KR20100115368A

KR20100115368A - 핵산 시료의 제조 방법, 및, 그것을 사용한 핵산 증폭물의 제조 방법

Info

Publication number: KR20100115368A
Application number: KR1020107020466A
Authority: KR
Inventors: 마사히로 고즈카
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2009-01-16
Filing date: 2010-01-15
Publication date: 2010-10-27
Also published as: KR20130069866A; WO2010082631A1; KR101512709B1; EP2383335A4; EP2383335A1; US20110275126A1; JP5570422B2; JPWO2010082631A1; CN102105587A; EP2383335B1

Abstract

위험성이 높은 카오트로픽염(chaotropic salt) 등을 대량으로 사용할 필요가 없고, 특수한 담체(擔體)에 제한되지 않고, 안정성이 뛰어나고, 간편한 핵산 시료의 제조 방법 및 그것을 사용한 핵산 증폭물의 제조 방법을 제공한다. 세포를 함유하는 세포 시료에 대해, 상기 세포로부터 핵산 복합물을 방출시키고, 이 처리액을 담체와 접촉시킴으로써 상기 핵산 복합체를 상기 담체에 유지시킨다. 그리고, 분산매의 존재 하, 상기 담체에 가열 처리를 실시함으로써, 상기 분산매 중에 게놈이나 미토콘드리아 등의 DNA 및 RNA를 방출시킨다. 이것에 의해 핵산 시료를 회수할 수 있다.

Description

핵산 시료의 제조 방법, 및, 그것을 사용한 핵산 증폭물의 제조 방법{PROCESS FOR PRODUCING NUCLEIC ACID SAMPLE, AND PROCESS FOR PRODUCING NUCLEIC ACID AMPLIFICATION PRODUCT USING THE NUCLEIC ACID SAMPLE}

본 발명은, 세포를 함유하는 세포 시료로부터 핵산을 회수하여 핵산 시료를 제조하는 방법, 및, 그것을 사용한 핵산 증폭물의 제조 방법에 관한 것이다.

의료 분야에 있어서, 감염증 및 유전자 질환 등을 유전자 레벨로 진단하는 방법으로서, 환자로부터 채취한 DNA 등의 핵산을 주형으로 하여 핵산 증폭을 행하여, 특정한 변이 또는 1염기 다형(SNP)을 해석하는 방법이 널리 실시되고 있다. 핵산은, 통상, 환자의 전혈로부터 회수되지만, 전혈에는, 적혈구나 혈장 등의 다양한 성분이 함유되고, 그 중에는, 다량으로 잔존하면, 후의 증폭 반응에 영향을 미치는 성분도 존재한다. 또한, 핵산은, 일반적으로 백혈구에 함유되지만, 핵산을 방출한 후의 백혈구의 잔해도, 후의 증폭 반응에 영향을 미칠 가능성이 있다. 이 때문에, 환자의 혈액 시료로부터 주형이 되는 핵산을 회수하기에 있어는, 백혈구로부터 핵산을 방출시키고, 또한, 불필요한 성분을 어느 정도 제거하는 것이 필요로 되고 있다.

또한, 근래, 유전자의 해석 장치 및 그것에 사용하는 칩 등의 툴의 소형화가 요구되고 있다. 그리고, 그것에 따라, 소량의 전혈로부터 효율좋게 주형이 되는 핵산을 회수하는 것도 필요로 되고 있다. 이와 같이, 불필요한 성분의 제거 및 소량의 생체 시료로부터의 핵산의 고효율 회수가 요구되므로, 이하와 같은 방법이 개시되어 있다.

우선, 제1 방법으로서, 고농도의 카오트로픽염(chaotropic salt)의 존재 하에서, 핵산을 실리카 입자에 결합시키는 방법을 들 수 있다(특허문헌 1). 이 방법에 의하면, 핵산이 실리카 입자에 결합하기 때문에, 핵산과 실리카 입자와의 복합체를 액체 획분(劃分)과 분리함으로써, 핵산을 회수할 수 있다. 그러나, 카오트로픽염은, 부식성을 갖는 변성제이며, 인체 및 환경에의 영향이 문제시되고 있다. 또한, 카오트로픽염은, 핵산과 실리카 입자와의 결합에 필수이지만, DNA 폴리머라제 및 제한 효소 등의 많은 효소의 반응을 저해하기 때문에, 에탄올 등의 핵산 불용성의 유기 용매에 의한 세정이 필요하다. 그러나, 에탄올 등의 유기 용매도, 여러가지 효소 반응을 저해하기 때문에, 예를 들면, 건조에 의해 완전하게 제거하는 것이 필요하며, 조작이 번잡하다는 문제가 있다. 또한, 상기 유기 용매는, 통상, 휘발성이므로, 취급도 곤란하다. 또한, 이 방법에서는, 핵산을 회수하기 위한 담체(擔體)가, 실리카 및 그 유도체의 입자에 한정되고, 또한, 시약도, 카오트로픽염을 함유하는 특수한 시약에 한정된다. 이 때문에, 이들 이외의 담체나 시약으로 대용할 수 없어, 비용 및 제조에 수고가 든다는 문제가 있다.

제2 방법은, 생체 시료를 계면활성제의 존재 하, 비드상 지지체에 접촉시킴으로써, 상기 생체 시료 중의 DNA를 상기 지지체에 결합시켜, 회수하는 방법이다(특허문헌 2). 이 방법에서는, DNA는, 겔상의 DNA-비드 복합체로서 회수할 수 있다. 그러나, 이 방법에서는, 생체 시료로부터 충분량의 DNA를 방출시키기 위해서, 다량의 세포 현탁액을 계면활성제로 처리할 필요가 있어, 결과적으로, 샘플량이 많아져, 효율좋게 비드와 접촉할 수 없을 우려가 있다. 이 때문에, 미리, 원심 여과 등에 의해 세포를 농축하는, 혹은, 불필요한 세포나 물질을 제거하고나서 필요한 세포를 농축하는 등의 전처리가 생겨, 조작이 번잡하게 된다. 또한, 이 복합체는, 피펫팅 및 보르텍스(vortex) 혼합 등의 조작으로 간단하게 파괴되어, DNA의 수량이 현저하게 감소한다는 문제가 있다. 이 때문에, 서서히 조작하거나, 또는, 자성 비드를 사용하여, DNA가 결합한 자성 비드를 자석에 의해 회수함으로써, 액상으로부터 분리할 필요가 있다.

제3 방법은, 세포 추출액을 부직포에 접촉시킴으로써, 상기 세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키는 방법이다(특허문헌 3). 그러나, 이 방법에 의하면, 핵산을 부직포에 흡착시키기 위해서, 상기 세포 추출액을 고(高)염농도 조건으로 할 필요가 있다. 이 때문에, 얻어진 핵산을 핵산 증폭에 사용하는 경우, 예를 들면, 염에 의한 영향을 회피하기 위해서, 미리, 염을 제거할 필요가 있어, 조작이 번잡하다. 또한, 핵산은 부직포에 매우 강고하게 부착하기 때문에, 부직포로부터의 DNA의 용출이 곤란하다. 이 때문에, 용출은, 극히 가혹한 환경 하에서의 처리, 예를 들면, pH12와 같은 강알칼리 조건 하에서의 장시간 가열 처리, 그 밖에도, 활성 산소로의 처리 등이 필요하게 된다. 이와 같은 방법에서는, 조작이 번잡할 뿐아니라, 용출에 의해 핵산에 손상이 생길 가능성이 극히 높다고 생각된다.

[선행기술문헌]

[특허문헌]

특허문헌 1 : 일본 특허 제2680462호 공보

특허문헌 2 : 일본 특허 제3787354호 공보

특허문헌 3 : 국제공개 제03/006650호

[발명의 개요]

[발명이 해결하고자 하는 과제]

그래서, 본 발명은, 종래와 같이, 예를 들면, 위험성이 높은 카오트로픽염 등을 대량으로 사용할 필요가 없어, 특수한 담체에 제한되지 않고, 안전성이 뛰어나고, 간편한 핵산 시료의 제조 방법 및 그것을 사용한 핵산 증폭물의 제조 방법의 제공을 목적으로 한다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

본 발명의 핵산 시료의 제조 방법은, 세포로부터 핵산을 회수하는 핵산 시료의 제조 방법으로서, 하기 (A)∼(E) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

(A) 상기 세포를 함유하는 세포 시료에 대해, 상기 세포로부터 핵산 복합체를 방출시키는 공정

(B) 상기 (A) 공정 후의 상기 세포 시료를 함유하는 처리액과, 담체를 접촉시키는 공정

(C) 상기 담체와 상기 처리액을 분리하는 공정

(D) 상기 담체에 가열 처리를 실시하는 공정

(E) 상기 (D) 공정의 전 또는 후, 상기 담체에 분산매를 첨가하는 공정

본 발명의 핵산 증폭물의 제조 방법은, 핵산 증폭 방법에 의해, 목적 서열의 핵산 증폭물을 제조하는 방법으로서, 하기 (a) 및 (b) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

(a) 본 발명의 핵산 시료의 제조 방법에 의해, 세포를 함유하는 세포 시료로부터 핵산 시료를 회수하는 공정

(b) 상기 (a) 공정에서 회수한 상기 핵산 시료 중의 핵산을 주형으로 하여, 핵산 증폭 방법에 의해, 상기 주형 핵산에 있어서의 목적 서열의 핵산 증폭물을 제조하는 공정

[발명의 효과]

본 발명에 의하면, 세포로부터 핵산 복합체를 방출시킴으로써, 뛰어난 효율로 핵산을 회수할 수 있다. 이 때문에, 예를 들면, 게놈 DNA나 RNA 이외에, 미토콘드리아 DNA의 회수도 가능하다. 또한, 상기 세포로부터의 핵산 복합체의 방출은, 예를 들면, 특수한 시약을 사용하지 않고 행할 수 있기 때문에, 안전성이나 조작성도 뛰어나다. 이와 같이, 본 발명은, 안전성 및 조작성이 뛰어나고, 또한, 회수율이 뛰어나므로, 예를 들면, 소량의 세포나 소량의 세포 시료로부터도, 핵산 증폭 등에 필요한 주형이 되는 핵산을 충분량 회수할 수 있다. 또한, 이와 같이 소량의 세포나 소량의 세포 시료로부터의 회수를 간편한 조작으로 효율좋게 행할 수 있으므로, 예를 들면, 근래 주목받고 있는 마이크로칩 및 마이크로타스(microTAS) 등을 사용한 핵산 회수 및 핵산 증폭에도 유용하다고 할 수 있다.

[도면의 간단한 설명]

도 1은, 본 발명에서의 핵산 회수용 피펫 팁의 일례를 나타내는 단면도.

도 2(A)∼(D)는, 본 발명에서의 핵산 회수용 피펫 팁을 사용한 핵산 회수 방법의 개략을 나타내는 모식도.

도 3(A)∼(D)은, 본 발명에서의 핵산 회수용 바이오칩의 일례를 나타내는 모식도.

도 4(A)∼(D)는, 본 발명에서의 핵산 증폭용 바이오칩의 일례를 나타내는 모식도.

도 5는, 본 발명의 실시예1에서 사용한 지그(jig) 장치의 일례를 나타내는 모식도이며, (A)가 상면도, (B)가 단면도, (C)가 담체에 대한 액체의 통과 방향을 나타내는 모식도.

도 6은, 본 발명의 실시예2에서 사용한 지그 장치의 일례를 나타내는 모식도이며, (A) 및 (B)가 사시도, (C)가 상면도, (D)가 단면도.

도 7은, 참고예에 있어서의 핵산 복합체의 김자 염색(Giemsa stain)을 나타내는 사진.

[발명을 실시하기 위한 형태]

<핵산 시료의 제조 방법>

본 발명의 핵산 시료의 제조 방법은, 상술한 바와 같이, 세포로부터 핵산을 회수하는 핵산 시료의 제조 방법으로서, 하기 (A)∼(E) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 핵산 시료의 제조 방법은, 핵산 시료의 제조 방법, 핵산 시료의 회수 방법 또는 세포로부터의 핵산의 회수 방법이라 할 수도 있다.

(C) 상기 담체와 상기 처리액을 분리하는 공정

(D) 상기 담체에 가열 처리를 실시하는 공정

본 발명의 제조 방법에 있어서, 핵산의 회수는, 이하의 메커니즘에 의한다고 추정되지만, 본 발명은 이것에는 한정되지 않는다. 종래의 핵산 회수, 특히, 게놈 DNA의 회수에서는, 통상, 우선, 혈액 등의 시료의 처리로서, 세포(예를 들면, 백혈구) 내의 핵의 파괴, 상기 핵 내에서 팩키징된 염색체의 방출, 불필요한 단백질 및 섬유 등의 제거에 의한 핵 게놈의 직쇄화를 행하고나서, 예를 들면, 여러가지 담체에 핵 게놈을 유지시켜, 상기 담체와 액체 획분과의 분리에 의해 핵 게놈을 회수하고 있다. 이것에 대해, 본 발명에서는, 세포의 핵으로부터 핵 게놈을 함유하는 염색체를 방출시키지만, 핵 게놈을 직쇄화시키는 것이 아니라, 핵 게놈이 서로 얽힌 고도의 고차 구조인 입자 형상의 핵산 복합체로서, 핵 게놈을 유지시키고 있다. 이 핵산 복합체는, 통상, 직경 50∼200㎛ 정도이며, 직경이 10㎛ 이하인 핵보다도 크고, 또한, 직쇄의 핵 게놈보다도 입체 장해가 크고, 또한, 고도의 고차 구조를 취하고 있다. 이 때문에, 예를 들면, 담체에 유지되기 쉽다. 따라서, 세포 유래의 핵 게놈을 효율좋게 담체로 포획할 수 있다. 또한, 이와 같이 핵산 복합체의 상태에서 핵 게놈을 상기 담체에 포획시킴으로써, 미토콘드리아 게놈의 회수도 가능하다. 미토콘드리아 게놈은, 약 17,000개 정도의 뉴클레오티드가 연결된 환상 DNA로서, 매우 미세하므로, 이것을 회수하는 것은 극히 곤란하였다. 그러나, 본 발명에 의하면, 상기 담체에 포획된 핵산 복합체는, 핵산이 서로 얽힌 구조이기 때문에, 이 구조 내에, 미토콘드리아 게놈이 더 포획된다고 생각된다. 또한, 이와 같은 핵산 복합체는, 예를 들면, 직쇄의 핵 게놈과 비교하면, 매우 안정성이 뛰어나기 때문에, 예를 들면, 피펫팅 및 보르텍스 혼합 등의 조작에 의해서도 파괴되기 어렵다. 이 때문에, 회수 조작에 의한 회수율의 저하를 방지할 수 있다. 그리고, 상기 담체에 포획된 핵산 복합체에 가열 처리를 실시하는 것만으로, 상기 핵산 복합체에 함유되는 각종 핵산, 예를 들면, 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA, RNA 등을 분산매 중에 회수할 수 있다.

상기 (B) 공정에서, 상기 (A) 공정 후의 상기 처리액과, 상기 담체를 접촉시키는 방법, 및, 상기 (C) 공정에서, 상기 담체와 상기 처리액을 분리하는 방법은, 각각, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 후술하는 바와 같이, 상기 담체의 형상이나, 그 배치 상태 등에 따라 적절히 결정할 수 있다. 상기 (C) 공정에서, 상기 담체와 상기 처리액과의 분리는, 예를 들면, 상기 담체와 액체 획분과의 분리라 할 수도 있고, 또한, 상기 처리액 또는 상기 액체 획분의 제거라 할 수도 있다. 또, 상기 처리액(액체 획분)은, 예를 들면, 상기 담체로부터 완전하게 제거되지 않아도 되고, 예를 들면, 상기 담체에 상기 처리액이 잔존해도 된다.

