CN114717225A - 一种用于全血样本的处理液及包含其的试剂盒与扩增方法 - Google Patents
一种用于全血样本的处理液及包含其的试剂盒与扩增方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于全血样本的处理液及包含其的试剂盒与扩增方法，其中处理液包含SDS试剂以及用于提供的碱性环境的强碱，所述的处理液的pH值为10～14的强碱性环境，通过研究发现,在本发明的强碱性环境下，SDS和强碱会产生更好的产生协同作用，保证细胞裂解能更有效，也能使得DNA易于在扩增过程中被引物和聚合酶接近，强碱环境下蛋白质与核酸能更充分地分离，保证了处理液对于全血样本充分处理获得充足的待分析核酸片段。处理液中包含适量的甲酰胺除了能分离蛋白质‑DNA复合物并使蛋白变性和释放外，还能提高扩增反应的特异性以及DNA聚合酶的活性，使得扩增可以免去核酸提取纯化过程，直接以血液为模版进行高效和特异的荧光扩增。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断(IVD)技术领域，具体涉及一种用于全血样本的处理液及包含其的试剂盒与扩增方法。
背景技术
核酸检测作为一种常规的分子生物学技术，广泛应用在疾病控制、临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、畜牧业和分子生物学研究等多种领域。自1985年首次发表论文以来，聚合酶链反应已转变为无数种方法和诊断分析方法。特别是对于血液遗传病，感染性疾病和遗传背景分析，荧光PCR技术已经成为不可或缺的基本技术。而血液作为一种重要的生物分析样本，其内含有大量的PCR反应抑制物，如胆红素、血红蛋白、脂肪等。因此，基于现有技术，很难实现直接对血液样本进行PCR扩增。通常，为了完成血液样本核酸的荧光PCR扩增，必须先从血液中对核酸物质进行纯化处理。
目前对血液中核酸提取的方法主要有柱提取法和磁珠法。柱提取法是用于微量核酸分离纯化的较为简单的方法，其基本原理是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来。把释放出的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，再把吸附在特异载体上的核酸用洗脱液洗脱下来，分离得到纯化的核酸。柱提取法DNA提取的缺点是需要较多的样本，耗材多，对于珍稀样本无能为力。同时柱提取法DNA提取需要反复离心，不便于高通量、自动化操作，与现代生物学实验的高通量、自动化要求格格不入，特别是在基因诊断、疾病检测、转基因检测等领域，柱提取法DNA提取需要大量的操作人员及仪器设备。磁珠法是通过裂解液裂解细胞，使细胞中的核酸释放出来，核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，再用洗脱液洗脱，得到纯净的核酸。但磁珠法成本高昂，且对样本量的要求一般在200～600微升，仪器设备的要求也非常高，限制了其推广和使用。
尽管具体的提取方式不一样，但是都包括以下三个过程：一是破裂细胞膜和核膜；二是纯化核酸即去除蛋白质等影响后续PCR反应的杂质；三是洗脱核酸。通过提取处理虽然可以获得纯度比较高的核酸，但是核酸提取过程往往会导致核酸损失，同时繁琐的提纯步骤增加了样本间交叉污染的风险，从而增加了后续荧光PCR扩增失败的可能。此外，由于提取过程耗时长，成本高，且难以实现高通量检测。因此，血液样本能够直接作为模板或经过简单处理就能够进行荧光PCR扩增检测，成为血液荧光PCR扩增亟待解决的难题。
