JP5570422B2 - 核酸試料の製造方法、および、それを用いた核酸増幅物の製造方法 - Google Patents
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Description
(A)前記細胞を含む細胞試料について、前記細胞から核酸複合体を放出させる工程
(B)前記(A)工程後の前記細胞試料を含む処理液と、担体とを接触させる工程
(C)前記担体と前記処理液とを分離する工程
(D)前記担体に加熱処理を施す工程
(E)前記(D)工程の前または後、前記担体に分散媒を添加する工程
(a)本発明の核酸試料の製造方法により、細胞を含む細胞試料から核酸試料を回収する工程
(b)前記(a)工程で回収した前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅方法により、前記鋳型核酸における目的配列の核酸増幅物を製造する工程
本発明の核酸試料の製造方法は、前述のように、細胞から核酸を回収する核酸試料の製造方法であって、下記(A)〜(E)工程を含むことを特徴とする。本発明の核酸試料の製造方法は、核酸試料の調製方法、核酸試料の回収方法または細胞からの核酸の回収方法ということもできる。
(A)前記細胞を含む細胞試料について、前記細胞から核酸複合体を放出させる工程
(B)前記(A)工程後の前記細胞試料を含む処理液と、担体とを接触させる工程
(C)前記担体と前記処理液とを分離する工程
(D)前記担体に加熱処理を施す工程
(E)前記(D)工程の前または後、前記担体に分散媒を添加する工程
本発明の核酸試料の製造方法において、前記(A)工程の核酸複合体を放出させる手段は、特に制限されない。本発明の核酸試料の製造方法の一例として、前記(A)工程が、例えば、プロテアーゼおよび界面活性剤を含む処理試薬と、前記細胞試料とを混合する(A1)工程である、第1の製造方法があげられる。第1の製造方法においては、例えば、このように、前記(A)工程において、前記細胞試料と前記処理試薬とを混合することによって、前記細胞から核酸複合体を放出させた処理液が得られる。
<不織布>
平均繊維直径:例えば、20nm〜100μm、好ましくは約2μm
目付:例えば、20〜150g/m3、好ましくは約20g/m3
<織布>
メッシュのサイズ:例えば、10〜1000μm、好ましくは、100〜250μm
糸径(線径):例えば、40〜500μm、好ましくは、47〜152μm
目開き:例えば、50〜300μm、好ましくは、50〜105μm
<多孔質体>
平均孔径:例えば、10μm〜1000μm、好ましくは、30μm〜1000μm
平均密度:例えば、15〜85kg/m3、好ましくは、30〜80kg/m3
孔の形状:例えば、独立気泡体、連続気泡体
<ビーズ>
形状:真球、楕円球等の球形
直径(粒径):例えば、30nm〜100μm、好ましくは、約5μm
表面積比:例えば、0.5〜200m2/g、好ましくは、1.1m2/g
充填率:例えば、0.1〜10%、好ましくは、0.1〜5%
まず、全血に前記処理試薬を添加する。これによって、全血の白血球から核酸複合体が放出される。この核酸複合体には、例えば、ゲノムDNAやRNAの他に、ミトコンドリアDNAが含まれる。
続いて、前記全血と前記処理試薬とを混合した前記処理液を、前記担体に接触させる。これによって、前記担体に、核酸含有細胞である全血の白血球から放出された核酸複合体が捕獲される。
続いて、前記担体と前記処理液とを分離する。前記両者の分離方法は、特に制限されず、例えば、前記担体の形状や、その配置状態等によって適宜決定できる。前記担体が容器に固定されていない場合、例えば、前記容器から前記担体または前記処理液を取り出すことによって、両者を分離できる。また、前述の磁性体ビーズの場合は、例えば、磁石等でビーズを回収することによって、両者を分離できる。一方、前記担体が容器に固定されている場合、例えば、前記容器から前記処理液を除去(排出)することで、両者を分離できる。また、前述のように流路内に前記担体を配置している場合は、前記担体の内部または複数の前記担体と担体との間に前記処理液を通過させることで、例えば、血中細胞から前記処理液中に放出された核酸複合体を、前記担体に捕獲させると共に、前記処理液と前記担体とを分離できる。