상기 (E) 공정에서의 분산매의 첨가는, 상술한 바와 같이, 가열 처리를 실시하는 상기 (D) 공정 전에 행해도 되고, 후에 행해도 된다. 상기 (E) 공정을 상기 (D) 공정 후에 행하는 경우, 본 발명의 제조 방법은, 예를 들면, 상기 (A) 공정∼(C) 공정을 이 순서로 행하고, 계속해서 가열 처리의 상기 (D) 공정을 행한 후에, 상기 분산매를 첨가하는 상기 (E) 공정을 행한다. 또한, 상기 (E) 공정을 상기 (D) 공정 전에 행하는 경우, 본 발명의 제조 방법은, 예를 들면, 상기 (A) 공정∼(C) 공정을 이 순서로 행하고, 계속해서 상기 분산매를 첨가하는 상기 (E) 공정을 행한 후에, 가열 처리의 상기 (D) 공정을 행한다.

(제1 실시 형태)

본 발명의 핵산 시료의 제조 방법에 있어서, 상기 (A) 공정의 핵산 복합체를 방출시키는 수단은, 특히 제한되지 않는다. 본 발명의 핵산 시료의 제조 방법의 일례로서, 상기 (A) 공정이, 예를 들면, 프로테아제 및 계면활성제를 함유하는 처리 시약과, 상기 세포 시료를 혼합하는 (A1) 공정인, 제1 제조 방법을 들 수 있다. 제1 제조 방법에 있어서는, 예를 들면, 이와 같이, 상기 (A) 공정에서, 상기 세포 시료와 상기 처리 시약을 혼합함으로써, 상기 세포로부터 핵산 복합체를 방출시킨 처리액이 얻어진다.

이하에, 본 발명의 제1 제조 방법에 대해 설명하지만, 본 발명은, 이것에는 제한되지 않는다. 본 발명에서, 이하, 세포 시료와 혼합하기 전의, 상기 프로테아제 및 계면활성제를 함유하는 시약을 「처리 시약」이라 하고, 상기 처리 시약과 세포 시료를 혼합한 것을 「처리액」 또는 「혼합 처리액」이라 한다. 또, 본 발명에서, 상기 세포 시료와 상기 처리 시약과의 혼합이란, 예를 들면, 상기 처리 시약을 상기 세포 시료에 첨가해도 되고, 상기 처리 시약에 상기 세포 시료를 첨가해도 된다. 본 발명의 제1 제조 방법에 있어서 사용하는 상기 처리 시약은, 예를 들면, 「제1 처리 시약」이라고도 한다.

상기 처리 시약과 상기 세포 시료를 혼합한 처리액에 있어서, 상기 프로테아제의 농도는, 예를 들면, 0.5mU/μL 이상이며, 상기 계면활성제의 농도는, 예를 들면, 0.1체적% 이상인 것이 바람직하다. 이와 같은 조건에서 상기 세포 시료를 처리함으로써, 상기 핵산 복합체를 충분히 방출할 수 있다. 상기 프로테아제 농도 및 상기 계면활성제 농도는, 예를 들면, 각각, 상기 처리 시약과 상기 세포 시료를 함유하는 처리액에 있어서의 농도로서, 상기 처리액에 있어서의 세포의 함유량을 약 1×10²∼1×10⁹개로 가정한 경우의 농도이다. 또한, 상기 프로테아제 농도 및 상기 계면활성제 농도는, 예를 들면, 각각, 상기 처리 시약과 상기 세포 시료를 함유하는 처리액에 있어서의 농도로서, 상기 처리액에 있어서의 상기 세포 시료의 첨가 비율을 50∼100μL, 바람직하게는 50μL로 가정한 경우의 농도이어도 된다.

상기 처리액에 있어서, 상기 프로테아제의 농도의 하한은, 예를 들면, 0.5mU/μL 이상이며, 바람직하게는 1mU/μL 이상이며, 보다 바람직하게는 2mU/μL 이상이다. 상기 처리액에 있어서, 상기 프로테아제 농도의 상한은, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 1U/μL 이하이며, 바람직하게는 500mU/μL 이하이다. 상기 프로테아제의 농도 범위로서는, 예를 들면, 0.5∼1000mU/μL이며, 바람직하게는 1∼1000mU/μL이며, 보다 바람직하게는 2∼500mU/μL이며, 특히 바람직하게는 5∼15mU/μL의 범위이다. 프로테아제의 활성 단위(U : 유닛)는, 일반적으로, 헤모글로빈을 기질로 하여 37℃에서 1분간에 1㎛ol의 티로신에 상당하는 펩티드를 생성하는 효소량을 1U라 한다.

상기 처리액에 있어서, 예를 들면, 상기 세포 1×10²∼1×10⁹개에 대한 프로테아제의 비율은, 특히 제한되지 않지만, 하한이, 예를 들면, 0.02mU 이상이며, 바람직하게는 0.08mU 이상이며, 상한이, 예를 들면, 100U 이하이며, 바람직하게는 50U 이하이다. 또한, 상기 처리액에 있어서, 예를 들면, 상기 세포 시료 50μL에 대한 프로테아제의 비율은, 특히 제한되지 않지만, 하한이, 예를 들면, 0.02mU 이상이며, 바람직하게는 0.08mU 이상이며, 상한이, 예를 들면, 100U 이하이며, 바람직하게는 50U 이하이다.

상기 처리액에 있어서, 상기 계면활성제의 농도의 하한은, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.1체적% 이상이며, 바람직하게는 0.2체적% 이상이다. 또한, 상기 처리액에 있어서, 상기 계면활성제의 상한은, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 20체적% 이하이며, 바람직하게는 10체적% 이하이며, 보다 바람직하게는 5체적% 이하이며, 더욱 바람직하게는 2체적% 이하이다. 상기 계면활성제의 농도 범위는, 예를 들면, 0.1∼20체적%이며, 바람직하게는 0.1∼5체적%이며, 보다 바람직하게는 0.1∼2체적%이며, 특히 바람직하게는 0.2∼0.8체적%의 범위이다.

또한, 상기 처리액에 있어서, 상기 세포 1×10²∼1×10⁹개에 대한 계면활성제의 비율은, 특히 제한되지 않지만, 하한이, 예를 들면, 1펨토몰(1×10^-15몰) 이상이며, 바람직하게는, 2펨토몰 이상이며, 상한이, 예를 들면, 200펨토몰 이하이며, 바람직하게는 100펨토몰 이하이다. 또한, 상기 처리액에 있어서, 상기 세포 시료 50μL에 대한 상기 계면활성제의 비율은, 특히 제한되지 않지만, 하한이, 예를 들면, 1펨토몰 이상이며, 바람직하게는, 2펨토몰 이상이며, 상한이, 예를 들면, 200펨토몰 이하이며, 바람직하게는 100펨토몰 이하이다.

상술한 프로테아제 및 계면활성제의 비율은, 상기 세포가 진핵 세포(유핵 세포)의 경우, 바람직하게는 1×10²∼1×10⁸개에 대한 비율인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1×10³∼1×10⁷개에 대한 비율이다. 상기 진핵 세포 중에서도, 특히, 상기 세포가 전혈 유래의 세포(예를 들면, 백혈구)의 경우, 예를 들면, 5×10³∼1×10⁷개에 대한 비율인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 2.5×10⁴∼1×10⁷개에 대한 비율이다. 상기 진핵 세포 중에서도, 특히 타액 유래의 세포의 경우, 예를 들면, 1×10²∼1×10⁷개에 대한 비율인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1×10³∼1×10⁶개에 대한 비율이다. 또한, 상기 세포가 원핵 세포의 경우, 예를 들면, 1×10³∼1×10⁹개에 대한 비율인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1×10³∼1×10⁸개에 대한 비율이며, 예를 들면, 대장균 등도 마찬가지이다.

상기 처리 시약에 있어서의 프로테아제 농도 및 계면활성제 농도는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 상기 처리 시약을 상기 세포 시료와 혼합했을 때에, 상기 처리액에 있어서, 상술한 농도가 되도록 설정하는 것이 바람직하다.

상기 처리 시약에 있어서의 프로테아제의 농도는, 특히 제한되지 않지만, 하한이, 예를 들면, 1mU/μL 이상이며, 바람직하게는 2mU/μL 이상이며, 보다 바람직하게는 4mU/μL 이상이며, 상한이, 예를 들면, 2U/μL 이하이며, 바람직하게는 1U/μL 이하이며, 농도 범위는, 예를 들면, 1∼2000mU/μL이며, 바람직하게는 2∼2000mU/μL이며, 보다 바람직하게는 4∼1000mU/μL이며, 특히 바람직하게는 10∼30mU/mL의 범위이다. 상기 처리 시약에 있어서의 계면활성제의 농도로서는, 특히 제한되지 않지만, 하한이, 예를 들면, 0.2체적% 이상인 것이 바람직하고, 상한이, 예를 들면, 40체적% 이하이며, 보다 바람직하게는 20체적% 이하이며, 더욱 바람직하게는 10체적% 이하이며, 특히 바람직하게는 4체적% 이하이며, 농도 범위는, 예를 들면, 0.2∼40체적%이며, 바람직하게는 0.2∼10체적%이며, 보다 바람직하게는 0.2∼4체적%이며, 특히 바람직하게는 0.4∼1.6체적%의 범위이다.

상기 세포 시료(S)와 상기 처리 시약(T)과의 첨가 비율(체적비 S:T)은, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 1:0.5∼1:20이며, 바람직하게는 1:0.5∼1:10이며, 보다 바람직하게는 1:0.5∼1:5이다.

상기 프로테아제로서는, 예를 들면, 프로테이나제K, 키모트립신, 펩신, 카텝신D, 파파인 등을 들 수 있다. 이들의 프로테아제는, 어느 1종류이어도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다.

상기 계면활성제로서는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 비이온성 계면활성제가 바람직하다. 상기 비이온성 계면활성제로서는, 예를 들면, 폴리옥시에틸렌-p-이소옥틸페놀(polyoxyethylene-p-isooctylphenol), 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우릴산(polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate), 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르, 노닐페놀폴리티오에톡실레이트 등을 들 수 있다. 이들의 계면활성제로서는, 예를 들면, 트리톤(Triton)(상표) X-100, 트리톤(상표) X-114 등의 트리톤계, 노니데트(Nonidet)(상표) P40 등의 노니데트계, 트윈(Tween)(상표) 20, 트윈(상표) 80 등의 트윈계의 계면활성제를 들 수 있다. 이들의 계면활성제는, 어느 1종류이어도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다.

상기 처리 시약의 형태는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 고체(건조체)이어도 되고, 액체이어도 된다. 후자의 경우, 예를 들면, 용매에, 상기 프로테아제 및 상기 계면활성제가 첨가되어 있는 것이 바람직하다. 상기 용매는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 물, 각종 완충액, 완충 생리 식염수 등의 수성 용매, 유기 용매, 또는, 그들의 혼합액을 들 수 있다. 상기 완충액으로서는, 예를 들면, Tris-HCl, BES, PIPES, SSC, TAE, TBE, TG, MES, Bis-Tris, ADA, ACES, MOPSO, MOPS, TES, HEPES, DlPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS, CHES, CAPSO, CAPS, PBS, 붕산, 카코딜산, 시트르산, 글리신, 글리실글리신, 이미다졸, 시트르산리튬, 인산칼륨, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 트리틸아세트산암모늄(Trithylammonium Acetate) 등을 들 수 있다. 상기 처리 시약에 있어서의 완충액의 농도는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.1∼100mmol/L이며, 보다 바람직하게는 0.1∼50mmol/L이며, 특히 바람직하게는 0.1∼20mmol/L이다. 상기 처리 시약의 pH는, 예를 들면, 7.8∼9.5이며, 8.5∼8.9가 바람직하다.

상기 처리 시약은, 예를 들면, 또한, 단백질 변성제 등을 함유해도 된다. 상기 단백질 변성제로서는, 예를 들면, 요소, β-메르캅토에탄올, 라우릴황산나트륨, 디티오트레이톨, 구아니딘염산 등을 들 수 있다. 상기 처리 시약에 있어서의 상기 단백질 변성제의 농도는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0∼8mol/mL이며, 바람직하게는 1∼5mol/mL이며, 보다 바람직하게는 1∼3mol/mL이다. 이들은, 1종류이어도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다.

상기 처리 시약은, 예를 들면, 또한, 킬레이트제를 함유해도 된다. 상기 킬레이트제로서는, 예를 들면, EDTA, EGTA, NTA, DTPA, GLDA, HEDTA, GEDTA, TTHA, HIDA, DHEG 등을 들 수 있다. 상기 처리 시약에 있어서의 상기 킬레이트제의 농도는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0∼10mmol/mL이며, 바람직하게는 0∼1mmol/mL이며, 보다 바람직하게는 0∼0.1mmol/mL이다.

상기 세포로서는, 예를 들면, 핵산을 함유하고 있는 세포이면 되고, 진핵 세포 및 원핵 세포를 들 수 있다. 상기 진핵 세포로서는, 예를 들면, 백혈구 등의 혈중 세포, 구강내 세포, 손톱의 세포 및 모발의 세포 등의 체세포, 생식 세포 및 종양 세포 등을 들 수 있고, 또한, 이들의 배양 세포이어도 된다. 또한, 상기 세포로서 상기 진핵 세포를 함유하는 세포 시료는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 혈액, 타액, 구강 점막, 손톱 및 모발 등을 들 수 있고, 또한, 상기 진핵 세포의 배양물이어도 된다. 상기 원핵 세포로서는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 대장균 등을 들 수 있고, 또한, 그 배양 세포이어도 된다. 또한, 상기 세포로서 상기 원핵 세포를 함유하는 세포 시료는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 상기 원핵 세포의 배양물이어도 된다. 상기 배양물로서는, 예를 들면, 세포의 배양액, 회수한 배양 세포 등을 들 수 있다. 또한, 상기 세포 시료는, 예를 들면, 미희석의 세포 시료 및 희석한 세포 시료의 어느 것이어도 좋지만, 본 발명은, 미희석의 세포 시료로부터의 핵산 회수에 적용하는 것이 바람직하다. 상기 세포 시료가, 예를 들면, 구강내 세포, 또는, 배양 후에 회수한 배양 세포 등의 경우, 예를 들면, 미리 생리 식염수나 완충액 등에 상기 세포를 현탁한 것을 세포 시료로 하여, 상기 처리 시약과 혼합해도 되고, 세포를 그대로 세포 시료로서, 상기 처리 시약과 혼합해도 된다. 또한, 상기 세포 시료는, 예를 들면, 채취 직후의 세포 시료이어도 되고, 실온 방치, 냉장 보존, 또는 동결 후 융해한 세포 시료이어도 된다.

상기 혈액으로서는, 예를 들면, 전혈, 용혈한 전혈, 전혈의 혈구 획분, 상기 혈구 획분의 분산액 등을 들 수 있다. 상기 혈액은, 미희석 혈액 및 희석 혈액의 어느 것이어도 좋지만, 예를 들면, 미희석 혈액으로부터의 핵산 회수에 적용하는 것이 바람직하다. 상기 혈액은, 예를 들면, 채취 직후의 혈액이어도 되고, 실온 방치, 냉장 보존 또는 동결 후 융해한 혈액이어도 된다.

본 발명에 의해 회수되는 핵산은, 예를 들면, DNA 및 RNA의 적어도 한쪽이다. 상기 DNA로서는, 예를 들면, 게놈 DNA 이외에, 플라스미드 DNA, 미토콘드리아 DNA 등을 들 수 있다.

상기 (B) 공정에서는, 상기 (A) 공정 후의 상기 세포 시료를 함유하는 처리액, 예를 들면, 상기 처리 시약과 상기 세포 시료를 혼합한 처리액에, 상기 담체를 접촉시킨다. 상기 (B) 공정에서의 담체는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 상기 (A) 공정에서, 상기 처리 시약과의 처리에 의해 상기 세포로부터 방출된 상기 핵산 복합체를 포획할 수 있으면 된다. 상기 핵산 복합체의 평균 직경은, 예를 들면, 50∼200㎛이다. 따라서, 상기 담체는, 예를 들면, 상기 핵산 복합체가 통과하기 어렵고, 또한, 액체 획분이 통과할 수 있는 공극을 갖는 것이 바람직하다. 이것에 의해, 예를 들면, 상기 핵산 복합체를 유지하고, 또한, 액체 획분을 제거할 수 있다. 또한, 상기 핵산 복합체는, 상술한 바와 같이 고도의 고차 구조를 갖고 있기 때문에, 예를 들면, 섬유 등에 부착하기 쉽다(얽히기 쉽다). 이 때문에, 상기 담체에 있어서의 공극의 크기는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 직포 및 부직포의 섬유 등의 담체 자체에, 상기 핵산 복합체가 부착함으로써, 상기 핵산 복합체가 유지되어도 된다. 또한, 그 고차 구조로부터, 상기 담체에 부착한 핵산 복합체에 의해, 또다른 핵산 복합체가 유지된다고 생각된다.