目前用于简单处理全血样本进行荧光PCR的技术较少，且基本上都存在一定的局限性，CN107475252A提供的方法中全血样本的处理包含震荡、离心及热处理5～30min的步骤；CN106978501A提供的方法中全血样本的处理需要两步的加液及一步离心操作；CN111500735A提供的方法中需要进行两轮PCR，耗时较长且涉及开管操作，易造成气溶胶污染；CN111020026A和CN107058530A则分别使用了进口的PCR反应Mix和血液高耐受Taq酶，增加了检测的成本。因此，亟待开发一种血液样本经过简单处理就可以作为模板进行荧光PCR扩增检测的方法，以满足科研和医学领域对于基因检测技术的快速、简便、成本低廉的要求。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述存在的问题，本发明提供了一种用于全血样本的处理液及包含其的试剂盒与扩增方法。
本发明采用的技术方案包含用于全血样本的处理液、包含其的试剂盒以及扩增方法三方面的发明内容。
第一方面，本发明提供的全血样本的处理液包含SDS试剂(十二烷基硫酸钠)，用于提供的碱性环境的强碱，所述的处理液的pH值为10～14的强碱性环境。
优选地，还包含非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂的体积百分比为0.2％～2％。
优选地，所述的非离子表面活性剂为Tween 20。
优选地，还包含体积百分比为2％～8％的甲酰胺。
优选地，还包含K+离子化合物和/或Na+离子化合物。
优选地，包含的离子化合物为氯化钠化合物和氯化钾化合物组成的混合物，其中氯化钠的质量浓度为5mg/mL～8mg/mL，氯化钾的质量浓度为5mg/mL～8mg/mL。
优选地，还包含摩尔浓度为10mM～40mM的Tris-HCl。
优选地，所述强碱为NaOH和/或KaOH。
优选地，所述SDS的体积百分比为0.01％～0.04％，所述强碱的质量浓度为4mg/mL～50mg/mL。
第二方面，本发明提供了一种包含第一方面的用于全血样本的处理液的试剂盒。
第三方面本发明提供了一种扩增方法，使用第一方面的用于全血样本的处理液与全血样品按照第一预设体积比混合，再按照预定时间进行混匀操作，之后取至少部分混匀后的混合液，并按照第二预设体积比与扩增反应液混合，获得待扩增混合液，对所述至少部分待扩增混合液进行恒温或者循环温度扩增，完成扩增。
优选地，所述第一预设体积比取值范围(5～50)：1。
优选地，所述第二预设体积比取值范围为1:(5～50)。
优选地，所述扩增反应液包含抗血液抑制作用的突变型DNA聚合酶、buffer和dNTPs。
优选地，所述扩增方法中，对所述至少部分待扩增混合液进行的扩增为循环温度扩增。
优选地，所述处理液与所述全血样品按照第一预设体积比进行混合的预设混匀时间为：1～10min。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明提出了一种用于全血样本的处理液，包含了SDS与提供pH值为10～14强碱性环境的强碱，通过发明人研究发现，在更高的pH值环境中SDS能够与强碱产生更好的协同作用，保证细胞裂解能更有效，也能使得DNA易于在扩增过程中被引物和聚合酶接近，强碱环境下蛋白质与核酸能更充分地分离，保证了处理液对全血样本充分处理，以获得充足的待分析核酸片段。
2、通过添加非离子表面活性剂可以增加细胞的通透性，破坏膜结构和解聚蛋白质-DNA复合物，使血液中的血红素、蛋白质和脂肪等抑制物变性，以降低其对后续荧光PCR的抑制作用；Tris-HCl用于保证细胞裂解时pH值的稳定且能够较好地与后续扩增时的PCR反应液兼容；甲酰胺等阳离子聚合物组分除了能分离蛋白质-DNA复合物并使蛋白变性和释放外，还能提高PCR反应的特异性，此外还能够提高DNA聚合酶的活性，使得荧光PCR扩增可以免去核酸提取纯化过程，直接以血液为模版进行高效和特异的荧光PCR扩增；而Na+和K+化合物则可通过协调细胞膜内外离子平衡来对核酸起保护作用，通过调整不同组分的含量，可以实现高效充分且快速的全血样本核酸一步化提取。