つぎに、前記処理液を除去した前記担体に分散媒を添加する。なお、前記分散媒の添加は、このように、次工程の加熱処理の前に行ってもよいし、加熱処理の後に行ってもよい。
前記分散媒中の前記担体に加熱処理を施す。これによって、前記担体に捕獲された前記核酸複合体から核酸が放出され、前記放出された核酸が、前記分散媒中に解放(遊離)される。
本発明の製造方法において、細胞が真核細胞であって、真核細胞を含む細胞試料が、冷蔵保存または凍結融解後の試料である場合、例えば、以下に示す第2の製造方法が好ましい。本発明の第2の製造方法は、例えば、前記(A)工程が、界面活性剤無添加であり且つプロテアーゼを含む処理試薬と、凍結融解後または冷蔵保存後の前記細胞試料とを混合する(A2)工程の製造方法である。本発明の第2の製造方法において使用する前記処理試薬は、例えば、「第2の処理試薬」ともいう。なお、特に示さない限り、第2の製造方法は、例えば、前記(A1)工程に代えて前記(A2)工程を行えばよく、その他は、前記第1の製造方法と同様に行うことができる。
本発明の製造方法において、細胞が真核細胞であって、真核細胞を含む細胞試料が、凍結融解後の試料である場合、例えば、以下に示す第3の製造方法が好ましい。本発明の第3の製造方法は、例えば、前記(A)工程が、界面活性剤無添加且つプロテアーゼ無添加の処理試薬と、凍結融解後の前記細胞試料とを混合する(A3)工程の製造方法である。本発明の第3の製造方法において使用する前記処理試薬は、例えば、「第3の処理試薬」ともいう。なお、特に示さない限り、第3の製造方法は、例えば、前記(A1)または(A2)工程に代えて、前記(A3)工程を行えばよく、その他は、前記第1または第2の製造方法と同様に行うことができる。また、第3の製造方法においては、例えば、前記(A)工程において前記第3の処理試薬と混合することなく、前記(B)工程において、前記凍結融解後の前記細胞試料を前記担体に接触させてもよい。
本発明の製造方法において、細胞が原核細胞であって、原核細胞を含む細胞試料が、冷蔵保存または凍結融解後の試料である場合、例えば、以下に示す第4の製造方法が好ましい。本発明の第4の製造方法は、例えば、前記(A)工程が、前記原核細胞を含む細胞試料を、凍結融解または冷蔵保存する工程の製造方法である。なお、特に示さない限り、第4の製造方法は、例えば、前記(A1)、(A2)または(A3)工程に代えて、前記(A4)工程を行えばよく、その他は、前記第1から第3の製造方法と同様に行うことができる。
以上のように、本発明の核酸試料の製造方法により得られた核酸試料は、例えば、各種核酸増幅方法の鋳型試料として使用できる。そこで、本発明は、核酸増幅方法により、目的配列の核酸増幅物を製造する方法であって、下記(a)および(b)工程を含むことを特徴とする。また、本発明は、目的配列の増幅方法ということもできる。
(a)本発明の核酸試料の製造方法により、細胞を含む細胞試料から核酸試料を回収する工程
(b)前記(a)工程で回収した前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅方法により、前記鋳型における目的配列の核酸増幅物を製造する工程
本発明の第1の核酸回収用試薬は、本発明の第1の核酸試料の製造方法に使用するための試薬であり、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤を含む。本発明の第1の核酸回収用試薬は、例えば、本発明の第1の核酸試料の製造方法における第1の処理試薬と同様である。前記核酸回収用試薬において、前記プロテアーゼおよび界面活性剤は、前記細胞試料と混合した際に、前記細胞1×102〜1×109個に対する前記プロテアーゼの割合が、例えば、0.02mU以上となり、前記細胞1×102〜1×109個に対する前記界面活性剤の割合が、1フェムトモル以上となるように、配合されていることを特徴とする。
本発明の第1の核酸回収用キットは、本発明の第1の核酸試料の製造方法に使用するためのキットであり、前記担体と、前記プロテアーゼと、前記界面活性剤とを含むことを特徴とする。本発明において、前記担体、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤は、前述の通りである。
