JPH08508162A

JPH08508162A - ハロバクテリアにおける異種ポリペプチドの発現

Info

Publication number: JPH08508162A
Application number: JP6521074A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ターナー、ジョージ; シー．ベトラッチ、メアリー
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1993-03-25
Filing date: 1994-02-28
Publication date: 1996-09-03
Also published as: AU6587594A; CA2156251A1; FI954534A; NO953760D0; EP0690913A1; AU682508B2; NO953760L; US6010885A; PL310557A1; US5641650A; PL176653B1; FI954534A0; WO1994021789A1

Abstract

(57)【要約】この発明は、ハロバクテリア宿主中で異種ポリペプチドを生産し得る発現系の調製および使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ハロバクテリアにおける異種ポリペプチドの発現発明の分野本発明は、ハロバクテリウム（halobacterium）にとって内因性ではない可溶性の膜貫通異種ポリペプチドを生産し得るハロバクテリアの発現系の調製および使用に向けられたものである。発明の背景ハロバクテリア（halobacteria）は、自然界では強い光および低い酸素飽和度の条件下で、蒸発性の塩水の池に見出される。これらは、特有の明るい色の色素、例えばオレンジ乃至赤色の色素、バクテリオルベリン（bacterioruberin）、または「紫膜（purple membrane）」のパッチを含む。ハロバクテリアは、原核生物の系統発生的に別個の群、「古細菌」（Archaea）に属する。これらは真正細菌とも真核生物とも同程度に関連性が薄いものである。古細菌は、真核生物および真正細菌と共通する幾つかの特質、並びに古細菌に独特の特徴を有する。例えば、古細菌は、真核生物のＲＮＡポリメラーゼと免疫学的に関連する７−１２サブユニットＲＮＡポリメラーゼを備えた真核生物様の転写装置を有し（１）、プロモーター構造はＲＮＡＰｏｌＩＩと類似している（２）。これに対して、古細菌は、原核生物的な細胞形態、並びに２３Ｓ、１６Ｓおよび５ＳのｒＲＮＡを有し、これらのｒＲＮＡをコードする遺伝子は、真正細菌様のオペロンに配置されている（３）。注目すべきことに、古細菌はその膜組成の点で独特である。バクテリオロドプシン（ＢＲ）は、ハロバクテリアの「紫膜」の特定の結晶性パッチ中に唯一の蛋白質として見出されている。ＢＲの合成は、高い光強度および低い酸素圧によって誘導され、紫膜のパッチは、古細菌であるHalobacterium halobiumの細胞表面領域の５０％までをも占めることができる。ＢＲは１つの蛋白質（バクテリオオプシン（bacterio-opsin））の複合体より構成され、１：１の化学量論比率で発色団のレチナールを備えている（４）。この複合体は、三量体の構造の７つの膜貫通疎水性α−ヘリックスとして、脂質マトリクス中に埋め込まれている（５）。レチナールは、α−ヘリックスの内の１つの膜貫通領域を横切る途中約１／３の位置２１６のリジンに共有結合している（６）。バクテリオオプシンとレチナールとの複合体は、バクテリオロドプシン（ＢＲ）と命名された。いわゆるｂｏｐ遺伝子は、H．halobiumの光誘導性蛋白質ポンプであるバクテリオロドプシン（ＢＲ）をコードするものである。ハロバクテリアにおける内因性ポリペプチドの発現に関する研究が幾つか報告されている（７、８および９）。発明の要旨本発明は、ハロバクテリア宿主における異種ポリペプチド生産のための発現系の調製および使用に向けられたものである。第１の態様では、広い状況下においてこのような系は、転写および翻訳調節ＤＮＡ、ハロバクテリア宿主にとって内因性ではない異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ、並びに転写および翻訳停止シグナルをコードするＤＮＡを含み得る。好ましくは、この種の系は、バクテリオロドプシンのプレ配列をコードするＤＮＡを含むことができ、これはこれにより発現されるポリペプチドがプレ配列に連結されるようなものであり、これにより異種ポリペプチドが適切に膜を標的とすると共に、膜を横切って挿入または分泌されることが可能となる。更に本発明の他の好適な実施形態では、バクテリオロドプシンプレ配列の存在下または非存在下で、バクテリオロドプシン遺伝子の転写および翻訳調節配列、並びに翻訳および転写停止配列を使用する。バクテリオロドプシン遺伝子の調節および停止配列の使用は、異種ポリペプチド配列の高レベルの発現が可能となるよう作用する。第２の態様では、本発明は、発現の後にハロバクテリア宿主の膜からの成熟異種ポリペプチドの分離を促進するために、バクテリオロドプシンポリペプチドのＣ末端ドメインを利用することにも向けられている。この態様の好適な実施形態では、前記Ｃ末端配列と異種ポリペプチドをコードするＤＮＡとの間に、独特のプロテアーゼ部位をコードするＤＮＡを導入する。この態様の好適な実施形態では、バクテリオロドプシン遺伝子の転写および翻訳の調節および停止配列をコードするＤＮＡを使用することにより、バクテルオロドプシンのＣ末端領域に連結された異種ポリペプチドの高レベルの発現を達成するものである。本発明の更に好適な実施形態は、バクテリオロドプシンプレ配列を使用し、バクテリオロドプシンのＣ末端領域に連結された異種ポリペプチドの発現を促進することに向けられている。本発明は、発現ベクター、この種のベクターにより形質転換されたハロバクテリア宿主、およびこの種の発現ベクターを使用して異種ポリペプチドを生産し、単離し、必要に応じて更に精製する方法を含む、その等価な全ての態様におけるこの種の系に向けられている。詳細な説明好適な実施形態および最良の形態（ベストモード）を開示することにより、本発明をここに説明する。ただし、ハロバクテリアにおける異種ポリペプチド発現系を生成するために本発明者が最初に使用した方法を詳細に説明するが、当業界の一般的な技術の範囲内で改変を行い、元々記載したものとは１または複数の様式で異なる発現系を生成し得ることは、当業者に明らかであろう。Ａ）図面の簡単な説明図１は、Halobacterium halobium株Ｒ１由来のバクテリオロドプシン遺伝子と約４００ｂｐの上流配列とを含むＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ断片の制限地図である。図２は、Halobacterium halobium株Ｒ１由来のバクテリオロドプシン遺伝子と約４００ｂｐの上流配列とを含む図１のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ構築物（コンストラクト）の核酸配列（配列番号：１）である。ＢＲ蛋白質翻訳産物のアミノ酸配列（配列番号：２）を併せて示す。図３は、ｐＵＢＰ２の制限地図を示す。図４は、成熟ＢＲ蛋白質（配列番号：３）の二次構造の地図である。図５は、ｐＥＮＤＳ−ＯＭ１中の、ＢＲ調節配列とヒトムスカリン性アセチルコリン受容体（タイプＨＭ１）の遺伝子とを含むＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの制限地図である。図６は、ｐＥＮＤＳ−ＯＭ１のヒトムスカリン性アセチルコリン受容体（タイプＨＭ１）の遺伝子を含む図５のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの核酸配列（配列番号：６）を示す。ＨＭ１のアミノ酸配列（配列番号：７）も併せて示す。図７は、ｐＥＮＤＳ−ＯＭ２中の、ＢＲ調節配列とヒトムスカリン性アセチルコリン受容体（タイプＨＭ１）の遺伝子とを含むＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの制限地図である。図８は、Ｉ３ドメインを欠如するヒトムスカリン性アセチルコリン受容体（タイプＨＭ１）の遺伝子を含む図７のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの核酸配列（配列番号：８）を示す。Ｉ３ドメインを欠失したＨＭ１のアミノ酸配列（配列番号：９）を示す。図９は、ＢＲ調節配列およびラットセロトニン受容体（タイプ１Ｃ）遺伝子を含むＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの制限地図である。図１０は、ラットセロトニン受容体遺伝子を含む図９のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ構築物の核酸配列（配列番号：１０）、およびラットセロトニン受容体のアミノ酸配列（配列番号：１１）を示す。図１１は、ラットセロトニン受容体（タイプ１Ｃ）遺伝子を含むｐＵＢＰ２で形質転換したH．halobium Ｂｏｐ欠損株Ｌ３３から単離したＤＮＡのサザンブロットである。レーン１〜１０、１２〜１９、２１〜２４および２７は、図９および１０のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメント（配列番号：１０）を含むｐＵＢＰ２で形質転換した株Ｌ３３からのＤＮＡを含む。レーン１１および２５は、精製したプラスミドＤＮＡ（すなわち、セロトニン受容体遺伝子を含むｐＵＢＰ２）を含むポジティブコントロール（陽性対照群）である。レーン２９は、株Ｌ３３からのＤＮＡを含む。矢印は、セロトニンＤＮＡに対応するＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの位置を示す。図１２は、ラットセロトニン受容体遺伝子を含むｐＵＢＰ２で形質転換したH ．halobium Ｂｏｐ欠損株Ｌ３３から単離した全ＲＮＡのノーザンブロットを示す。レーン２および５は、コントロールとして、ｐＵＢＰ２中にｂｏｐ遺伝子を含む１．２ｋｂのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントで形質転換した野生型株Ｌ３３からのＲＮＡを含む。レーン１、３および４は、ラットセロトニン受容体遺伝子で形質転換したＬ３３からのＤＮＡを含む。図９および１０の１．８５ｋｂのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをプローブとして使用した。