3、本发明还提供了一种扩增方法，其可以直接利用处理液处理完成的混合液至少部分与配合使用的扩增反应液混合，进而可以实现直接的扩增操作，该扩增方法一方面免去了类似磁珠提取或者柱膜法提取的复杂操作以及过程中的污染风险，另一方面通过两种反应液体积比调整使得提取和扩增均能处于最优化的环境条件中，保证了提取扩增均能高效地被开展，当然通过配合提取后，混合液使用的扩增反应液也进行了最优化的探索研究，保证整个扩增方法能够实现更高灵敏度和避免更少假阴性等的效果。
附图说明
图1是本发明所提供的一种利用本发明方法处理样本后的扩增结果示意图；
图2是利用目前所使用的多步骤提取法处理样品进行扩增的扩增曲线示意图；
图3-1是使用本发明提供的全血样本处理液处理样本后，利用市面上常规或者本公司已有PCR反应液进行扩增的结果图；
图3-2是使用本发明提供的全血样本处理液和PCR反应液按照实施例2中的步骤对5份EDTA抗凝全血样进行处理后的扩增结果图；
图3-3是使用市场中销售的A公司的全血样本常温裂解试剂对同样的5份EDTA抗凝全血样本进行处理后的扩增结果图；
图3-4是以灭菌超纯水代替本发明提供的全血样本处理液，按照实施例2中的步骤对同样的5份EDTA抗凝全血样本进行处理后的扩增结果图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本申请实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
本发明中的术语“核酸”或“核酸序列”指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物单元的任何分子、优选聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链的核酸。或者，单链核酸可为不来源于任何双链DNA的单链核酸。
本发明的用于全血样本的处理液，包含SDS试剂其为一种离子型的表面活性剂，用于提供的碱性环境的强碱，所述的处理液的pH值为10～14的强碱性环境，通过本发明研究发现，在更高的pH值环境中，SDS能够与强碱产生更好的协同作用，保证细胞裂解能更有效，也能使得DNA易于在扩增过程中被引物和聚合酶接近，强碱环境下蛋白质与核酸能更充分地分离，保证了处理液对全血样本充分处理，以获得充足的待分析核酸片段。进一步，本发明使用的强碱可以为在水中溶解度较大的碱化合物，例如可以为KOH或NaOH，或者两者按一定的配比关系均被包含。优选地，所述SDS的体积百分比为0.01％～0.04％，所述强碱的质量浓度为4mg/mL～50mg/mL。
进一步地，本发明的用于全血样本的处理液中还包含非离子表面活性剂，非离子表面活性剂可以是多山梨醇酯和/或聚乙二醇辛基苯基醚,包括以商标TWEEN(聚山梨酸酯)和/或TRITON(Octoxynol)出售的非离子表面活性剂，其中，TWEEN可以是选自TWEEN 20(聚山梨酯20)、TWEEN 21(聚山梨酸酯21)、TWEEN 40(聚山梨酸酯40)、TWEEN 60(聚山梨酸酯60)、TWEEN 61(聚山梨酸酯61)、TWEEN 80(聚山梨酸酯80)、TWEEN 81(聚山梨酸酯81)和TWEEN 85(聚山梨酯-85)；TRITON可以是TRITON X-100(Octoxynol-9)、TRITON X-114(Octoxynol-7)或TRITON X-200(辛氧基磺酸钠)等等。通过本发明的探索，所述非离子表面活性剂最优地体积百分比为0.2％～2％，如此最优地增加细胞的通透性，破坏膜结构和解聚蛋白质-DNA复合物，使血液中的血红素、蛋白质和脂肪等抑制物变性，以降低其对后续荧光PCR的抑制作用，当然，一种商用比较多且低成本的试剂可以为Tween 20。
