JP2006211973A - 核酸の分離精製方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】生体材料中の核酸を固相表面に吸着させた後、洗浄等を経て脱離させて核酸を分離精製する方法において、固相に核酸を吸着させる溶液を得るための処理の時間を長くすることなく、より多くの生体材料を処理する方法を提供する。
【解決手段】（１）生体材料に溶解液を加え、核酸を含む試料溶液を作成し、
さらに、該試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を加え、水溶性有機溶媒含有試料溶液を調製する工程、
（２）該水溶性有機溶媒含有試料溶液を固相に接触させて、固相に核酸を吸着させる工程、
（３）洗浄液を該固相に接触させて、固相に核酸が吸着した状態で固相を洗浄する工程、（４）回収液を該固相に接触させて、固相から核酸を脱離させる工程
を含む核酸の分離精製方法であって、
上記（１）の工程において、水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を、少なくとも２回に分けて加えることを特徴とする核酸の分離精製方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、核酸を分離精製する方法に関し、より詳細には、核酸を含む混合物から核酸を分離精製する方法に関する。
核酸は、様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸の形態で用いることが要求される。
診断分野においても、核酸は種々の形態で種々の目的に用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現におよぶ種々の理由により、興味ある核酸の位置確認、同定および単離において日常的に用いられている。
多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要する。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損失に結びつきやすい。血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料から核酸を精製する場合には、コンタミネーション（汚染）および疑陽性の結果が生じるという危険性も加わる。
広く知られた分離精製方法の一つに、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の固相に吸着させ、これに引き続いて洗浄、脱離等の操作を行い、分離精製する方法がある（例えば、特許文献1）。この方法は、分離性能として優れているが、簡便性、迅速性、自動化適性において充分とは言えず、またこの方法に用いられる器具及び装置は自動化及び小型化に不向きであり、更に器具及び装置、特に吸着体を同一性能で工業的に大量生産することが困難であり、かつ取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点がある。さらに、素材自体が脆いために機械的強度を得るには一定以上の厚みが必要となるため、特にＤＮＡとＲＮＡの混合試料からＲＮＡを選択的に回収する際、ＤＮase等の高価な試薬を用いる必要がある等の問題がある。
また、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、固相に核酸を吸着させる溶液及び固相から核酸を脱離させる溶液をそれぞれ用いて、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相に核酸を吸着及び脱離させることによって、核酸を分離精製する方法が記載されている（特許文献２、３）。
その他に、従来から知られている核酸分離精製法としては、遠心法によるもの、磁気ビーズを用いるもの、フィルターを用いるものなどがあり、これらを利用した核酸分離精製装置が提案されている。例えば、フィルターを用いた核酸分離性装置としては、フィルターを収容したフィルターチューブをラックに多数セットし、これに核酸を含む試料液を分注し、上記ラックの底部の周囲をシール材を介してエアチャンバーで密閉して内部を減圧し、全フィルターチューブを同時に排出側より吸引し試料液を通過させて核酸をフィルターに吸着し、その後、洗浄液および回収液を分注して、同様に減圧吸引して洗浄・脱離するようにした機構が提案されている（例えば、特許文献４参照）。
一般に、表面に水酸基を持つ有機高分子等からなる多孔膜に核酸を吸着させる際には、核酸を含む溶液に水溶性有機溶媒を含む溶液が加えられる。通常、このときに用いられる水溶性有機溶媒は主にエタノール水溶液である。一般に、核酸を含む溶液に添加した後の固相に核酸を吸着させる溶液における最終のエタノール濃度（終エタノール濃度）は２０
質量％〜６０質量％が好ましいとされている。
特公平7−51065号公報 特開2003−128691号公報 特開2004−49108号公報 特許第2832586号公報
本発明の目的は、生体材料中の核酸を固相表面に吸着させた後、洗浄等を経て脱離させて核酸を分離精製する方法において、固相に核酸を吸着させる溶液を得るための処理の時間を長くすることなく、より多くの生体材料を処理する方法を提供することである。
上記課題は、以下の本発明の構成により達成された。
１． （１）生体材料に溶解液を加え、核酸を含む試料溶液を作成し、
さらに、該試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を加え、水溶性有機溶媒含有試料溶液を調製する工程、
（２）該水溶性有機溶媒含有試料溶液を固相に接触させて、固相に核酸を吸着させる工程、
（３）洗浄液を該固相に接触させて、固相に核酸が吸着した状態で固相を洗浄する工程、（４）回収液を該固相に接触させて、固相から核酸を脱離させる工程
を含む核酸の分離精製方法であって、
上記（１）の工程において、水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を、少なくとも２回に分けて加えることを特徴とする核酸の分離精製方法。
２． 上記（１）の工程において、
試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加えた後、
振とう、転倒混和、回転の運動を含む少なくともいずれかの操作によって撹拌を行い、
攪拌後の溶液に、さらに水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加える上記第１項に記載の核酸の分離精製方法。
３． 上記（１）の工程において、
試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加えた後、
該溶液の吸引、および吐き出しを少なくとも一度含む操作によって撹拌を行い、
攪拌後の溶液に、さらに水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加える上記第１項又は第２項に記載の核酸の分離精製方法。
４． 上記（１）の工程において、
水溶性有機溶媒含有試料溶液における水溶性有機溶媒の濃度が、５〜９０質量％である上記第１項〜第３項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
５． 上記（１）の工程において、
水溶性有機溶媒含有試料溶液における水溶性有機溶媒の濃度が、１０〜６０質量％である上記第１項〜第３項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
６． 上記（１）の工程において、
水溶性有機溶媒含有試料溶液における水溶性有機溶媒の濃度が、２０〜４０質量％である上記第１項〜第３項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
７． 固相が、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する、有機高分子からなる多孔膜である上記第１項〜第６項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
８． 有機高分子が、水酸基を有する上記第７項に記載の核酸の分離精製方法。
９． 多孔膜が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる上記第７項又は第８項に記載の核酸の分離精製方法。
１０． 多孔膜が、表裏非対称性の膜である上記第７項〜第９項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
１１． 溶解液が、核酸可溶化試薬である上記第１項〜第１０項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
１２． 生体材料が動物組織である上記第１項〜第１１項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
１３． 核酸可溶化試薬が、カオトロピック塩、核酸安定化剤、界面活性剤、緩衝剤及び消泡剤から選ばれる少なくとも一つを含む上記第１１項に記載の核酸の分離精製方法。
１４． カオトロピック塩が、塩酸グアニジンおよびグアニジンチオシアン酸塩から選ばれる少なくとも一つを含む上記第１３項に記載の核酸の分離精製方法。
１５． 水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ならびにブタノール及びその異性体から選択される少なくとも１つである上記第１項〜第１４項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
１６． 洗浄液が、メタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ならびにブタノール及びその異性体から選択される少なくとも１つを２０〜５０質量％含む上記第１項〜第１５項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
１７． 洗浄液が、塩化物を１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌ含む溶液である、上記第１項〜第１６項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