상기 담체로서는, 예를 들면, 부직포, 메시(mesh)상 직포 등의 직포, 스폰지 등의 다공질체 등을 들 수 있다. 그 형상도 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 시트상, 필름상, 블록상, 비드상 등을 들 수 있다. 또한, 상기 비드상의 담체는, 예를 들면, 부직포, 직포, 다공질체 등으로 형성되어도 되고, 비공질체로 형성되어도 된다.

이하에, 상기 각 담체의 특성을 예시하지만, 본 발명은, 이것에는 제한되지 않는다.

<부직포>

평균 섬유 직경 : 예를 들면, 20nm∼100㎛, 바람직하게는 약 2㎛

단위면적당 중량 : 예를 들면, 20∼150g/m³, 바람직하게는 약 20g/m³

<직포>

메시의 사이즈 : 예를 들면, 10∼1000㎛, 바람직하게는, 100∼250㎛

실의 직경(선경) : 예를 들면, 40∼500㎛, 바람직하게는, 47∼152㎛

오프닝 : 예를 들면, 50∼300㎛, 바람직하게는, 50∼105㎛

<다공질체>

평균 공경(孔徑) : 예를 들면, 10㎛∼1000㎛, 바람직하게는, 30㎛∼1000㎛

평균 밀도 : 예를 들면, 15∼85kg/m³, 바람직하게는, 30∼80kg/m³

구멍의 형상 : 예를 들면, 독립 기포체, 연속 기포체

<비드>

형상 : 진구, 타원구 등의 구형

직경(입경) : 예를 들면, 30nm∼100㎛, 바람직하게는, 약 5㎛

표면적비 : 예를 들면, 0.5∼200m²/g, 바람직하게는, 1.1m²/g

충전율 : 예를 들면, 0.1∼10%, 바람직하게는, 0.1∼5%

상기 담체는, 예를 들면, 폴리머제 담체를 들 수 있다. 상기 폴리머로서는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 폴리아미드(예를 들면, 상품명 나일론), 폴리우레탄, 폴리에테르, 폴리스티렌, 폴리염화비닐, 예를 들면, 테플론(등록상표) 등의 폴리테트라플루오로에틸렌 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 예를 들면, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리에스테르가 바람직하고, 보다 바람직하게는 폴리프로필렌, 폴리우레탄, 폴리에스테르이다.

상기 폴리머제 담체는, 예를 들면, 전체가 상기 폴리머로 형성된 담체이어도 되고, 혈액과 접촉하는 부분만, 예를 들면, 노출 표면만이, 상기 폴리머에 피복된 담체이어도 된다.

상기 비드상의 폴리머제 담체는, 예를 들면, 상술한 바와 같이, 다공질체로 형성되어도 되고, 비다공질체로 형성되어도 된다. 상기 비드상의 폴리머제 담체로서는, 예를 들면, 자석에 의한 회수가 가능하므로, 자성을 띤 자성 비드도 바람직하다. 상기 자성 비드를 구성하는 폴리머로서는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 폴리스티렌, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리젖산(PLA), 키토산이나, 이들의 폴리머와 말레산과의 공중합체 등을 들 수 있다. 또한, 상기 자성 비드는, 예를 들면, PEG-COOH, alkyl-OH, SO₃H, SiO₂ 등으로 표면 처리되어 있어도 된다. 또한, 상기 자성 비드는, 예를 들면, 금속 등의 자성체로부터 구성되는 비드의 표면에, 상술한 폴리머가 피복되어 있는 것이어도 된다. 상기 금속으로서는, 예를 들면, 마그네타이트, 마그헤마이트, 철, 니켈 등을 들 수 있다.

또한, 상기 담체로서는, 이외에, 예를 들면, 금속제 담체를 들 수 있다. 상기 금속으로서는, 예를 들면, 스테인리스, 티탄, 알루미늄 등을 들 수 있다. 이들의 금속은, 1종류이어도 되고, 2종류 이상이어도 된다.

상기 담체는, 예를 들면, 단층체이어도 되고, 2층 이상의 적층체이어도 된다. 상기 적층체는, 예를 들면, 어느 1종류의 부재로 구성되어도 되고, 다른 2종류 이상의 부재로 구성되어도 되고, 또한, 다른 재질의 부재로 구성되어도 된다.

사용하는 상기 담체의 크기는, 제한되지 않고, 예를 들면, 상기 (A) 공정에서의 상기 세포 시료의 양, 상기 세포 시료와 상기 처리 시약을 혼합한 처리액의 양, 및, 상기 담체의 형상 등에 따라 적절히 결정할 수 있다. 또, 구체예에 대해서는, 후술한다.

상기 (B) 공정에서, 상기 처리액과 상기 담체를 접촉시키는 방법, 및, 상기 (C) 공정에서, 상기 처리액과 상기 담체를 분리하는 방법은, 각각, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 후술하는 바와 같이, 상기 담체의 형상이나, 그 배치 상태 등에 따라 적절히 결정할 수 있다. 또, 상기 담체로부터 상기 처리액은, 상술한 바와 같이, 완전하게 분리되지 않아도 된다.

본 발명의 제1 핵산 시료의 제조 방법에 대해, 일례로서, 전혈로부터 핵산을 회수하는 방법을 설명하지만, 본 발명은, 이것에는 한정되지 않는다.

혈액의 처리 공정

우선, 전혈에 상기 처리 시약을 첨가한다. 이것에 의해, 전혈의 백혈구로부터 핵산 복합체가 방출된다. 이 핵산 복합체에는, 예를 들면, 게놈 DNA나 RNA 이외에, 미토콘드리아 DNA가 함유된다.

상기 처리 시약에 의한 처리 조건은, 특히 제한되지 않지만, 처리 시간은, 예를 들면, 1∼600초이며, 바람직하게는 5∼600초이며, 보다 바람직하게는 5∼300초이다. 처리 온도는, 예를 들면, 4∼60℃이며, 바람직하게는 10∼60℃이며, 보다 바람직하게는 15∼40℃이다.

담체와의 접촉 공정

계속해서, 상기 전혈과 상기 처리 시약을 혼합한 상기 처리액을 상기 담체에 접촉시킨다. 이것에 의해, 상기 담체에, 핵산 함유 세포인 전혈의 백혈구로부터 방출된 핵산 복합체가 포획된다.

상기 담체의 크기는, 상술한 바와 같이, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 처리하는 전혈의 양, 상기 담체의 재질 및 형상 등에 따라 적절히 결정할 수 있다. 구체예를 이하에 나타낸다.

상기 담체가 예를 들면, 부직포, 직포 또는 다공질체로부터 구성되는 시트상, 필름상 또는 블록상 등의 담체인 경우, 예를 들면, 이하와 같은 조건에서, 전혈과 담체를 접촉시킨다. 상기 (A) 공정에서 처리한 전혈의 체적(X)에 대한 상기 담체의 체적(Y : 공극을 포함한다)의 비(X:Y)는, 예를 들면, 1:2.2×10^-3∼1:0.7이며, 바람직하게는 1:2.2×10^-3∼1:0.31이며, 보다 바람직하게는 1:2.2×10^-3∼1:0.13이다. 또한, 상기 (A) 공정 후의 전혈을 함유하는 상기 처리액의 체적(X')에 대한 상기 담체의 체적(Y : 공극을 포함한다)의 비(X':Y)는, 예를 들면, 1:1.1×10^-3∼1:0.35이며, 바람직하게는 1:1.1×10^-3∼1:0.16이며, 보다 바람직하게는 1:1.1×10^-3∼1:0.07이다.

상기 담체가 예를 들면, 비드인 경우, 복수의 비드를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 비드의 형상은, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 진구, 대략 진구, 타원구 등을 들 수 있다. 상기 비드의 평균 직경은, 예를 들면, 30nm∼100㎛이며, 바람직하게는 30nm∼20㎛이며, 보다 바람직하게는 30nm∼5㎛이다. 예를 들면, 전혈 50μL로부터 핵산을 회수하는 경우, 상기 복수의 비드의 총표면적(Z)은, 예를 들면, 5∼2000cm²이며, 바람직하게는 10∼2000cm²이며, 보다 바람직하게는 200∼2000cm²이다. 또한, 상기 비드의 충전율은, 예를 들면, 0.1∼10%이며, 바람직하게는, 0.1∼5%이며, 보다 바람직하게는, 1∼5%이다.

상기 처리액과 상기 담체를 접촉시켜, 상기 핵산 복합체를 상기 담체에 포획시킬 때의 처리 조건은, 특히 제한되지 않지만, 처리 온도가, 예를 들면, 15∼40℃이며, 바람직하게는 20∼35℃이며, 특히 바람직하게는 실온(약 25℃)이며, 처리 시간은, 예를 들면, 1초∼10분이며, 바람직하게는 30초∼5분이다.

상기 처리액과 상기 담체를 접촉시키는 방법은, 특히 제한되지 않고, 상술한 바와 같이, 예를 들면, 상기 담체의 형상 등에 따라 적절히 결정할 수 있다. 상기 양자는, 예를 들면, 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube), 시험관, 유로를 구비하는 칩 등의 용기 내에서 접촉시킬 수 있다. 구체적으로는, 상기 용기 내에, 상기 담체와 상기 처리액을 넣음으로써 상기 양자를 접촉시켜도 되고, 미리 상기 담체를 고정화한 상기 용기에, 상기 처리액을 넣음으로써, 상기 양자를 접촉시켜도 된다.

또한, 후술하는 바와 같이, 예를 들면, 칩 등의 유로 내에 상기 담체를 배치하여, 상기 유로에 상기 처리액을 흐르게 하고, 상기 담체의 내부를 통과시킴으로써, 양자를 접촉시켜도 된다. 이와 같은 방법에 의하면, 상기 처리액 중의 핵산 복합체는, 상기 담체에 유지되고, 그 이외의 성분을 제거할 수 있다. 여기서, 「상기 담체를 통과」란, 예를 들면, 상기 처리액이, 상기 담체 내부로 들어가, 상기 담체의 내부를 이동하는 것을 의미한다. 특히, 상기 담체에 공급한 상기 처리액의 전부 또는 일부가, 상기 담체의 내부로 들어가, 상기 담체의 내부로부터 상기 담체의 외부로 통과하는 것이 바람직하다. 이와 같이 상기 담체의 내부로부터 상기 담체의 외부로 상기 처리액을 통과시키면, 예를 들면, 상기 담체 내에 잔존하는 상기 처리액 중의 불필요 성분의 양을 저감할 수 있다. 이것에 의해, 최종적으로 얻어지는 핵산 시료에 있어서의 불필요 성분의 함유량을 더욱 저감할 수 있다. 또한, 예를 들면, 칩 등의 유로 내에 복수의 상기 담체(예를 들면, 비드)를 배치하여, 상기 처리액을, 상기 담체와 담체 사이를 통과시킴으로써, 양자를 접촉시켜도 된다. 이것에 의해서도, 상술한 바와 같이, 상기 핵산 복합체는 상기 담체에 유지되고, 그 이외의 성분을 제거할 수 있다. 상기 처리액은, 예를 들면, 감압 또는 가압에 의해, 상기 유로 내의 상기 담체의 내부, 또는, 상기 담체 사이를 통과시킬 수 있다.

분리 공정

계속해서, 상기 담체와 상기 처리액을 분리한다. 상기 양자의 분리 방법은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 상기 담체의 형상이나, 그 배치 상태 등에 따라 적절히 결정할 수 있다. 상기 담체가 용기에 고정되어 있지 않는 경우, 예를 들면, 상기 용기로부터 상기 담체 또는 상기 처리액을 취출함으로써, 양자를 분리할 수 있다. 또한, 상술한 자성체 비드의 경우는, 예를 들면, 자석 등으로 비드를 회수함으로써, 양자를 분리할 수 있다. 한편, 상기 담체가 용기에 고정되어 있는 경우, 예를 들면, 상기 용기로부터 상기 처리액을 제거(배출)함으로써, 양자를 분리할 수 있다. 또한, 상술한 바와 같이 유로 내에 상기 담체를 배치하여 있는 경우는, 상기 담체의 내부 또는 복수의 상기 담체와 담체 사이에 상기 처리액을 통과시킴으로써, 예를 들면, 혈중 세포로부터 상기 처리액 중에 방출된 핵산 복합체를 상기 담체에 포획시킴과 함께, 상기 처리액과 상기 담체를 분리할 수 있다.

분산매의 첨가 공정

이어서, 상기 처리액을 제거한 상기 담체에 분산매를 첨가한다. 또, 상기 분산매의 첨가는, 이와 같이, 다음 공정의 가열 처리 전에 행해도 되고, 가열 처리 후에 행해도 된다.

상기 분산매의 첨가에 의해, 상기 담체가 상기 분산매 중에 침지한 상태가 되는 것이 바람직하다. 상기 분산매는, 특히 제한되지 않지만, 물, 각종 완충액, 완충 생리 식염수 등의 수성 용매, 유기 용매, 또는, 그들의 혼합액을 들 수 있다. 상기 완충액으로서는, 예를 들면, Tris-HCl, BES, MOPS, TES, HEPES, DlPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS 등을 들 수 있다. 상기 완충액의 농도는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.1∼100mmol/L이며, 바람직하게는, 0.1∼50mmol/L이며, 특히 바람직하게는, 0.1∼10mmol/L이다. 상기 분산매의 pH는, 예를 들면, 7.8∼9.5이며, 8.5∼8.9가 바람직하다.

상기 분산매의 첨가 비율은, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 상기 (A) 공정에서 처리한 전혈의 체적(X)에 대한 분산매의 체적(D)의 비(체적비 X:D)는, 예를 들면, 1:0.5∼1:10이며, 바람직하게는, 1:0.5∼1:5이며, 보다 바람직하게는, 1:1∼1:3이다.

또, 상기 담체에의 상기 분산매의 공급에 앞서, 예를 들면, 세정액의 공급 및 제거를 행해도 된다. 이것에 의해, 상기 담체에 잔존하여 있는 불필요한 성분을 더 배제할 수 있다. 상기 세정액으로서는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 상기 분산매와 동일한 것을 사용할 수 있다. 또한, 상기 분산매의 공급에 앞서, 가열 처리를 실시하는 경우는, 상기 가열 처리에 앞서, 상기 담체에의 세정액의 공급 및 상기 세정액의 제거를 행하는 것이 바람직하다.

가열 처리 공정

상기 분산매 중의 상기 담체에 가열 처리를 실시한다. 이것에 의해, 상기 담체에 포획된 상기 핵산 복합체로부터 핵산이 방출되고, 상기 방출된 핵산이, 상기 분산매 중에 해방(유리)된다.

가열 처리의 온도는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 50∼130℃이며, 바람직하게는 80∼130℃이며, 보다 바람직하게는 90∼100℃이다. 가열 처리는, 예를 들면, 일정한 온도로 행해도 되고, 온도를 연속적 또는 단계적으로 상승시켜도 된다. 또한, 처리 시간은, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 1∼30분이며, 바람직하게는 1∼5분이다.

또, 상기 분산매의 첨가에 앞서 가열 처리를 행한 경우는, 가열 처리에 의해 상기 핵산 복합체로부터 핵산을 방출시킨 후, 상기 분산매를 첨가하여, 상기 방출된 핵산을 상기 분산매 중에 유리시키면 된다.