矢印は、ラットセロトニン受容体ＲＮＡの位置を示す。図１３は、ＢＲ調節配列およびヒトトロンビン受容体遺伝子を含むＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの制限地図である。図１４は、ヒトトロンビン受容体遺伝子を含む図１３のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの核酸配列（配列番号：１２）、およびヒトトロンビン受容体のアミノ酸配列（配列番号：１３）を示す。図１５は、ｐβｇｂｏｐ、ｐＥＫ１７、ｐＢＡＴＣ、ｐ１．２ＫｂＢｏｐおよびｐＢＲＡＴの制限地図を示す。図１６は、ＢＲ調節配列、バクテリオオプシン遺伝子、およびEscherichia co liのアスパルテートトランスカルバミラーゼの触媒サブユニットをコードする遺伝子を含むＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの制限地図を示す。図１７は、バクテリオオプシンおよびE．coliアスパルテートトランスカルバミラーゼ遺伝子を含む図１６のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの核酸配列（配列番号：１４）、およびＢＲ／E．coliアスパルテートトランスカルバミラーゼ融合蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：１５）を示す。図１８は、ｐＢＲＡＴで形質転換したH．halobiumのウエスタンブロットを示す。ブロットに対しては、アスパルテートトランスカルバミラーゼの触媒サブユニットに対する抗体をプローブとした。レーン２は、E．coliアスパルテートトランスカルバミラーゼを含む。レーン６〜９および１１は、ｐＢＲＡＴで形質転換したH．halobiumからの蛋白質を含む。レーン８の矢印は、バクテリオロドプシン／アスパルテートトランスカルバミラーゼ（ＢＲ／ＡＴＣａｓｅ）融合蛋白質の位置を示す。図１９は、バクテリオロドプシン／アスパルテートトランスカルバミラーゼ（ＢＲ／ＡＴＣａｓｅ）融合蛋白質の発現が、ハロバクテリア紫細胞膜に局在化することを示す。ショ糖密度勾配で分画したH．halobiumの全細胞膜（Ａ）を洗浄し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、クーマシーブルーで染色した（Ｂ）。（Ｂ）におけるレーンは、以下の蛋白質サンプルを含む。分子量マーカー（レーン１）；ｐＢＲＡＴで形質転換したH．halobium株Ｌ３３からの未分画膜全体（レーン２）；ｂｏｐ遺伝子を含む１．２ＫｂＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメント（レーン３）またはｂｏｐ遺伝子を含む９ＫｂゲノムＤＮＡフラグメント（レーン４）で形質転換したH．halobium株Ｌ３３からの紫膜；H．halobi um株Ｌ３３からの膜全体（レーン５）；野生型H．halobium株Ｒ１からの紫膜（レーン６）；ｐＢＲＡＴで形質転換したH．halobium株Ｌ３３の紫膜（レーン７〜９）。Ｂ）定義「発現ベクター」という用語は、ここでは機能的な定義とし、その中に含まれるＤＮＡ配列を発現させ得るベクターを包含するものであって、このような配列が、その発現を行い得る他の配列に機能的に連結されているものである。本明細書では、「ベクター」および「プラスミド」は互換的に使用する。プラスミドは、最も普通に使用されるベクターの形態だからである。ただし、本発明は、等価な機能をなし得るこのような他の形態の発現ベクターであって、当業界で公知であるか公知となるものを包含することを意図する。ここでは「機能的」という用語および文法的に等価なものにより、それぞれのＤＮＡ配列が、その意図される目的のために動作可能であり作動することを意味する。「異種ポリペプチド」という用語は、ここでは宿主細胞にとって内因性ではない、または宿主細胞にとって内因性であったとしても本来の状態では達成し得ない量でここで取得し得る、現在既知または未知のポリペプチドに言及するものとする。この定義に包含されるものには、ハロバクテリアの非レチナール結合蛋白質がある。異種ポリペプチドの例には、限定されるものではないが、真核生物、真正細菌、古細菌由来のポリペプチド、合成ポリペプチド、および生物的に等価なアミノ酸アナログを含むポリペプチドが包含される。更に包含されるものには、７−膜貫通交差群（７-transmembrane crossing family）の他のメンバー、例えば、ムスカリン性アセチルコリン受容体、セロトニン受容体、トロンビン受容体、β−アドレナリン性受容体等がある。異種ペプチドには、膜蛋白質、例えば膵嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンスレギュレータ、および可溶性蛋白質、例えば種々の酵素（例えば、プロテアーゼおよびアスパルテートトランスカルバミラーゼ）も包含される。その公知または決定された機能に従ってそれぞれ生物学的に使用され、一般に当業界で公知の手順に従って適宜適用させるものとする。「異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ」という用語は、発現される宿主にとって内因性ではないポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を意味する。ハロバクテリアのゲノムの高いＧＣ含量（すなわち約５８〜６８％）のために、異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列はこの範囲にあることが好適であるが、ハロバクテリアで通常認められるより高い、および低いＧＣ含量の配列を使用することができる。我々は、例えば、ＢＲのＣ末端に対する融合蛋白質として、約５０％のＧＣ含量を有するEscherichia coliのアスパルテートトランスカルバミラーゼの発現に成功している。「転写および翻訳調節ＤＮＡ」という用語および等価なものは、その最も広い意味において、発現の転写および翻訳エレメントの両方を担当するＤＮＡ配列に言及するものである。好適な実施形態では、調節ＤＮＡはバクテリオロドプシンのものとする（ＲＮＡ開始部位に対して−３６４〜＋４１、図２（配列番号：１））。他の実施形態では、調節ＤＮＡは、ｂｏｐ遺伝子の上流の約４０００ｂｐの配列（約−４０００〜＋４１）を含み、ｂｏｐ遺伝子クラスターの３つの他の遺伝子を含み、これにはｂｒｐ（１３）、ｂａｔ（１４）およびｂｌｐ（GroppとBet lach、原稿作成中）を含まれる。これらの遺伝子の幾つかまたは全部を調節遺伝子とすることができる。「転写および翻訳停止シグナル」という用語および等価なものは、その最も広い範囲において、それぞれ転写および翻訳を終止するよう機能するＤＮＡを意味する。転写および翻訳停止シグナルは、バクテリオロドプシン遺伝子のものであるのが好適である。「バクテリオロドプシン遺伝子のプレ配列」という用語は、ここではバクテリオロドプシンの標的を膜とするのに必要な約１３アミノ酸の配列を意味する。１３アミノ酸のプレ配列は、図２（配列番号：１）に示されＲＮＡ開始部位に対して＋３〜＋４１のヌクレオチドによってコードされている。「ハロバクテリウム宿主」という用語により、野生型の遺伝子型を有する高度および中程度好塩菌の種を含む、Halobacteriumに属する株を意味する。野生型の遺伝子型を有する高度好塩菌の種の例には、Halobacterium saccharovorium（ ATCC29252）、Halobacterium california（ATCC38799）、Halobacterium halobi um（CCM2090）、およびHalobacterium valismortis（ATCC29-715）が含まれる。野生型の中程度好塩菌は、種Halobacterium mediterannei（ATCC33500）により例示される。ハロバクテリアの宿主種は、バクテリオロドプシンを欠損することが好適たり得る。バクテリオロドプシン欠損種には、野生型、例えばH．volcani i、または変異株、例えばＬ３３（１５）、Ｓ９Ｆ１ｘ３（１６）、ＩＶ−８（１７）およびＩＶ−１４（１７）がある。紫膜を構成的に（例えばＬ３３）または誘導的に発現する株から誘導されたバクテリオロドプシン欠損変異株は、異なる応用のために有用である。発現ベクター構築物中の上流の調節領域の性状に応じて、誘導性の株は調節された発現を可能とするが、構成的な株ではそうではない。「制限部位」という用語は、ここではＤＮＡ開裂の部位としてエンドヌクレアーゼによって認識され得るＤＮＡ配列に言及するものである。「Ｃ末端配列」、「Ｃ末端領域」という用語および等価なものにより、バクテリオロドプシンのＣ末端におけるポリペプチド配列を意味するものとする（図４参照）。「独特のプロテアーゼ部位」という用語は、これを備えるポリペプチドの開裂の部位としてプロテアーゼによって認識され得るアミノ酸配列を意味する。これは異種ポリペプチド発現産物には存在しない。好適な実施形態では、その配列が希であるという観点から、因子Ｘ_aのプロテアーゼ部位（Ile-Glu-Gly-Arg）（配列番号：４）が使用される。Ｃ）実施例１．異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のハロバクテリアの発現ベクターへのクローニングｉ．膜蛋白質の発現のための構築物ＰＣＲを含む標準的な分子的技術を使用して（１２）全ての構築物を作製した。発現ベクターは、種々の従来の様式で調製することができる。他のものも使用することができるが、発現ベクターに適用すべき好適なハロバクリテリアのクローニングベクターは、Blaseioら（７）によって記載されたプラスミドｐＵＢＰ２（図３）である。このプラスミドは、従来の技術を使用して単離することができる。例えば、このプラスミドは、塩化セシウム−臭化エチジウム密度勾配、透析膜へのアガロースゲルからの電気泳動、プラスミド分離用の市販のクロマトグラフィカラム、例えばマジックミニプレップ（magic minipreps）ＤＮＡ精製システム（プロメガ（Promega）社、Madison，WI）等を使用して精製することができる。用い得る発現ベクターは、通常はＤＮＡ構築物が組込まれていない細胞に対して、ＤＮＡが組込まれた細胞を選択することができるマーカーを含み得る。普通に使用される選択マーカーの例は抗生物質耐性である。ハロバクテリアの選択のために、ノボビオシン（８）およびメビノリン（７）に対する耐性を含む２つのマーカーが利用可能である。使用するマーカーは、メビノリン耐性のものが好適である。