进一步地，本发明的用于全血样本的处理液中还包含阳离子聚合物，其可以为聚丙酰胺、甲酰胺等等，将阳离子聚合物体积百分比设置为2％～8％的范围内，除了能分离蛋白质-DNA复合物并使蛋白变性和释放外，还能提高PCR反应的特异性，此外还能够提高DNA聚合酶的活性，使得荧光PCR扩增可以免去核酸提取纯化过程，直接以血液为模版进行高效和特异的荧光PCR扩增。
进一步地，本发明的用于全血样本的处理液还可以包含K+离子化合物和/或Na+离子化合物，通过适当的配比可以实现通过协调细胞膜内外离子平衡来对核酸起最优化的保护作用。K+离子化合物和/或Na+离子化合物包括但不限于KCl和/或NaCl、K2SO4和/或Na2SO4、KNO3和/或NaNO3等等。
进一步地，本发明的用于全血样本的处理液还可以进一步包含Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液，当然，缓冲液也可以为巴比妥和钠-盐酸缓冲溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液或硼酸盐-硼砂缓冲溶液等等。最优地，将缓冲液Tris-HCl摩尔浓度设置为10mM～40mM范围内，如此可保证细胞裂解时pH值的稳定，且能够较好地与后续扩增时的PCR反应液兼容。
进一步，本发明还保护一种使用上述处理液制成的试剂盒，试剂盒体积、形状与类型等此处并不限定，采用现有相关的试剂盒即可。当然，也可以为并联的几组实现对于多个全血样本同时进行处理的效果。
在一种情况下，用于全血样本的处理液包括SDS、Tween 20、Tris-HCl、甲酰胺、氯化钠、氯化钾、强碱；其中，SDS的体积百分比为0.01％～0.04％，Tris-HCl的摩尔浓度为10～40mM，Tween 20的体积百分比为0.2％～2％，甲酰胺的体积百分比为2％～8％，氯化钠的质量浓度为5mg/mL～8mg/mL，氯化钾的质量浓度为5mg/mL～8mg/mL，强碱的质量浓度为4mg/mL～50mg/mL，处理液的pH为10～14。通过一定比例的强碱和SDS使细胞裂解释放核酸，所述Tween20组分能增加细胞的通透性，破坏膜结构和解聚蛋白质-DNA复合物，使血液中的血红素、蛋白质和脂肪等抑制物变性，以降低其对后续荧光PCR的抑制作用。而氯化钠和氯化钾则通过协调细胞膜内外离子平衡来对核酸起保护作用，Tris-HCl用于保证细胞裂解时pH值的稳定且能够较好地与后续扩增时的PCR反应液兼容。所述甲酰胺组分除了能分离蛋白质-DNA复合物并使蛋白变性和释放外，还能提高PCR反应的特异性，此外还能够提高DNA聚合酶的活性，使得荧光PCR扩增可以免去核酸提取纯化过程，直接以血液为模版进行高效和特异的荧光PCR扩增。可以理解，该处理液不仅可用于DNA样品的PCR扩增检测，也适用于RNA样品或RNA、DNA混合样品的多重扩增检测。
进一步，本发明公开了一种扩增方法，首先使用本发明公开的用于全血样本的处理液与全血样品按照第一预设体积比混合，再按照预定时间进行混匀操作，之后取至少部分混匀后的混合液，并按照第二预设体积比与扩增反应液混合，获得待扩增混合液，对所述至少部分待扩增混合液进行恒温或者循环温度扩增，完成扩增。其中，第一预设体积比中全血样本的体积较少，如此实现了在整个提取过程中两者的混合不至于引起过大的反应环境变化，如此能保证SDS与碱性环境持续高效的协同作用，所述第一预设体积比取值范围(5～50)：1，也就是混合的液体中处理液的体积大于甚至远远大于全血样本的体积。再按照可以为例如1～10min的混匀时间进行处理液和全血样本的混匀，混匀过程可以借助人力或者机械等外力作用来进行，可以是离心机的旋转混匀，摇摆臂的振荡混匀，借助棉签等的搅拌运动等等此处并不限定实现类型。混匀操作完成后可取至少部分混匀后的混合液，并按照第二预设体积比与扩增反应液混合，获得待扩增混合液，之后可以对于该待扩增混合液进行分杯，实现多对象的检测，也可以首先对于取出的至少部分混匀后的混合液进行分杯，之后按照第二预设体积比与扩增反应液混合，获得多份待扩增混合液，两种方案均可，此处并不限定具体采用哪种方式来实现多对象的检测，当然在一些情况下也可以不进行分杯操作，来利用标记探针和检测通道差异完成需要检测的目标片段。