１８． 上記（２）、（３）及び（４）の各工程において、水溶性有機溶媒含有試料溶液、洗浄液又は回収液の多孔膜への通過を、少なくとも二個の開口を有する容器内に溶液が内部を通過可能な多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジ及び圧力発生装置を用いて行い、且つ、該圧力発生装置が、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されるポンプである上記第７項〜第１７項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
１９． 上記第１項〜第１８項のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うための、核酸分離精製カートリッジと試薬のキット。
２０． 上記第１項〜第１８項のいずれかに記載の核酸分離精製方法を自動で行う装置。
本発明においては、固相に核酸を吸着させる溶液（本発明における「水溶性有機溶媒含有試料溶液」）を調製する工程において、添加する水溶性有機溶媒の液量を減らし、しかながら終濃度は変えず、つまり通常用いられるものより高濃度のものを用いる。これによ
り、固相に核酸を吸着させる溶液の最終液量を減量できることになるので、最初に生体材料に加える溶解液の量を増やすことができる。本発明の構成においては、水溶性有機溶媒は、複数回に分けて加えるものであり、これにより高濃度の水溶性有機溶媒を用いても、混和を容易にすることが可能となる。以上により、より多くの生体材料を処理することが出来るようになり、核酸を迅速に回収することが出来るようになる。使用する固相は、特に限られないが、好ましくは多孔膜を使用することであり、該多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジを用い、該多孔膜としてイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する膜を用いることが本発明の効果を得る上でより好ましく、更に、本発明においては、二個の開口を有する容器内に有機高分子からなる多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジを使用することが好ましい。
本発明によれば、生体材料中の核酸を固相表面に吸着させた後、洗浄等を経て脱離させて核酸を分離精製する方法において、固相に核酸を吸着させる溶液を得るための処理の時間を長くすることなく、より多くの生体材料を処理する方法を提供することができる。
また本発明によれば、分離性能に優れ、洗浄効率がよく、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である多孔膜を使用して、生体材料から、より安価で、簡便に核酸を選択的に回収することができる。
本発明の核酸分離精製方法は、
（１）生体材料に溶解液を加え、核酸を含む試料溶液を作成し、
さらに、該試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を加え、水溶性有機溶媒含有試料溶液を作成する工程（以下、「水溶性有機溶媒含有試料溶液調製工程」とも言う。）、
（２）該水溶性有機溶媒含有試料溶液を固相に接触させて、固相に核酸を吸着させる工程（以下、「吸着工程」とも言う。）、
（３）洗浄液を該固相に接触させて、固相に核酸が吸着した状態で固相を洗浄する工程（以下、「洗浄工程」とも言う。）、
（４）回収液を該固相に接触させて、固相から核酸を脱離させる工程（以下、「回収工程」とも言う。）
を少なくとも含むものである。
使用する固相は特に限定されないが、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔膜（以下、「核酸吸着性多孔膜」とも言う。）が好ましい。
好ましくは、上記（２）、（３）及び（４）の各工程において、水溶性有機溶媒含有試料溶液、洗浄液又は回収液を、圧力発生装置を用いて核酸吸着性多孔膜に通過させるものであり、より好ましくは、上記（２）、（３）及び（４）の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、水溶性有機溶媒含有試料溶液、洗浄液、又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、注入した各液を通過させ、他の開口より排出させるものである。水溶性有機溶媒含有試料溶液、洗浄液、又は回収液を加圧状態で上記多孔膜に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができ、好ましい。ポンプの加圧は、好ましくは10〜300kPa、より好ましくは40〜200kPaの範囲で行われる。
さらに好ましくは、上記核酸吸着性多孔膜を収容する核酸分離精製カートリッジを用いて、以下の工程で核酸を分離精製することができる。
すなわち、(a)水溶性有機溶媒含有試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内
に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、(b)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジト内を加圧状態にし、注入した水溶性有機溶媒含有試料溶液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜内に核酸を吸着させる工程、(c)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、(d)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、(e)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、(f)核酸分離精製カートリッジの一の開口に結合された圧力発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜内から核酸を脱離させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程が挙げることができる。
上記の核酸分離精製の工程では、最初の水溶性有機溶媒含有試料溶液を注入から核酸分離精製カートリッジ外に核酸を得るまでの工程を実質30分以内、好適な状況では2分以内で終了することが可能である。
また、上記の核酸分精製の工程では、紫外可視分光光度計での測定値(２６０nm/２８０nm)が、ＤＮＡの場合は１．６〜２．０、ＲＮＡの場合は１．８〜２．２となる純度を持つ核酸を回収することができ、不純物混入量の少ない高純度の核酸を定常的に得ることができる。さらには、紫外可視分光光度計での測定値(２６０nm/２８０nm)がＤＮＡの場合は１．８付近、ＲＮＡの場合は２．０付近となる純度を持つ核酸を回収することができる。
また、上記工程において、圧力発生装置としては、注射器、ピペッタ、ペリスタポンプのような加圧が可能なポンプ等、或いは、エバポレーター等の減圧可能なものが挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力発生装置は、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されている。
また、上記工程において、上記核酸分離精製カートリッジの他の開口に結合された圧力発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にしても好適に実施できる。また、核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させることによっても好適に実施することができる。
本発明において使用できる生体材料は、核酸を含むものであれば特に制限はなく、細胞、組織、血液、菌体などが挙げられる。例えば診断分野においては、生体材料として採取された全血、血漿、血清、尿、便、***、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルス、培養細胞など、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生体材料から調製された溶液が対象となる。培養細胞としては、浮遊系細胞、接着系細胞等が挙げられる。浮遊系細胞とは培養液中で容器壁に付着することなく漂いながら生育、増殖する細胞を指し、例えばＨＬ６０，Ｕ９３７，ＨｅＬａＳ３等が代表的な細胞株として挙げられる。接着系細胞とは培養液中で容器壁底面に付着し生育、増殖する細胞を指し、例えばＮＩＨ３Ｔ３，ＨＥＫ２９３，ＨｅＬａ，ＣＯＳ，ＣＨＯ細胞等が代表的な細胞株として挙げられる。生体材料として用いられる動物（またはその一部）としては、動物組織が挙げられる。例えば、動物を解剖したとき或いは生検により採取可能な、肝臓、腎臓、脾臓、脳、心臓、肺や胸腺など個体を構成する組織全てを使用することができる。以下、これらの生体材料を検体とも言う。
（１）生体材料に溶解液を加え、核酸を含む試料溶液を作成し、さらに、該試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を加え、水溶性有機溶媒含有試料溶液を作成する工程「水溶性有機溶媒含有試料溶液調製工程」
検体は、最初に溶解液を加えて「核酸を含む試料溶液」を得る。溶解液としては、核酸を溶出する試薬を含む水溶液（核酸可溶化試薬）を用い、細胞膜・核膜を溶解する処理を行うことが好ましい。さらに水溶性有機溶媒、又は水溶性有機溶媒を含む溶液を加えることにより、核酸が水溶液内に分散し、「水溶性有機溶媒含有試料溶液」を得る。
核酸可溶化試薬としては、カオトロピック塩、核酸安定化剤、界面活性剤、緩衝剤及び消泡剤いずれか１つ以上を含む溶液が挙げられる。
上記、核酸可溶化試薬中のカオトロピック塩濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ〜８ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは、１ｍｏｌ／Ｌ〜６ｍｏｌ／Ｌである。前記カオトロピック塩としては、特に限定は無く公知のカオトロピック塩を使用することができる。カオトロピック塩としては、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム等を使用することができる。中でもグアニジン塩が好ましい。グアニジン塩としては、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸塩（チオシアン酸グアニジン）が挙げられ、中でも塩酸グアニジンが好ましい。これらの塩は単独でも、複数組み合わせて用いてもよい。