メビノリンは、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害剤である（７）。このマーカーは、好適なクローニングプラスミドｐＵＢＰ２中に存在する（図３）。ＤＮＡ配列の挿入を簡便にするために、プラスミドは、種々の制限部位を含むポリリンカー配列を含み得る。ポリリンカーの幾つかの例が知られており、利用可能である（１２）。典型的なポリリンカーはポリリンカー１（１２．３）（図３）であり、これはＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＭｌｕＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩの制限部位を含む。他の典型的なポリリンカーは、ＳｐｈＩ、ＥｃｏＲ５、ＳｓｔＩ、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位を有するポリリンカー２（３．７０）（図３）である。異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、標準的な技術を用いて、プロモーターおよびリボソーム結合部位を含む転写および翻訳調節領域の下流に配置するよう挿入する。使用するプロモーターは誘導性であって、異種ポリペプチド生成物の制御された発現を可能とするものが好適である。本発明の好適な実施形態では、バクテリオロドプシン遺伝子の転写および翻訳調節配列を使用し得る。バクテリオロドプシン遺伝子は、適切な制限酵素を用いて、ハロバクテリアのゲノムから単離することができる。バクテリオロドプシン遺伝子の転写および翻訳調節配列は、図２に示されるバクテリオロドプシン配列（配列番号：１）のＲＮＡ開始部位に対して−３６５〜＋４１に位置する。異種ポリペプチド合成の適切な終止を行うために、周知の技術（１２）を用いて、異種ポリペプチド配列をコードする挿入ＤＮＡ配列の下流に、転写および翻訳停止シグナルをコードするＤＮＡ配列を配置する。好ましくは、翻訳停止コドン（ＴＧＡ）と、その後に転写終止シグナルを含む〜８０ｂｐとを有するバクテリオロドプシン遺伝子（図２）（配列番号：１）の下流の配列を停止シグナルとして用いる。ハロバクテリアの膜を標的とする異種膜貫通ポリペプチドを生産するのが有利な場合、ＢＲのプレ配列をコードするＤＮＡの下流に、異種ポリペプチドをコードするＤＮＡを連結する。クローン化した配列の全てが２つの独特の制限部位（ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩから選択）を含むＤＮＡフラグメント上にあるように、対象となる異種遺伝子を、ＢＲ調節配列と共にE．coliプラスミドｐＵＣ１９（２０）にクローン化することができる。更に詳しくは、バクテリオロドプシン調節配列／プロモーターの下流で、バクテリオロドプシン転写および翻訳終止配列の上流に、ＢＲプレ配列とフレームが合うように異種遺伝子を連結する。ＢＲプレ配列と異種遺伝子との間に、特定の独特のプロテアーゼ部位を、幾つかの構築物において導入することができる。ｂｏｐ遺伝子および〜３７０ｂｐの上流配列を含む１．２ｋｂｐのフラグメントを、ＰＣＲを使用してH．halobium株Ｒ１のＤＮＡから単離し、ｐＵＣ１９のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローン化した（ｐ１．２Ｋｂｂｏｐと表示する）（図１５Ｂ）。２つの内因性ＡｌｗＮＩ部位を、クローン化した１．２ｋｂｐフラグメントから除去した。ｉ）ｂｏｐ遺伝子開始コドンの１６５ｂｐ上流に位置する１つの部位は（配列番号：１）、クンケル（Kunkel）法（２９）を使用してＧ→Ｔの点変異を起こさせて除去し、ｉｉ）ｂｏｐ遺伝子停止コドンの７ｂｐ上流に位置する第２のＡｌｗＮＩ部位は、トランスフォーマー（Transformer）部位特異的突然変異誘発キット（クロンテック・ラボラトリース（Clontech Labor atories）社、Palo Alto，CA）を使用して除去した。その後、ｂｏｐ上流配列、ＢＲプレ配列をコードするＤＮＡ、およびＢＲの最初の４つの（ヘリックス外）残基を含む〜４００ｂｐのＰｓｔＩ／ＡｌｗＮＩフラグメント（「ｂｏｐ５′フラグメント」と表示する）を、変異した１．２ｋｂｐフラグメントからＰＣＲにより単離した。同時に、ＢＲの６つのＣ末端残基をコードするＤＮＡ、ＢＲ停止コドン、およびＢＲの転写終止配列（停止コドンの４４ｂｐ上流まで）を含む〜１００ｂｐのＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメント（「ｂｏｐ３′フラグメント」と表示する）を、調製用消化および精製（プレプ・ア・ジーン、バイオラド（Pr ep-A-Gene、BioRad）、Richmond，CA）により、１．２ｋｂｐのｂｏｐ遺伝子フラグメントから取得した。更に、クローンテック・トランスファーマー（Clonte ch Transformer）キットを使用して、ｐＵＣ１９に位置する内因性ＡｌｗＮＩ部位（位置１２１７）を除去し、変異したｐＵＣ１９をＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩを用いて調製用に消化し、調製用に精製した（「ベクターフラグメント」と表示する）。３つのフラグメント（すなわち「ｂｏｐ５′フラグメント」、「ｂｏｐ３′ フラグメント」および「ベクターフラグメント」）を、後記するように、ＢＲプレ配列およびヘリックス外残基とフレームを合わせ、フラグメントの５′末端の１つのＡｌｗＮＩ部位およびフラグメントの３′末端の１つのＮｏｔＩ部位を含むよう操作した種々の異種遺伝子を含むＤＮＡフラグメントと連結した。全ての異種遺伝子において、内因性ＡｌｗＮＩ、ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩおよびｐｓｔＩ部位を（必要に応じて）最初に除去し、構築を容易にした。一旦異種遺伝子がＢＲ５′および３′調節配列と共にｐＵＣ１９にクローン化されると、この中間構築物（「ｐＥＮＤｓ」と表示する）をＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩにより調製用に消化した。その後、ＢＲの調節配列と共に異種遺伝子を含むＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを、アガロースゲル電気泳動によりｐＵＣ１９配列から調製用に単離し、プレプ・ア・ジーン（バイオラド、Richmond，CA）を使用して精製し、E．c oli／H．halobiumシヤトルベクターｐＵＢＰ２（７）にクローン化した。ｐＵＢＰ２は、ｐＢＲ３２２のレプリコンおよびアンピシリン耐性マーカー、ハロバクテリアのプラスミドｐＨＨ１の複製開始点、並びにメビノリン耐性マーカーを担持する。メビノリン耐性は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子のアッププロモーター変異によりコードされる。５′および３′ＢＲ調節配列と異種遺伝子との間の接合部を介した制限地図作成およびヌクレオチド配列決定により構築を確認した。ａ．ヒトムスカリン性アセチルコリン受容体（タイプＨＭ１）この遺伝子を用いて２つの異なる構築物を作製した。第１のもの（ｐＥＮＤｓ −ＯＭ１と表示する）は全遺伝子を含むが、第２のもの（ｐＥＮＤｓ−ＯＭ２と表示する）は、シグナル化に関与すると考えられる大きい内部細胞質ループ（すなわちＩ３）を欠如したものである。以下に記載する構築物を作成する前に、クローンテックトランスフォーマーキットまたはクンケル法（２９）を使用し、ｐＧＥＭ３（プロメガ社、Madison，WI）にクローン化したヒトムスカリン性アセチルコリン受容体（ＨＭ１と表示する）から、２つの内因性ＡｌｗＮＩ部位と１つの内因性ＰｓｔＩ部位とを除去した。除去した部位の位置を図６に示す（配列番号：６）。ｐＥＮＤｓ−ＯＭ１は次のように作成した。最初に、ＰＣＲによりＨＭ１遺伝子をｐＧＥＭ３／ＨＭ１から単離し、ＰＣＲフラグメントの５′末端にＡ１ｗＮＩ部位および３′末端にＮｏｔＩ部位を含むものとした。このＰＣＲフラグメントを前記した「ｂｏｐ５′フラグメント」、「ｂｏｐ３′フラグメント」および「ベクターフラグメント」に連結し、E．coliに形質転換した。この結果得られたプラスミドをｐＥＮＤｓ−ＯＭ１と命名した。ｐＥＮＤｓ−ＯＭ１は、ＢＲ５ ′配列から４コドン下流に位置するＨＭ１のメチオニン開始コドンを含む。ＡｌｗＮＩ部位の導入により生成した９つの追加の塩基対は、ＢＲ５′配列とＨＭ１遺伝子の開始コドンとの間にフレームを合せて位置する３つの追加の残基（すなわちｇｌｎ、ａｌａ、ｌｅｕ）をコードする。この遺伝子の３′末端において、ＨＭ１停止コドンは、ＢＲ停止コドンより４８ｂｐ先行する。前記したように、ｐＥＮＤｓ−ＯＭ１から、ＢＲ調節配列をＨＭ１遺伝子と共に、ｐＵＢＰ２のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメント（図５および図６、配列番号：６）に移した。関連する構築物（sibling construct）と同様にして、ｐＥＮＤｓ−ＯＭ２を作成した。ただし最初に、独特のＳｔｕＩ制限部位（ＨＭ１遺伝子の開始コドンに対して位置７１２、配列番号：６）におけるＨＭ１遺伝子の消化の後に、Ｉ３ドメインの欠失を行い、４℃で時間を変えてエキソヌクレアーゼＢａｌ−３１による消化を行った。平滑末端化した生成物を自己連結させ、Ｉ３ドメイン内に大きさの異なる欠失を有する変異体を得た。ＨＭ１のアミノ酸残基２３１〜３５７を欠如するこれらの１つを更なる検討のために選択した（配列番号：７）。この変異体からのＤＮＡを使用し、ＨＭ１遺伝子（Ｉ３ループを欠く）を含み５′ＡｌｗＮＩ部位および３′ＮｏｔＩ部位を有するＰＣＲフラグメントを作成した。このＰＣＲフラグメントは、Ｉ３ループを欠如する以外は前記したフラグメントと同一であり、ｐＥＮＤｓ−ＯＭ１構築物と類似する様式でｐＥＮＤｓ−ＯＭ２を作成するのに使用した。ＢＲ調節配列およびＨＭ１遺伝子（Ｉ３ループを欠く）を含むＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの配列を図８に示す（配列番号：８）。ｂ．ラットセロトニン受容体（タイプ１Ｃ）プラスミドｐＳＲ１ｃ（２７）上の３ＫｂＥｃｏＲＩｃＤＮＡフラグメントとしてクローン化されたラットセロトニン受容体遺伝子（「Ｓｅｒ」と表示する）を、以下の構築のための基礎として使用した。Ｓｅｒ遺伝子は、内因性のＡｌｗＮＩ、ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ部位を含まず、H．