进一步，所述第二预设体积比取值范围为1:(5～50)，如此实现了全血与处理液的混合液在扩增反应过程中占比很少，不至于影响扩增反应所需要的最佳反应条件例如最佳的pH值条件等，此时的扩增反应液体积大于甚至远远大于全血与处理液的混合液的体积，当然最后的扩增可以为循环温度扩增方案也可以为恒温扩增方案，只需要调整最后的扩增反应液配方与配比即可实现，此处并不限定，当然最优地选择目前使用最多的PCR类型的循环温度扩增方案完成最终的扩增反应，其中所述扩增反应液包含抗血液抑制作用的突变型DNA聚合酶、buffer和dNTPs。
在一种优选的条件下，本发明所述PCR扩增反应液中的buffer，其组分可包括MgCl2、KCl、Tris-HCl、四甲基氯化铵、BSA、甘油、NP-40，pH为8.3。其中，MgCl2的摩尔浓度为1.5～2mM，KCl的质量浓度为4-6mg/mL，Tris-HCl的摩尔浓度为20～30mM，四甲基氯化铵的摩尔浓度为20～50mM，BSA的质量浓度为0.2～0.6mg/mL，甘油的体积百分比为10％～50％，NP-40的体积百分比为0.1％～1％。本发明的PCR扩增反应液，除了提供PCR反应所必须的原料及离子环境之外，还起到了进一步抑制血液中的抑制成分的作用，提高了PCR反应的效率。其中BSA对于减少污染物，例如酚类化合物有一定帮助，而且也能减少反应物附着在试管壁的情况，利于反应的顺利进行。NP-40作为一种非离子型去污剂，可以中和样本处理过程中带入的SDS，避免其对聚合酶活性的抑制。在处理液和PCR扩增反应液的协同作用下，使血液中的核酸释放，作为模板直接用于PCR反应，并且去除了血液中的抑制成分对PCR反应的抑制，提高了PCR反应效率。在一种情况下，对所述样品中的人类APOE基因进行PCR扩增的条件为：热变性反应：95℃反应3min；扩增反应：95℃反应15s，60℃反应45s，40个循环。
进一步，本发明还提供了一种PCR扩增试剂盒，包括上述处理液和PCR扩增反应液，处理液与PCR扩增反应液各组分协同作用，实现了直接以血液为模版进行PCR扩增，克服了血液中抑制成分对PCR反应的干扰，且极大提高了检测效率。
本发明提供了的用于全血样本的处理液和扩增方法中的PCR扩增反应液，只需用处理液对血液样本进行简单处理，经简单处理后的血液样本直接作为后续荧光PCR的模板进行基因检测，大大简化了样本处理的操作流程、缩短了样本处理时间，显著提高了PCR检测的效率，具有较高的时间和经济效益；并且本发明的PCR扩增反应液可以有效地配合处理液，进一步降低了血液中杂质对PCR的抑制作用，二者互相协同，实现了不受血液抑制物影响的全血直接扩增；本发明样本需求量少，并适合高通量检测的进行，适用范围广，具有检测结果重复性、准确性好等优点，还可配合PCR试剂冻干技术、微流控芯片技术等，实现PCR的现场即时检测(POCT)，为临床医学检验、检验检疫、疾病预防控制等提供有效的解决方案。
下面结合实施例对本发明做进一步的较为完整、详细的描述。
一、样本处理液和PCR反应液的配制
一种用于全血样本的处理液，组分包括SDS、Tween 20、Tris-HCl、甲酰胺、氯化钠、氯化钾、强碱；其中，SDS的体积百分比为0.02％，Tris-HCl的摩尔浓度为25mM，Tween 20的体积百分比为0.5％，甲酰胺的体积百分比为2％，氯化钠的质量浓度为6mg/mL，氯化钾的质量浓度为6mg/mL，强碱(NaOH)的质量浓度为8mg/mL，处理液的pH为10。