계속해서, 가열 처리 후의 상기 분산매를 회수한다. 상술한 바와 같이, 핵산이 상기 분산매 중에 방출되어 있기 때문에, 이 분산매를, 전혈 유래의 핵산을 함유하는 핵산 시료로서 회수할 수 있다. 본 발명에 의해 얻어지는 핵산 시료의 용도는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 후술하는 핵산 증폭에 사용하는 것이 바람직하다. 또, 전혈 이외의 세포 시료에 대해서도, 마찬가지로 처리를 행하여, 핵산 시료를 회수할 수 있다.

본 발명의 방법에 의하면, 예를 들면, 상기 세포 시료가 전혈이며, 처리하는 전혈이 50μL, 사용하는 상기 처리 시약이 50μL, 상기 분산매가 100μL의 경우, 예를 들면, 100∼10000copy/μL의 핵산 시료를 회수할 수 있다. 이 양의 핵산이면, 예를 들면, PCR 등의 핵산 증폭법에 있어서 충분한 주형이 될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하면, 게놈 DNA나 RNA 뿐아니라, 종래, 회수가 곤란했던 미토콘드리아 DNA도 회수 가능하다.

(제2 실시 형태)

본 발명의 제조 방법에 있어서, 세포가 진핵 세포로서, 진핵 세포를 함유하는 세포 시료가, 냉장 보존 또는 동결 융해 후의 시료인 경우, 예를 들면, 이하에 나타내는 제2 제조 방법이 바람직하다. 본 발명의 제2 제조 방법은, 예를 들면, 상기 (A) 공정이, 계면활성제 무첨가이며 또한 프로테아제를 함유하는 처리 시약과, 동결 융해 후 또는 냉장 보존 후의 상기 세포 시료를 혼합하는 (A2) 공정의 제조 방법이다. 본 발명의 제2 제조 방법에 있어서 사용하는 상기 처리 시약은, 예를 들면, 「제2 처리 시약」이라고도 한다. 또, 특별히 명시가 없는 한, 제2 제조 방법은, 예를 들면, 상기 (A1) 공정 대신에 상기 (A2) 공정을 행하면 되고, 그 밖에는, 상기 제1 제조 방법과 같이 행할 수 있다.

본 발명에서의 세포 시료로서는, 상술한 진핵 세포를 함유하는 세포 시료를 들 수 있다. 본 발명의 제2 제조 방법에 있어서, 상기 제2 처리 시약은, 상술한 바와 같이, 계면활성제 무첨가이며 또한 프로테아제를 함유하는 시약을 사용할 수 있다. 동결 융해 후 또는 냉장 보존 후의 세포 시료는, 진핵 세포의 세포막의 일부 혹은 대부분이 파괴되어 있기 때문에, 예를 들면, 계면활성제에 의한 세포막의 파괴를 생략할 수 있어, 계면활성제를 함유하지 않는 상기 처리 시약이어도, 효율좋게 핵산 복합체를 방출할 수 있다고 추측된다. 이 때문에, 처리 시약의 비용을 보다 한층 저하할 수 있다. 또, 이 추측은, 본 발명을 하등 제한하지 않는다.

상기 세포 시료의 동결 융해의 조건은, 하등 제한되지 않고, 세포 시료를 동결한 후, 융해하면 된다. 동결 온도는, 예를 들면, -15∼-200℃이며, 융해 온도는, 예를 들면, 4∼50℃이다. 또한, 상기 세포 시료의 냉장 보존의 조건은, 하등 제한되지 않지만, 예를 들면, 냉장 온도는, 예를 들면, 0∼8℃이며, 보존시간은, 예를 들면, 4일∼1년이며, 1주간∼1개월이어도 된다.

상기 제2 처리 시약은, 예를 들면, 냉장 보존 전 또는 동결 보존 전부터, 상기 세포 시료에 첨가해도 되고, 냉장 보존 후 또는 동결 융해 후에, 상기 세포 시료에 첨가해도 된다.

상기 제2 처리 시약의 조성은, 계면활성제 무첨가인 이외는, 상기 제1 제조 방법에 있어서의 제1 처리 시약과 마찬가지이다. 또한, 상기 제2 처리 시약과 세포 시료를 혼합한 처리액에 있어서, 진핵 세포 및 세포 시료에 대한 프로테아제의 비율도, 상기 제1 제조 방법과 마찬가지이다.

(제3 실시 형태)

본 발명의 제조 방법에 있어서, 세포가 진핵 세포로서, 진핵 세포를 함유하는 세포 시료가, 동결 융해 후의 시료인 경우, 예를 들면, 이하에 나타내는 제3 제조 방법이 바람직하다. 본 발명의 제3 제조 방법은, 예를 들면, 상기 (A) 공정이, 계면활성제 무첨가 또한 프로테아제 무첨가의 처리 시약과, 동결 융해 후의 상기 세포 시료를 혼합하는 (A3) 공정의 제조 방법이다. 본 발명의 제3 제조 방법에 있어서 사용하는 상기 처리 시약은, 예를 들면, 「제3 처리 시약」이라고도 한다. 또, 특별히 명시가 없는 한, 제3 제조 방법은, 예를 들면, 상기 (A1) 또는 (A2) 공정 대신에, 상기 (A3) 공정을 행하면 되고, 그 밖에는, 상기 제1 또는 제2 제조 방법과 같이 행할 수 있다. 또한, 제3 제조 방법에 있어서는, 예를 들면, 상기 (A) 공정에서 상기 제3 처리 시약과 혼합하지 않고, 상기 (B) 공정에서, 상기 동결 융해 후의 상기 세포 시료를 상기 담체에 접촉시켜도 된다.

본 발명에서의 세포 시료로서는, 상술한 진핵 세포를 함유하는 세포 시료를 들 수 있다. 본 발명의 제3 제조 방법에 있어서, 상기 제3 처리 시약은, 상술한 바와 같이, 계면활성제 무첨가 또한 프로테아제 무첨가의 시약을 사용할 수 있다. 동결 융해 후의 세포 시료는, 진핵 세포의 세포막 및 핵막의 일부 또는 대부분이 파괴되고, 동시에, 일부의 세포에서는 핵 내에서 핵산을 팩키징하고 있던 단백질이 변성하여, 팩키지의 기능을 소실함으로써, 핵산 복합체를 방출한다고 생각된다. 이 때문에, 예를 들면, 계면활성제 및 프로테아제를 함유하지 않는 처리 시약이어도, 효율좋게 핵산 복합체를 방출시킬 수 있다. 이 때문에, 처리 시약의 비용을 보다 한층 저하할 수 있다.

상기 세포 시료의 동결 융해의 조건은, 하등 제한되지 않고, 세포 시료를 동결한 후, 융해하면 된다. 동결 온도는, 예를 들면, -15∼-200℃이며, 융해 온도는, 예를 들면, 4∼50℃이다.

상기 제3 처리 시약은, 예를 들면, 동결 보존 전부터, 상기 세포 시료에 첨가해도 되고, 동결 융해 후에, 상기 세포 시료에 첨가해도 된다.

상기 제3 처리 시약의 조성은, 예를 들면, 계면활성제 및 프로테아제 무첨가인 이외는, 상기 제1 제조 방법에 있어서의 제1 처리 시약과 같으며, 예를 들면, 상술한 각종 용매 등을 들 수 있다.

(제4 실시 형태)

본 발명의 제조 방법에 있어서, 세포가 원핵 세포로서, 원핵 세포를 함유하는 세포 시료가, 냉장 보존 또는 동결 융해 후의 시료인 경우, 예를 들면, 이하에 나타내는 제4 제조 방법이 바람직하다. 본 발명의 제4 제조 방법은, 예를 들면, 상기 (A) 공정이, 상기 원핵 세포를 함유하는 세포 시료를 동결 융해 또는 냉장 보존하는 공정의 제조 방법이다. 또, 특별히 명시가 없는 한, 제4 제조 방법은, 예를 들면, 상기 (A1), (A2) 또는 (A3) 공정 대신에, 상기 (A4) 공정을 행하면 되고, 그 밖에는, 상기 제1∼제3 제조 방법과 같이 행할 수 있다.

본 발명에서의 세포 시료로서는, 상술한 원핵 세포를 함유하는 세포 시료를 들 수 있다. 제4 제조 방법에 있어서는, 예를 들면, 세포 시료를 냉장 보존 또는 동결 융해하는 것만으로, 상기 핵산 복합체를 방출시킬 수 있다.

제4 제조 방법에 있어서는, 예를 들면, 상술한 바와 같이, 상기 (A) 공정에서, 상기 세포 시료를 동결 융해 또는 냉장 보존함으로써, 상기 세포로부터 핵산 복합체를 방출시킨 처리액이 얻어진다. 이 상기 (A) 공정 후의 처리액은, 예를 들면, 상기 담체에 접촉시키는 상기 (B) 공정 전에, 예를 들면, 처리 시약과 혼합하는 것이 바람직하다. 상기 처리 시약으로서는, 예를 들면, 상기 프로테아제 및 상기 계면활성제의 어느 것도 함유하지 않는 시약, 또는, 상기 프로테아제 및 상기 계면활성제의 어느 한쪽을 함유하고 또한 다른 쪽이 무첨가인 시약을 들 수 있다. 본 발명의 제4 제조 방법에 있어서 사용하는 상기 처리 시약은, 예를 들면, 「제4 처리 시약」이라고도 한다. 상기 제4 처리 시약이 프로테아제 또는 계면활성제를 함유하는 경우, 그 첨가 비율은, 예를 들면, 상기 제1 제조 방법에 있어서의 제1 처리 시약과 마찬가지이다. 또한, 세포 시료에 대한 첨가 비율도, 상기 제1 제조 방법과 마찬가지이다. 상기 제4 처리 시약이 프로테아제 및 계면활성제를 함유하지 않는 경우, 상기 제4 처리 시약은, 예를 들면, 이들이 무첨가인 이외는, 상기 제1 제조 방법에 있어서의 제1 처리 시약과 같으며, 예를 들면, 상술한 각종 용매 등을 들 수 있다.

동결 융해 후 또는 냉장 보존 후의 세포 시료는, 원핵 세포의 세포벽이 파괴되어 있거나, 혹은, 파괴되기 쉬워져 있다. 그리고, 원핵 세포는, 세포핵이 존재하지 않기 때문에, 상술한 바와 같이 세포벽이 파괴되어 있거나, 또는, 파괴되기 쉬워져 있다. 이것에 의해, 예를 들면, 계면활성제 및 프로테아제, 또는, 어느 한쪽을 함유하지 않는 제4 처리 시약이어도, 효율좋게 핵산 복합체를 방출시킬 수 있다. 이 때문에, 처리 시약의 비용을 보다 한층 저하할 수 있다.

상기 제4 처리 시약은, 예를 들면, 냉장 보존 전 또는 동결 보존 전부터, 상기 세포 시료에 첨가해도 되고, 냉장 보존 후 또는 동결 융해 후에, 상기 세포 시료에 첨가해도 된다.

<증폭산물의 제조 방법>

이상과 같이, 본 발명의 핵산 시료의 제조 방법에 의해 얻어진 핵산 시료는, 예를 들면, 각종 핵산 증폭 방법의 주형 시료로서 사용할 수 있다. 그래서, 본 발명은, 핵산 증폭 방법에 의해, 목적 서열의 핵산 증폭물을 제조하는 방법으로서, 하기 (a) 및 (b) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은, 목적 서열의 증폭 방법이라 할 수도 있다.

(b) 상기 (a) 공정에서 회수한 상기 핵산 시료 중의 핵산을 주형으로 하여, 핵산 증폭 방법에 의해, 상기 주형에 있어서의 목적 서열의 핵산 증폭물을 제조하는 공정

본 발명의 핵산 증폭물의 제조 방법은, 본 발명의 핵산 시료의 제조 방법에 의해 핵산을 회수하는 점이 특징이며, 그 밖의 공정이나 조건 등은, 하등 제한되지 않는다. 또한, 상술한 바와 같이, 본 발명의 핵산 시료의 제조 방법에 의하면, 주형으로서 사용 가능한 충분량의 핵산을 얻을 수 있기 때문에, 예를 들면, 상기 (a) 공정의 핵산을 그대로 상기 (b) 공정에 사용할 수 있다.

상기 (b) 공정에서의 핵산 증폭 방법의 종류는, 하등 제한되지 않고, 종래 공지의 증폭 방법을 들 수 있다. 구체예로서는, PCR(Polymerase Chain Reaction)법, NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)법, TM(Transcription-mediated amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법, SMAP(SMart Amplification Process)법, LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)법, ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)법 등을 들 수 있다. 또한, 각종 핵산 증폭 방법의 공정이나 반응 조건 등은, 제한되지 않고, 예를 들면, 종래 공지의 조건에 따라 행할 수 있다.

상기 핵산 증폭 방법에 사용하는 시약으로서는, 특히 제한되지 않고, 종래 공지의 시약을 사용할 수 있고, 예를 들면, 폴리머라제, 뉴클레오시드3인산(dNTP), 완충제, 물이나 완충액 등의 용매 등을 들 수 있다. 이 밖에도, 예를 들면, 글리세롤, 헤파린, 베타인, KCl, MgCl₂, MgSO₄ 등을 함유해도 된다.

<핵산 회수용 시약>

본 발명의 제1 핵산 회수용 시약은, 본 발명의 제1 핵산 시료의 제조 방법에 사용하기 위한 시약이며, 상기 프로테아제 및 상기 계면활성제를 함유한다. 본 발명의 제1 핵산 회수용 시약은, 예를 들면, 본 발명의 제1 핵산 시료의 제조 방법에 있어서의 제1 처리 시약과 마찬가지이다. 상기 핵산 회수용 시약에 있어서, 상기 프로테아제 및 계면활성제는, 상기 세포 시료와 혼합했을 때에, 상기 세포 1×10²∼1×10⁹개에 대한 상기 프로테아제의 비율이, 예를 들면, 0.02mU 이상이 되고, 상기 세포 1×10²∼1×10⁹개에 대한 상기 계면활성제의 비율이 1펨토몰 이상이 되도록, 배합되어 있는 것을 특징으로 한다.

또, 본 발명의 제1 핵산 회수용 시약은, 예를 들면, 상기 세포 시료와 혼합했을 때, 상술한 범위가 되도록, 상기 프로테아제 및 계면활성제가 배합되어 있으면 된다.

본 발명의 제2 핵산 회수용 시약은, 본 발명의 제2 핵산 시료의 제조 방법에 사용하기 위한 시약이며, 특히 제한되지 않지만, 적어도 프로테아제를 함유하고 있으면 되고, 상기 세포 시료와 혼합했을 때에, 상기 제1 처리 시약과 같은 범위가 되도록, 상기 프로테아제를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 제2 핵산 회수용 시약은, 예를 들면, 본 발명의 제2 핵산 시료의 제조 방법에 있어서의 제2 처리 시약과 마찬가지이다. 또한, 본 발명의 제3 핵산 회수용 시약은, 본 발명의 제3 핵산 시료의 제조 방법에 사용하기 위한 시약이며, 예를 들면, 상기 프로테아제 및 상기 계면활성제의 어느 한쪽을 함유해도 되고, 어느 것도 함유하지 않는 용매이어도 된다. 본 발명의 제3 핵산 회수용 시약은, 예를 들면, 본 발명의 제3 핵산 시료의 제조 방법에 있어서의 제3 처리 시약과 마찬가지이다. 본 발명의 제4 핵산 회수용 시약은, 본 발명의 제4 핵산 시료의 제조 방법에 사용하기 위한 시약이며, 예를 들면, 상기 프로테아제 및 상기 계면활성제의 어느 것도 함유하지 않는 용매이어도 되고, 상기 프로테아제 및 상기 계면활성제의 어느 한쪽을 함유하고 또한 다른 쪽이 무첨가인 용매이어도 된다. 본 발명의 제4 핵산 회수용 시약은, 예를 들면, 본 발명의 제4 핵산 시료의 제조 방법에 있어서의 제4 처리 시약과 마찬가지이다.

