JP2004073193A - 核酸分離方法および核酸抽出試薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 有核細胞を含む試料から核酸を分離精製する方法であって、
1)有核細胞を含む試料と、少なくとも細胞成分分解酵素および界面活性剤を含むライシス溶液とを接触させる工程、
2)水溶性有機溶媒の存在下、有核細胞を含む試料と、平均粒径が0.01〜1000μmの水不溶性固相担体とを接触させて、有核細胞より遊離させた核酸を該固相担体表面に吸着結合させる工程、ならびに
3) 該固相担体を試料から分離する工程
を含むことを特徴とする核酸分離方法。
【選択図】 なし
Description
核酸を含有する試料から核酸を得る方法としてはフェノール・クロロホルム抽出法が古くから利用されてきた。この方法はフェノール・クロロホルムを用いてタンパク質、脂質などの水難溶性の検体成分を変性、溶解または沈殿させる。極めて高い荷電を持ち、親水性の強い核酸を水相に溶解するという溶解度の違いを利用する。この方法は高純度核酸が抽出できるが、フェノール・クロロホルムが有毒のため、作業環境等の制限から、大量検体からの核酸抽出には、不向きである。
かかる有毒な溶媒を使用しない代替方法として、カオトロピック溶液を利用してタンパク質、脂質等の夾雑物を水相に可溶化し、核酸をシリカビーズに吸着させて固相で回収後、核酸を再び水相に溶解するBoom法(Boom et al. J. Clin. Microbiol. 28:495-503 (1990))などがある。この方法では、抽出された核酸が短くて、断片化されているものが多い。特に、サザンプロットのようなDNA解析法に不向きである。
これら以外にも、カチオン性高分子を利用して、DNAと共沈する試薬も開発されているが、DNAの分離に、試薬の微調整が伴い、かつ、液液分離のため、遠心操作が終始欠かせず、多数検体のルーチン処理に効率が低いので、産業界への利用は進展しない。
2)水溶性有機溶媒の存在下、有核細胞を含む試料と、平均粒径が0.01〜1000μmの水不溶性固相担体とを接触させて、有核細胞より遊離させた核酸を該固相担体表面に吸着結合させる工程、ならびに
3) 該固相担体を試料から分離する工程
からなる核酸分離方法に関する。
本発明は、有核細胞を含む試料から核酸を分離精製する試薬であって、少なくとも前記細胞成分分解酵素、水不溶性固相担体、水溶性有機溶媒を含む核酸抽出試薬を提供する。
なお、本明細書において「核酸」とは、二本鎖(ds)、一本鎖(ss)、またはその組み合わせ(部分的なdsまたはss)としてのDNAおよび/またはRNA、を意味する。
また、本発明に適用できる検体の形状、検体量等に特に制限を受けない。前記組織を潰したものであれば、ペレット状のものであってもよいし、水溶液に溶かした形、または分散した形のものであってもよい。
血液の核酸量は、白血球細胞数により依存する。溶血操作は、核を有しないが血液中に多量に存在する赤血球を破壊することにより(すなわち、溶血)、遠心分離で白血球と分離することができる。溶血方法は特に限定されず、等張、低張等の浸透圧を利用する方法あるし、物理的な破壊方法、または、急激な加熱による熱ショック方法等が挙げられる。本発明において、特に熱ショック法を組み合わせた方法が好適である。
溶血剤を血液試料に作用させることによる方法が好ましい。公知の溶血剤には、塩化アンモニウム、シュウ酸アンモニウム、サポニンなどが挙げられる。このうちで温和な条件で著しい溶血効果を発揮する溶血剤として、少なくとも0.01〜0.5M塩化アンモニウムを含むものが好適である。さらに必要に応じてトリス緩衝液、リン酸緩衝液のようなpHをコントロールするための緩衝液、浸透圧を調節するための塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩、白血球の破壊を防止するためのマグネシウム塩、DNA分解を阻止するためのEDTAなどのキレート剤あるいはサッカロースなどの糖類などを添加してもよい。なお、緩衝液を併用する場合、その濃度は数mMから数百mMの範囲で適宜選択できる。
・細胞溶解の工程
白血球の溶解操作は、細胞膜、核膜、タンパク質などを分解して、細胞核内から溶解液中へ核酸を遊離させるために公知の方法を用いることができる。