上記、核酸可溶化試薬中の界面活性剤は、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤である。本発明においてはノニオン界面活性剤を好ましく用いることができる。ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドを用いることができるが、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤を用いることができる、さらに好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤は、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコールから選択されるポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。
また、カチオン界面活性剤も好ましく用いることができる。さらに好ましくは、カチオン界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドから選択されるカチオン界面活性剤である。これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。これら界面活性剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。
核酸可溶化試薬には、核酸安定化剤を共存させることが好ましい。検体中には、核酸を分解するヌクレアーゼ等が含まれていることがあり、検体をホモジナイズすると、ヌクレアーゼが核酸に作用し、収量が減少することがある。これを回避する目的で、核酸可溶化液に、ヌクレアーゼを不活性化させる作用を有する安定化剤を共存させることができる。
これにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、検体の微量化及び迅速化が可能となる。
ヌクレアーゼの不活性化剤としては、一般的に還元剤を好ましく用いることができる。還元剤としては、水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホ
ウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、等が上げられるが、メルカプト化合物が好ましい。メルカプト化合物は、Ｎ-アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が上げられるが、特に限定されない。メルカプト化合物は、溶解液として、0.1〜20％の質量濃度で、より好ましくは、0.5〜15質量％で用いることができる。
緩衝剤としては、通常用いられるｐＨ緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒ）を挙げることができる。好ましくは、生化学用のｐＨ緩衝剤が挙げられる。このような緩衝剤としては、クエン酸塩、リン酸塩または酢酸塩を含む緩衝剤、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＥＤＴＡ）、ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ／ＥＤＴＡ）、ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ／ＥＤＴＡ）、グッド緩衝剤が挙げられる。グッド緩衝剤としては、ＭＥＳ(２‐Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ)、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ(Ｂｉｓ（２‐ｈｙｄｏｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ）、ＨＥＰＥＳ（２‐［４‐（２‐Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）‐１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｘｉｎｅ‐１，４‐ｂｉｓ（２‐ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））、ＡＣＥＳ（Ｎ‐（２‐Ａｃｅｔａｍｉｎｏ）−２‐ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＣＡＰＳ（Ｎ‐Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３‐ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＴＥＳ（Ｎ‐Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２‐ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）が挙げられる。
これらの緩衝剤は、前記核酸可溶化試薬中の濃度は１〜３００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
上記核酸可溶化試薬には、消泡剤を含有させることも好ましい。上記消泡剤としては、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分が好ましく挙げられ、また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤が好ましい。
消泡剤の具体例としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルエキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−3−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、リン燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の2つの成分を組み合わせて使用することができる。また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤を使用することも好ましい。
また、上記の核酸可溶化試薬溶液は水溶性有機溶媒を含んでいても良い。この水溶性有機溶媒は、核酸可溶化試薬に含まれる各種試薬の溶解性を上げることを目的としており、アセトン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド等が挙げられるが、アルコールが好ましい。アルコールは、1級アルコール、2級アルコール、3級アルコールのいずれでも良い。
アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体をより好ましく用いることができる。これらの水溶性有機溶媒は単独または複
数組み合わせて用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸可溶化試薬溶液における濃度は１〜２０質量％であることが好ましい。
上記の核酸可溶化試薬溶液は、好ましくはｐＨ３〜８、より好ましくはｐＨ４〜７、さらに好ましくはｐＨ５〜７のものが用いられる。
検体はホモジナイズ処理することが好ましく、自動化処理適正を向上することができる。ホモジナイズ処理は、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる、高速攪拌処理を用いる、微細空隙から押し出す処理、ガラス、ステンレス、ジルコニアなどのビーズを用いる処理等で行うことができる。
ホモジナイズした検体と核酸可溶化試薬試薬とを混合する方法は、特に限定されない。混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる、この場合、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができる。
得られた核酸を含む試料溶液は次に、水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒の水溶液を添加し、水溶性有機溶媒含有試料溶液を調製する。本発明においては水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液は、少なくとも２回に分けて加えられる。核酸を含む試料溶液に添加する水溶性有機溶媒は、アルコールを好ましく用いることができる。アルコールは、1級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでもよく、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール及びその異性体を好ましく用いることができる。これら水溶性有機溶媒の水溶性有機溶媒含有試料溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。該最終濃度はさらに好ましくは、１０〜６０質量％であり、特に好ましくは、２０〜４０質量％である。添加する該水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒の水溶液の濃度は２０容量％から１００容量％、好ましくは５０容量％から１００容量％である。本発明においては水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒の水溶液は、少なくとも２回に分けて添加する。一回目の添加量は全添加量の５容量％〜９０容量％であることが好ましい。さらに好ましくは一回目の添加量は全添加量の２５容量％〜７０容量％である。
また、試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加えた後、振とう、転倒混和、回転の運動を含む少なくともいずれかの操作によって撹拌を行い、攪拌後の溶液に、さらに水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加えることが好ましい。更に好ましくは、試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加えた後、該溶液の吸引、および吐き出しを少なくとも一度含む操作によって撹拌を行い、攪拌後の溶液に、さらに水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加えることである。転倒混和、回転の運動を含む少なくともいずれかの操作と、溶液の吸引、および吐き出しを少なくとも一度含む操作の両方を行う場合には、これらの操作の順番はいずれが先であってもよい。溶液の吸引、および吐き出しには、ピペットなどを好適に使用することができる。