扩增方法中配合使用的扩增反应液，组分包括抗血液抑制作用的突变型DNA聚合酶、buffer、dNTPs。PCR反应液中的buffer，其组分包括MgCl2、KCl、Tris-HCl、四甲基氯化铵、BSA、甘油、NP-40，pH为8.3。其中，MgCl2的摩尔浓度为1.5mM，KCl的质量浓度为5mg/mL，Tris-HCl的摩尔浓度为22mM，四甲基氯化铵的摩尔浓度为35mM，BSA的质量浓度为0.3mg/mL，甘油的体积百分比为10％，NP-40的体积百分比为0.2％。
二、基于样本处理液和PCR反应液的APOE基因检测
实施例：准备20份EDTA抗凝的人全血样本，分别取10μL加入到290μL样本处理液中(样本处理液与样品的体积比为29:1)，充分涡旋混匀30s，瞬离，取2μL的全血与处理液的混合液与18μL的PCR扩增反应液混合(全血与处理液的混合液与PCR扩增反应液体积比为1：9)，进行实时定量PCR扩增，扩增曲线如图1所示，当然两步的预设体积比也不限于实施例中配置的比例，只要满足相应的体积比范围条件即可，此处并不限定。
对比例：采用磁珠法对上述20份样品进行核酸提取并进行实时荧光定量PCR扩增，所用试剂盒为天隆科技公司磁珠法全血DNA提取试剂盒(货号：T140)，对比例扩增曲线如图2所示。
各实施例和对比例的Ct值如表1所示，PCR扩增的条件为：热变性反应：95℃反应3min；扩增反应：95℃反应15s，60℃反应45s，40个循环。
表1实施例和对比例各样本的Ct值
根据检测结果可知，对比例1-20和实施例1-20均能检测出APOE基因的基因型，结果一致率达100％，准确性较好。另外Ct数值越小说明检测灵敏度越高，对比Ct值可知采用本发明样本处理液及核酸PCR扩增方法的实施例在血液样品扩增检测中的灵敏度与磁珠法的灵敏度相当。
三、本发明处理液与PCR扩增反应液与市场其他全血样本处理液对比
1)使用本发明提供的全血样本处理液处理样本后，利用市面上常规或者本公司已有PCR反应液进行扩增，扩增结果如图3-1所示。
2)使用本发明提供的全血样本处理液和PCR反应液按照实施例2中的步骤对5份EDTA抗凝全血样进行处理，扩增结果如图3-2所示。
3)使用市场中销售的A公司的全血样本常温裂解试剂(包含Lysis Buffer和Stabilizing Buffer两个组分)对同样的5份EDTA抗凝全血样本进行处理，扩增结果如图3-3所示，参照说明书操作流程为：
a.使用前，将Lysis Buffer和Stabilizing Buffer分别轻微颠倒混匀，避免产生大量气泡。
b.将2μL待裂解全血样本置于离心管中，加入20μL的Lysis Buffer，涡旋混匀，低速瞬时离心收集至离心管底。
c.室温(20～25℃)孵育3min。
d.加入20μL的Stabilizing Buffer，涡旋混匀，低速瞬时离心收集至离心管底，完成DNA裂解溶液的制备。
4)以灭菌超纯水代替本发明提供的全血样本处理液，按照实施例2中的步骤对同样的5份EDTA抗凝全血样本进行处理，扩增结果如图3-4所示。
结果分析
使用本发明提供的全血样本处理液和PCR反应液、市售全血样本常温裂解液、灭菌超纯水对同样的5例EDTA抗凝全血样本进行处理，处理后的样本作为模板进行APOE基因检测，检测结果如图3-1至图3-4所示。结果表明，使用本发明提供的全血样本处理液处理后的样本，在PCR反应液的协同作用下，其荧光PCR扩增的Ct值和荧光值明显优于使用市售产品和灭菌超纯水处理的样本。
与市售产品A公司的全血样本常温裂解试剂相比，本发明提供的血液样本处理液和PCR反应液具有以下优点：
1)操作流程更少、操作更加便捷
2)设备需求更简单；
3)成本更低；
4)荧光PCR扩增效率更高；
5)受血液样本中的抑制物的影响更少。