そのための方法として、たとえば浸透圧、ずり応力、凍結破砕、摩砕剤による機械的な力などを利用する細胞膜の破壊方法、物理的なエネルギーを利用する超音波法、各種の界面活性剤、変性剤もしくは酵素類を利用する化学、生化学的方法あるいはこれらを組み合わせた方式などが挙げられる。
ライシス溶液
細胞溶解溶液、すなわちライシス(lysis solution)溶液は、少なくとも細胞成分分解酵素1種類以上を含み、かつ、各酵素濃度が0.01〜50 mg/mlであることが好ましい。ここでいう酵素濃度は酵素純度が80%以上である試薬を使用する場合の濃度である。
本発明において細胞成分分解酵素とは、アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼよりなる群から選択される少なくとも1つ以上のものである。また酵素濃度が0.01mg/ml以下の濃度になると、細胞内に含まれる核酸以外成分の分解に効率が極端に低くなるので好ましくない。50mg/ml以上になると、酵素自体が回収核酸に混在される可能性が高くなるので好ましくない。
これらの細胞成分分解酵素は生物体から抽出したものであってもよいし、遺伝子組み換え技術により調製される酵素であってもよい。また、これらの多くの酵素は、市場入手が可能である。
これらの細胞成分分解酵素を加えることで、目的の核酸以外の成分を酵素反応により分解することができるので、高純度核酸の分離が可能である。核酸以外の成分の断片化により、有機溶媒への溶解性が増幅される。また、有機溶媒添加で、核酸以外の成分が沈殿を起こしても巨大分子である目的核酸とは異なり、微小な塊になるので、本発明の固相担体への付着、沈着、吸着することなく、固液分離洗浄で簡単に除去することができる。
一方、添加した酵素量は細胞成分に比べて極わずかのため、固相表面が細胞成分によってブロッキングされているので、添加した酵素成分が固相表面に強く吸着されることがない。通常の固液分離洗浄で簡単に除去され、核酸溶液中に遊離し、目的核酸に混ぜって抽出されることはない。
酵素消化による細胞の溶解操作
本発明において、前記の複数種類の酵素をライシス溶液に共存させ、同時に添加して白血球を処理してもよく、あるいは前後に順序をつけて酵素を添加して処理してもよい。複数の酵素を使用するとき、それぞれの酵素濃度を0.01〜50mg/ml、好ましくは0.1〜10mg/mlの範囲で調整することが好ましい。これらの酵素を使用する際、酵素活性を最大に引き上げるために使用する酵素の種類に応じて、緩衝液、塩、イオン種、界面活性剤などを適宜調整することはいうまでもない。
・固相担体への吸着工程
通常は、上記細胞溶解処理を終えた細胞内容物を含む試料から核酸を、以下に開示する固相担体を含む水溶性有機溶媒を含有する溶液に接触させることにより該固相担体に吸着させて他の高分子夾雑物と分離する。
本発明の固相担体の組成は特に限定されるものではない。一般的に市販されている有機系、無機系、有機無機の複合系で構成される微粒子であってもよいし、ガラス、セラミックス、金属または金属酸化物、またはこれらの複合体より構成される微粒子であってもよい。
なお、本発明にいう「ストークス直径」とは、固相担体が粒子の場合の有効径であり、球状以外の形状を有する固相担体のサイズは、ストークス法則に従って求められた直径を、同一ストークス直径を有する球状担体の直径とみなすものとする。具体的には、球状以外の形状を有する担体を水溶液に分散させて遠心分離するストークス式から沈降速度を求める。同一素材からできた球状粒子についても、同様に沈降速度を求め、沈降速度の等しい球状担体の粒径をその球状以外の形状の担体のストークス粒径とする。
具体的にこれらの固相担体は有機合成反応で調製することができる。例えば、芳香族ビニル化合物、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステルよりなる群から選ばれる一種のモノマーの重合体(以下、「特定重合体」という)であり、必要に応じてα,β−不飽和カルボン酸モノマーを共重合することにより有機高分子粒子表面にカルボン酸基を導入することができる。