また、水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を２回目添加以降にもこれらの攪拌を行ってもよい。
また、得られた水溶性有機溶媒含有試料溶液は、表面張力は０．０５Ｊ／ｍ2以下であることが好ましく、また、粘度は、１〜１００００ｍＰａであることが好ましく、比重は、０．８〜１．２であることが好ましい。こうした物性の溶液にすることで、次の工程において、水溶性有機溶媒含有試料溶液を核酸吸着性多孔膜に接触後に、試料溶液を除去しやすくする。
（２）該水溶性有機溶媒含有試料溶液を固相に接触させて、固相に核酸を吸着させる工程「吸着工程」
以下に、本発明で用いる固相および吸着工程について説明する。
また、本発明の固相は、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する固相であることが好ましい。これは、固相側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と固相が引き合うようになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。好ましくは、固相は、親水基を有する固相であり、環境の極性を変化させることで、核酸と固相の親水基同士が引きあるようになると推定される。
ここで親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。
本発明において、親水基を有する固相とは、固相を形成する材料自体が、親水性基を有する固相、または固相を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入した固相を意味する。固相を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、固相を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である固相、親水基を持たない有機材料の固相を処理して親水基を導入した固相、親水基を持たない有機材料の固相に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した固相、固相を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である固相、親水基を持たない無機材料の固相を処理して親水基を導入した固相、親水基を持たない無機材料の固相に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した固相などを、使用することができるが、加工の容易性から、固相を形成する材料は有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。
親水基を有する材料の固相としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などで、形成された固相を挙げることができるが、特に水酸基を有する有機材料の固相を好ましく使用することができる。
水酸基を有する有機材料の固相として、多糖構造を有する材料が好ましく、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る有機高分子の固相をより好ましく使用することができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物を好ましく使用する事ができる。特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、99：1〜1：99である事が好ましく、90：10〜50：50である事がより好ましい。
更に好ましい水酸基を有する有機材料としては、特開2003−128691号公報に記載のアセチルセルロースの鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースの鹸化物とは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理したものであり、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物も好ましく使用することができる。より好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物を使用することである。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９であることが好ましい。更に好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比は、９０：１０〜５０：５０であることである。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率をあげるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。例えば、トリアセチルセルロースなどのアセチルセルロースの場合には、鹸化率（表面鹸化率）が約５％以上であることが好ましく、１０％以上であることが更に好ましい。また、水酸基を有する有機高分子の表面積を大きくするために、アセチルセルロースの固相を鹸化処理することが好ましい。
鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したセルロースのエステル誘導体のエステル基が加水分解され、水酸基が導入され再生セルロースとなる。こうして作成された再生セルロースは、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。また、鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度や処理時間を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲ、ＩＲ又はＸＰＳにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。
親水基を持たない有機材料の固相に親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖を固相に結合することができる。有機材料の固相にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、固相とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、固相を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする2つの方法がある。
まず、固相とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に固相と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、固相の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。固相と反応する官能基としては、固相の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。
固相を基点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖を形成させる方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で基材表面上に活性種を与え、固相と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって固相と結合させる方法を指す。基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、2−ヒドロキシエチルアクリレート、2−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。
親水基を持たない有機材料の固相に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができるが、多糖構造を有するポリマーが好ましい。
また、親水基を持たない有機材料の固相に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
親水基を有する無機材料である固相としては、シリカ化合物等で形成された固相を挙げることができる。膜形状で使用する場合、ガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第3058342号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。
親水基を持たない無機材料の固相に親水基を導入する方法としては、固相とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、固相を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する2つの方法がある。固相とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、固相を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、上記、親水基を持たない有機材料の固相とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法において、記載した親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。
親水基を持たない無機材料の固相に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセル
ロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる。
また、親水基を持たない無機材料の固相に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
親水基を持たない無機材料の固相としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭等を加工して作製した固相を挙げることができる。