本文中应用了具体的实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本分明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本分明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
Claims (16)
1.一种用于全血样本的处理液，其特征在于，所述处理液包含SDS试剂以及用于提供碱性环境的强碱，所述处理液的pH值为10～14。
2.如权利要求1所述的用于全血样本的处理液，其特征在于，还包含非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂的体积百分比为0.2％～2％。
3.如权利要求2所述的用于全血样本的处理液，其特征在于，所述的非离子表面活性剂为Tween 20。
4.如权利要求1所述的用于全血样本的处理液，其特征在于，还包含体积百分比为2％～8％的甲酰胺。
5.如权利要求1所述的用于全血样本的处理液，其特征在于，还包含K+离子化合物和/或Na+离子化合物。
6.如权利要求5所述的用于全血样本的处理液，其特征在于，包含的离子化合物为氯化钠化合物和氯化钾化合物组成的混合物，其中氯化钠的质量浓度为5mg/mL～8mg/mL，氯化钾的质量浓度为5mg/mL～8mg/mL。
7.如权利要求1所述的用于全血样本的处理液，其特征在于，还包含摩尔浓度为10mM～40mM的Tris-HCl。
8.如权利要求1所述的用于全血样本的处理液，其特征在于，所述强碱为NaOH和/或KOH。
9.如权利要求1-8任一所述的用于全血样本的处理液，其特征在于，所述SDS试剂的体积百分比为0.01％～0.04％，所述强碱的质量浓度为4mg/mL～50mg/mL。
10.一种包含如权利要求1-9任一所述的用于全血样本的处理液的试剂盒。
11.一种扩增方法，其特征在于，使用如权利要求1-9任一所述的用于全血样本的处理液与全血样本按照第一预设体积比混合，再按照预定时间进行混匀操作，之后取至少部分混匀后的混合液，并按照第二预设体积比与扩增反应液混合，获得待扩增混合液，对所述至少部分待扩增混合液进行恒温或者循环温度扩增，完成扩增。
12.如权利要求11所述的扩增方法，其特征在于，所述第一预设体积比的取值范围(5～50)：1。
13.如权利要求11所述的扩增方法，其特征在于，所述第二预设体积比的取值范围为1:(5～50)。
14.如权利要求11所述的扩增方法，其特征在于，所述扩增反应液包含抗血液抑制作用的突变型DNA聚合酶、buffer和dNTPs。
15.如权利要求11所述的扩增方法，其特征在于，所述扩增方法中，对所述至少部分待扩增混合液进行的扩增为循环温度扩增。
16.如权利要求11-15任一所述的扩增方法，其特征在于，所述处理液与所述全血样品按照第一预设体积比进行混合的预设混匀时间为1～10min。
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Citations (7)
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| CN102533724A (zh) * | 2010-12-30 | 2012-07-04 | 上海复星医学科技发展有限公司 | 一种用于生物样品中核酸提取纯化的细胞裂解试剂 |
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- 2022-04-14 CN CN202210387834.7A patent/CN114717225A/zh active Pending
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