본 발명의 각 핵산 회수용 시약은, 예를 들면, 액체이어도 고체이어도 된다. 액체의 경우, 예를 들면, 원액을 그대로 상술한 처리 시약으로서 사용해도 되고, 사용 전에 희석한 희석액을 상술한 처리 시약으로서 사용해도 된다. 고체의 경우, 예를 들면, 상기 세포 시료와 혼합하기 전에, 상술한 처리 시약의 용매에 용해 또는 분산하고, 이것을 상술한 처리 시약으로서 사용할 수도 있다. 본 발명의 각 핵산 회수용 시약은, 예를 들면, 또다른 성분을 함유해도 된다. 본 발명의 핵산 회수용 시약을 사용하여, 예를 들면, 세포로부터의 핵산의 회수 및 목적 서열의 핵산 증폭을 행하는 경우, 본 발명의 각 핵산 회수용 시약은, 또한, 핵산 증폭에 필요한 성분을 적절히 함유해도 되고, 예를 들면, 폴리머라제, 뉴클레오시드3인산(dNTP), 완충제, 물이나 완충액 등의 용매 등을 들 수 있다. 본 발명의 각 핵산 회수용 시약은, 예를 들면, 본 발명의 핵산 증폭물의 제조 방법에 사용하기 위한 제조용 시약이라고도 할 수 있다.

<핵산 회수용 키트>

본 발명의 제1 핵산 회수용 키트는, 본 발명의 제1 핵산 시료의 제조 방법에 사용하기 위한 키트이며, 상기 담체와, 상기 프로테아제와, 상기 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서, 상기 담체, 상기 프로테아제 및 상기 계면활성제는, 상술한 바와 같다.

본 발명의 제1 핵산 회수용 키트는, 상기 담체로서, 예를 들면, 후술하는, 상기 담체를 갖는 본 발명의 핵산 회수용 칩 또는 핵산 증폭용 칩을 포함해도 된다.

본 발명의 제1 핵산 회수용 키트에 있어서, 상기 프로테아제와 상기 계면활성제는, 예를 들면, 각각 별개의 용기에 수용되어도 되고, 양자가 공존하여 동일한 용기에 수용되어도 된다. 상기 프로테아제와 상기 계면활성제가 공존하고 있는 경우, 본 발명의 제1 핵산 회수용 키트는, 예를 들면, 상기 담체와 상기 본 발명의 제1 핵산 회수용 시약을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 본 발명의 제1 핵산 회수용 시약은, 상술한 바와 같으며, 상기 프로테아제와 상기 계면활성제를 포함하고 있으면 되고, 액체이어도 고체이어도 된다. 본 발명의 제1 핵산 회수용 키트에 있어서, 상기 프로테아제와 상기 계면활성제와의 비율은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 사용시에 있어서, 상술한 비율이 되도록 사용할 수 있으면 된다.

본 발명의 제2 핵산 회수용 키트는, 본 발명의 제2 핵산 시료의 제조 방법에 사용하기 위한 키트이며, 특히 제한되지 않지만, 상기 담체와, 상기 프로테아제를 포함하고, 예를 들면, 상기 담체와 상기 본 발명의 제2 핵산 회수용 시약을 포함해도 된다. 또한, 본 발명의 제3 핵산 회수용 키트는, 본 발명의 제3 핵산 시료의 제조 방법에 사용하기 위한 키트이며, 예를 들면, 상기 담체와, 상기 프로테아제 및 상기 계면활성제의 어느 한쪽을 포함해도 되고, 상기 담체와, 상기 프로테아제 및 상기 계면활성제의 어느 것도 함유하지 않는 용매를 포함해도 되고, 또한, 예를 들면, 상기 담체와 상기 본 발명의 제3 핵산 회수용 시약을 포함해도 된다. 본 발명의 제4 핵산 회수용 키트는, 본 발명의 제4 핵산 시료의 제조 방법에 사용하기 위한 키트이며, 예를 들면, 상기 담체와, 상기 프로테아제 및 상기 계면활성제의 어느 것도 함유하지 않는 용매를 포함해도 되고, 상기 담체와, 상기 프로테아제 및 상기 계면활성제의 어느 한쪽을 함유하고 또한 다른 쪽이 무첨가인 용매를 포함해도 되고, 또한, 예를 들면, 상기 담체와 상기 본 발명의 제4 핵산 회수용 시약을 포함해도 된다.

본 발명의 각 핵산 회수용 키트는, 예를 들면, 또한, 사용 설명서를 포함해도 된다. 또한, 본 발명의 각 핵산 회수용 키트는, 예를 들면, 또다른 성분을 포함해도 된다. 본 발명의 핵산 회수용 키트를 사용하여, 예를 들면, 세포로부터의 핵산의 회수 및 목적 서열의 핵산 증폭을 행하는 경우, 본 발명의 핵산 회수용 키트는, 또한, 핵산 증폭에 필요한 성분을 적절히 포함해도 되고, 예를 들면, 폴리머라제, 뉴클레오시드3인산(dNTP), 완충제, 물이나 완충액 등의 용매 등을 들 수 있다. 본 발명의 핵산 회수용 키트는, 예를 들면, 본 발명의 핵산 증폭물의 제조 방법에 사용하기 위한 제조용 키트라고도 할 수 있다.

<핵산 회수용 칩>

본 발명의 핵산 회수용 칩은, 본 발명의 핵산 시료의 제조 방법에 사용하기 위한 칩이며, 칩 본체와 상기 담체를 갖고, 상기 칩 본체가, 액체의 유로를 구비하고, 상기 유로 내에 상기 담체가 배치되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 핵산 회수용 칩과 상기 본 발명의 핵산 회수용 시약을 사용함으로써, 예를 들면, 본 발명의 핵산 시료의 제조 방법을 실시할 수 있다.

본 발명의 핵산 회수용 칩은, 예를 들면, 상기 세포 시료 및 상기 처리 시약 등의 액체가 통과하는 유로에, 상기 담체가 배치되어 있으면 되고, 그 밖의 구성이나 형상 등은 하등 제한되지 않는다. 이하에, 본 발명의 핵산 회수용 칩의 형태를 예시하지만, 본 발명은, 이것에는 제한되지 않는다.

(제1 핵산 회수용 칩)

제1 핵산 회수용 칩은, 예를 들면, 상기 칩 본체와 상기 담체를 갖고, 상기 칩 본체가, 액체의 유로를 갖고, 상기 유로의 일단(一端)이 액체를 도입 및 배출하기 위한 제1 개구부를 구비하고, 상기 유로의 타단(他端)이 압력 제어 수단과 연결 가능한 제2 개구부를 구비하고, 상기 유로 내에 상기 담체가 배치되어 있다. 상기 담체는, 예를 들면, 필터가 되는 시트상 담체이어도 되고, 복수의 비드상 담체이어도 된다.

상기 제1 핵산 회수용 칩은, 예를 들면, 사용시에 있어서, 상기 제2 개구부에 압력 제어 수단을 연결하고, 상기 압력 제어 수단에 의해 상기 유로를 감압 조건으로 제어함으로써, 액체를 상기 제1 개구부로부터 상기 유로 내부에 도입하고, 상기 압력 제어 수단에 의해 상기 유로를 가압 조건으로 제어함으로써, 도입된 액체를 상기 제1 개구부로부터 상기 유로 외부로 배출할 수 있다. 이 때문에, 우선, 감압 조건에서, 상기 세포 시료를 함유하는 상기 처리액을 상기 유로 내부에 도입하면, 상기 처리액이, 배치된 상기 담체를 통과한다. 이 때문에, 예를 들면, 상기 처리 시약에 의해 세포 시료 중의 세포로부터 방출한 핵산 복합체가, 통과시, 상기 담체에 포획된다. 계속해서, 가압 상태에서, 도입된 상기 처리액을 상기 유로 외부로 배출하면, 상기 세포 시료 유래의 불필요 성분을 제거할 수 있다. 그리고, 감압 조건에서 상기 분산매를 상기 유로 내부에 도입한 후, 상기 분산매의 존재 하에서 상기 담체에 가열 처리를 실시하면, 상기 담체에 포획된 상기 핵산 복합체로부터 핵산이 상기 분산매 중에 방출된다. 그래서, 가압 조건에서, 상기 분산매를 상기 유로 외부로 배출하면, 상기 핵산을 함유하는 분산매를 핵산 시료로 하여 회수할 수 있다. 핵산 회수용 칩과 압력 제어 수단과의 연결은, 직접적이어도 간접적이어도 된다. 또, 상기 세포 시료 및 상기 처리 시약의 도입 방법은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 미리, 상기 세포 시료와 상기 처리 시약을 혼합한 처리액을 준비하고, 이것을 도입해도 되고, 한쪽을 도입하고 이것을 다른 쪽으로 배출하는 조작(피펫팅)을 반복하여, 최종적으로, 상기 처리액을 도입해도 된다.

이와 같은 형태의 핵산 회수용 칩으로서는, 예를 들면, 흡인 장치에 장착하여 사용하는 피펫 팁을 들 수 있다. 이 경우, 예를 들면, 수동이나 자동의 피펫터 등의 흡인 장치가, 상기 압력 제어 수단에 해당한다. 상기 제1 핵산 회수용 칩으로서, 피펫 팁을 예로 들어, 도 1을 사용하여 설명한다. 동(同) 도면은, 핵산 회수용 피펫 팁(이하, 「피펫 팁」이라 한다)의 단면도이다. 동 도면에 나타내는 바와 같이, 피펫 팁(1)은, 중공의 원추상 본체(13), 액체의 도출구인 제1 개구부(11) 및 피펫터에 장착 가능한 제2 개구부(12)를 구비하고, 원추상 본체(13)의 내부로서, 제1 개구부(11)측에, 담체(10)가 배치되어 있다. 피펫 팁(1)에 있어서, 원추상 본체(13)의 내부의 공극이, 액체의 유로 및 도입된 액체의 수용부가 된다.

상기 피펫 팁의 크기나 형상은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 도입하는 상기 세포 시료를 함유하는 상기 처리액의 양에 따라, 적절히 설정할 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산 회수용 칩은, 상술한 바와 같이, 상기 담체를 구비하는 것이 특징이므로, 예를 들면, 시판의 피펫 팁에 상기 담체를 배치하는 것만으로 제조 가능하다. 또한, 피펫 등의 흡인 장치에의 장착 방법 등도 종래와 같이 행할 수 있다.

피펫 팁(1)을 사용한 핵산 시료의 제조 방법(핵산 회수 방법)의 일례를, 도 2를 사용하여 설명한다. 또, 본 발명은 이것에 제한되지 않는다. 도 2는, 피펫 팁을 사용한 핵산 시료의 제조 방법의 공정의 개략을 시한 단면도이다. 도 2에 있어서, 도 1과 동일 개소에는 동일 부호를 붙이고 있다.

우선, 피펫 팁(1)을 제2 개구부(12)로부터 피펫터(도시하지 않음)에 장착한다. 그리고, 도 2(A)에 나타내는 바와 같이, 피펫터의 조작에 의해, 제1 개구부(11)로부터 처리액(20)을 흡인한다. 그 때, 흡인한 처리액(20)의 모두가, 피펫 팁(1) 내의 담체(10)를 통과하는 것이 바람직하다. 이것에 의해, 처리액(20) 중에 방출된 핵산 복합체가 담체(10)에 포획된다. 이어서, 도 2(B)에 나타내는 바와 같이, 피펫터의 조작에 의해, 흡인한 처리액(20)을 제1 개구부(11)로부터 외부로 배출한다. 여기서 배출되는 처리액(20')은, 핵산 복합체가 담체(10)에 의해 제거되어 있고, 핵산 회수에 불필요한 성분, 예를 들면, 적혈구 등을 함유하는 액체이다. 계속해서, 도 2(C)에 나타내는 바와 같이, 피펫터의 조작에 의해, 제1 개구부(11)로부터 분산매(30)를 흡인한다. 이 때, 피펫 팁(1) 내의 담체(10)가, 흡인한 분산매(30)로 채워져 있는 것이 바람직하다. 그리고, 이 상태, 즉, 담체(10)가 분산매(30) 중에 존재하는 상태에서, 상술한 가열 처리를 행한다. 마지막으로, 도 2(D)에 나타내는 바와 같이, 피펫터의 조작에 의해, 제1 개구부(11)로부터 가열 처리 후의 분산매(40)를 외부로 배출한다. 배출한 분산매(40)에는, 상술한 바와 같이, 담체(10)에 포획되어 있던 상기 핵산 복합체로부터 방출된 핵산이 함유되어 있다. 이 분산매(40)를 핵산 시료로 하여 회수하면, 예를 들면, 핵산 증폭의 주형 시료에 이용할 수 있다. 이 핵산 시료는, 도 2(B)로 표시되는 공정에서, 핵산 회수에 불필요한 성분이 배출되어 있으므로, 상기 불필요 성분의 함유량도 저감되어 있다.

(제2 핵산 회수용 칩)

제2 핵산 회수용 칩은, 예를 들면, 상기 칩 본체와 상기 담체를 갖고, 상기 칩 본체가, 액체의 유로를 갖고, 상기 유로의 일단이 가압 수단과 연결 가능하며 또한 액체를 도입하기 위한 제1 개구부를 구비하고, 상기 유로의 타단이 액체를 배출하기 위한 제2 개구부를 구비하고, 상기 유로 내에 본 발명의 핵산 회수용 담체가 배치되어 있다.

상기 제2 핵산 회수용 칩은, 사용시에 있어서, 상기 제1 개구부에 가압 수단을 연결하고, 상기 가압 수단에 의해 액체를 가압함으로써, 상기 액체를 상기 제1 개구부로부터 상기 유로 내부에 도입하고, 상기 가압 수단에 의해 상기 유로를 가압하여, 도입된 액체를 상기 제2 개구부로부터 상기 유로 외부로 배출할 수 있다. 이 때문에, 우선, 가압 조건 하에서 상기 처리액을 상기 유로 내부에 도입하면, 상기 처리액은 배치된 상기 담체를 통과하기 때문에, 상기 담체에 상기 처리액 중의 핵산 복합체가 포획된다. 이어서, 가압 조건 하에서 도입된 상기 처리액을 상기 유로 외부로 배출하면, 세포 시료 유래의 불필요 성분을 제거할 수 있다. 그리고, 가압 조건에서 상기 분산매를 상기 유로 내부에 도입한 후, 상기 분산매의 존재 하에서 상기 담체에 가열 처리를 실시하면, 상기 담체에 포획되어 있는 상기 핵산 복합체로부터 핵산이 상기 분산매 중에 해방된다. 그래서, 가압 조건에서 상기 분산매를 상기 유로 외부로 배출하면, 핵산을 함유하는 분산매를 핵산 시료로 하여 회수할 수 있다. 또, 핵산 회수용 칩과 가압 수단과의 연결은, 직접적이어도 간접적이어도 된다(이하, 같음).

이와 같은 형태의 핵산 회수용 칩으로서는, 예를 들면, 표면에 오목상의 유로가 형성된 지지 기판과, 상기 표면을 덮는 커버 기판으로 형성되는, 이른바 바이오칩을 들 수 있다. 상기 제2 핵산 회수용 칩으로서, 바이오칩을 예로 들어, 도 3을 사용하여 설명한다. 동 도면은, 핵산 회수용 바이오칩(이하, 「바이오칩」이라 한다)의 개략을 나타내는 모식도이며, (A)는 측면도, (B)는 상면도, (D)는 상기 (B)의 A-A 방향 단면도이다. 또한, 동 도면(C)은, 바이오칩을 구성하는 지지 기판(22)의 상면도이다. 동 도면에 나타내는 바와 같이, 바이오칩(2)은, 지지 기판(22)과 커버 기판(21)을 포함한다. 지지 기판(22)의 표면에는, 유로(23), 유로(23)로부터 분기하는 유로(27), 유로(27)에 연결된 배액부(24), 유로(23)에 연결된 핵산 함유액(핵산 시료)의 수용부(25)가, 오목상의 홈으로서 형성되어 있다. 커버 기판(21)은, 지지 기판(22)의 오목상의 홈이 형성된 표면에 피복되어 있고, 이것에 의해, 유로(23)의 말단(도면에 있어서 좌단)이 액체의 도입구(26)가 된다. 그리고, 유로(23) 내부로서, 배액부(24) 및 수용부(25)와의 연결부보다도 도입구(26)측에, 담체(10)가 배치되어 있다. 유로(23)는, 핵산 시료의 수용부(25)와, 유로(27)를 거쳐 배액부(24)와의 양방에 연결하고 있지만, 배액부(24)에의 액체의 도입과 수용부(25)에의 액체의 도입은, 적절히 전환 가능하다. 바이오칩의 크기나 형상은, 특히 제한되지 않는다.