本発明に固相として好適に用いられる核酸吸着性多孔膜は、溶液が内部を通過可能なものである。ここで「溶液が内部を通過可能」とは、膜の一方の面が接する空間と膜の他方の面が接する空間の間に圧力差を生じさせた場合に、高圧の空間側から低圧の空間側へと、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。または、膜に遠心力を掛けた場合に、遠心力の方向に、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。
上記の核酸吸着性多孔膜は、好適には、厚さが１０μｍ〜５００μｍである。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである。洗浄がし易い点で、厚さが薄いほど好ましい。
上記の核酸吸着性多孔膜は、表裏対称性の多孔膜であってもよいが、表裏非対称性の多孔膜を好ましく使用することができる。
上記の核酸吸着性多孔膜は、好適には、最小孔径が０．２２μｍ以上である。さらに好ましくは、最小孔径が０．５μｍ以上である。また、最大孔径と最小孔径の比が２以上である多孔膜を用いる事が好ましい。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。さらに好ましくは、最大孔径と最小孔径の比が５以上である。
上記の核酸吸着性多孔膜は、好適には、空隙率が50〜95％である。さらに好ましくは、空隙率が65〜80％である。また、バブルポイントが、0.1〜10kgf/cm2である事が好ましい。さらに好ましくは、バブルポイントが、0.2〜4kgf/cm2である。
上記の核酸吸着性多孔膜は、圧力損失が、0.1〜100kPaである事が好ましい。これにより、過圧時に均一な圧力が得られる。さらに好ましくは、圧力損失が、0.5〜50kPaである。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ100μmあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。
上記の核酸吸着性多孔膜は、25℃で1kg/cm2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜cm2あたり1分間で1〜5000mLであることが好ましい。さらに好ましくは、25℃で1kg/cm2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜cm2あたり1分間で5〜1000mLである。
上記の核酸吸着性多孔膜は、多孔膜1mgあたりの核酸の吸着量が0.1μg以上である事が好ましい。さらに好ましくは、多孔膜1mgあたりの核酸の吸着量が0.9μg以上である。
上記の核酸吸着性多孔膜は、一辺が５ｍｍの正方形の多孔膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに、１時間以内では溶解しないが４８時間以内に溶解するセルロース誘導体が、好ましい。また、一辺が５ｍｍの正方形の多孔膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬
したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体も好ましい。中でも、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体がより好ましい。
核酸吸着性多孔膜中を、水溶性有機溶媒含有試料溶液を通過させる場合、該試料溶液を一方の面から他方の面へと通過させることが、液を多孔膜へ均一に接触させることができる点で、好ましい。核酸吸着性多孔膜中を、水溶性有機溶媒含有試料溶液を通過させる場合、該試料溶液を核酸吸着性多孔膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まりし難い点で好ましい。
水溶性有機溶媒含有試料溶液を核酸吸着性多孔膜を通過させる場合の流速は、液の多孔膜への適切な接触時間を得るために、膜の面積cm2あたり、2〜1500μL/secである事が好ましい。液の多孔膜への接触時間が短すぎると十分な分離精製効果が得られず、長すぎると操作性の点から好ましくない。さらに、上記流速は、膜の面積cm2あたり、5〜700μL/secである事が好ましい。
また、使用する溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔膜は、1枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。
複数枚の核酸吸着性多孔膜は、無機材料の核酸吸着性多孔膜と有機材料の核酸吸着性多孔膜との組合せであっても良い。例えば、ガラスフィルターと再生セルロースの多孔膜との組合せを挙げることができる。また、複数枚の核酸吸着性多孔膜は、無機材料の核酸吸着性多孔膜と有機材料の核酸非吸着性多孔膜との組合せであってもよい、例えば、ガラスフィルターと、ナイロンまたはポリスルホンの多孔膜との組合せを挙げることができる。
少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。また、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔膜を複数枚収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。この場合、少なくとも二個の開口を有する容器内に収容される複数枚の核酸吸着性多孔膜は、同一のものであっても、異なるものであっても良い。
核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔膜を収容する以外、その他の部材を収容していないことが好ましい。上記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックを使用することができる。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。また、上記の容器は透明であっても、着色してあっても良い。
核酸分離精製カートリッジとして、個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段を備えている核酸分離精製カートリッジを使用する事ができる。個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段としては、バーコード、磁気テープなどが挙げられる。
また、少なくとも二個の開口を有する容器内から核酸吸着性多孔膜を容易に取り出す事が可能になっている構造を有した核酸分離精製カートリッジを使用することもできる。
（３）洗浄液を該固相に接触させて、固相に核酸が吸着した状態で固相を洗浄する工程「洗浄工程」
以下、洗浄工程について説明する。
本発明の洗浄液は、好ましくは水溶性有機溶媒を５０質量％以下の濃度で含有する水溶液であり、より好ましくは水溶性有機溶媒を１質量％以上５０質量％以下の濃度で含有する水溶液である。洗浄液は、核酸吸着性多孔膜に核酸と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、核酸吸着性多孔膜から核酸は脱離させないが不純物は脱離させる組成であることが好ましい。
洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはその異性体、ブタノールまたはその異性体、などのアルコ−ルを用いることができる。より好ましくは、これらのアルコールから選択される少なくとも１つを２０〜５０質量％含むことである。中でもエタノールを用いることが好ましい。
本発明の洗浄液は、更に水溶性塩を含有することが好ましい。水溶性塩としては、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物が好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましくナトリウム塩が最も好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は10mmol/L以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、1mol/L以下であることが好ましく、0.1mol/L以下であることがより好ましい。より好ましくは、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、さらには、塩化ナトリウムが20mmol/L以上含まれていることである。
更に、洗浄液は、カオトロピック物質を含んでいないことを特徴とする。それによって、洗浄工程に引き続く回収工程にカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばPCR反応等の酵素反応を阻害するので、後の酵素反応等を考慮すると洗浄液にカオトロッピク物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性で有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。
ここで、カオトロピック物質とは、前記したように尿素、イソチオシアン酸グアニジン、チオシナア酸グアニジン、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。
従来、核酸分離精製工程における洗浄工程の際、洗浄液がカートリッジなどの容器に対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、洗浄工程に続く回収工程への洗浄液の混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カートリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次の工程に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。
したがって、洗浄工程における洗浄液が次工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカートリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ2未満にすることが好ましい。表面張力が低いと、洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。