halobiumでの発現のために次のように適合させた。ＡｌｗＮＩおよびＮｏｔＩクローン化部位を、Ｓｅｒ遺伝子の５′コード領域および３′非コード領域内にそれぞれ導入した。更に、ポリアスパラギン酸ペプチドをコードするＤＮＡを、フレームを合せてＳｅｒ遺伝子の上流およびＡｌｗＮＩ部位の下流に配置した。この配列の翻訳により、発現される蛋白質の後の検出のために有用なペプチドエピトープが生成される（３１）。このフラグメントを単離し、前記した「ｂｏｐ５′フラグメント」、「ｂｏｐ３′フラグメント」および「ベクターフラグメント」と連結し、E．c oliに形質転換した。この結果得られたプラスミドはｐＥＮＤｓ−Ｓｅｒと命名したが、これはラットセロトニン受容体遺伝子の３６番目のコドンを含み、ペプチドエピトープをコードするＤＮＡおよびＢＲ５′配列がこれに先行している。この構築によって生成され、３つの追加残基（すなわちｇｌｎ、ａｌａ、ｌｅｕ）をコードする９つの追加塩基対が、ＢＲ５′配列とエピトープ配列との間にフレームを合せて配置される。この遺伝子の３′末端では、Ｓｅｒ停止コドンがＢＲ停止コドンに対して１８ｂｐ先行している。ｐＥＮＤｓ−Ｓｅｒを構築した後に、ＢＲ調節配列をＳｅｒ遺伝子と共にＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメント上でｐＵＢＰ２に移した（図９および図１０、配列番号１０）。ｃ．ヒトトロンビン受容体ヒトトロンビン受容体遺伝子のクローン（「Ｔｈｒｏｍｂ」と表示する）（３３）を以下の構築のための基礎として使用した。クンケル法（２９）を使用し、４つの内因性ＤＮＡ制限部位を遺伝子から除去した。これらは、３つのＡｌｗＮＩ部位（２９１、９４５および１０３８）および１つのＰｓｔＩ部位（５３７）を含む。位置は、遺伝子の開始コドンの最初の塩基に対して示す。「ｐＥＮＤｓ −Ｔｈｒｏｍｂ」を次のように作成した。オリゴヌクレオチド特異的挿入突然変異誘発（oligonucleotide-directed-insertion-mutagenesis）およびＰＣＲを使用し、この遺伝子を含むＡｌｗＮＩ／ＮｏｔＩフラグメントを作成した。このフラグメントには、発現された蛋白質の検出および精製に使用する短いペプチドをコードした付加的なヌクレオチド配列が含まれる。エピトープコード配列と共にこの遺伝子を含むＡｌｗＮＩ／ＮｏｔＩフラグメントを、前記した「ｂｏｐ５′ フラグメント」、「ｂｏｐ３′フラグメント」および「ベクターフラグメント」に連結し、E．coliに形質転換した。この結果得られるプラスミドをｐＥＮＤｓ −Ｔｈｒｏｍｂと命名した。ｐＥＮＤｓ−Ｔｈｒｏｍｂでは、構築によって生成し、１１の追加したアミノ酸をコードする３３の追加塩基対が、ＢＲ５′配列とＴｈｒｏｍｂ配列との間にフレームを合せて配置されている。２７の追加残基がポリアスパラギン酸ペプチド配列をコードし、これは翻訳された場合に、発現された蛋白質の検出に有用なペプチドエピトープを生成する（３１）。遺伝子の３ ′末端において、６つのヒスチジンコドンが、Ｔｈｒｏｍｂ停止コドンの上流に挿入されている。これらのヒスチジンコドンは、発現される蛋白質の親和力による精製の促進を意図するものである（２６）。遺伝子の３′末端において、Ｔｈｒｏｍｂ停止コドンはＢＲ停止コドンより１８ｂｐ先行する。前記したように、ＢＲ調節配列は、ヒトトロンビン受容体遺伝子と共にｐＵＢＰ２のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントに移すことができる（図１３および図１４、配列番号：１２）。ｉｉ．可溶性蛋白質の発現のための構築物発現の後に異種可溶性ポリペプチドが培養培地へ細胞外放出されることを所望する場合には、当業者に周知の技術（１２）を使用して、バクテリオロドプシンのプレ配列をコードするＤＮＡ（図２（配列番号：１）、ＲＮＡ開始部位に対して＋３〜＋４１）に、異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を連結することができる。発現の後に、ハロバクテリアの膜を標的とする異種可溶性ポリペプチドを生産することが都合がよい場合には、バクテリオロドプシンのＣ末端領域（図２および図４（配列番号：１および３）をコードするＤＮＡまたはそのフラグメントの下流に、異種ポリペプチドをコードするＤＮＡを連結する。その後の異種ポリペプチド生成物の精製を容易にするために、バクテリオロドプシンＣ末端領域をコードするＤＮＡと異種ポリペプチドをコードするＤＮＡとの間に、独特のプロテアーゼ部位をコードするＤＮＡ配列を加工する。独特のプロテアーゼ開裂部位をコードする配列は公知であり、例えばサブチリシン、トロンビン、エンテロキナーゼおよび因子Ｘ_aが含まれる。好適な実施形態では、アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号：４）をコードするＤＮＡ配列を使用し、因子Ｘ_aにより認識される独特のプロテアーゼ部位をコードするものとする。可溶性蛋白質発現ベクターの設計および使用方法は、膜蛋白質について前記したものと同様である。ただし、可溶性蛋白質を、ＢＲのＣ末端領域に対するフレームを合わせた融合体として発現させる。よって、これらの融合蛋白質は、膜ドメイン（すなわちＢＲまたはその一部分）と可溶性ドメイン（すなわち異種ポリペプチド）とを有することとなる。異種遺伝子は、バクテリオロドプシン遺伝子とＢＲの下流の転写／翻訳終止配列との間で、ＢＲのＣ末端でクローン化される。更に、ＢＲと異種遺伝子との間に独特のプロテアーゼ部位を加工し、その後の蛋白質の精製を容易にする。最終的な構築物は、E．coli／H．halobiumシャトルベクター、ｐＵＢＰ２（７）にクローン化する。ａ．E．coliアスパルテートトランスカルバミラーゼ（触媒サブユニット）可溶性蛋白質であるアスパルテートトランスカルバミラーゼの触媒サブユニット（ＡＴＣａｓｅと表示する）を、次のようにしてＢＲのＣ末端に融合させた。ｂｏｐ遺伝子（図１５Ａ参照）の３′末端付近に位置する独特のＮｏｔＩ部位で、ｂｏｐ遺伝子含有プラスミドｐβｇｂｏｐ（３２）を消化した。その後、このＮｏｔＩ部位を埋めて平滑部位を生成した（１２）。この結果得られたＤＮＡをＳｐｈＩで消化し、２つのフラグメント、ｂｏｐ遺伝子のＮ末端と共にベクターを含む大きいフラグメント（フラグメント１と表示する）と内部ｂｏｐ遺伝子配列を含む小さいフラグメントとを作成した。フラグメント１を単離して精製した。ｐβｇｂｏｐの第２の画分をＳｐｈＩ／ＨａｅＩＩで消化し、ｂｏｐ遺伝子の内部部分を含む２１７ｂｐのフラグメント（フラグメント２と表示する）を単離し精製した（図１５Ａ）。 E．coliのアスパルテートトランスカルバミラーゼ触媒サブユニットの構造遺伝子をｐＥＫ１７から単離した（図１５Ａ）（３０）。ＡＴＣａｓｅをコードする最初の１８ｂｐ以外の全てを含む８４５ｂｐのＭｓｅＩ／ＮｒｕＩフラグメント（フラグメント３と表示する）を単離し精製した。２つの相補的なオリゴヌクレオチドをアニールさせることによりＤＮＡの合成フラグメント（フラグメント４と表示する）を構築し、ｂｏｐおよびＡＴＣａｓｅ遺伝子を接続するのに使用した。合成フラグメントを加工し、５′末端のＨａｅＩＩ部位、３′末端のＭｓｅＩ部位、および内部ＮｒｕＩ部位を含むものとした。また、ｉ）独特のプロテアーゼ部位（すなわち血液凝血因子Ｘ_a）、およびｉｉ）ＡＴＣａｓｅアミノ酸６および７（ＡＴＣａｓｅ開始コドンに対して）をコードするヌクレオチドも含むものとした（図１７、配列番号：１４）。４つのＤＮＡフラグメントの全てを互いに連結し、E．coli株Ｄ1210（２８）を形質転換するのに使用し、アンピシリン耐性により選択した。Ｐ³²放射性標識ランダムプライム（２５）ＡＴＣａｓｅＭｓｅＩ／ＮｒｕＩフラグメントをプローブとして使用し、コロニーフィルターハイブリダイゼーションによって陽性クローンを同定した。制限地図作成およびヌクレオチド配列決定によって陽性クローンを確認した。１つの陽性クローンを選択し、ｐＢＡＴＣとした（図１５Ａ）。その後、ｂｏｐ−ＡＴＣａｓｅ融合構築物を次のようにH．halobiumの発現に適合させた。５′末端のｂｏｐ遺伝子の内部ＳｐｈＩ部位および３′末端のＡＴＣａｓｅ翻訳停止コドンとこれらの間に広がる配列とを含むフラグメントを、ＰＣＲによりｐＢＡＴＣから単離した（図１５Ｂ参照）。更に、このＰＣＲフラグメントの３′末端を構成するために使用するオリゴヌクレオチドを、転写終止配列の下流のｂｏｐ配列と相補的で且つ独特のＢａｍＨＩを含むよう設計し、以下のクローン化工程を容易にした。この結果得られたＰＣＲフラグメントをＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩにより消化し、精製し、次の構築において使用した。ｐＵＣ１９（前記）にクローン化されたｂｏｐ遺伝子および上流配列を含むプラスミドｐ１．２ＫｂｂｏｐをＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩにより消化し、２つのフラグメント、ベクターおよびｂｏｐ遺伝子の主要部分を含む大きいものと、ｂｏｐ遺伝子のＣ末端半分を含む３５８ｂｐのフラグメントとを得た（図１５Ｂ）。これらの２つのフラグメントの内大きい方を単離し、精製し、ＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩｂｏｐ−ＡＴＣａｓｅＰＣＲフラグメントに連結した。陽性クローンを単離し、制限地図作成およびヌクレオチド配列決定により確認した。このクローンをＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ＢＲ／ＡＴＣａｓｅ融合体をコードするＤＮＡとｂｏｐ上流調節配列とを含むフラグメント（図１６）を、E．coli／H．halobium シャトルベクターｐＵＢＰ２にクローン化した。この結果得られた構築物をｐＢＲＡＴと命名した（図１５Ｂ）。このＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントのヌクレオチド配列（配列番号：１４）および翻訳されたアミノ酸配列（配列番号：１５）を図１７に示す。２．Halobacterium halobiumの形質転換ｐＥＮＤｓ−ＳｅｒのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメント（図９および１０、配列番号：１０）、およびＢＲ調節配列と共に異種遺伝子を含むｐＢＲＡＴ（図１５Ｂ、図１６および図１７、配列番号：１４）構築物を単離し精製した。その後、これらのフラグメントをE．coli／H．halobiumシャトルベクターｐＵＢＰ２（７）にクローン化し、記載されたように（２４）H．