具体的に固相担体として使用される材料は、特に限定されるものではないが、一般にポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリアミドなどのような合成有機高分子、ガラス、シリカ、二酸化珪素、窒化珪素、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、酸化ナトリウム、酸化カルシウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛などの無機物またはステンレスなどの金属であってもよい。
本発明に使用する水溶性有機溶媒として、水酸基を含む水に可溶な溶媒が挙げられ、特にアルコールが好ましい。具体的には、そのアルコールとして、ブタノール、2-ブタノール、ペンタノール、2−ペンタノール、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールよりなる群より少なくとも1つ以上選択される。水溶性有機溶媒は1種の溶媒を単独で使用してもよいし2種以上を併用してもよい。これらのうちで、特にエタノール、イソプロパノールが好ましい。
必要に応じて上記水溶性有機溶媒を添加する前、または添加すると同時に塩、水溶性ポリマー、多糖類、界面活性剤を添加してもよい。たとえばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、ポリビニルアルコール、アガロース、デキストラン、デキストラン硫酸、またはドデシルスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらの添加物を加えることにより、核酸をより高効率に固相担体に捕獲され、かつ、容易に再溶解されることが多い。
添加する塩の該溶媒液での濃度は、好ましくは0.1〜50mM、さらに好ましくは0.5〜10mMである。塩濃度が0.1mM未満では添加する塩による核酸析出効果が小さいため好ましくない。逆に50mMを超える塩濃度では、核酸以外の親水性タンパク質などの析出も引き起こすようになるため、核酸のみの塩析効果が減殺される。同様に、該溶媒液中の水溶性ポリマー、多糖類濃度は、0.0001-10%(w/v)、界面活性剤の濃度は、0.01〜15%(w/v)が好ましく、特に0.05〜0.5%(w/v)が好ましい。当該界面活性剤の濃度が0.01 w/v%未満では疎水性タンパク質のミセル効果が弱く、15 w/v%を超えると界面活性剤の析出を招くためいずれも好ましくない。
本発明では水溶性有機溶媒の存在下、核酸を含む試料と固相担体とを接触させることにより、核酸が固相担体の固体相に吸着される。
ここで、ライシス溶液、固相担体および水溶性有機溶媒の接触順については限定されない。
すなわち、(a)細胞の溶解処理に際して、予め固相担体を同時に添加する方法、(b)細胞の溶解処理後に固相単体を添加する方法、あるいは(c)固相担体と試料とを最初に直接接触させた後に細胞の溶解処理を行う方法のいずれでもよい。
ただし、(c)固相担体と試料を最初に接触させる場合には、固相担体と試料を接触させた後すぐにライシス溶液を添加するのがよい。
これらの方法の中では、特に(b)溶解処理後に固相担体を添加する方法が好ましいが、この場合、固相担体は水溶性有機溶媒と一緒に加えてもあるいは別個に加えてもよい。
核酸の固相担体への吸着に要する時間は、水溶性有機溶媒、核酸含有試料および固相担体を混合後、通常0.1〜20分、好ましくは3〜15分である。特にゲノムDNAのような長い核酸を抽出する場合、吸着工程時間を長くすることが好ましい。また吸着温度は0〜60℃、好ましくは4〜25℃である。
・洗浄および溶出工程
固体担体への核酸の吸着工程が終了後、反応液から固相担体を分離して分離した固相担体を洗浄する。また、必要に応じて核酸を液洗浄する前に、グアニジン塩酸塩、グラニジンチオシアネート、尿素のような蛋白質溶解液に浸し、残留蛋白成分を溶解させて除去してもよい。洗浄液としては、固体担体に結合した核酸を溶離させないものであれば、吸着工程で使用した水溶性有機溶媒と同じ溶媒であっても、その他の水溶性溶媒であってもよい。また核酸の固相担体への吸着が維持できるならば必要に応じて水溶性有機溶媒の濃度を低くしてもよい。
こうして得られる核酸が吸着された固相担体は使用目的により、そのまま次の操作、たとえばPCR法による増幅や制限酵素処理など各種の核酸分析に供することができる。あるいは乾燥した固相担体に滅菌蒸留水、トリス塩酸/EDTA緩衝液(TE)を加えて攪拌することにより固相担体に吸着した核酸を液層に溶出してもよい。