ここで、洗浄効率を上げる為に、水の割合を増やすことができるが、この場合、洗浄液の表面張力は上昇し、残留する液量が増える。洗浄液の表面張力が０．０３５Ｊ／ｍ2以上の場合は、カートリッジの撥水性を高めることで、残留する液量を抑えることができる
。カートリッジの撥水性を高めることで、液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量が抑制できる。撥水性を高める方法としては、カートリッジ表面にシリコン等の撥水剤をコートするか、カートリッジ成型時にシリコン等の撥水剤を練り込む等の手段があるが、これに限らない。
また、洗浄や回収操作を自動化することによって、操作が簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、迅速化のためには１回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰り返すことが好ましい。
洗浄工程において、洗浄液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給される。供給された洗浄液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が洗浄効率が優れてより好ましい。洗浄工程における洗浄液の液量は、2μl/cm2以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上するが、操作性を保ち、試料の流出を抑止するためには、200μl/cm2以下が好ましい。
洗浄工程において、洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させる場合の流速は、膜の単位面積（cm2）あたり、2〜1500μL/secであることが好ましく、5〜700μL/secであることがより好ましい。通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになるが、核酸の分離精製操作の迅速化も重要であるので上記した範囲が選択される。
洗浄工程において、洗浄液の液温は4〜70℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。また洗浄工程において、その核酸分離精製カートリッジを器械的な振動や超音波による攪拌を与えながら、または遠心分離により洗浄することもできる。
本発明に従い、核酸吸着性多孔膜を利用することにより洗浄工程を簡素化することができる。すなわち、(1)洗浄液が核酸吸着性多孔膜を通過する回数を1回でよい、(2)洗浄工程を室温でできる。(3)洗浄後、直ちに回収液をカートリッジに注入することができる。(4)前記(1)、(2)、(3)のいずれか1つもしくは2つ以上のも可能である。従来法においては、洗浄液中に含まれる有機溶媒を迅速に取り除くため、しばしば乾燥工程を必要としたが、本発明に係る核酸吸着性多孔膜は薄膜であるためにこれを省略できるからである。
従来、核酸分離精製工程において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となっている。洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多性孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと廃液容器の形状とを工夫することによって抑止することができる。
（４）回収液を該固相に接触させて、固相から核酸を脱離させる工程「回収工程」
次いで、核酸吸着性多性孔膜から核酸を脱離させて回収する工程について示す。
回収工程において、回収液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔膜を装着した核酸分離精製カー
トリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が回収効率が優れてより好ましい。
水溶性有機溶媒含有試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調整して核酸の脱離を行うことができる。分離精製された核酸を含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数10から数100μlであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量の核酸を分離精製したい場合には回収液量は1μlから数10mlの範囲で変える事ができる。
回収液としては好ましくは精製蒸留水、Tris/EDTAバッファー等が使用できる。また、回収した核酸をPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）に供する場合、PCR反応において用いる緩衝溶液(例えば、KCl 50mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、MgCl2 1.5mmol/Lを最終濃度とする水溶液)を用いることもできる。
回収液のpHは、pH2〜11であることが好ましい。さらには、pH5〜9であることが好ましい。回収液は、500mmol/L以下のイオン強度であることが好ましく、更には50〜0.01mmol/Lの塩濃度であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着核酸の溶出に効果を及ぼす。回収液は、290mmol/L以下のイオン強度であることが好ましく、さらには、90mmol/L以下の塩濃度であることが好ましい。こうすることで、核酸の回収率が向上し、より多くの核酸を回収することができる。
回収液の体積を水溶性有機溶媒含有試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(水溶性有機溶媒含有試料溶液体積)＝1：100〜99：100、更に好ましくは、(回収液体積)：(水溶性有機溶媒含有試料溶液体積)＝1：10〜9：10にすることができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。
また別の方法としては、回収液の体積を水溶性有機溶媒含有試料溶液よりも多い条件で核酸の脱離を行うことにより、希望の濃度の核酸を含む回収液を得ることができ、次工程（PCRなど）に適した濃度の核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(水溶性有機溶媒含有試料溶液体積)＝1：1〜50：1、更に好ましくは、(回収液体積)：水溶性有機溶媒含有試料溶液体積)＝1：1〜5：1にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用することにより、多孔膜からの核酸回収率の増加を図ることができる。
また、目的に応じて回収液の温度を変化させることで簡便に核酸を回収することができる。例えば、回収液の温度を0〜10℃にして多孔膜からの核酸の脱離を行うことで、酵素による分解を防止する何らかの試薬や特別な操作を加えることなく核酸分解酵素の働きを抑制して、核酸の分解を防ぎ、簡便に、効率よく核酸溶液を得ることができる。
また、回収液の温度を10〜35℃とした場合、一般的な室温で核酸の回収を実施することが出来、複雑な工程を必要とせずに核酸を脱離させて分離精製することができる。
また別の方法としては、回収液の温度を高温、例えば35〜70℃することで、多孔膜からの核酸の脱離を煩雑な操作を経ず簡便に高い回収率で実施することができる。
回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入する事がある。
回収工程においては、核酸の回収液をその後の後工程に使用できる組成にしておくことが可能である。分離精製された核酸は、しばしばPCR(ポリメラーゼチェインリアクション)法により増幅される。この場合、分離精製された核酸溶液はPCR法に適したバッファー液で希釈する必要がある。本方法による回収工程において、回収液にPCR法に適したバッファー液を用いることで、その後のPCR工程へ簡便、迅速に移行することができる。
また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解酵素の阻害剤としてはEDTAなどが上げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。
また、回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、260nmの吸収が無い素材で作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収した核酸溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。260nmに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が挙げられるがそれに限定されるものではない。
前記の核酸分離精製方法に用いる、核酸分離精製カートリッジと、(１)〜(４)の各工程に用いる試薬をキットとすることができる。
上記の、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力発生装置を用いて、水溶性有機溶媒含有試料溶液から核酸を分離精製する工程は、工程を自動で行う自動装置を用いて行うことが好ましい。それにより、操作が簡便化および迅速化するだけでなく、作業者の技能によらず一定の水準の、核酸を得ることが可能になる。
以下に、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力発生装置を用いて、水溶性有機溶媒含有試料溶液から核酸を分離精製する工程を自動で行う自動で行う自動装置の例を示すが、自動装置はこれの限定されるものではない。
自動装置は、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジを用い、該核酸分離精製カートリッジに水溶性有機溶媒含有試料溶液を注入し加圧して該試料液中の核酸を前記核酸吸着性多孔膜に吸着させた後、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去した後、前記核酸分離精製カートリッジに、回収液を分注し核酸吸着性多孔膜に吸着した核酸を脱離して回収液とともに回収する、分離精製動作を自動的に行う核酸分離精製装置であって、前記核酸分離精製カートリッジ、前記水溶性有機溶媒含有試料溶液残渣および洗浄液の排出液を収容する廃液容器および前記核酸を含む回収液を収容する回収容器を保持する搭載機構と、前記核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液および回収を分注する分注機構とを備えてなることを特徴とするものである。