바이오칩(2)을 사용한 핵산 회수 방법으로서, 시린지 가압 등의 가압 송액 장치를 사용한 일례를, 도 3을 사용하여 설명한다. 또, 본 발명은 이것에 제한되지 않는다.

가압 송액 장치(도시하지 않음)에 의해, 도입구(26)로부터 처리액을 송액한다. 이것에 의해, 송액된 처리액은, 유로(23) 내에 배치된 담체(10)를 통과하여, 유로(27)를 거쳐 배액부(24)에 수용된다. 그리고, 처리액 중에 방출되어 있는 핵산 복합체가 담체(10)에 포획된다. 여기서 배액부(24)에 수용되는 처리액은, 상기 핵산 복합체가 담체(10)에 의해 제거되어 있고, 핵산 회수에 불필요한 성분, 예를 들면, 적혈구 등을 함유하는 액체이다. 이어서, 마찬가지로 하여, 가압 송액 장치에 의해, 도입구(26)로부터 분산매를 송액한다. 이 때, 유로(23) 내의 담체(10)가, 분산매로 채워져 있는 것이 바람직하다. 그리고, 이 상태, 즉, 담체(10)가 분산매 중에 존재하는 상태에서, 상술한 가열 처리를 행한다. 마지막으로, 가압 송액 장치에 의해, 가열 처리 후의 분산매를 핵산 함유액의 수용부(25)로 이동시킨다. 수용부(25)에 수용된 분산매에는, 상술한 바와 같이, 포획되어 있던 상기 핵산 복합체로부터 방출된 핵산이 함유되어 있다. 이 핵산을 함유하는 분산매를 핵산 시료로 하여, 예를 들면, 핵산 증폭의 주형 시료에 이용할 수 있다. 또한, 이 핵산 시료는, 핵산 회수에 불필요한 성분이 배출되어 있으므로, 상기 불필요 성분의 함유량도 저감되어 있다.

상술한 방법은, 가압에 의해 액체를 도입 및 배출하는 예이지만, 본 발명은, 이것에 제한되지 않는다. 즉, 예를 들면, (1) 감압에 의해 액체를 도입 및 배출, (2) 가압에 의해 액체를 도입하여 감압에 의해 액체를 배출, 또는, (3) 감압에 의해 액체를 도입하여 가압에 의해 액체를 배출할 수도 있다. 상기 (1)의 방법에 사용하는 핵산 회수용 칩으로서는, 예를 들면, 상기 칩 본체가, 상기 유로의 일단에, 액체를 도입하기 위한 제1 개구부를 구비하고, 상기 유로의 타단에, 감압 수단과 연결 가능하며, 또한, 액체를 배출하기 위한 제2 개구부를 구비하는 것이 바람직하다. 이 핵산 회수용 칩은, 예를 들면, 사용시에 있어서, 상기 제2 개구부에 감압 수단을 연결하고, 상기 감압 수단에 의해 상기 유로 내부를 감압하여, 상기 액체를 상기 제1 개구부로부터 상기 유로 내부에 도입하고, 또한, 도입된 액체를 상기 제2 개구부로부터 상기 유로 외부로 배출하는 것이 바람직하다. 또, 핵산 회수용 칩과 감압 수단과의 연결은, 직접적이어도 간접적이어도 된다(이하, 같음). 또한, 상기 (2)의 방법에 사용하는 핵산 회수용 칩으로서는, 예를 들면, 상기 칩 본체가, 상기 유로의 일단에, 가압 수단과 연결 가능하며, 또한, 액체를 도입하기 위한 제1 개구부를 구비하고, 상기 유로의 타단에, 감압 수단과 연결 가능하며, 또한, 액체를 배출하기 위한 제2 개구부를 구비하는 것이 바람직하다. 이 핵산 회수용 칩은, 예를 들면, 사용시에 있어서, 상기 제1 개구부에 가압 수단을 연결하고, 상기 가압 수단에 의해 액체를 가압하여, 상기 액체를 상기 제1 개구부로부터 상기 유로 내부에 도입하고, 상기 제2 개구부에 감압 수단을 연결하고, 상기 감압 수단에 의해 상기 유로 내부를 감압하여, 도입된 액체를 상기 제2 개구부로부터 상기 유로 외부로 배출하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 (3)의 방법에 사용하는 핵산 회수용 칩으로서는, 예를 들면, 상기 칩 본체가, 상기 유로의 일단에, 가압 수단과 연결 가능하며, 또한, 액체를 도입하기 위한 제1 개구부를 구비하고, 상기 유로의 타단에, 감압 수단과 연결 가능하며, 또한, 액체를 배출하기 위한 제2 개구부를 구비하고, 사용시에 있어서, 상기 제2 개구부에 감압 수단을 연결하고, 상기 감압 수단에 의해 상기 유로 내부를 감압하여, 상기 액체를 상기 제1 개구부로부터 상기 유로 내부에 도입하고, 상기 제1 개구부에 가압 수단을 연결하고, 상기 가압 수단에 의해 상기 유로를 가압하여, 도입된 액체를 상기 제2 개구부로부터 상기 유로 외부로 배출하는 것이 바람직하다. 이들의 형태는, 예를 들면, 액체를 도입하는 제1 개구부를 가압 수단과 연결 가능하게 하거나, 액체를 배출하는 제2 개구부를 감압 수단과 연결 가능하게 하는 등, 조합에 의해 적절히 설정 가능하다.

또, 상기 담체로서, 예를 들면, 비드상 등의 담체를 복수 사용할 수도 있다. 이 경우, 예를 들면, 상기 유로 내에 상기 비드상 담체가 충전된 형태를 들 수 있다. 본 형태에 있어서는, 예를 들면, 상기 유로에 상기 처리액을 송액함으로써, 상기 비드상 담체 사이를 상기 처리액이 통과하고, 그 때에, 각 비드상 담체의 표면에 있어서 상기 처리액 중의 핵산 복합체가 포획된다. 또한, 상기 비드상 담체가, 예를 들면, 다공질체의 경우는, 외측의 표면 뿐아니라, 예를 들면, 공극부의 노출 표면에 있어서도, 상기 핵산 복합체를 포획하는 것이 가능하다.

본 발명의 핵산 회수용 바이오칩은, 예를 들면, 또한, 핵산을 사용한 각종 반응을 행하는 반응부 및 검출부, 상기 반응에 필요한 시약을 수용하는 시약부 등을 갖고 있어도 된다. 구체적으로는, 핵산 회수용 바이오칩 내에 있어서, 상기 수용부가, 유로를 거쳐, 반응부와 연결되어 있어도 되고, 또한, 상기 반응부가, 유로를 거쳐, 상기 시약부 및 검출부 등과 연결되어 있어도 된다. 또한, 미리, 상기 수용부에 목적의 반응에 필요한 시약을 배치해도 되고, 상기 수용부가, 유로를 거쳐, 상기 시약부와 연결되어도 된다. 이와 같은 형태에 있어서는, 예를 들면, 상기 수용부가 상기 반응부가 된다. 이와 같이 반응부 및 검출부 등이 연결됨으로써, 예를 들면, 하나의 바이오칩 내에서, 세포 시료로부터의 핵산의 회수 뿐아니라, 회수한 핵산을 사용하여 목적의 반응을 행하고, 또한 그 반응 결과를 측정하는 것도 가능하게 된다. 이 때문에, 본 발명을 핵산을 사용하는 각종 분석, 예를 들면, 핵산 증폭이나 SNP 검출 등에 이용함으로써, 종래보다도 더욱 간편한 분석이 가능하게 된다. 또한, 본 발명의 핵산 회수용 칩은, 유로에 상기 담체를 배치하는 것만으로 만족하므로, 예를 들면, 바이오칩의 소형화도 가능하게 된다. 이와 같은 바이오칩의 또다른 형태로서, 이하에, 일례로서 핵산 증폭용 칩을 든다.

<핵산 증폭용 칩>

본 발명의 핵산 증폭용 칩은, 본 발명의 핵산 증폭물의 제조 방법에 사용하기 위한 칩으로서,

칩 본체와 담체를 갖고,

상기 칩 본체가, 액체를 도입하는 개구부, 배액을 수용하는 배액부, 핵산 증폭 반응을 실시하는 반응부, 및, 액체의 유로를 갖고,

상기 유로의 일단이 상기 개구부이며,

상기 유로가, 상기 배액부 및 상기 반응부와 연결되고,

상기 유로 내로서, 상기 배액부 및 상기 반응부와의 연결부보다도 상기 개구부측에, 상기 담체가 배치되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 핵산 증폭용 칩과 상기 본 발명의 핵산 회수용 시약을 사용함으로써, 예를 들면, 본 발명의 핵산 시료의 제조 방법을 이용한 핵산 증폭물의 제조 방법을 실시할 수 있다.

본 발명의 핵산 증폭용 칩은, 상기 처리액, 상기 세포 시료 및 상기 처리 시약 등의 액체가 통과하는 유로에, 상기 담체를 구비되어 있으면 되고, 그 밖의 구성이나 형상은 제한되지 않는다.

본 발명의 핵산 증폭용 칩은, 예를 들면, 상기 유로(제1 유로)에 더하여, 제2 유로 및 제3 유로를 더 포함하고, 상기 반응부가, 상기 제2 유로에 의해 직접 또는 간접적으로 상기 제1 유로와 연결되고, 상기 배액부가, 상기 제3 유로에 의해 직접 또는 간접적으로 상기 제1 유로와 연결되어 있어도 된다. 또한, 본 발명의 핵산 증폭용 칩은, 예를 들면, 상기 배액부에의 액체의 도입과 상기 반응부에의 액체의 도입이 전환 가능한 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 상기 제2 유로에의 액체의 도입과 상기 제3 유로에의 액체의 도입이 전환 가능함으로써, 상기 배액부에의 액체의 도입과 상기 반응부에의 액체의 도입이 전환 가능한 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에서, 상기 담체에 포획된 상기 핵산 복합체로부터의 핵산의 방출 및 증폭 반응에 필요한 처리는, 모두 가열 처리이다. 따라서, 본 발명의 핵산 증폭용 칩에 의하면, 예를 들면, 온도 제어 수단을 구비하는 장치에 셋팅하여 온도 제어를 행하는 것만으로, 핵산의 회수 및 증폭 반응을 실시할 수 있다.

이와 같은 형태의 핵산 증폭용 칩으로서는, 예를 들면, 표면에 오목상의 유로가 형성된 지지 기판과, 상기 표면을 덮는 커버 기판으로 형성되는, 이른바 바이오칩을 들 수 있다. 본 발명의 핵산 증폭용 칩으로서, 바이오칩을 예로 들어, 도 4를 사용하여 설명한다. 또, 도 4에 나타내는 바이오칩은, 특별히 명시가 없는 한, 도 3에 나타내는 바이오칩과 같은 형태이며, 또한, 마찬가지로 하여 사용할 수 있다.

도 4는, 핵산 증폭용 바이오칩(이하, 「바이오칩」이라 한다)의 개략을 나타내는 모식도이며, (A)는 측면도, (B)는 상면도, (D)는 상기 (B)의 A-A 방향 단면도이다. 또한, 동 도면(C)은, 바이오칩을 구성하는 지지 기판(22)의 상면도이다. 동 도면에 있어서, 도 3과 동일 개소에는 동일 부호를 붙이고 있다. 동 도면에 나타내는 바와 같이, 바이오칩(3)은, 지지 기판(22)과 커버 기판(21)을 포함한다. 지지 기판(22)의 표면에는, 제1 유로(23), 제1 유로(23)에 연결된 제3 유로(27), 제3 유로(27)에 연결된 배액부(24), 제1 유로(23)에 연결된 핵산 함유액(핵산 시료)의 수용부(25), 수납부(25)에 연결된 제2 유로(33), 제2 유로(33)에 연결된 반응부(31)가, 오목상의 홈으로서 형성되어 있다. 커버 기판(21)은, 지지 기판(22)의 오목상의 홈이 형성된 표면에 피복되어 있고, 이것에 의해, 유로(23)의 말단(도면에 있어서 좌단)이 액체의 도입구(26)가 된다. 그리고, 유로(23) 내부로서, 배액부(24) 및 수용부(25)와의 연결부(제3 유로(27)와의 연결부)보다도 도입구(26)측에, 담체(10)가 배치되어 있다. 또, 유로(23)는, 핵산 함유액의 수용부(25)와 제3 유로(27)를 거쳐 배액부(24)와의 양방에 연결하고 있지만, 배액부(24)에의 액체의 도입과 수용부(25)에의 액체의 도입은, 적절히 전환 가능하다.

바이오칩(3)에서는, 수용부(25)에 수납된 핵산 함유액을, 예를 들면, 제2 유로(33)를 더 거쳐 반응부(31)로 이동시킨다. 그리고, 증폭 반응에 필요한 시약이 반응부(31)에 배치되어 있는 경우는, 그대로 증폭 반응을 개시시킬 수 있다. 또한, 별개로 시약을 수용한 시약부(도시하지 않음)를 구비하는 경우에는, 예를 들면, 시약부 내의 시약을 반응부(31)로 송액한 후, 증폭 반응을 개시시킬 수 있다. 증폭 반응의 검출은, 예를 들면, 반응부(31)에서 그대로 행해도 되고, 또한, 검출부(도시하지 않음)를 구비하는 경우는, 예를 들면, 반응부(31)로부터 반응액을 검출부로 송액하고, 상기 검출부에서 검출을 행해도 된다.

[실시예]

이어서, 본 발명의 실시예에 대해 설명한다. 단, 본 발명은 하기 실시예에 의해 제한되지 않는다.

[실시예1]

하기 표 2에 나타내는 각종 담체(1a 및 1b)를 직경 2mm의 원형으로 잘라내고, 이것을 도 5에 나타내는 바와 같이 지그 장치에 셋팅했다. 도 5는, 담체를 셋팅한 지그 장치의 모식도이다. 동 도면에 있어서, (A)가, 담체를 셋팅한 지그 장치의 상면도, (B)가, 상기 (A)의 I-I 방향 단면도, (C)가, 담체에 대한 액체의 통과 방향을 나타내는 모식도이다. 지그 장치(4)는, 유로(23)와 담체(10)를 갖고 있고, 유로(23)의 축 방향 중앙 부근에 담체(10)가 배치되어 있다. 구체적으로는, 지그 장치(4)에 있어서, 담체(10)는, 알루미늄제의 오목상 부재(6a)의 오목부에 배치되고, 또한, 상기 오목부에 알루미늄제의 볼록상 부재(6b)의 볼록부를 감입(嵌入)함으로써, 오목상 부재(6a)와 볼록상 부재(6b)로 이루어지는 알루미늄 블록 내에 고정되어 있다. 또, 도시하고 있지 않지만, 상기 알루미늄 블록은, 바닥면(동 도면(B)에 있어서 하측의 면)이 노출하도록, 플라스틱제 부재로 고정되어 있다. 이 지그 장치(4)를, 상기 노출한 바닥면이 접촉하도록, 히트 블록 위에 배치했다. 각 도면에 있어서 화살표는, 액체의 진행 방향을 나타낸다. 동 도면(C)의 화살표에 나타내는 바와 같이, 본 실시예에 있어서, 액체는, 담체(10)의 원형 표면으로부터 도입되고, 다른 쪽의 표면으로부터 배출된다.

