JP2006211973A - 核酸の分離精製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(1)生体材料に溶解液を加え、核酸を含む試料溶液を作成し、
さらに、該試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を加え、水溶性有機溶媒含有試料溶液を調製する工程、
(2)該水溶性有機溶媒含有試料溶液を固相に接触させて、固相に核酸を吸着させる工程、
(3)洗浄液を該固相に接触させて、固相に核酸が吸着した状態で固相を洗浄する工程、(4)回収液を該固相に接触させて、固相から核酸を脱離させる工程
を含む核酸の分離精製方法であって、
上記(1)の工程において、水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を、少なくとも2回に分けて加えることを特徴とする核酸の分離精製方法。
【選択図】なし
Description
一般に、表面に水酸基を持つ有機高分子等からなる多孔膜に核酸を吸着させる際には、核酸を含む溶液に水溶性有機溶媒を含む溶液が加えられる。通常、このときに用いられる水溶性有機溶媒は主にエタノール水溶液である。一般に、核酸を含む溶液に添加した後の固相に核酸を吸着させる溶液における最終のエタノール濃度(終エタノール濃度)は20
質量%〜60質量%が好ましいとされている。
1. (1)生体材料に溶解液を加え、核酸を含む試料溶液を作成し、
さらに、該試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を加え、水溶性有機溶媒含有試料溶液を調製する工程、
(2)該水溶性有機溶媒含有試料溶液を固相に接触させて、固相に核酸を吸着させる工程、
(3)洗浄液を該固相に接触させて、固相に核酸が吸着した状態で固相を洗浄する工程、(4)回収液を該固相に接触させて、固相から核酸を脱離させる工程
を含む核酸の分離精製方法であって、
上記(1)の工程において、水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を、少なくとも2回に分けて加えることを特徴とする核酸の分離精製方法。
試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加えた後、
振とう、転倒混和、回転の運動を含む少なくともいずれかの操作によって撹拌を行い、
攪拌後の溶液に、さらに水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加える上記第1項に記載の核酸の分離精製方法。
試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加えた後、
該溶液の吸引、および吐き出しを少なくとも一度含む操作によって撹拌を行い、
攪拌後の溶液に、さらに水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加える上記第1項又は第2項に記載の核酸の分離精製方法。
水溶性有機溶媒含有試料溶液における水溶性有機溶媒の濃度が、5〜90質量%である上記第1項〜第3項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
水溶性有機溶媒含有試料溶液における水溶性有機溶媒の濃度が、10〜60質量%である上記第1項〜第3項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
水溶性有機溶媒含有試料溶液における水溶性有機溶媒の濃度が、20〜40質量%である上記第1項〜第3項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
り、固相に核酸を吸着させる溶液の最終液量を減量できることになるので、最初に生体材料に加える溶解液の量を増やすことができる。本発明の構成においては、水溶性有機溶媒は、複数回に分けて加えるものであり、これにより高濃度の水溶性有機溶媒を用いても、混和を容易にすることが可能となる。以上により、より多くの生体材料を処理することが出来るようになり、核酸を迅速に回収することが出来るようになる。使用する固相は、特に限られないが、好ましくは多孔膜を使用することであり、該多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジを用い、該多孔膜としてイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する膜を用いることが本発明の効果を得る上でより好ましく、更に、本発明においては、二個の開口を有する容器内に有機高分子からなる多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジを使用することが好ましい。
また本発明によれば、分離性能に優れ、洗浄効率がよく、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である多孔膜を使用して、生体材料から、より安価で、簡便に核酸を選択的に回収することができる。
(1)生体材料に溶解液を加え、核酸を含む試料溶液を作成し、
さらに、該試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を加え、水溶性有機溶媒含有試料溶液を作成する工程(以下、「水溶性有機溶媒含有試料溶液調製工程」とも言う。)、
(2)該水溶性有機溶媒含有試料溶液を固相に接触させて、固相に核酸を吸着させる工程(以下、「吸着工程」とも言う。)、
(3)洗浄液を該固相に接触させて、固相に核酸が吸着した状態で固相を洗浄する工程(以下、「洗浄工程」とも言う。)、
(4)回収液を該固相に接触させて、固相から核酸を脱離させる工程(以下、「回収工程」とも言う。)
を少なくとも含むものである。
使用する固相は特に限定されないが、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔膜(以下、「核酸吸着性多孔膜」とも言う。)が好ましい。
すなわち、(a)水溶性有機溶媒含有試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内
に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、(b)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジト内を加圧状態にし、注入した水溶性有機溶媒含有試料溶液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜内に核酸を吸着させる工程、(c)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、(d)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、(e)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、(f)核酸分離精製カートリッジの一の開口に結合された圧力発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜内から核酸を脱離させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程が挙げることができる。
検体は、最初に溶解液を加えて「核酸を含む試料溶液」を得る。溶解液としては、核酸を溶出する試薬を含む水溶液(核酸可溶化試薬)を用い、細胞膜・核膜を溶解する処理を行うことが好ましい。さらに水溶性有機溶媒、又は水溶性有機溶媒を含む溶液を加えることにより、核酸が水溶液内に分散し、「水溶性有機溶媒含有試料溶液」を得る。
これにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、検体の微量化及び迅速化が可能となる。
ウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、等が上げられるが、メルカプト化合物が好ましい。メルカプト化合物は、N-アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が上げられるが、特に限定されない。メルカプト化合物は、溶解液として、0.1〜20%の質量濃度で、より好ましくは、0.5〜15質量%で用いることができる。
これらの緩衝剤は、前記核酸可溶化試薬中の濃度は1〜300mmol/Lであることが好ましい。
アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体をより好ましく用いることができる。これらの水溶性有機溶媒は単独または複
数組み合わせて用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸可溶化試薬溶液における濃度は1〜20質量%であることが好ましい。
また、水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を2回目添加以降にもこれらの攪拌を行ってもよい。
以下に、本発明で用いる固相および吸着工程について説明する。
ロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる。
上記の核酸吸着性多孔膜は、好適には、最小孔径が0.22μm以上である。さらに好ましくは、最小孔径が0.5μm以上である。また、最大孔径と最小孔径の比が2以上である多孔膜を用いる事が好ましい。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。さらに好ましくは、最大孔径と最小孔径の比が5以上である。
したときに1時間以内に溶解するが、ジクロロメタン5mLに浸漬したときには24時間以内に溶解しないセルロース誘導体も好ましい。中でも、一辺が5mmの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸5mLに浸漬したときに1時間以内に溶解するが、ジクロロメタン5mLに浸漬したときには24時間以内に溶解しないセルロース誘導体がより好ましい。
以下、洗浄工程について説明する。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は10mmol/L以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、1mol/L以下であることが好ましく、0.1mol/L以下であることがより好ましい。より好ましくは、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、さらには、塩化ナトリウムが20mmol/L以上含まれていることである。
ここで、カオトロピック物質とは、前記したように尿素、イソチオシアン酸グアニジン、チオシナア酸グアニジン、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。
。カートリッジの撥水性を高めることで、液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量が抑制できる。撥水性を高める方法としては、カートリッジ表面にシリコン等の撥水剤をコートするか、カートリッジ成型時にシリコン等の撥水剤を練り込む等の手段があるが、これに限らない。
次いで、核酸吸着性多性孔膜から核酸を脱離させて回収する工程について示す。
回収工程において、回収液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔膜を装着した核酸分離精製カー
トリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口(核酸を含む試料溶液を注入した開口)から供給され、該開口に結合された圧力発生装置(例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど)を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が回収効率が優れてより好ましい。
内径7mm、核酸吸着性多孔膜を収容する部分を持つ核酸精製カートリッジを作製する。
下記に示す処方の核酸可溶化試薬、洗浄液回収液およびDNaseを調製する。
塩酸グアニジン(和光純薬社製) 528.4g
オルフィンAK-02(日進化学工業社製) 5.59g
レオドールTWS-120V(花王社製) 32.95g
エタノール(和光純薬社製) 64.8g
Cetyl trimethyl ammonium bromide(CTAB)(和光純薬社製) 22.3g
蒸留水 575.3g
蒸留水 466.8g
1mol/Lトリス塩酸(pH7.5)(和光純薬社製) 7.04g
塩化ナトリウム(和光純薬社製) 3.95g
Tris-HCl(pH6.5) 1mmol/L
DNase(Promega社製) 360μl
DNase用buffer(Promega社製, 上記DNaseに同梱のもの) 72μl
蒸留水 288μl
DNase(Qiagen社製) 11.25μl
DNase用buffer(Qiagen社製, 上記DNaseに同梱のもの) 315μl
蒸留水 33.75μl
[実施例1]
接着細胞としてHeLa細胞を用いて以下のとおりOn−dish法によって、実施例1の水溶性有機溶媒含有試料溶液を得た。
培養細胞用6穴プレートにてHeLa細胞を培養液(MEM−10%胎児子牛血清)中5%CO2存在下37℃で培養した。同時に培養した細胞数を計測した結果、1穴当たりの細胞数は3.12×106個であった。この培養細胞用プレート1穴から培養液を除いた後、核酸可溶化試薬原液を添加し、細胞溶解液を得た。この細胞溶解液をピペッティングを行うことにより攪拌し別の容器に回収した。
核酸可溶化試薬原液516μlに2-メルカプトエタノール4μlを加え溶解液を調製し、上記、細胞の入った容器に調製した溶解液全量を加え、ボルテックスミキサーで1分間攪拌した。その後99.5容量%エタノールを100μlを加え、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。さらにその後99.5容量%エタノール180μlを加え、終エタノール濃度35質量%にし、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。
このようにして得られた実施例1の水溶性有機溶媒含有試料溶液を、上記(1)及び(2)で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した水溶性有機溶媒含有試料溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、圧力発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを30容量%の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を3回繰り返した。続いて、圧力発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液100μlを注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
接着細胞としてHeLa細胞を用いて以下のとおりOn−dish法によって、比較例1の核酸混合物溶液を得た。