（１）核酸精製カートリッジの作製
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔膜を収容する部分を持つ核酸精製カートリッジを作製する。
（２）核酸吸着性多孔膜として、トリアセチルセルロースの多孔膜を鹸化処理した多孔膜を使用し、上記（１）で作成した核酸精製カートリッジの核酸吸着性多孔膜収納部に収容する。
（３）核酸可溶化試薬原液、洗浄液、回収液およびＤＮａｓｅ溶液の調製
下記に示す処方の核酸可溶化試薬、洗浄液回収液およびＤＮａｓｅを調製する。
（核酸可溶化試薬原液）
塩酸グアニジン（和光純薬社製） 528.4g
オルフィンAK-02（日進化学工業社製） 5.59g
レオドールTWS-120V（花王社製） 32.95g
エタノール（和光純薬社製） 64.8g
Cetyl trimethyl ammonium bromide(CTAB)（和光純薬社製） 22.3g
蒸留水 575.3g
（洗浄液）
蒸留水 466.8g
1ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（pH7.5）（和光純薬社製） 7.04g
塩化ナトリウム（和光純薬社製） 3.95g
（回収液）
Tris-HCl（ｐＨ６．５） １ｍｍｏｌ／Ｌ
（ＤＮａｓｅ溶液１）
DNase（Promega社製） 360μl
DNase用buffer（Promega社製, 上記DNaseに同梱のもの） 72μl
蒸留水 288μl
（ＤＮａｓｅ溶液２）
DNase（Qiagen社製） 11.25μl
DNase用buffer（Qiagen社製, 上記DNaseに同梱のもの） 315μl
蒸留水 33.75μl
（４）核酸分離精製操作
［実施例１］
接着細胞としてＨｅＬａ細胞を用いて以下のとおりＯｎ−ｄｉｓｈ法によって、実施例１の水溶性有機溶媒含有試料溶液を得た。
培養細胞用6穴プレートにてＨｅＬａ細胞を培養液（ＭＥＭ−１０％胎児子牛血清）中５％ＣＯ2存在下３７℃で培養した。同時に培養した細胞数を計測した結果、１穴当たりの細胞数は3.12×106個であった。この培養細胞用プレート１穴から培養液を除いた後、核酸可溶化試薬原液を添加し、細胞溶解液を得た。この細胞溶解液をピペッティングを行うことにより攪拌し別の容器に回収した。
核酸可溶化試薬原液516μlに2-メルカプトエタノール4μlを加え溶解液を調製し、上記、細胞の入った容器に調製した溶解液全量を加え、ボルテックスミキサーで1分間攪拌した。その後９９．５容量％エタノールを100μｌを加え、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。さらにその後９９．５容量％エタノール180μｌを加え、終エタノール濃度３５質量％にし、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。
このようにして得られた実施例１の水溶性有機溶媒含有試料溶液を、上記（１）及び（２）で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した水溶性有機溶媒含有試料溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、圧力発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを３０容量％の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を3回繰り返した。続いて、圧力発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液100μｌを注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
［比較例１］
接着細胞としてＨｅＬａ細胞を用いて以下のとおりＯｎ−ｄｉｓｈ法によって、比較例１の核酸混合物溶液を得た。
培養細胞用6穴プレートにてＨｅＬａ細胞を培養液（ＭＥＭ−１０％胎児子牛血清）中５％ＣＯ2存在下３７℃で培養した。同時に培養した細胞数を計測した結果、１穴当たりの細胞数は3.12×106個であった。この培養細胞用プレート１穴から培養液を除いた後、核酸可溶化試薬原液を添加し、細胞溶解液を得た。この細胞溶解液をピペッティングを行うことにより攪拌し別の容器に回収した。
核酸可溶化試薬原液350μlに2-メルカプトエタノール3.5μlを加えて溶解液を調製し、上記、細胞の入った容器に調製した溶解液全量を加え、ボルテックスミキサーで1分間攪拌する。その後７０容量％エタノール水溶液を３５０μｌを加え、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌する。
撹拌後、上記（１）及び（２）で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸混合物溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを３０容量％の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を3回繰り返す。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液100μｌを注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
［実施例２］
ヒト前骨髄性白血病細胞(ＨＬ６０)培養液を用意した。細胞数が3×106個になるように調製し、Ｃａ2+、Ｍｇ2+フリーPBSで細胞を洗浄した。4℃、300g、5分、スイングローターで遠心し、浮遊細胞をペレット状にした後、上清を除去し、タッピングによって細胞を再懸濁した。核酸可溶化試薬原液516μlに2-メルカプトエタノール4μlを加え溶解液を調製し、上記、細胞の入った容器に調製した溶解液全量を加え、ボルテックスミキサーで1分間攪拌した。その後９９．５容量％エタノール100μｌを加え、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。さらにその後９９．５容量％エタノール180μｌを加え、終エタノール濃度３５質量％にし、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。PBSでの細胞洗浄を開始してから、撹拌終了まで、１０分であった。
このようにして得られた実施例２の水溶性有機溶媒含有試料溶液を、上記（１）及び（２）で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した水溶性有機溶媒含有試料溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、圧力発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを３０容量％の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。次に圧力発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口より、核酸分離精製カートリッジ内の膜上にＤＮａｓｅ溶液40μｌを乗せ、5分、置いた後、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを３０容量％の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。別の同様の操作をさらにもう一度、繰り返した。続いて、圧力発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液100μｌを注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。なお、実施例２は、ＤＮａｓｅ溶液として、ＤＮａｓｅ溶液１を用いて４回試行し、また別にＤＮａｓｅ溶液２を用いて４回試行した。
［比較例２］
ヒト前骨髄性白血病細胞(HL60)培養液を用意した。細胞数が3×106個になるように調製し、Ｃａ2+、Ｍｇ2+フリーPBSで細胞を洗浄した。4℃、300g、5分、スイングローターで遠心し、浮遊細胞をペレット状にした後、上清を除去し、タッピングによって細胞を再懸濁した。核酸可溶化試薬原液350μlに2-メルカプトエタノール3.5μlを加え溶解液を調製し、上記、細胞の入った容器に調製した溶解液全量を加え、ボルテックスミキサーで1分間攪拌した。その後７０容量％エタノール水溶液を３５０μｌを加え、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。PBSでの細胞洗浄を開始してから、撹拌終了まで、1０分であった。
撹拌後、上記（１）及び（２）で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸混合物溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを３０容量％の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。次に圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口より、核酸分離精製カートリッジ内の膜上にＤＮａｓｅ溶液40μｌを乗せ、5分、置いた後、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを３０容量％の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作をさらにもう一度、繰り返した。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液100μｌを注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。なお、比較例２は、ＤＮａｓｅ溶液として、ＤＮａｓｅ溶液１を用いて４回試行し、また別にＤＮａｓｅ溶液２を用いて４回試行した。
［実施例３］
ヒト前骨髄性白血病細胞(HL60)培養液を用意した。細胞数が5×106個になるように調製