한편, 전혈 50μL와 하기 표 1의 처리 시약1-1 50μL를 혼합하여 처리액 100μL를 준비했다. 상기 처리액에 있어서, 전혈 50μL에 대해, 프로테아제의 첨가량은 5.4U이며, 계면활성제의 첨가 비율은 0.25체적%로 했다. 그리고, 상기 처리액 100μL를 지그 장치(4)의 유로(23)의 일단의 개구부로부터 유로(23) 내부로 가압에 의해 주입하고, 담체(10)를 통과시켜, 유로(23)의 타단의 개구부로부터 배출시켰다. 이어서, 하기 표 1의 세정액 100μL를 마찬가지로 하여 주입하고, 담체(10)에 통과시킨 후, 배출했다. 그리고, 히트 블록에 의해, 지그 장치(4) 내의 담체(10)를 96℃에서 5분간 가열한 후, 하기 표 1의 분산매 100μL를 마찬가지로 하여 주입하고, 담체(10)에 상기 분산매를 통과시켜, 상기 분산매를 배출시켰다. 배출시킨 상기 분산매를 핵산 시료로 했다.

[표 1]

[표 2]

1a : 상품명 나일론, SEFAR사제

1b : 상품명 MF80A, 노이악코포레이션사제

회수한 핵산 시료에 대해, 게놈 DNA의 농도를 리얼타임 PCR법에 의해 측정했다. 또한, 전혈 50μL당의 게놈 DNA량의 이론값을 산출하여, 하기식으로부터, 상기 각 담체에 의한 게놈 DNA의 회수율을 산출했다. 이들의 결과를 상기 표 2에 아울러 나타낸다.

회수율(%)=100×(A×B)/C

A : 핵산 시료의 DNA 농도

B : 핵산 시료의 체적

C : 전혈 50μL당의 DNA량의 이론값

상기 표 2에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법에 의하면, 종래와는 달리, 예를 들면, 특수한 약제를 사용하지 않고, 간편하게 게놈 DNA를 회수할 수 있었다. 또한, 회수한 핵산 시료 중의 게놈 DNA 농도도, 500copy/μL 이상이며, PCR 등에 있어서의 필요량인 것이 확인할 수 있었다.

[실시예2]

하기 표 3에 나타내는 각종 담체(2a∼2j)를 준비했다. 2b(직포), 2c(직포) 및 2j(부직포)의 담체는, 직경 2mm의 원형으로 잘라내고, 두께가 1.5mm가 되도록 적층하여, 원주상의 담체로 했다. 남은 담체는, 직경 2mm, 높이 1.5mm의 원주상으로 잘라내었다. 2b, 2c 및 2j의 적층체 및 다른 단층체를 각각 원주상 담체로서, 도 6에 나타내는 바와 같이 지그 장치에 셋팅했다. 도 6은, 상기 담체를 셋팅한 지그 장치의 모식도이다. 동 도면에 있어서, (A)가, 지그 장치 본체와 담체를 나타내는 사시도, (B)가 본체에 담체를 셋팅한 지그 장치의 사시도, (C)가 상기 (B)의 상면도, (D)가 상기 (C)의 Ⅱ-Ⅱ 방향 단면도이다. 지그 장치(5)는, 직경 1mm의 유로(23)와 담체 배치부(8)를 갖는 본체(7), 및, 담체(10)를 구비하고, 유로(23)의 축 방향 중앙 부근에, 담체 배치부(8)가 마련되고, 담체 배치부(8) 내에 담체(10)가 배치되어 있다. 또한, 도시하고 있지 않지만, 담체(10)의 노출면(동 도면(D)에 있어서 상측의 면)은, 점착 시트로 덮여 있다. 또, 본 실시예에 있어서는, 도 6(B)∼(D)의 화살표에 나타내는 바와 같이, 각종 액체는, 원주상 담체의 측면으로부터 도입되고, 측면으로부터 배출된다.

한편, 전혈 50μL와 상기 실시예1의 처리 시약1-1 50μL를 혼합하여 처리액 100μL를 준비했다. 그리고, 상기 처리액 100μL를 지그 장치(5)의 유로(23)의 일단의 개구부로부터 유로(23) 내부에 가압에 의해 주입하고, 담체(10)를 통과시켜, 유로(23)의 타단의 개구부로부터 배출시켰다. 이어서, 상기 실시예1의 세정액 100μL를 마찬가지로 하여 주입하고, 상기 세정액을 담체(10)에 통과시킨 후, 배출했다. 그리고, 지그 장치(5)로부터 담체(10)를 취출하여, 상기 실시예1의 분산매 100μL 중에 침지시켰다. 그리고, 상기 각 담체를 96℃에서 5분간 가열했다. 가열 후의 상기 분산매를 회수하고, 이것을 핵산 시료로 했다.

[표 3]

2a : 상품명 MAPS, 노이악코포레이션사제

2b : 상품명 PET150-HD, SEFAR사제

2c : 상품명 9P-150, SEFAR사제

2d : 상품명 CFS, 노이악코포레이션사제

2e : 상품명 MF50, 노이악코포레이션사제

2f : 상품명 MF80, 노이악코포레이션사제

2g : 상품명 800EA, 쿠라보보세키가부시키가이샤제

2h : 상품명 806EA, 쿠라보보세키가부시키가이샤제

2i : 상품명 852EA, 쿠라보보세키가부시키가이샤제

2j : 상품명 EM02010, 도레·파인케미컬가부시키가이샤제

PP : 폴리프로필렌

PE : 폴리에틸렌

회수한 핵산 시료에 대해, 상기 실시예1과 같이, 게놈 DNA의 농도를 측정하여, 상기 각 담체에 의한 게놈 DNA의 회수율을 산출했다. 이들의 결과를 상기 표 3에 아울러 나타낸다.

실시예2a의 핵산 시료에 대해서는, 미토콘드리아 DNA의 농도를 리얼타임 PCR법에 의해 측정했다. 그 결과, 약 10⁵copy/μL이었다.

상기 표 3에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법에 의하면, 종래와는 달리, 예를 들면, 특수한 약제를 사용하지 않고, 간편하게 게놈 DNA를 회수할 수 있었다. 회수한 핵산 시료 중의 게놈 DNA 농도도, 3000copy/μL 이상이며, PCR 등에 있어서의 필요량인 것이 확인할 수 있었다. 또한, 미토콘드리아 DNA에 대해서도, 충분량을 회수할 수 있었다.

[실시예3]

우선, 전혈 50μL와 상기 실시예1의 처리 시약1-1 50μL를 혼합하여 처리액 100μL를 준비했다. 한편, 담체로서, 하기 표 4에 나타내는 각종 담체(실시예3a∼3g)를 직경 2mm의 원형으로 잘라내었다. 1.5mL 용량의 튜브 내에, 잘라낸 상기 각 담체와 상기 처리액 100μL를 넣고, 보르텍스로 혼합한 후, 상기 처리액을 제거했다. 상기 튜브 내에, 상기 실시예1의 세정액 100μL를 첨가하고, 보르텍스로 혼합한 후, 상기 세정액을 폐기했다. 그리고, 상기 튜브로부터 상기 각 담체를 취출하여, 새로운 튜브 내에, 상기 실시예1의 분산매 100μL와 함께 넣고, 96℃에서 5분간 가열했다. 가열 후의 상기 분산매를 회수하여, 핵산 시료로 했다.

[표 4]

3a : 상품명 LV, 셀폴고교사제

3b : 상품명 MAPS, 노이악코포레이션사제

3c : 상품명 PET250-HD, SEFAR사제

3d : 상품명 PET150-HD, SEFAR사제

3e : 상품명 9P-150, SEFAR사제

3f : 상품명 CFS, 노이악코포레이션사제

3g : 상품명 EM02010, 도레·파인케미컬가부시키가이샤제

PE : 폴리에틸렌

PP : 폴리프로필렌

회수한 핵산 시료에 대해, 상기 실시예1과 같이, 게놈 DNA의 농도를 측정하여, 상기 각 담체에 의한 게놈 DNA의 회수율을 산출했다. 이들의 결과를 상기 표 4에 아울러 나타낸다.

상기 표 4에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법에 의하면, 종래와는 달리, 예를 들면, 특수한 약제를 사용하지 않고, 간편하게 게놈 DNA를 회수할 수 있었다. 또한, 회수한 핵산 시료 중의 게놈 DNA 농도도, 1500copy/μL 이상이며, PCR 등에 있어서의 필요량인 것이 확인할 수 있었다.

[실시예4]

1.5mL 용량의 튜브 내에서, 전혈 50μL와 상기 실시예1의 처리 시약1-1 50μL를 혼합하여 처리액 100μL를 준비했다. 상기 튜브에, 또한, 담체로서, 하기 표 5에 나타내는 각종 자성 비드(실시예4a 및 4b)를 총량 1mg 첨가하여, 보르텍스로 혼합했다. 자석으로 상기 자성 비드를 회수하고, 상기 튜브 내의 상기 처리액을 제거하여, 상기 튜브 내에, 회수한 상기 자성 비드와 상기 실시예1의 세정액 100μL를 넣고, 보르텍스로 혼합하고, 재차, 상기 자성 비드를 회수하여, 상기 세정액을 제거했다. 그리고, 상기 튜브에, 회수한 상기 자성 비드와 상기 실시예1의 분산매 100μL를 넣고, 보르텍스로 혼합하고, 96℃에서 5분간 가열했다. 가열 후, 상기 튜브를 원심 분리에 제공하여 상기 자성 비드를 제거하여, 상기 분산매를 회수했다. 이것을 핵산 시료로 했다.

[표 5]

4a 및 4b : 상품명 micromer(상표) M, micromod사제

PS : 폴리스티렌

회수한 핵산 시료에 대해, 상기 실시예1과 같이, 게놈 DNA의 농도를 측정하여, 상기 각 담체에 의한 게놈 DNA의 회수율을 산출했다. 이들의 결과를 상기 표 5에 아울러 나타낸다.

상기 표 5에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법에 의하면, 종래와는 달리, 예를 들면, 특수한 약제를 사용하지 않고, 간편하게 DNA를 회수할 수 있었다. 또한, 회수한 핵산 시료 중의 DNA 농도도, 400copy/μL 이상이며, PCR 등에 있어서의 필요량인 것이 확인할 수 있었다.

[참고예1]

전혈을 본 발명의 핵산 회수용 시약(처리 시약)으로 처리하여, 필터상의 담체에 유지되는 핵산 복합체를 확인했다.

전혈 10μL와 하기 표 6의 처리 시약 10μL를 혼합하여 처리액 20μL를 준비했다. 담체로서는, 오프닝 100㎛의 필터(상품명 나일론메시; SEFAR사제)를 사용했다. 이 처리액 20μL를, 상기 실시예1과 같이 하여, 상기 담체에 통과시켰다. 그리고, 상기 담체를 통상의 방법에 따라 김자 염색하고, 광학 현미경으로 관찰했다. 이 결과를 도 7에 나타낸다. 동 도면의 광학 현미경 사진에 있어서, 화살표로 표시하는 바와 같이, 직경 약 200㎛ 정도의 자색으로 염색된 핵산 복합체가, 담체에 부착하여 있는 것이 확인되었다.

[표 6]

[실시예5]

전혈로부터의 RNA의 회수

담체로서, 상품명 MF-80A(노이악코포레이션사제)를 사용했다. 이 담체를 직경 2mm의 원형으로 잘라내어, 상기 실시예1과 같이 하여 지그 장치에 셋팅했다. 한편, 다른 검체로부터 3종류의 전혈(신선혈)을 준비하고, 각 전혈 50μL와 하기 표 7의 처리 시약5-1 50μL를 혼합하여 처리액 100μL를 제조했다. 상기 처리액에 있어서, 전혈 50μL에 대해, 프로테아제의 첨가량은 1.35U이며, 계면활성제의 첨가 비율은 0.25체적%이다. 그리고, 하기 표 7의 세정액 및 분산매를 사용한 이외는, 상기 실시예1과 같이 하여, 핵산 시료를 제조했다. 회수한 핵산 시료에 대해, One Step SYBR Prime Script RT-PCR Kit Ⅱ(TAKARA) 및 β-액틴용의 하기 프라이머 셋트를 사용하여, RNA의 정량을 행했다. 컨트롤로서, 동일한 전혈로부터 QIAamp RNA Blood Mini(QIAGEN사제)를 사용하여 정제한 핵산 시료에 대해서도, 마찬가지로 RNA의 정량을 행했다. 그리고, 컨트롤의 회수 RNA량을 100%로 한 경우의, 본 실시예의 회수 RNA량의 상대값(%)을 구했다.

[표 7]

그 결과, 3종류의 검체에 대한 결과는, 각각 5.6%, 12.3%, 7.2%이었다. 이 회수율은, 예를 들면, RT-PCR의 주형으로서는 충분량이다. 따라서, 본 실시예에 의하면, 종래와는 달리, 특수한 약제를 사용하지 않고, 간편하게 필요량의 RNA를 회수할 수 있었다.

[실시예6]

타액으로부터의 게놈 DNA의 회수

우선, 타액 100μL(인간 핵산 함유 세포수 : 약 150,000개)와 하기 표 8의 각 처리 시약 100μL를 혼합하여 처리액 200μL를 준비했다. 상기 처리액에 있어서, 타액 50μL에 대해, 프로테아제의 첨가량은 1U이며, 계면활성제의 첨가 비율은 0.5체적%, 1체적%, 2체적%이다. 한편, 담체로서, 공경 60㎛의 PET제 메시상 직포(산프라테크사제, 메시 사이즈 60㎛)를 사용했다. 이 담체를 직경 3.5mm의 원형으로 잘라내어, 도 1에 나타내는 피펫 팁(용량 200μL) 내부에 장착했다(유효경 2.2mm). 상기 유효경이란, 상기 피펫 팁 내부에 장착한 상기 담체에 있어서, 실제로 통액 가능한 직경을 의미한다. 이 피펫 팁을 피펫터에 장착하고, 상기 처리액 200μL를 흡인 토출한 후, 상기 실시예1의 세정액 200μL의 흡인 토출을 행했다. 재차, 새로운 상기 세정액 200μL를 흡인 토출한 후, 상기 피펫 팁으로부터 담체를 취출했다. 이 담체를 상기 실시예1의 분산매 100μL에 침지하고, 95℃에서 5분간 가열함으로써, 핵산 시료를 얻었다. 이들 핵산 시료에 대해, 상기 실시예1과 같이 하여, 게놈 DNA의 농도를 측정했다. 이들의 결과를 하기 표 8에 아울러 나타낸다.

[표 8]

상기 표 8에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법에 의하면, 타액에 대해서도, PCR의 주형으로서 충분량인 3000copy/μL 정도의 게놈 DNA를 회수할 수 있었다.

[실시예7]

구강 점막 세포로부터의 게놈 DNA의 회수

우선, 면봉(1P1501V, 일본면봉제)으로 뺨의 내측을 좌우 각각 10회, 원을 그리듯이 긁고, 하기 표 9의 각 처리 시약 200μL에 혼합하여 처리액 200μL(인간 핵산 함유 세포수 : 약 250,000개)를 준비했다. 상기 처리액에 있어서, 구강 점막 세포 현탁액 50μL에 대해, 프로테아제의 첨가량은 1U이며, 계면활성제의 첨가량은 0.5체적%, 1체적%, 2체적%이다. 한편, 상기 실시예6에 있어서의 담체를 장착한 피펫 팁을 사용하여, 마찬가지로 하여, 핵산 시료를 제조했다. 이들 핵산 시료에 대해, 상기 실시예1과 같이 하여, 게놈 DNA의 농도를 측정했다. 이들의 결과를 하기 표 9에 아울러 나타낸다.

[표 9]

상기 표 9에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법에 의하면, 구강 점막 세포에 대해서도, PCR의 주형으로서 충분량인 1000∼2000copy/μL 정도의 게놈 DNA를 회수할 수 있었다.

[실시예8]

배양 세포로부터의 게놈 DNA의 회수

우선, 아시아인 유래 정상 제대 정맥 혈관 내피 세포(KJB-110, DS PHARMA BIOMEDICAL)의 배양 세포 현탁액을 생리 식염수로 세정하여 배지 성분을 제거하고, 상기 배양 세포를 1×10³cells/μL가 되도록 생리 식염수에 현탁했다. 상기 배양 세포 현탁액 100μL(핵산 함유 세포수 : 약 1×10⁵개)를 하기 표 10의 각 처리 시약 100μL에 혼합하여 처리액 200μL를 준비했다. 상기 처리액에 있어서, 배양 세포 현탁액 50μL에 대해, 프로테아제의 첨가량은 1U이며, 계면활성제의 첨가 비율은 0.5체적%, 1체적%, 2체적%로 했다. 한편, 상기 실시예6에 있어서의 담체를 장착한 피펫 팁을 사용하여, 마찬가지로 하여, 핵산 시료를 제조했다. 이들 핵산 시료에 대해, 상기 실시예1과 같이 하여, 게놈 DNA의 농도를 측정했다. 이들의 결과를 하기 표 10에 아울러 나타낸다.