本発明の核酸回収用チップは、本発明の核酸試料の製造方法に使用するためのチップであり、チップ本体と前記担体とを有し、前記チップ本体が、液体の流路を備え、前記流路内に前記担体が配置されていることを特徴とする。本発明の核酸回収用チップと前記本発明の核酸回収用試薬とを使用することによって、例えば、本発明の核酸試料の製造方法を実施できる。
第1の核酸回収用チップは、例えば、前記チップ本体と前記担体とを有し、前記チップ本体が、液体の流路を有し、前記流路の一端が液体を導入および排出するための第1の開口部を備え、前記流路の他端が圧力制御手段と連結可能な第2の開口部を備え、前記流路内に前記担体が配置されている。前記担体は、例えば、フィルターとなるシート状担体でもよいし、複数のビーズ状担体であってもよい。
第2の核酸回収用チップは、例えば、前記チップ本体と前記担体とを有し、前記チップ本体が、液体の流路を有し、前記流路の一端が加圧手段と連結可能であり且つ液体を導入するための第1の開口部を備え、前記流路の他端が液体を排出するための第2の開口部を備え、前記流路内に本発明の核酸回収用担体が配置されている。
本発明の核酸増幅用チップは、本発明の核酸増幅物の製造方法に使用するためのチップであって、
チップ本体と担体とを有し、
前記チップ本体が、液体を導入する開口部、排液を収容する排液部、核酸増幅反応を実施する反応部、および、液体の流路を有し、
前記流路の一端が前記開口部であり、
前記流路が、前記排液部および前記反応部と連結され、
前記流路内であって、前記排液部および前記反応部との連結部よりも前記開口部側に、前記担体が配置されていることを特徴とする。本発明の核酸増幅用チップと前記本発明の核酸回収用試薬とを使用することによって、例えば、本発明の核酸試料の製造方法を利用した核酸増幅物の製造方法を実施できる。
下記表2に示す各種担体(1aおよび1b)を直径2mmの円形に切り抜き、これを、図5に示すように治具装置にセットした。図5は、担体をセットした治具装置の模式図である。同図において、(A)が、担体をセットした治具装置の上面図、(B)が、前記(A)のI−I方向断面図、(C)が、担体に対する液体の通過方向を示す模式図である。治具装置4は、流路23と担体10を有しており、流路23の軸方向中央付近に担体10が配置されている。具体的には、治具装置4において、担体10は、アルミ製の凹状部材6aの凹部に配置され、さらに、前記凹部にアルミ製の凸状部材6bの凸部を嵌入することによって、凹状部材6aと凸状部材6bとからなるアルミブロック内に固定されている。なお、図示していないが、前記アルミブロックは、底面(同図(B)において下側の面)が露出するように、プラスチック製部材で固定されている。この治具装置4を、前記露出した底面が接触するように、ヒートブロック上に配置した。各図において矢印は、液体の進行方向を示す。同図(C)の矢印に示すように、本実施例において、液体は、担体10の円形表面から導入され、他方の表面から排出される。
回収率(%)=100×(A×B)/C
A:核酸試料のDNA濃度
B:核酸試料の体積
C:全血50μL当たりのDNA量の理論値
下記表3に示す各種担体(2a〜2j)を準備した。2b(織布)、2c(織布)および2j(不織布)の担体は、直径2mmの円形に切り抜いて、厚みが1.5mmとなるように積層し、円柱状の担体とした。残りの担体は、直径2mm、高さ1.5mmの円柱状に切り抜いた。2b、2cおよび2jの積層体および他の単層体を、それぞれ円柱状担体として、図6に示すように治具装置にセットした。図6は、前記担体をセットした治具装置の模式図である。同図において、(A)が、治具装置本体と担体とを示す斜視図、(B)が本体に担体をセットした治具装置の斜視図、(C)が前記(B)の上面図、(D)が前記(C)のII−II方向断面図である。治具装置5は、直径1mmの流路23と担体配置部8とを有する本体7、および、担体10を備え、流路23の軸方向中央付近に、担体配置部8が設けられ、担体配置部8内に担体10が配置されている。さらに、図示していないが、担体10の露出面(同図(D)において上側の面)は、粘着シートで覆われている。なお、本実施例においては、図6(B)〜(D)の矢印に示すように、各種液体は、円柱状担体の側面から導入され、側面から排出される。