し、Ｃａ2+、Ｍｇ2+フリーPBSで細胞を洗浄した。4℃、300g、5分、スイングローターで遠心し、浮遊細胞をペレット状にした後、上清を除去し、タッピングによって細胞を再懸濁した。核酸可溶化試薬原液516μlに2-メルカプトエタノール4μlを加え溶解液を調整し、上記、細胞の入った容器に調製した溶解液全量を加え、ボルテックスミキサーで1分間攪拌する。その後９９．５容量％エタノールを100μｌを加え、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。さらにその後９９．５容量％エタノール180μｌを加え、終エタノール濃度３５質量％にし、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。
このようにして得られた実施例３の水溶性有機溶媒含有試料溶液を、上記（１）及び（２）で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した水溶性有機溶媒含有試料溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを３０容量％の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を3回繰り返した。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液100μｌを注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
［比較例３］
ヒト前骨髄性白血病細胞(HL60)培養液を用意する。細胞数が5×106個になるように調製し、Ｃａ2+、Ｍｇ2+フリーPBSで細胞を洗浄する。4℃、300g、5分、スイングローターで遠心し、浮遊細胞をペレット状にした後、上清を除去し、タッピングによって細胞を再懸濁した。核酸可溶化試薬原液516μlに2-メルカプトエタノール4μlを加え溶解液を調製し、上記、細胞の入った容器に調製した溶解液全量を加え、ボルテックスミキサーで1分間攪拌した。その後99.5容量％エタノール水溶液を２８０μｌを加え、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。その後、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。
撹拌後、上記（１）及び（２）で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸混合物溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを３０容量％の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を3回繰り返した。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液100μｌを注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
表１に各試料において使用した溶解液、溶解原液（核酸可溶化試薬原液）と水溶性有機溶媒を含む溶液の量を示す。
Figure 2006211973
（５）溶解液の膜通過にかかる時間と回収された核酸量
上記各試料において、得られた核酸を含む回収液中の核酸の量を230nmの吸光度から、
その濃度を求めた。また、得られた回収液の核酸濃度と溶解液の膜の通過にかかる時間を計測した。結果を表２に示す。
Figure 2006211973
表１及び表２の実施例１と比較例１、実施例２と比較例２との比較から明らかなように、溶解液量を520μl、添加するエタノール濃度を99.5容量％にし、量を280μlにし、二度に分けて添加した場合のときは溶解液の膜を通過する時間が短くなることがわかる。この結果は、本発明の方法を用いることにより、より多くの細胞を処理することが出来ることを示している。高濃度のエタノールを用い、溶解液量を増やし、エタノールを二度に分けて加えることで処理できる生体材料の上限が上がることが分かる。また、実施例３と比較例３との比較から全体の液量を変えずに、99.5容量％エタノールを二度に分けて添加した場合も一度に添加した場合に比べ、処理できる細胞数が多くなっていることがわかる。

Claims (20)

  1. （１）生体材料に溶解液を加え、核酸を含む試料溶液を作成し、
    さらに、該試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を加え、水溶性有機溶媒含有試料溶液を調製する工程、
    （２）該水溶性有機溶媒含有試料溶液を固相に接触させて、固相に核酸を吸着させる工程、
    （３）洗浄液を該固相に接触させて、固相に核酸が吸着した状態で固相を洗浄する工程、（４）回収液を該固相に接触させて、固相から核酸を脱離させる工程
    を含む核酸の分離精製方法であって、
    上記（１）の工程において、水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を、少なくとも２回に分けて加えることを特徴とする核酸の分離精製方法。
  2. 上記（１）の工程において、
    試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加えた後、
    振とう、転倒混和、回転の運動を含む少なくともいずれかの操作によって撹拌を行い、
    攪拌後の溶液に、さらに水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加える請求項1に記載の核酸の分離精製方法。
  3. 上記（１）の工程において、
    試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加えた後、
    該溶液の吸引、および吐き出しを少なくとも一度含む操作によって撹拌を行い、
    攪拌後の溶液に、さらに水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加える請求項1又は２に記載の核酸の分離精製方法。
  4. 上記（１）の工程において、
    水溶性有機溶媒含有試料溶液における水溶性有機溶媒の濃度が、５〜９０質量％である請求項１〜３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  5. 上記（１）の工程において、
    水溶性有機溶媒含有試料溶液における水溶性有機溶媒の濃度が、１０〜６０質量％である請求項１〜３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  6. 上記（１）の工程において、
    水溶性有機溶媒含有試料溶液における水溶性有機溶媒の濃度が、２０〜４０質量％である請求項１〜３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  7. 固相が、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する、有機高分子からなる多孔膜である請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  8. 有機高分子が、水酸基を有する請求項７に記載の核酸の分離精製方法。
  9. 多孔膜が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる請求項７又は８に記載の核酸の分離精製方法。
  10. 多孔膜が、表裏非対称性の膜である請求項７〜９のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  11. 溶解液が、核酸可溶化試薬である請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  12. 生体材料が動物組織である請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  13. 核酸可溶化試薬が、カオトロピック塩、核酸安定化剤、界面活性剤、緩衝剤及び消泡剤から選ばれる少なくとも一つを含む請求項１１に記載の核酸の分離精製方法。
  14. カオトロピック塩が、塩酸グアニジンおよびグアニジンチオシアン酸塩から選ばれる少なくとも一つを含む請求項１３に記載の核酸の分離精製方法。
  15. 水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ならびにブタノール及びその異性体から選択される少なくとも１つである請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  16. 洗浄液が、メタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ならびにブタノール及びその異性体から選択される少なくとも１つを２０〜５０質量％含む請求項１〜１５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  17. 洗浄液が、塩化物を１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌ含む溶液である、請求項１〜１６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  18. 上記（２）、（３）及び（４）の各工程において、水溶性有機溶媒含有試料溶液、洗浄液又は回収液の多孔膜への通過を、少なくとも二個の開口を有する容器内に溶液が内部を通過可能な多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジ及び圧力発生装置を用いて行い、且つ、該圧力発生装置が、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されるポンプである請求項７〜１７のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  19. 請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うための、核酸分離精製カートリッジと試薬のキット。
  20. 請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸分離精製方法を自動で行う装置。
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