本発明による方法の実施については、特に限定されるものはなく、試料および目的に応じた多様な実施の形態をとることができる。
(1)方法の一段階で、核酸含有試料から遊離した核酸が後続の精製過程において少なくとも固相の大部分に結合するため、汚染の危険を極めて低くすることができる。病原菌への汚染は、ウィルスまたは細菌などの病原菌に感染している可能性のある検体の処理に伴う人体への危険は、サンプルを反応容器に入れる分離段階の第1段階にほぼ限定される。初期の処理においてウィルスまたは細菌は有効に不活性化される。もう一つの汚染として、多数の検体を同時的に処理する場合の、相互汚染の問題である。単一の反応容器で行うことによって、コンタミリスクを最小限に回避もしくは減少できる。
核酸の抽出および調製の自動化は、操作の熟練、高度の知識を必要とせずに、迅速に大量の検体を処理することも可能とする。したがって、核酸調製の自動化は遺伝子工学、遺伝学的診断をはじめとして核酸分析を必要とする各分野において広範な利用、用途を有するため、極めて重要な意義をもつ。
核酸分離キット
本発明は、有核細胞を含む検体試料から核酸を分離精製するための試薬キットも提供する。本発明の試薬は、少なくとも、溶血液、ライシス溶液、酵素液、水不溶性固相担体、水溶性有機溶媒を含む。
さらに必要に応じて、本キットは洗浄液、溶離液、補助剤、専用容器、その他の必要なアクセサリーなどを含んでもよい。
「洗浄液」、「溶離液」については、吸着工程で使用した水溶性有機溶媒と同じ溶媒、またはその他の水溶性溶媒、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などを例示することができる。両者は同一系の緩衝液であってもよく、緩衝液の液性を変更する、具体的にはイオン強度、pH、含有する塩類の種類を変化させることにより、洗浄用および溶離の作用を実現させることができる。
なお、本実験を試薬調製の時間を除いて10本同時進行で実施したときの所要時間は約1時間を要した。
比較例1
参照実験として実施例1で得た白血球沈殿をフェノール・クロロホルム法で抽出した。抽出法は、「分子クローニング」(J.Sambrook、1982、 CSH出版)に従った。なお、本参考実験での所要時間は試薬調製を除いて10本平行して実施したとき、約3時間が要した。
実施例及び比較例の結果を、下記の表1に示す。
Claims (7)
- 有核細胞を含む試料から核酸を分離精製する方法であって、
1)有核細胞を含む試料と、少なくとも細胞成分分解酵素および界面活性剤を含むライシス溶液とを接触させる工程、
2)水溶性有機溶媒の存在下、有核細胞を含む試料と、平均粒径が0.01〜1000μmの水不溶性固相担体とを接触させて、有核細胞より遊離させた核酸を該固相担体表面に吸着結合させる工程、ならびに
3) 該固相担体を試料から分離する工程
を含むことを特徴とする核酸分離方法。 - 細胞成分分解酵素が、アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼおよびヌクレアーゼからなる群から選ばれる少なくとも1つであることを特徴とする請求項1記載の核酸分離方法。
- 界面活性剤がアニオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項1記載の核酸分離方法。
- 水不溶性固相担体がポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリアミド、ガラス、シリカ、二酸化珪素、窒化珪素、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、酸化亜鉛よりなる群から選択される少なくとも1つからなることを特徴とする請求項1記載の核酸分離方法。
- さらに4)分離した固相担体を洗浄する工程を含むことを特徴とする請求項1記載の核酸分離方法。
- さらに5)固相担体に吸着した核酸を溶出させる工程を含むことを特徴とする請求項1記載の核酸分離方法。
- 有核細胞を含む試料から核酸を分離精製する試薬であって、少なくとも前記細胞成分分解酵素、水不溶性固相担体、水溶性有機溶媒を含む核酸抽出試薬キット。
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