2b:商品名PET150−HD、SEFAR社製
2c:商品名9P−150、SEFAR社製
2d:商品名CFS、イノアックコーポレーション社製
2e:商品名MF50、イノアックコーポレーション社製
2f:商品名MF80、イノアックコーポレーション社製
2g:商品名800EA、倉敷紡績株式会社製
2h:商品名806EA、倉敷紡績株式会社製
2i:商品名852EA、倉敷紡績株式会社製
2j:商品名EM02010、東レ・ファインケミカル株式会社製
PP:ポリプロピレン
PE:ポリエチレン
まず、全血50μLと前記実施例1の処理試薬1−1 50μLとを混合して処理液100μLを準備した。他方、担体として、下記表4に示す各種担体(実施例3a〜3g)を直径2mmの円形に切り抜いた。1.5mL容量のチューブ内に、切り抜いた前記各担体と前記処理液100μLとを入れ、ボルテックスで混合した後、前記処理液を除去した。前記チューブ内に、前記実施例1の洗浄液100μLを添加し、ボルテックスで混合した後、前記洗浄液を廃棄した。そして、前記チューブから前記各担体を取り出し、新たなチューブ内に、前記実施例1の分散媒100μLと共に入れ、96℃で5分間加熱した。加熱後の前記分散媒を回収し、核酸試料とした。
3b:商品名MAPS、イノアックコーポレーション社製
3c:商品名PET250−HD、SEFAR社製
3d:商品名PET150−HD、SEFAR社製
3e:商品名9P−150、SEFAR社製
3f:商品名CFS、イノアックコーポレーション社製
3g:商品名EM02010、東レ・ファインケミカル株式会社製
PE:ポリエチレン
PP:ポリプロピレン
1.5mL容量のチューブ内で、全血50μLと前記実施例1の処理試薬1−1 50μLとを混合して処理液100μLを準備した。前記チューブに、さらに、担体として、下記表5に示す各種磁性ビーズ(実施例4aおよび4b)を総量1mg添加して、ボルテックスで混合した。磁石で前記磁性ビーズを回収して、前記チューブ内の前記処理液を除去し、前記チューブ内に、回収した前記磁性ビーズと前記実施例1の洗浄液100μLとを入れ、ボルテックスで混合し、再度、前記磁性ビーズを回収して、前記洗浄液を除去した。そして、前記チューブに、回収した前記磁性ビーズと前記実施例1の分散媒100μLとを入れ、ボルテックスで混合し、96℃で5分間加熱した。加熱後、前記チューブを遠心分離に供して前記磁性ビーズを除去し、前記分散媒を回収した。これを核酸試料とした。
全血を本発明の核酸回収用試薬(処理試薬)で処理して、フィルター状の担体に保持される核酸複合体を確認した。
全血からのRNAの回収
担体として、商品名MF−80A(イノアックコーポレーション社製)を使用した。この担体を直径2mmの円形に切り抜き、前記実施例1と同様にして治具装置にセットした。他方、異なる検体から三種類の全血(新鮮血)を準備し、各全血50μLと下記表7の処理試薬5−1 50μLとを混合して処理液100μLを調製した。前記処理液において、全血50μLに対して、プロテアーゼの添加量は1.35Uであり、界面活性剤の添加割合は0.25体積%である。そして、下記表7の洗浄液および分散媒を使用した以外は、前記実施例1と同様にして、核酸試料を調製した。回収した核酸試料について、One Step SYBR Prime Script RT-PCR Kit II(TAKARA)およびβ−アクチン用の下記プライマーセットを用いて、RNAの定量を行った。コントロールとして、同一の全血からQIAamp RNA Blood Mini(QIAGEN社製)を用いて精製した核酸試料についても、同様にRNAの定量を行った。そして、コントロールの回収RNA量を100%とした場合の、本実施例の回収RNA量の相対値(%)を求めた。
唾液からのゲノムDNAの回収