培養細胞用6穴プレートにてHeLa細胞を培養液(MEM−10%胎児子牛血清)中5%CO2存在下37℃で培養した。同時に培養した細胞数を計測した結果、1穴当たりの細胞数は3.12×106個であった。この培養細胞用プレート1穴から培養液を除いた後、核酸可溶化試薬原液を添加し、細胞溶解液を得た。この細胞溶解液をピペッティングを行うことにより攪拌し別の容器に回収した。
核酸可溶化試薬原液350μlに2-メルカプトエタノール3.5μlを加えて溶解液を調製し、上記、細胞の入った容器に調製した溶解液全量を加え、ボルテックスミキサーで1分間攪拌する。その後70容量%エタノール水溶液を350μlを加え、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌する。
撹拌後、上記(1)及び(2)で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸混合物溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを30容量%の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を3回繰り返す。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液100μlを注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
ヒト前骨髄性白血病細胞(HL60)培養液を用意した。細胞数が3×106個になるように調製し、Ca2+、Mg2+フリーPBSで細胞を洗浄した。4℃、300g、5分、スイングローターで遠心し、浮遊細胞をペレット状にした後、上清を除去し、タッピングによって細胞を再懸濁した。核酸可溶化試薬原液516μlに2-メルカプトエタノール4μlを加え溶解液を調製し、上記、細胞の入った容器に調製した溶解液全量を加え、ボルテックスミキサーで1分間攪拌した。その後99.5容量%エタノール100μlを加え、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。さらにその後99.5容量%エタノール180μlを加え、終エタノール濃度35質量%にし、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。PBSでの細胞洗浄を開始してから、撹拌終了まで、10分であった。
このようにして得られた実施例2の水溶性有機溶媒含有試料溶液を、上記(1)及び(2)で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した水溶性有機溶媒含有試料溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、圧力発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを30容量%の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。次に圧力発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口より、核酸分離精製カートリッジ内の膜上にDNase溶液40μlを乗せ、5分、置いた後、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを30容量%の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。別の同様の操作をさらにもう一度、繰り返した。続いて、圧力発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液100μlを注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。なお、実施例2は、DNase溶液として、DNase溶液1を用いて4回試行し、また別にDNase溶液2を用いて4回試行した。
ヒト前骨髄性白血病細胞(HL60)培養液を用意した。細胞数が3×106個になるように調製し、Ca2+、Mg2+フリーPBSで細胞を洗浄した。4℃、300g、5分、スイングローターで遠心し、浮遊細胞をペレット状にした後、上清を除去し、タッピングによって細胞を再懸濁した。核酸可溶化試薬原液350μlに2-メルカプトエタノール3.5μlを加え溶解液を調製し、上記、細胞の入った容器に調製した溶解液全量を加え、ボルテックスミキサーで1分間攪拌した。その後70容量%エタノール水溶液を350μlを加え、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。PBSでの細胞洗浄を開始してから、撹拌終了まで、10分であった。
撹拌後、上記(1)及び(2)で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸混合物溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを30容量%の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。次に圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口より、核酸分離精製カートリッジ内の膜上にDNase溶液40μlを乗せ、5分、置いた後、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを30容量%の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作をさらにもう一度、繰り返した。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液100μlを注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。なお、比較例2は、DNase溶液として、DNase溶液1を用いて4回試行し、また別にDNase溶液2を用いて4回試行した。
ヒト前骨髄性白血病細胞(HL60)培養液を用意した。細胞数が5×106個になるように調製
し、Ca2+、Mg2+フリーPBSで細胞を洗浄した。4℃、300g、5分、スイングローターで遠心し、浮遊細胞をペレット状にした後、上清を除去し、タッピングによって細胞を再懸濁した。核酸可溶化試薬原液516μlに2-メルカプトエタノール4μlを加え溶解液を調整し、上記、細胞の入った容器に調製した溶解液全量を加え、ボルテックスミキサーで1分間攪拌する。その後99.5容量%エタノールを100μlを加え、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。さらにその後99.5容量%エタノール180μlを加え、終エタノール濃度35質量%にし、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。
このようにして得られた実施例3の水溶性有機溶媒含有試料溶液を、上記(1)及び(2)で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した水溶性有機溶媒含有試料溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを30容量%の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を3回繰り返した。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液100μlを注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