[표 10]

상기 표 10에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법에 의하면, 배양 세포에 대해서도, PCR의 주형으로서 충분량인 수백copy/μL 정도의 게놈 DNA를 회수할 수 있었다.

[실시예9]

대장균으로부터의 플라스미드 DNA의 회수

우선, IAPP(췌도(膵島) 아밀로이드펩티드) 서열을 편성한 플라스미드 DNA를 갖는 대장균을 LB배지로 12시간 배양한 후, 배양액 100μL(핵산 함유 세포수 : 약 1×10⁷개)를 이하의 각 처리 시약 100μL에 혼합하여, 처리액 200μL를 준비했다. 또, 하기 표 11의 처리 시약9-1에서 처리하는 대장균은, 배양 후, 배양액 그대로 -80℃로 동결하고, 사용시에 25℃에서 융해시킨 후, 마찬가지로 하여 상기 처리 시약9-1과 혼합했다. 상기 처리액에 있어서, 배양 세포 현탁액 50μL에 대해, 프로테아제의 첨가량은, 0, 1U이며, 계면활성제의 첨가 비율은, 0체적%, 0.5체적%, 1체적%, 2체적%이다. 한편, 상기 실시예6에 있어서의 담체를 장착한 피펫 팁을 사용하여, 마찬가지로 하여, 핵산 시료를 제조했다. 이들 핵산 시료에 대해, 상기 실시예1과 같이 하여, 플라스미드 DNA의 농도를 측정했다. 또한, 이들 핵산 시료에 대해, 260nm의 흡광도 측정으로부터, 게놈 DNA의 농도를 측정했다. 이들의 결과를 하기 표 11에 아울러 나타낸다.

[표 11]

상기 표 11에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법에 의하면, 대장균의 배양 세포에 대해서도, PCR의 주형으로서 충분량인 약 50만copy/μL 정도의 플라스미드 DNA, 약 3만copy/μL의 게놈 DNA를 각각 회수할 수 있었다. 또한, 각 처리 시약9-1을 사용한 결과에서, 대장균의 배양 세포를 동결 융해함으로써, 프로테아제 및 계면활성제를 사용하지 않고, 동일 정도의 플라스미드 DNA 및 게놈 DNA를 회수할 수 있음을 알 수 있었다.

[실시예10]

전혈로부터의 게놈 DNA의 회수

우선, 4℃에서 70일간 냉장 보존한 전혈 100μL, 및, -30℃에서 9개월간 동결 보존 후, 융해한 전혈 100μL를 각각, 하기 표 12의 각 처리 시약 100μL에 혼합하여 처리액 200μL를 준비했다. 상기 냉장 보존 전혈 100μL 중의 핵산 함유 세포수는, 약 580,000개이며, 상기 동결 융해 전혈 100μL 중의 핵산 함유 세포수는, 약 560,000개이었다. 상기 처리액에 있어서, 전혈 50μL에 대해, 프로테아제의 첨가량은 1U, 2U이며, 계면활성제는 무첨가이다. 한편, 상기 실시예6에 있어서의 담체를 장착한 피펫 팁을 사용하여, 마찬가지로 하여, 핵산 시료를 제조했다. 이들 핵산 시료에 대해, 상기 실시예1과 같이 하여, 게놈 DNA의 농도를 측정했다. 이들의 결과를 하기 표 12에 아울러 나타낸다.

[표 12]

상기 표 12에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법에 의하면, 전혈을 냉장 보존 또는 동결 융해함으로써, 계면활성제를 사용하지 않고, PCR의 주형으로서 충분량인 게놈 DNA를 회수할 수 있었다.

[실시예11]

1.신선혈로부터의 게놈 DNA의 회수

냉장 또는 냉동 보존하여 있지 않은 채혈 당일의 신선 전혈을 이하에 나타내는 여러가지 조건에서 처리한 후, 게놈 DNA의 회수를 행했다. 상기 신선 전혈의 백혈구수는, 약 5,500개/μL이었다.

튜브 내에, 50μL의 하기 표 13의 처리 시약6과 50μL의 신선 전혈을 넣고, 처리액을 제조했다. 또, 상기 처리 시약6에 있어서의 프로테아제 및 계면활성제의 농도는, 하기 표 14에 나타낸다. 또한, 상기 처리액에 있어서의 프로테아제 및 계면활성제의 농도는, 하기 표 14의 농도의 1/2이다(이하, 같음). 한편, 담체로서, 공경 105㎛의 PET제 메시상 직포(상품명 PET105, SEFAR사제, 메시 사이즈 105㎛)를 준비했다. 이 담체를 직경 2.5mm의 원형으로 잘라내어, 도 1에 나타내는 피펫 팁(용량 200μL) 내부에 장착했다(유효경 1.4mm). 이 피펫 팁을 피펫터에 장착하고, 상기 처리액 100μL의 흡인 토출을 20회 행하여, 상기 처리액을 토출했다. 계속해서, 새로운 튜브에 세정액1(250mmol/L KCl수용액) 100μL를 넣고, 상기 피펫 팁을 사용하여 흡인 토출을 10회 행하여, 상기 세정액1을 토출했다. 또한, 새로운 튜브에 세정액2(0.1mmol/L EDTA 및 1mmol/L Tris-HCl, pH8.0) 100μL를 넣고, 상기 피펫 팁에의 흡인 토출을 10회 행하여, 상기 세정액2를 토출한 후, 상기 피펫 팁으로부터 담체를 취출했다. 이 담체를 분산매(0.1mmol/L EDTA 및 1mmol/L Tris-HCl, pH8.0) 100μL에 침지하고, 그 상태에서, 5분간 95℃에서 처리함으로써, 핵산 시료를 얻었다. 이들 핵산 시료에 대해, 상기 실시예1과 같이 하여, 게놈 DNA의 농도를 측정했다. 이들의 결과를 하기 표 14에 아울러 나타낸다. 또, 프로테아제 및 계면활성제를 함유하는 처리 시약을 사용한 예를 실시예A1∼A6, 어느 한쪽 또는 양방이 무첨가인 처리 시약을 사용한 예를 비교예A1∼A3으로 했다.

[표 13]

[표 14]

상기 표 14에 나타내는 바와 같이, 본 실시예에 의하면, 신선 전혈로부터, PCR의 주형으로서 충분량인 약 100copy/μL 정도의 게놈 DNA를 각각 회수할 수 있었다. 이것에 대해, 프로테아제 및 계면활성제를 첨가하여 있지 않은 비교예A1, 어느 한쪽을 첨가하여 있지 않은 비교예A2 및 A3에 대해서는, DNA가 거의 회수할 수 없었다.

2.냉장혈로부터의 게놈 DNA의 회수

2개월간 냉장 보존한 전혈을 이하에 나타내는 여러가지 조건에서 처리한 후, 게놈 DNA의 회수를 행했다. 상기 냉장혈의 백혈구수는, 약 6,900개/μL이었다.

상기 처리 시약6에 있어서의 프로테아제 및 계면활성제의 농도를 하기 표 15에 나타내는 농도로 한 이외는, 상기 신선 전혈과 같이 하여 게놈의 회수 및 측정을 행했다.

[표 15]

상기 표 15의 실시예B1에 나타내는 바와 같이, 냉장혈이면, 계면활성제 무첨가 또한 프로테아제를 함유하는 처리 시약으로 처리한 후, 상술한 바와 같이 가열 처리함으로써, PCR의 주형으로서 충분량인 게놈 DNA를 회수할 수 있었다. 이와 같이, 전혈을 냉장 보존한 경우는, 상기 처리 시약이 계면활성제를 함유하지 않아도, 효율좋게 DNA를 회수할 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 상기 표 15의 실시예B2에 나타내는 바와 같이, 상기 처리 시약이, 프로테아제 이외에, 계면활성제를 더 함유함으로써, 보다 한층 게놈 DNA의 회수율을 향상할 수 있음을 알 수 있었다. 이것에 대해, 상기 표 15에 나타내는 바와 같이, 프로테아제 및 계면활성제를 첨가하여 있지 않은 비교예B1에 대해서는, DNA를 거의 회수할 수 없었다.

3.동결혈로부터의 게놈 DNA의 회수

-30℃에서 2시간 동결 보존한 전혈을 실온 해동하여 이하에 나타내는 여러가지 조건에서 처리한 후, 게놈 DNA의 회수를 행했다. 상기 동결혈의 백혈구수는, 약 5,500개/μL이었다.

상기 처리 시약6에 있어서의 프로테아제 및 계면활성제의 농도를 하기 표 16에 나타내는 농도로 한 이외는, 상기 신선 전혈과 같이 하여 게놈의 회수 및 측정을 행했다.

[표 16]

상기 표 16의 실시예C1에 나타내는 바와 같이, 동결 융해 후의 전혈이면, 계면활성제 및 프로테아제가 무첨가이어도, 상술한 바와 같이 가열 처리함으로써, PCR의 주형으로서 충분량인 게놈 DNA를 회수할 수 있었다. 또한, 실시예C2 및 C3에 나타내는 바와 같이, 프로테아제를 함유하는 처리 시약을 사용함으로써, DNA의 회수율을 향상할 수 있고, 또한, 실시예C4에 나타내는 바와 같이, 프로테아제와 계면활성제를 함유하는 처리 시약을 사용함으로써, 보다 한층 DNA의 회수율을 향상할 수 있음을 알 수 있었다.

[산업상의 이용 가능성]

이상과 같이, 본 발명에 의하면, 예를 들면, 특수한 시약을 사용하지 않고, 간편하게 핵산을 회수할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 뛰어난 효율로 세포로부터의 핵산 회수가 가능하며, 예를 들면, 게놈 DNA나 RNA 이외에, 미토콘드리아 DNA의 회수도 가능하다. 이와 같이, 본 발명은, 안전성 및 조작성이 뛰어나고, 또한, 핵산의 회수율도 뛰어나므로, 예를 들면, 소량의 세포 시료로부터도, 핵산 증폭 등에 필요한 주형 핵산을 충분량 회수할 수 있다. 또한, 이와 같이 소량의 세포 시료로부터의 회수를 간편한 조작으로 행하는 것이 가능하므로, 예를 들면, 근래 주목받고 있는 마이크로칩이나 마이크로타스 등을 사용한 핵산 회수나 핵산 증폭에도 유용하다고 할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> ARKRAY, INC. <120> Method of Producing Nucleic Acid Sample, and Method of Producing Amplified Nucleic Acid Used the Same <130> TF09046-01 <150> JP09/008091 <151> 2009-01-16 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for beta-actin <400> 1 tgaaccccaa ggccaaccgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for beta-actin <400> 2 ttgtgctggg tgccagggca 20

Claims

세포로부터 핵산을 회수하는 핵산 시료의 제조 방법으로서,
하기 (A)∼(E) 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
(A) 상기 세포를 함유하는 세포 시료에 대해, 상기 세포로부터 핵산 복합체를 방출시키는 공정
(B) 상기 (A) 공정 후의 상기 세포 시료를 함유하는 처리액과, 담체(擔體)를 접촉시키는 공정
(C) 상기 담체와 상기 처리액을 분리하는 공정
(D) 상기 담체에 가열 처리를 실시하는 공정
(E) 상기 (D) 공정의 전 또는 후, 상기 담체에 분산매를 첨가하는 공정
제1항에 있어서,
상기 (A) 공정이, 프로테아제 및 계면활성제를 함유하는 처리 시약과, 상기 세포 시료를 혼합하는 공정이며,
상기 처리 시약과 상기 세포 시료를 혼합한 처리액에 있어서, 상기 프로테아제의 농도가 0.5mU/μL 이상이며, 계면활성제의 농도가, 0.1체적% 이상인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 처리액에 있어서, 상기 프로테아제의 농도가 0.5∼1000mU/μL이며, 상기 계면활성제의 농도가 0.1∼20체적%인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 처리액에 있어서, 상기 세포 1×10²∼1×10⁹개에 대한 상기 프로테아제의 비율이 0.02mU 이상이며, 상기 세포 1×10²∼1×10⁹개에 대한 상기 계면활성제의 비율이 1펨토몰(1×10^-15몰) 이상인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 처리액에 있어서, 상기 세포 시료 50μL에 대한 상기 프로테아제의 비율이 0.02mU 이상이며, 상기 세포 시료 50μL에 대한 상기 계면활성제의 비율이 1펨토몰 이상인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 프로테아제가 프로테이나제K, 키모트립신, 펩신, 카텝신D 및 파파인으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 프로테아제인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 계면활성제가 비이온성 계면활성제인, 제조 방법.
제7항에 있어서,
상기 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌-p-이소옥틸페놀, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우릴산, 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르, 및, 노닐페놀폴리티오에톡실레이트로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 계면활성제인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 처리 시약이, 또한, 킬레이트제 및 단백질 변성제의 적어도 한쪽을 함유하는, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 세포가 진핵 세포이며,
상기 (A) 공정이, 계면활성제 무첨가이며 또한 프로테아제를 함유하는 처리 시약과, 동결 융해 후 또는 냉장 보존 후의 상기 세포 시료를 혼합하는 공정인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 세포가 혈중 세포, 타액중 세포, 구강 점막 세포, 체세포, 생식 세포 및 종양 세포로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 세포가 배양 세포인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 세포 시료가 혈액, 타액, 구강 점막, 손톱 및 모발로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 세포 시료가 세포의 배양물인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 세포 시료가 미희석의 세포 시료인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 세포가 원핵 세포이며,
상기 (A) 공정이, 상기 원핵 세포를 함유하는 세포 시료를 동결 융해 또는 냉장 보존하는 공정인, 제조 방법.
제16항에 있어서,
상기 (A) 공정에서, 프로테아제 무첨가이며 또한 계면활성제를 함유하는 처리 시약 또는 계면활성제 무첨가이며 또한 프로테아제를 함유하는 처리 시약과, 동결 융해 후 또는 냉장 보존 후의 상기 세포 시료를 혼합하는 공정인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 담체가 부직포, 직포 및 다공질체로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 담체가 다공질체이며, 그 평균 공경이 10∼1000㎛인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 담체가 부직포이며, 그 단위면적당 중량이 20∼150g/m³인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 담체가 직포이며, 그 메시(mesh) 사이즈가 10∼1000㎛인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 담체의 형상이 필터상, 시트상, 블록상 및 비드상으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 담체가 비드이며, 체적 충전율이 0.1∼10%의 범위인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 담체가 폴리머제 담체 및 금속제 담체의 적어도 한쪽인, 제조 방법.
제24항에 있어서,
상기 폴리머가 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리에테르, 폴리스티렌, 폴리염화비닐 및 폴리테트라플루오로에틸렌으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 폴리머인, 제조 방법.
제24항에 있어서,
상기 금속이 스테인리스, 티탄 및 알루미늄으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 (D) 공정에서의 가열 온도가 50∼130℃인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 (D) 공정에서의 가열 시간이 1∼30분인, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 핵산이 DNA 및 RNA의 적어도 한쪽인, 제조 방법.
제29항에 있어서,
상기 DNA가 게놈 DNA 및 미토콘드리아 DNA의 적어도 한쪽인, 제조 방법.
핵산 증폭 방법에 의해, 목적 서열의 핵산 증폭물을 제조하는 방법으로서,
하기 (a) 및 (b) 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭물의 제조 방법.
(a) 제1항에 기재된 핵산 시료의 제조 방법에 의해, 세포를 함유하는 세포 시료로부터 핵산 시료를 회수하는 공정
(b) 상기 (a) 공정에서 회수한 상기 핵산 시료 중의 핵산을 주형으로 하여, 핵산 증폭 방법에 의해, 상기 주형에 있어서의 목적 서열의 핵산 증폭물을 제조하는 공정