まず、唾液100μL(ヒト核酸含有細胞数:約150,000個)と下記表8の各処理試薬100μLとを混合して処理液200μLを準備した。前記処理液において、唾液50μLに対して、プロテアーゼの添加量は1Uであり、界面活性剤の添加割合は0.5体積%、1体積%、2体積%である。他方、担体として、孔径60μmのPET製メッシュ状織布(サンフラテック社製、メッシュサイズ60μm)を使用した。この担体を直径3.5mmの円形に切り抜き、図1に示すピペットチップ(容量200μL)内部に装着した(有効径2.2mm)。前記有効径とは、前記ピペットチップ内部に装着した前記担体において、実際に通液可能な直径を意味する。このピペットチップをピペッターに装着し、前記処理液200μLを吸引吐出した後、前記実施例1の洗浄液200μLの吸引吐出を行った。再度、新たな前記洗浄液200μLを吸引吐出した後、前記ピペットチップから担体を取り出した。この担体を前記実施例1の分散媒100μLに浸漬し、95℃で5分間加熱することで、核酸試料を得た。これらの核酸試料について、前記実施例1と同様にして、ゲノムDNAの濃度を測定した。これらの結果を、下記表8にあわせて示す。
口腔粘膜細胞からのゲノムDNAの回収
まず、綿棒(1P1501V、日本綿棒製)で頬の内側を左右それぞれ10回、円を描くようにこすり、下記表9の各処理試薬200μLに混合して処理液200μL(ヒト核酸含有細胞数:約250,000個)を準備した。前記処理液において、口腔粘膜細胞懸濁液50μLに対して、プロテアーゼの添加量は1Uであり、界面活性剤の添加量は0.5体積%、1体積%、2体積%である。他方、前記実施例6における担体を装着したピペットチップを用いて、同様にして、核酸試料を調製した。これらの核酸試料について、前記実施例1と同様にして、ゲノムDNAの濃度を測定した。これらの結果を、下記表9にあわせて示す。
培養細胞からのゲノムDNAの回収
まず、アジア人由来正常臍帯静脈血管内皮細胞(KJB-110、DS PHARMA BIOMEDICAL)の培養細胞懸濁液を、生理食塩水で洗浄して培地成分を除去し、前記培養細胞を1×103cells/μLになるように生理食塩水に懸濁した。前記培養細胞懸濁液100μL(核酸含有細胞数:約1×105個)を、下記表10の各処理試薬100μLに混合して処理液200μLを準備した。前記処理液において、培養細胞懸濁液50μLに対して、プロテアーゼの添加量は1Uであり、界面活性剤の添加割合は0.5体積%、1体積%、2体積%とした。他方、前記実施例6における担体を装着したピペットチップを用いて、同様にして、核酸試料を調製した。これらの核酸試料について、前記実施例1と同様にして、ゲノムDNAの濃度を測定した。これらの結果を、下記表10にあわせて示す。
大腸菌からのプラスミドDNAの回収
まず、IAPP(膵島アミロイドペプチド)配列を組み込んだプラスミドDNAを有する大腸菌を、LB培地で12時間培養した後、培養液100μL(核酸含有細胞数:約1×107個)を以下の各処理試薬100μLに混合して、処理液200μLを準備した。なお、下記表11の処理試薬9−1で処理する大腸菌は、培養後、培養液のまま−80℃で凍結し、使用時に25℃で融解させた後、同様にして前記処理試薬9−1と混合した。前記処理液において、培養細胞懸濁液50μLに対して、プロテアーゼの添加量は、0、1Uであり、界面活性剤の添加割合は、0体積%、0.5体積%、1体積%、2体積%である。他方、前記実施例6における担体を装着したピペットチップを用いて、同様にして、核酸試料を調製した。これらの核酸試料について、前記実施例1と同様にして、プラスミドDNAの濃度を測定した。また、これらの核酸試料について、260nmの吸光度測定から、ゲノムDNAの濃度を測定した。これらの結果を、下記表11にあわせて示す。
全血からのゲノムDNAの回収
まず、4℃で70日間冷蔵保存した全血100μL、および、−30℃で9カ月間凍結保存後、融解した全血100μLを、それぞれ、下記表12の各処理試薬100μLに混合して処理液200μLを準備した。前記冷蔵保存全血100μL中の核酸含有細胞数は、約580,000個であり、前記凍結融解全血100μL中の核酸含有細胞数は、約560,000個であった。前記処理液において、全血50μLに対して、プロテアーゼの添加量は1U、2Uであり、界面活性剤は無添加である。他方、前記実施例6における担体を装着したピペットチップを用いて、同様にして、核酸試料を調製した。これらの核酸試料について、前記実施例1と同様にして、ゲノムDNAの濃度を測定した。これらの結果を、下記表12にあわせて示す。
1.新鮮血からのゲノムDNAの回収