halobium Ｂｏｐ欠損株Ｌ３３に形質転換した。好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法（１０、１１）を使用して、プラスミドをハロバクテリアに導入することができる。その後、ハロバクテリア細胞の生育を維持するのに十分な適切な栄養培地中の培養で、形質転換したハロバクテリア細胞を生育させる（７、８）。 H．halobiumは、形質転換手順の際に細胞が溶解する傾向がある（７）。界面活性剤はハロバクテリアの溶解を促進することが知られているため（２１）、全ての培地およびガラス器具は洗浄剤を含まないものとした。形質転換は、ブラセイオ（Blaseio）（７）およびクリン（Cline）（１１）に従い、改変を加えて行った。最初に、洗浄剤を含まない複合（ＹＥＴ）培地で細胞を数回継代培養する。次いで、細胞を約０．０１のＯＤ₆₆₀まで継代培養し、生育の対数期初期から半ばまで（０．４〜０．６のＯＤ₆₆₀）４０℃で生育させる。後の操作は全て室温で行った。培養物をウォーターバスシェーカーから取出し、撹拌しないで４時間から一夜インキュベートした後、２ｍｌの培養物を１０００×ｇで１５分間遠心分離した。上澄をピペットで注意深く除去し、遠心分離チューブの内部を吸収性ティシュで拭いた。１／１０容量のスフェロプラスト化溶液に細胞沈殿物を再懸濁した後（１１）、１／１００容量の０．５ＭＥＤＴＡをスフェロプラスト化溶液（１１）に添加し、２分間インキュベートした。その後、１０μｌのスフェロプラスト化溶液中の１μｇのＤＮＡを、スフェロプラスト化溶液に、等容量の６０％ＰＥＧ６００（未再結晶化）と共にスフェロプラスト化した細胞を添加した。合せた溶液を穏やかではあるが完全に混合した後、２０分間インキュベートした。１５％ショ糖含有複合（ＹＥＴ）培地を１０ｍｌ添加した後、撹拌しないで４２℃で一夜インキュベートした。次の日、３０００×ｇで１５分間細胞を遠心分離し、１５％ショ糖含有複合（ＹＥＴ）培地３００μｌに再懸濁した。この溶液を、固体複合（ＹＥＴ）選択培地上に平板処理した。３．形質転換体の解析、異種ポリペプチドの発現、および発現のアッセイハロバクテリア細胞がうまく形質転換されていることを確定するために、種々の技法を用いた。ハロバクテリアを形質転換するのに使用した発現ベクターが優勢な選択マーカーを含む場合は、組換えプラスミドを保持しないハロバクテリア細胞の生育が阻害されるよう適切な選択培地中で生育させることにより、形質転換した細胞を選択することができる。例えば、メビノリン耐性マーカーを含むプラスミドを使用した場合には、５〜２５μＭの濃度範囲でメビノリンを含む固体栄養培地上での生育によって、このプラスミドを保持するハロバクテリア細胞を選択することができる。更に、標準的な技術（１２）を使用してプラスミドを単離し、制限処理し、使用することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）、ゲル電気泳動、制限分析、サザン、ノーザンおよびウエスタンブロットを用いることができ、配列決定等の全てを有利に用いることができる。異種ポリペプチドの発現のために用いた特定の構築物およびハロバクテリアの基本株に応じて、異種ポリペプチド生成物の構成的または誘導的な発現を行うことができる。構成的な発現の場合は、生成物は細胞が生育すると共に連続的に形成されることとなる。これに対して、誘導的な発現では、細胞が所定の細胞密度に到達した時に誘導を行うことができる。異種ポリペプチドＤＮＡ配列を含む発現ベクターに誘導性のプロモーターを導入する場合、転写の誘導を行うような濃度および期間の条件下で、適切なインデューサー（誘発因子）を使用して転写を誘導することができる。例えば、バクテリオロドプシン遺伝子の調節配列を使用した場合は、ＢＲの高レベルの発現を誘導することが知られている低い酸素圧および高い光強度（１８、１９）により、転写を誘導することができる。低い酸素圧は、種々の方法、例えば酸素を含有しない窒素で培養フラスコを通気し、これを封止することにより、または酸素制限が自然に起こる生育の静止期に培養物を到達させることにより達成される（１８）。約１００ｍＷ／ｃｍ²より大きい高い光強度は、記載されているように（１８、１９）、種々の光源および装置を使用して達成することができる。ｐＢＲＡＴのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを含むｐＵＢＰ２で、またｐＥＮＤＳ−ＳｅｒのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを含むｐＵＢＰ２で、形質転換されたH．halobiumを、２５μＭメビノリンを含む固体複合（ＹＥＴ）培地上でプレート処理した。４２℃で１〜２週間プレートをインキュベートし、形質転換体を生育させた。マジックミニプレップＤＮＡ精製システム（プロメガ社、Madison，WI）を使用し、個々の形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離した。サザン解析を使用し、ｐＵＢＰ２上の異種遺伝子の存在を確認した。セロトニン受容体遺伝子を含むＡｌｗＮＩ／ＮｏｔＩフラグメントをプローブとして使用したサザンブロット解析により、アッセイした全ての形質転換体中にセロトニン受容体遺伝子配列が存在することが示された（図１１）。ＲＮＡｚｏｌの手順（シナ・バイオテク（Cinna Biotech））を使用し、全ＲＮＡを個々の形質転換体から単離し、ノーザン分析に供した（１８）。ノーザンブロット解析により、Ｓｅｒ遺伝子配列の転写がおきたことが明らかとなった（図１２）。ＢＲおよびＡＴＣａｓｅの両抗体を使用するウエスタン解析により、ＢＲ／ＡＴＣａｓｅ融合体が発現され、ハロバクテリアの膜に局在していることが示された（図１８）。洗浄したハロバクテリアの全細胞膜をショ糖勾配上で分画し（図１９Ａ）、画分をＳＤＳＰＡＧＥに供した（図１９Ｂ）。紫画分由来の融合蛋白質の予想分子量に対応するバンド（すなわち〜６０ｋＤａ、図１９Ｂ参照）が観察された。これらのデータにより、融合体の発現が確認され、融合体のＢＲ部分がハロバクテリアの膜内で正確に折畳まれていることが示される。ＢＲ発色団（63,000の消衰係数、３１）の存在により、５ｍｇ／リットルの融合蛋白質の発現を概算することができる。異種蛋白質に対する特異的な抗体が利用可能である場合は、サザンおよびノーザン解析で陽性と試験された形質転換体をウエスタン分析に供する。抗体が利用可能でない場合は、抗原性であることが知られているエピトープをコードするＤＮＡを発現ベクター構築物中に導入し、発現の検出を助成することができる。この種のエピトープの例は、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ− Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕをコードする配列である（配列番号：５）（２２）。または、異種蛋白質の発現は、機能的に、例えば受容体に対するリガンド結合アッセイ、および適切な基質を使用する可溶性蛋白質に対する酵素活性のアッセイにより検定することができる。４．異種ポリペプチドの精製異種ポリペプチドの生産を種々の方法で停止させることができる。異種ポリペプチドを培地中に放出させる場合には、物理的な例えば機械的もしくは熱的、または化学的な処理を使用し、可溶性または不溶性の形態でこれを単離することができる。用いられる処理には、凍結（≦０℃）、加熱、流体力学的剪断、乾燥、選択ろ過、または酸、塩基、塩もしくは有機溶剤の添加による沈殿が含まれ得る。発現された異種ポリペプチドが膜または細胞質中に残る場合は、細胞を回収して培養培地からこれらを分離する。回収のためには種々の技術を使用することができるが、望ましくは遠心分離を使用する。その後、上澄を廃棄し、適切な緩衝化した水性媒体で細胞沈殿物を洗浄し、全ての残りの培養培地成分を除去する。典型的には、緩衝化した媒体は、約１〜１０℃の範囲の温度、より普通には４℃ とし得る。全ゆる簡便な手段により、例えば凍結および機械的な手段、低張溶液の使用（２３）等により細胞を溶解させることができる。その後、この結果得られた破壊細胞の分散物を、可溶性の蛋白質および他の夾雑物から細胞膜を実質的に分離するような手段によって処理する。膜を単離するために幾つかの技術を効果的に用いることができ、これらには分画遠心分離、密度勾配遠心分離等が含まれる。この膜の単離により、融合蛋白質は大部分の可溶性蛋白質から分離される。異種ポリペプチドは、個々の性質およびＢＲの性質に応じた手順に従って精製される。発現された可溶性異種ポリペプチドがＢＲのＣ末端領域で融合されている場合は、ＢＲドメインが膜中で融合蛋白質に対するアンカー（錨）となる可能性をもたらすことができる。異種ポリペプチドが、バクテリオロドプシン遺伝子のＣ末端領域、またはそのフラグメントに連結された融合ポリペプチドとして発現され、前記異種ポリペプチドとＣ末端領域との間に独特のプロテアーゼ部位がある場合は、ハロバクテリアの膜を適切な独特のプロテアーゼと共にインキュベートし、プロテアーゼ開裂部位において実質的に完全な開裂を行うことにより、異種ポリペプチドを単離することができる。例えば、異種ポリペプチドが、アミノ酸配列（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ −Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号：４）を介してバクテリオロドプシンＣ末端領域に連結されている場合、製造業者が推奨する条件下で細胞膜を因子Ｘ_aと共にインキュベートする。因子Ｘ_aは、１ｍｇ／ｍｌの最終蛋白質濃度で再蒸留水中に溶解させる。開裂させる融合蛋白質は、１００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス− ＨＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ₂、ｐＨ８．０中に溶解させる。基質の溶解度を増加させるために、酵素活性を有意に阻害することなく、尿素またはアセトニトリルを、それぞれ１Ｍおよび１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加することができる。推奨される酵素の量は、重量基準で基質の１／２００〜１／１０である。４℃ 〜２５℃で１〜１８時間インキュベートを行うべきである。最適な開裂条件は、それぞれの融合蛋白質について決定する必要がある。融合蛋白質からの所望のポリペプチドの放出は、開裂部位における隣接したアミノ酸配列、２つの融合ポリペプチド成分のサイズ、および開裂部位の接近性（accessibility）により影響を受ける。