ヒト前骨髄性白血病細胞(HL60)培養液を用意する。細胞数が5×106個になるように調製し、Ca2+、Mg2+フリーPBSで細胞を洗浄する。4℃、300g、5分、スイングローターで遠心し、浮遊細胞をペレット状にした後、上清を除去し、タッピングによって細胞を再懸濁した。核酸可溶化試薬原液516μlに2-メルカプトエタノール4μlを加え溶解液を調製し、上記、細胞の入った容器に調製した溶解液全量を加え、ボルテックスミキサーで1分間攪拌した。その後99.5容量%エタノール水溶液を280μlを加え、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。その後、ボルテックスミキサーで5秒間撹拌した。
撹拌後、上記(1)及び(2)で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸混合物溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、エタノールを30容量%の濃度で含む洗浄液500μlを注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を3回繰り返した。続いて、圧力発生装置を外し上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液100μlを注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
上記各試料において、得られた核酸を含む回収液中の核酸の量を230nmの吸光度から、
その濃度を求めた。また、得られた回収液の核酸濃度と溶解液の膜の通過にかかる時間を計測した。結果を表2に示す。
Claims (20)
- (1)生体材料に溶解液を加え、核酸を含む試料溶液を作成し、
さらに、該試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を加え、水溶性有機溶媒含有試料溶液を調製する工程、
(2)該水溶性有機溶媒含有試料溶液を固相に接触させて、固相に核酸を吸着させる工程、
(3)洗浄液を該固相に接触させて、固相に核酸が吸着した状態で固相を洗浄する工程、(4)回収液を該固相に接触させて、固相から核酸を脱離させる工程
を含む核酸の分離精製方法であって、
上記(1)の工程において、水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を、少なくとも2回に分けて加えることを特徴とする核酸の分離精製方法。 - 上記(1)の工程において、
試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加えた後、
振とう、転倒混和、回転の運動を含む少なくともいずれかの操作によって撹拌を行い、
攪拌後の溶液に、さらに水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加える請求項1に記載の核酸の分離精製方法。 - 上記(1)の工程において、
試料溶液に水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加えた後、
該溶液の吸引、および吐き出しを少なくとも一度含む操作によって撹拌を行い、
攪拌後の溶液に、さらに水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒を含む溶液を少なくとも一回加える請求項1又は2に記載の核酸の分離精製方法。 - 上記(1)の工程において、
水溶性有機溶媒含有試料溶液における水溶性有機溶媒の濃度が、5〜90質量%である請求項1〜3のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。 - 上記(1)の工程において、
水溶性有機溶媒含有試料溶液における水溶性有機溶媒の濃度が、10〜60質量%である請求項1〜3のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。 - 上記(1)の工程において、
水溶性有機溶媒含有試料溶液における水溶性有機溶媒の濃度が、20〜40質量%である請求項1〜3のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。 - 固相が、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する、有機高分子からなる多孔膜である請求項1〜6のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 有機高分子が、水酸基を有する請求項7に記載の核酸の分離精製方法。
- 多孔膜が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる請求項7又は8に記載の核酸の分離精製方法。
- 多孔膜が、表裏非対称性の膜である請求項7〜9のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 溶解液が、核酸可溶化試薬である請求項1〜10のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 生体材料が動物組織である請求項1〜11のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 核酸可溶化試薬が、カオトロピック塩、核酸安定化剤、界面活性剤、緩衝剤及び消泡剤から選ばれる少なくとも一つを含む請求項11に記載の核酸の分離精製方法。
- カオトロピック塩が、塩酸グアニジンおよびグアニジンチオシアン酸塩から選ばれる少なくとも一つを含む請求項13に記載の核酸の分離精製方法。
- 水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ならびにブタノール及びその異性体から選択される少なくとも1つである請求項1〜14のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 洗浄液が、メタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ならびにブタノール及びその異性体から選択される少なくとも1つを20〜50質量%含む請求項1〜15のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 洗浄液が、塩化物を10mmol/L〜1mol/L含む溶液である、請求項1〜16のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 上記(2)、(3)及び(4)の各工程において、水溶性有機溶媒含有試料溶液、洗浄液又は回収液の多孔膜への通過を、少なくとも二個の開口を有する容器内に溶液が内部を通過可能な多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジ及び圧力発生装置を用いて行い、且つ、該圧力発生装置が、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されるポンプである請求項7〜17のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 請求項1〜18のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うための、核酸分離精製カートリッジと試薬のキット。
- 請求項1〜18のいずれかに記載の核酸分離精製方法を自動で行う装置。
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