冷蔵または冷凍保存していない採血当日の新鮮全血を、以下に示す種々の条件で処理した後、ゲノムDNAの回収を行った。前記新鮮全血の白血球数は、約5,500個/μLであった。
2ヵ月間冷蔵保存した全血を、以下に示す種々の条件で処理した後、ゲノムDNAの回収を行った。前記冷蔵血の白血球数は、約6,900個/μLであった。
−30℃で2時間凍結保存した全血を、室温解凍して以下に示す種々の条件で処理した後、ゲノムDNAの回収を行った。前記凍結血の白血球数は、約5,500個/μLであった。
Claims (30)
- 細胞から核酸を回収する核酸試料の製造方法であって、
下記(A)〜(E)工程を含むことを特徴とする製造方法。
(A)溶媒中で、前記細胞を含む細胞試料について、前記細胞から核酸複合体を放出させる工程であり、前記溶媒が水性溶媒である、工程
(B)前記(A)工程後の前記細胞試料を含む処理液と、担体とを接触させる工程であり、前記担体が、不織布以外の担体である、工程
(C)前記担体と前記処理液とを分離する工程
(D)前記担体に、90〜100℃で1〜5分間の加熱処理を施す工程
(E)前記(D)工程の前または後、前記担体に分散媒を添加する工程であり、前記分散媒が水性溶媒である、工程 - 前記(A)工程が、プロテアーゼおよび界面活性剤を含む処理試薬と、前記細胞試料とを混合する工程であり、
前記処理試薬と前記細胞試料とを混合した処理液において、前記プロテアーゼの濃度が0.5mU/μL以上であり、界面活性剤の濃度が、0.1体積%以上である、請求項1記載の製造方法。 - 前記処理液において、前記プロテアーゼの濃度が0.5〜1000mU/μLであり、前記界面活性剤の濃度が、0.1〜20体積%である、請求項2記載の製造方法。
- 前記処理液において、前記細胞1×102〜1×109個に対する前記プロテアーゼの割合が、0.02mU以上であり、前記細胞1×102〜1×109個に対する前記界面活性剤の割合が、1フェムトモル(1×10-15モル)以上である、請求項2または3記載の製造方法。
- 前記処理液において、前記細胞試料50μLに対する前記プロテアーゼの割合が、0.02mU以上であり、前記細胞試料50μLに対する前記界面活性剤の割合が、1フェムトモル以上である、請求項2から4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記プロテアーゼが、プロテイナーゼK、キモトリプシン、ペプシン、カテプシンDおよびパパインからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼである、請求項2から5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項2から6のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン−p−イソオクチルフェノール、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリル酸、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、および、ノニルフェノールポリチオエトキシレートからなる群から選択された少なくとも一つの界面活性剤である、請求項7記載の製造方法。
- 前記処理試薬が、さらに、キレート剤およびタンパク質変性剤の少なくとも一方を含む、請求項2から8のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記細胞が、真核細胞であり、
前記(A)工程が、界面活性剤無添加であり且つプロテアーゼを含む処理試薬と、凍結融解後または冷蔵保存後の前記細胞試料とを混合する工程である、請求項1記載の製造方法。 - 前記細胞が、血中細胞、唾液中細胞、口腔粘膜細胞、体細胞、生殖細胞および腫瘍細胞からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項1から10のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記細胞が、培養細胞である、請求項1から11のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記細胞試料が、血液、唾液、口腔粘膜、爪および毛髪からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項1から12のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記細胞試料が、細胞の培養物である、請求項1から13のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記細胞試料が、未希釈の細胞試料である、請求項1から14のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記細胞が、原核細胞であり、
前記(A)工程が、前記原核細胞を含む細胞試料を、凍結融解または冷蔵保存する工程である、請求項1記載の製造方法。 - 前記(A)工程において、プロテアーゼ無添加であり且つ界面活性剤を含む処理試薬または界面活性剤無添加であり且つプロテアーゼを含む処理試薬と、凍結融解後または冷蔵保存後の前記細胞試料とを混合する工程である、請求項16記載の製造方法。
- 前記担体が、織布および多孔質体の少なくとも一方である、請求項1から17のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記担体が、多孔質体であり、その平均孔径が、10〜1000μmである、請求項1から18のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記担体が、織布であり、そのメッシュサイズが、10〜1000μmである、請求項1から18のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記担体の形状が、フィルター状、シート状、ブロック状およびビーズ状からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項1から20のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記担体が、ビーズであり、体積充填率が、0.1〜10%の範囲である、請求項21記載の製造方法。
- 前記担体が、ポリマー製担体および金属製担体の少なくとも一方である、請求項1から22のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記ポリマーが、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエーテル、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルおよびポリテトラフルオロエチレンからなる群から選択された少なくとも一つのポリマーである、請求項23記載の製造方法。
- 前記金属が、ステンレス、チタンおよびアルミニウムからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項23記載の製造方法。
- 前記(D)工程における加熱温度が、95〜96℃である、請求項1から25のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記核酸が、DNAおよびRNAの少なくとも一方である、請求項1から26のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記DNAが、ゲノムDNAおよびミトコンドリアDNAの少なくとも一方である、請求項27記載の製造方法。
- 前記分散媒のpHが、7.8〜9.5である、請求項1から28のいずれか一項に記載の製造方法。
- 核酸増幅方法により、目的配列の核酸増幅物を製造する方法であって、
下記(a)および(b)工程を含むことを特徴とする核酸増幅物の製造方法。
(a)請求項1から29のいずれか一項に記載の核酸試料の製造方法により、細胞を含む細胞試料から核酸試料を回収する工程
(b)前記(a)工程で回収した前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅方法により、前記鋳型における目的配列の核酸増幅物を製造する工程
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