プロテアーゼ処理の後に標準的な精製手順を実施し、主要でない独特のプロテアーゼ成分を除去する。異種ポリペプチド蛋白質の更なる精製を所望する場合は、異種ポリペプチドに特異的な抗体、リガンドアフィニティ、電気泳動、クロマトグラフィ、ゾーン遠心分離等を有効に用いることができる。その後、生成物は、凍結乾燥、スプレードライ等のようないずれかの便利な手段により乾燥させるか、または代替的に適切な緩衝化した水溶液に懸濁することができる。かくして異種ポリペプチド生成物は使用準備が整う。５．バイオアッセイ異種ポリペプチドは、その個々の性質に応じた手順を使用してアッセイすることができる。例えば、受容体は、リガンド結合アッセイを使用してアッセイする。酵素活性を有する可溶性蛋白質は、適切な基質を使用してアッセイする。引用文献一覧便利とするために、本明細書の本文中で参照した種々の文書を、本文中のその文献の括弧内の番号に対応する番号により以下の引用文献一覧にまとめる。これらの文書のそれぞれを参考により特にここに援用する。１．グロップ（Gropp）、Syst．Appl．Microbiol.，7，95（1986）２．ジリング（Zillig）、Eur．J．Biochem.，173，473（1988）３．デニス（Dennis）、J．Bacteriol.，168，471（1986）４．オエステルヘルト（Oesterhelt）、Proc.Nat.Acad.Sci.USA，70，2853（197 1）５．ヘンダーソン（Henderson）、Annu．Rev．Biophys．Bioenerg．6，87（1977 ）６．カトル（Katre）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，78，4068（1981）７．ブラシエオ（Blasieo）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87，6772（1990）８．ホルメス（Holmes）、J．Bacteriol.，172，756（1990）９．ニ（Ni）、Gene 90，169（1990） 10．チャールボイス（Charlebois）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84，8530（ 1987） 11．クリン（Cline）、J．Bacteriol.，169，1341（1987） 12．マニアティス（Maniatis）、Molecular Cloning:A Laboratory Manual）Col d Spring Harbor Laboratory，CSH，N.Y．（1989） 13．ベトラッチ（Betlach）、Nucl．Acids Res.，12，7949（1984） 14．ロング（Leong）、J．Bacteriol.，170，4903（1988） 15．ワグナー（Wagner）、FEBS Letters 131，341（1983） 16．シュプディッヒ（Spudich）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79 4398（1982） 17．ファイファー（Pfeifer）、J．Bacteriol.，145，375（1981） 18．シャンド（Shand）、J．Bacteriol.，173，4692（1991） 19．ベトラッチ（Betlach）、Protocols for Archael Research，Robb& Das Sar ma編Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，印刷中（199 3） 20．ヤニッシュ−ペロン（Yanisch-Perron）、Gene 33，103（1985） 21．カメクラ（Kamekura）、Appl．Environmental Microbiol．54，990（1988） 22．グラッセンマイヤー（Grussenmeyer）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82， 7952（1985） 23．ターナー（Turner）、Biochemistry 32，1332（1993） 24．クリン（Cline）、Can．J．Microbiol.，35，148（1989） 25．ファインバーグ（Feinberg）、Analytical Biochemistry 132，6（1983） 26．ホフマン（Hoffmann）、Nucleic Acids Research 19，6337（1991） 27．ジュリウス（Julius）、Science 241，558（1988） 28．クーン（Kuhn）、Gene44，253（1986） 29．クンケル（Kunkel）、Methods Enzymol．154，367（1987） 30．ノーラン（Nowlan）、J．Biol．Chem．260，14712（1985） 31．パワー（Power）、Gene 113，95（1992） 32．シャンド（Shand）、Biochemistry 30，3082（1991） 33．ヴー（Vu）、Cell 64，1057（1991）後記上記記載により、本発明を実施するのに用いることのできる特定の方法を詳細に説明した。ハロバクテリアにおける異種ポリペプチドの発現、単離、検出および更なる精製のためのベクターを構築し使用するのに最初に用いた特定の方法を詳細に説明したが、当業者であれば、ここに記載したのと同一および等価な系に到達するための代替的な信頼性のある方法を如何に構成するかを知得するであろう。上記したものは、その全体的な範囲を限定するものとして解釈すべきではなく、寧ろ本発明の範囲は、添付する請求の範囲の法的な解釈によってのみ左右される。前記言及したハロバクテリウム株は、12301パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド20852-1776所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託した。寄託した日付は、ATCC 29252が1976年２月３日、ATCC 38799 が1979年９月13日、ATCC 29715が1977年９月19日、およびATCC 33500が1981年２月23日である。配列表 (1)一般情報 (i)出願人：ターナー・ジョージ・ジェイベトラッチ・メアリー・シー (ii)発明の名称：ハロバクテリアにおける異種ポリペプチドの発現 (iii)配列の数：15 (iv)連絡先： (A)宛先：ロバート・バーリナー (B)番地：201ノース・フィギュロア・ストリート (C)市：ロサンゼルス (D)州：カリフォルニア (E)国：アメリカ合衆国 (F)ZIP ：90012 (v)コンピュータ読取り可能形式： (A)媒体種類：フロッピーディスク (B)コンピュータ：IBM PC互換 (C)操作システム：PC-D0S/MS-DOS (D)ソフトウェア：PatentIn Release #1.0，Version #1.25 (vi)現行出願データ： (A)出願杏号：PCT (B)出願日： (C)分類： (viii)代理人／事務所情報： (A)名前：バーリナー、ロバート (B)登録番号：20,121 (C)レファレンス／整理番号：5555-206-PCT (ix)通信情報： (A)電話番号：(213)977-1001 (B)ファクシミリ番号：(213)977-1003 (2)配列番号：１ (i)配列の性質： (A)配列の長さ：1254塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：２本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic） (ix)特徴： (A)名前／記号：他の情報 (B)存在位置：376..414 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシンプレ配列」 (ix)特徴： (A)名前／記号：CDS (B)存在位置：376..1161 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の情報 (B)存在位置：3..8 (D)他の情報：／注＝「PstI部位」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：1245..1250 (D)他の情報：／注＝「BamHI部位」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他のシグナル (B)存在位置：374 (D)他の情報：／注=「ＲＮＡ開始部位」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：9..414 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシン転写および翻訳調節配列はこの領域に位置する」 (xi)配列：SEQ ID NO：１： (2)配列番号：２ (i)配列の性質： (A)配列の長さ：262アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：蛋白質 (xi)配列：SEQ ID NO：２： (2)配列番号：３ (i)配列の性質： (A)配列の長さ：248アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (C)鎖の数：１本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：蛋白質 (ix)特徴： (A)名前／記号：Region (B)存在位置：225..248 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシンの細胞質Ｃ末端領域」 (ix)特徴： (A)名前／記号：Region (B)存在位置：１ (D)他の情報：／注＝「ピログルタメート」 (xi)配列：SEQ ID NO：３： (2)配列番号：４ (i)配列の性質： (A)配列の長さ：４アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (C)鎖の数：１本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO：４： (2)配列番号：５ (i)配列の性質： (A)配列の長さ：９アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (C)鎖の数：１本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：SEQ ID NO：５： (2)配列番号：６ (i)配列の性質： (A)配列の長さ：1956塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：１本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (ix)特徴： (A)名前／記号：CDS (B)存在位置：376..1812 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：376..414 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシンプレ配列」 (ix)特徴： (A)名前／記号：terminator (B)存在位置：1864..1866 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシン停止コドン」 (ix)特徴： (A)名前／記号：mutation (B)存在位置：置換（213．""） (D)他の情報：／注＝「ＧからＴへの変異により AlwNI制限部位を除去」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：427..435 (D)他の情報：／注＝「AlwNIクローン化部位」 (ix)特徴： (A)名前／記号：mutation (B)存在位置：置換（930．""） (D)他の情報：／注＝「ＧからＡへの変異により AlwNI制限部位を除去」 (ix)特徴： (A)名前／記号：mutation (B)存在位置：置換（1179．""） (D)他の情報：／注＝「ＴからＡへの変異により AlwNI制限部位を除去」 (ix)特徴： (A)名前／記号：mutation (B)存在位置：置換（1245．""） (D)他の情報：／注＝「ＧからＡへの変異により PstI制限部位を除去」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他のシグナル (B)存在位置：374 (D)他の情報：／注＝「ＲＮＡ開始部位」 (ix)特徴： (A)名前／記号：mutation (B)存在位置：置換（1863．""） (D)他の情報：／注＝「ＣからＴへの変異により AlwNI制限部位を除去」 (ix)特徴： (A)名前／記号：terminator (B)存在位置：1813..1815 (D)他の情報：／注＝「ムスカリン性「ＯＭＬ停止コドン」 (xi)配列：SEQ ID NO：６： (2)配列番号：７ (i)配列の性質： (A)配列の長さ：479アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：蛋白質 (xi)配列：SEQ ID NO：７： (2)配列番号：８ (i)配列の性質： (A)配列の長さ：1581塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：１本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (ix)特徴： (A)名前／記号：CDS (B)存在位置：376..1437 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：376..414 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシンプレ配列」 (ix)特徴： (A)名前／記号：terminator (B)存在位置：1489..1491 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシン停止コドン」 (ix)特徴： (A)名前／記号：mutation (B)存在位置：置換（213．""） (D)他の情報：／注＝「ＧからＴへの変異により AlwNI制限部位を除去」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：427..435 (D)他の情報：／注＝「AlwNIクローン化部位」 (ix)特徴： (A)名前／記号：mutation (B)存在位置：置換（930．""） (D)他の情報：／注＝「ＧからＡへの変異により AlwNI制限部位を除去」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他のシグナル (B)存在位置：374 (D)他の情報：／注＝「ＲＮＡ開始部位」 (ix)特徴： (A)名前／記号：terminator (B)存在位置：1438..1440 (D)他の情報：／注＝「ムスカリン性停止コドン」 (ix)特徴： (A)名前／記号：mutation (B)存在位置：置換（1488．""） (D)他の情報：／注＝「ＣからＴへの変異により AlwNI制限部位を除去」 (xi)配列：SEQ ID NO：８： (2)配列番号：９ (i)配列の性質： (A)配列の長さ：354アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：蛋白質 (xi)配列：SEQ ID NO：９： (2)配列番号：10 (i)配列の性質： (A)配列の長さ：1848塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：１本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：376..414 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシンプレ配列」 (ix)特徴： (A)名前／記号：terminator (B)存在位置：1756..1758 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシン停止コドン」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：517..591 (D)他の情報：／注＝「ラットセロトニン受容体蛋白質のヘリックスＩ（タイプ１Ｃ）」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：625..690 (D)他の情報：／注＝「ラットセロトニン受容体蛋白質のヘリックスＩＩ（タイプ１Ｃ）」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：736..807 (D)他の情報：／注＝「ラットセロトニン受容体蛋白質のヘリックスＩＩＩ（タイプ１Ｃ）」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：868..939 (D)他の情報：／注＝「ラットセロトニン受容体蛋白質のヘリックスＩＶ（タイプ１Ｃ）」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：997..1059 (D)他の情報：／注＝「ラットセロトニン受容体蛋白質のヘリックスＶ（タイプ１Ｃ）」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：1297..1362 (D)他の情報：／注＝「ラットセロトニン受容体蛋白質のヘリックスＶＩ（タイプ１Ｃ）」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：1411..1476 (D)他の情報：／注＝「ラットセロトニン受容体蛋白質のヘリックスＶＩＩ（タイプ１Ｃ）」 (ix)特徴： (A)名前／記号：mutation (B)存在位置：置換（213．""） (D)他の情報：／注＝「ＧからＴへの変異により AlwNI制限部位を除去」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：1732..1734 (D)他の情報：／注＝「ラットセロトニン受容体蛋白質（タイプ１Ｃ）のＣ末端アミノ酸をコードするコドン」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他のシグナル (B)存在位置：374 (D)他の情報：／注＝「ＲＮＡ開始部位」 (ix)特徴： (A)名前／記号：CDS (B)存在位置：376..1734 (ix)特徴： (A)名前／記号：terminator (B)存在位置：1735..1737 (D)他の情報：／注＝「セロトニン停止コドン」 (ix)特徴： (A)名前／記号：repeat region (B)存在位置：436..462 (D)他の情報：／注＝「ポリアスパラギン酸をコードする配列」 (ix)特徴： (A)名前／記号：mutation (B)存在位置：置換（1755．""） (D)他の情報：／注＝「ＣからＴへの変異により AlwNI制限部位を除去」 (xi)配列：SEQ ID NO：10： (2)配列番号：11 (i)配列の性質： (A)配列の長さ：453アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：蛋白質 (xi)配列：SEQ ID NO：11： (2)配列番号：12 (i)配列の性質： (A)配列の長さ：1764塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：１本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (ix)特徴： (A)名前／記号：repeat region (B)存在位置：436..462 (D)他の情報：／注＝「ポリアスパラギン酸をコードする配列」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：463..465 (D)他の情報：／注＝「ヒトトロンビン受容体蛋白質のＮ末端アミノ酸をコードするコドン」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：1630..1632 (D)他の情報：／注＝「ヒトトロンビン受容体蛋白質のＣ末端アミノ酸をコードするコドン」 (ix)特徴： (A)名前／記号：repeat region (B)存在位置：1633..1650 (D)他の情報：／注＝「ポリヒスチジンをコードする配列」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：648..656 (D)他の情報：／注＝「欠失したAlwNI制限部位」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：893..898 (D)他の情報：／注＝「欠失したPstI制限部位」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：1301..1309 (D)他の情報：／注＝「欠失したAlwNI制限部位」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：1394..1402 (D)他の情報：／注＝「欠失したAlwNI制限部位」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他のシグナル (B)存在位置：374 (D)他の情報：／注＝「ＲＮＡ開始部位」 (ix)特徴： (A)名前／記号：mutation (B)存在位置：置換（1671．""） (D)他の情報：／注＝「ＣからＴへの変異により AlwNI制限部位を除去」 (ix)特徴： (A)名前／記号：CDS (B)存在位置：376..1650 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：376..414 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシンプレ配列」 (ix)特徴： (A)名前／記号：terminator (B)存在位置：1672..1674 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシン停止コドン」 (ix)特徴： (A)名前／記号：terminator (B)存在位置：1651..1653 (D)他の情報：／注＝「トロンビン停止コドン」 (xi)配列：SEQ ID NO：12： (2)配列番号：13 (i)配列の性質： (A)配列の長さ：425アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：蛋白質 (xi)配列：SEQ ID NO：13： (2)配列番号：14 (i)配列の性質： (A)配列の長さ：2147塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：１本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (ix)特徴： (A)名前／記号：他のシグナル (B)存在位置：378..380 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシン開始コドン」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：378..416 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシンプレ配列」 (ix)特徴： (A)名前／記号：CDS (B)存在位置：378..2054 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：417..419 (D)他の情報：／注＝「成熟バクテリオロドプシンのＮ末端アミノ酸をコードするコドン」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：1122..1124 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシンのアミノ酸番号236をコードするコドン」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：1137..1139 (D)他の情報：／注＝「E．coliアスパルテートトランスカルバミラーゼの触媒サブユニットのアミノ酸番号６をコードするコドン」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：1125..1178 (D)他の情報：／注＝「合成ＤＮＡフラグメント」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：1125..1136 (D)他の情報：／注＝「因子Ｘａ蛋白質分解部位をコードする配列」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：2037..2039 (D)他の情報：／注＝「E．coliアスパルテートトランスカルバミラーゼのアミノ酸番号306をコードするコドン」 (ix)特徴： (A)名前／記号：他の特徴 (B)存在位置：2040..2054 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシンＣ末端アミノ酸番号245〜249をコードする配列」 (ix)特徴： (A)名前／記号：terminator (B)存在位置：2055..2057 (D)他の情報：／注＝「バクテリオロドプシン停止コドン」 (xi)配列：SEQ ID NO：14： (2)配列番号：15 (i)配列の性質： (A)配列の長さ：559アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：蛋白質 (xi)配列：SEQ ID NO：15：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ベトラッチ、メアリーシー. アメリカ合衆国 94131 カリフォルニア州サンフランシスコダイアモンドストリート 2530

Claims

【特許請求の範囲】１．ハロバクテリア宿主中で異種ポリペプチドを生産するのに有用な発現ベクターであって、ａ）転写及び翻訳調節ＤＮＡであって該調節ＤＮＡの３′位置にあるＤＮＡの機能的な発現のためのＤＮＡと、ｂ）前記調節ＤＮＡの３′にある異種ポリペプチドをコードするＤＮＡと、ｃ）前記異種ＤＮＡの３′にある転写および翻訳停止シグナルをコードするＤＮＡとを含む発現ベクター。２．前記ハロバクテリア宿主のための複製および選択能力をコードするＤＮＡを有する請求項１記載のベクター。３．バクテリオロドプシン遺伝子のプレ配列をコードする更なるＤＮＡを、該プレ配列と前記異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドの発現のために、前記調節ＤＮＡと前記異種ポリペプチドをコードする前記ＤＮＡとの間に含む請求項１記載のベクター。４．バクテリオロドプシン遺伝子のＣ末端配列をコードする更なるＤＮＡと、該Ｃ末端配列と前記異種ポリペプチドをコードする前記ＤＮＡとの間に独特のプロテアーゼ開裂部位および制限部位を任意の順序で機能的にコードするＤＮＡと、を含み、前記更なるＤＮＡが、前記異種ポリペプチドをコードする前記ＤＮＡの３′にある請求項１または３記載のベクター。５．前記転写および翻訳調節配列、並びに前記転写および翻訳停止シグナルがバクテリオロドプシン遺伝子のものである請求項１記載のベクター。６．前記転写および翻訳調節配列、並びに前記転写および翻訳停止シグナルがバクテリオロドプシン遺伝子のものである請求項４記載のベクター。７．前記異種ポリペプチドが、タイプＨＭ１ヒトムスカリン性アセチルコリン受容体である請求項１または２記載のベクター。８．前記異種ポリペプチドが、Escherichia coli由来のアスパルテートトランスカルバミラーゼの触媒サブユニットである請求項４記載のベクター。９．前記異種ポリペプチドが、Escherichia coli由来のアスパルテートトランスカルバミラーゼの触媒サブユニットである請求項５記載のベクター。１０．請求項１記載のベクターにより形質転換されたハロバクテリア宿主。１１．請求項４記載のベクターにより形質転換されたハロバクテリア宿主。１２．請求項５記載のベクターにより形質転換されたハロバクテリア宿主。１３．ハロバクテリア宿主中で異種ポリペプチドを生産する方法であって、ａ）機能的な発現のために必要なエレメントであって、 i）転写および翻訳調節ＤＮＡであって、該調節ＤＮＡの３′位置にあるＤＮＡの機能的な発現のためのＤＮＡと、 ii）前記調節ＤＮＡの３′にある異種ポリペプチドをコードするＤＮＡと、 iii）前記異種ＤＮＡの３′にある転写および翻訳停止シグナルをコードするＤＮＡとを含むエレメントを取得し、ｂ）ａ）のエレメントを機能的に組立て、ｃ）前記組立てたエレメントによりハロバクテリア宿主を形質転換し、ｄ）異種ポリペプチドをコードする前記ＤＮＡを発現させ、ｅ）前記異種ポリペプチドを単離し、ｆ）必要に応じて前記異種ポリペプチドを更に精製することを含む異種ポリペプチドの生産方法。１４．前記エレメントが、バクテリオロドプシン遺伝子のＣ末端配列をコードする更なるＤＮＡと、該Ｃ末端配列と前記異種ポリペプチドをコードする前記ＤＮＡとの間に独特のプロテアーゼ開裂部位および制限部位を任意の順序で機能的にコードするＤＮＡと、を含み、前記更なるＤＮＡが、前記異種ポリペプチドをコードする前記ＤＮＡの３′にある請求項１３記載の方法。１５．前記転写および翻訳調節配列、並びに前記転写および翻訳停止シグナルがバクテリオロドプシン遺伝子のものである請求項１３記載の方法。１６．前記異種ポリペプチドが、Escherichia coli由来のアスパルテートトランスカルバミラーゼの触媒サブユニットである請求項１３記載の方法。１７．ハロバクテリア宿主中で異種ポリペプチドを生産する方法であって、ａ）前記ハロバクテリアに形質転換された機能的な発現ベクター内で前記異種ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させ、ｂ）前記異種ポリペプチドを単離し、ｃ）必要に応じて前記異種ポリペプチドを更に精製することを含む異種ポリペプチドの生産方法。１８．ハロバクテリア宿主中で異種ポリペプチドを生産する方法であって、ａ）ハロバクテリアに形質転換された機能的な発現ベクター内で前記異種ポリペプチドおよびバクテリオロドプシン遺伝子のＣ末端配列をコードするＤＮＡであって、前記Ｃ末端配列は、異種ポリペプチドをコードする前記ＤＮＡの３′にあるものとし、ｂ）異種ポリペプチドおよびバクテリオロドプシンＣ末端領域をコードする前記ＤＮＡの発現の後に前記ハロバクテリアの膜を分離し、ｃ）前記異種ポリペプチドを単離し、ｄ）必要に応じて前記異種ポリペプチドを更に精製することを含む異種ポリペプチドの生産方法。１９．前記ＤＮＡが、前記異種ポリペプチドをコードする前記ＤＮＡと前記バクテリオロドプシンＣ末端配列をコードする前記ＤＮＡとの間に、独特のプロテアーゼ開裂部位を機能的にコードする更なるＤＮＡを更に含み、前記更なるＤＮＡが、前記異種ポリペプチドをコードする前記ＤＮＡの３′にある請求項１５記載の方法。