えば、彼女は先月ベッドから転がり落ちた）を有して彼女の 改善を維持した。これは陳腐に聞こえるが、キャナヴァン病の子供はベッドから 落ちず、彼等は実質的に不動であり、ほとんどは硬直しており、自発性の動きが 非常に少なく、そして寝返りをうつことが出来ない。A.M.において改善された運 動機能はまた、改善された応答性により一致するが、彼女の機能レベルはL.K.ほ ど高くはない。 臨床的結果の概要 手術の12ヶ月後、２人の子供は手術の前よりも高いレベルの神経学的機能にあ る。２人の子供のみでの第I期試験としてのこの研究は、臨床的効果を評価する ために設計されたものではなく、そして統計的な力を有さない。しかし重要なこ とには、第I期試験が、これらの２人の子供において安全性および許容性を実証 し、有意な逆の効果を伴わず、そして一時的な手術後の発熱のみを伴った。神経 学的状態および発達状態における改善は、所定の脳領域での脳NAの正常化と一致 する。さらに、A.M.は、手術後の一時的なCSFリ−クを反映すると推測されるNA に関して、より小さくそしてより一時的な変化を有し、そしてそれゆえ、より少 ないCNS遺伝子移入を有したようである。これはまた、L.K.で観察されるよりも 少ない臨床的改善と一致する。CSF圧力の低下は、頭蓋内圧が上昇したキャナヴ ァン病の子供において一時的な利点を生じ得るが、この試験における２人の子供 は、正常な開口CSF圧力を有した。改善の時間経過は、一時的なCSFタップと一致 せず、そして一過性のCSFリークを有する一方の子供は少ない改善を示した。要 約すると、これらの２人の子供におけるLPD複合体の脳室内送達は、安全であり 、そしてよく許容された。MRS、VEPおよび神経発達の評価は、遺伝子移入が起こ ったことを示唆する。繰り返しMRIにおける白質シグナルの分析は、片方の子供 における再髄鞘形成を強く示唆する。 実施例６：さらなるヒトの臨床試験 さらなる９人の子供を、同じ方法論（10ml、同じベクター、脳室内投与）を用 いて試験した。データは、神経学的な改善および上昇した電位の正常化により測 定した場合、安全性および効果を示す。 以下の略語を本明細書中で使用した：NGF:神経増殖因子;BDNF:神経栄養因子;G DNF:グリア細胞株;GABA:γアミノ酪酸;CNS:中枢神経系:AAV:アデノ随伴ベクター ;ITR:逆方向末端反復配列;LPD:脂質捕捉ポリカチオン縮合DNA;bbb:脳血管関門;C MV:サイトメガロウイルス;ASPA:アスパルトアシクラーゼ;GMP:グアノシン一リン 酸;DOPE:ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン;DC:Chol-3b[N-(N',N'ジ メチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール;EGTA:エチレングリコール- ビス(β-アミノエチルエーテル);ICC:免疫細胞化学性;PF:パラホルムアルデヒド ;GS:ヤギ血清;NHS:正常ウマ血清;PBS:リン酸緩衝化生理食塩水;CSF:脳脊髄 液;NF:壊死因子／核因子／神経因子／神経線維腫症;GFAP:グリア線維酸性タンパ ク質;NAA:N-アセチルアスパラギン酸;H&E:ヘモトキシリンおよびエオジン;MHC: 主要組織適合複合体;HSV:単純ヘルペスウイルス;GPDS:ゲッセル-プロベンス発育 計画;VEP:視覚誘発電位;CHOP:フィラデルフィアの小児病院;NMRS:核磁気共鳴分 析分析;AEP:聴覚誘発電位。 本明細書中に引用した参考文献の技術は、特に参考として援用される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＮＺ，Ｕ Ｓ (72)発明者 レオネ，パオラ アメリカ合衆国 コネチカット 06512, イースト ヘイブン，ケネス ストリート 123 (72)発明者 ドゥリング，マシュウ ジェイ. ニュージーランド国 オウクランド，ベル モント ストリート 74 (72)発明者 ソーギ，フランク エル. アメリカ合衆国 ペンシルバニア 15205, ピッツバーク，ミドルタウン ロード 2640

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．中枢神経系の細胞に核酸を送達するための方法であって： 脂質捕捉ポリカチオン縮合核酸を中枢神経系組織に投与する工程、 を包含し、ここで、該脂質捕捉ポリカチオン縮合核酸が、脂質、ポリカチオン、 および送達される核酸を含む、方法。 ２．前記脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびカチオン 性脂質を含む、請求項１に記載の方法。 ３．前記カチオン性脂質が、3b-[N-(N',N'ジメチルアミノエタン)カルバモイル] コレステロールである、請求項２に記載の方法。 ４．前記ポリカチオンが、ポリリジンおよび硫酸プロタミンからなる群から選択 される、請求項１に記載の方法。 ５．前記送達される核酸が、発現配列に隣接されたアデノ随伴ウイルス逆方向末 端反復配列を含む、請求項１に記載の方法。 ６．前記発現配列が、初期サイトメガロウイルス（cytomegalus virus）プロモ ーター、発現される核酸配列、およびSV40ポリＡシグナルを含む、請求項５に記 載の方法。 ７．前記発現される核酸配列が、ASPAをコードする核酸配列を含む、請求項６に 記載の方法。 ８．前記中枢神経系組織が、脳組織である、請求項１に記載の方法。 ９．前記脂質捕捉ポリカチオン縮合核酸が脳内に投与される、請求項８に記載の 方法。 １０．前記脂質捕捉ポリカチオン縮合核酸が実質内または脳室内に投与される、 請求項９に記載の方法。 １１．中枢神経系で細胞に核酸を送達するための組成物であって、脂質を含む脂 質捕捉ポリカチオン縮合核酸、ポリカチオン、および送達される核酸を含む、組 成物。 １２．前記脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびカチオ ン性脂質を含む、請求項１１に記載の組成物。 １３．前記カチオン性脂質が、3b-[N-(N',N'ジメチルアミノエタン)カルバモイ ル]コレステロールである、請求項１２に記載の組成物。 １４．前記ポリカチオンが、ポリリジンおよび硫酸プロタミン硫酸からなる群か ら選択される、請求項１１に記載の組成物。 １５．前記送達される核酸が、発現配列に隣接されたアデノ随伴ウイルス逆方向 末端反復配列を含む、請求項１１に記載の組成物。 １６．前記発現配列が、初期サイトメガロウイルス（cytomegalus virus）プロ モーター、発現される核酸配列、およびSV40ポリＡシグナルを含む、請求項１５ に記載の組成物。 １７．前記発現される核酸配列が、ASPAをコードする核酸配列を含む、請求項１ ６に記載の組成物。 １８．発現配列に隣接するアデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列を含む核酸配 列の発現のための構築物であって、ここで、該発現配列が、初期サイトメガロウ イルス（cytomegalus virus）プロモーター、発現される核酸配列、およびSV40 ポリＡシグナルを含む、構築物。 １９．前記発現される核酸配列が、ASPAをコードする核酸配列を含む、請求項１ ８に記載の構築物。 ２０．発現配列に隣接するアデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列を含む核酸配 列の発現のための構築物であって、ここで、該発現配列が、ASPAをコードする核 酸配列を含む、構築物。 ２１．中枢神経系組織への遺伝子送達を増強するための方法であって： 中枢神経系組織において高浸透圧状態を引き起こす化合物を投与する工程、お よび 組織に遺伝子を投与する工程、 を包含する、方法。
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