JP2007529225A - 分画された血液白血球からのrnaの抽出のための方法および試薬 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血液から白血球(white blood cell)(「WBC」または「白血球」(leukocyte)とも呼ばれる)を分画するための、分画された細胞中のRNA分子の安定性を高めるための、および分画された細胞からRNAを抽出するための方法に関する。本発明はさらに、発現プロファイリングおよびRT-PCRのような技術を用いる、mRNA発現パターンを含む、mRNAの解析に関する。本発明はさらに、マイクロ-RNA(「miRNA」)、siRNAなどを含む、低分子RNA(small RNA)の解析に関する。
血液は、かなりの量のRNAが回収され得る、もっとも利用しやすいヒト組織である。実質的な量を病的影響を伴わず取り除くことができ、かつ急速に再生するため、それはまた、もっとも消費できるものである。血液はまた、循環系の設計が血液細胞が本質的に身体の全ての部分の組織と密接に接触することを確実にしているため、広範囲に広まった事象を報告する特有の能力も有する。これは、循環白血球が、感染、癌、炎症、ならびに遺伝的および代謝性疾患により、影響を受けた遠位の組織の監視のための監視細胞(sentinel cell)としての役割を果たす可能性を有することを意味する(Whitney et al., 2002; Alcorta et al., 2002)。例えば最近の報告は、ラットモデル系において、虚血性脳卒中および発作を含む、中枢神経系病理と相互に関係がある、密度勾配分画されたリンパ球におけるmRNAパターンの変化を記載する(Tang et al., 2001)。
最初の課題の1つは、血液中で活発に新陳代謝している細胞(すなわち、mRNAを含んでいる細胞)の濃度が低いことである。血液中のmRNAの濃度は、それにより比較的低くなる。重量および容量で血液の50%未満が細胞から成っており(血液の>50%は非細胞の血漿)、細胞分画の〜0.1から0.2%のみが白血球からなり、残りは主に、概してmRNAを発現しない成熟赤血球(red blood cell)(「RBC」または「赤血球(erythrocyte)」)である。大部分(>99%)は成熟赤血球で、感知できるほどのmRNAを含まないが、高い濃度のヘムを持っている。ヘムは、逆転写およびPCRを含む酵素反応の強力な阻害因子である。細胞のRNAの抽出のための事実上全てのプロトコルは、数倍量の抽出試薬(通常、3-10倍量)中での組織の破壊を必要とするので、源組織として分画されていない全血の使用は、試料のさらなる希釈をもたらし、RNA回収を複雑にする。例えば、通常の手法(Choczymski/Sacchi, Trizol)を用いる10 mlの全血の処理は、100 ml(10倍量)の溶解液の添加を必要とする。結果として生じる試料量は、有機抽出および固相抽出プロトコルでの使用のためには実用的ではない。
実際上の理由から、上記に記載のように、全血は、RNA抽出または免疫選択の前に、有核細胞(すなわち、WBC)を濃縮するために、しばしば分画される。血漿および赤血球の除去は、血液から多くのヌクレアーゼおよび阻害因子を排除し、少なくとも10倍まで試料の量を減じ、より大きな試験管の代わりに微量遠心管(<2 ml)中でRNA抽出が実施されることを可能にする。また、白血球サブセットの免疫選択のための多くのプロトコルは、全血よりはむしろ分画された白血球に実施される場合、より効果的かつ費用効果が高い。
全血または分画された白血球からRNAを抽出するための大多数の方法は、グアニジンチオシアネート中での試料の最初の溶解を含む。例えば、このような方法の1つは、シリカマトリックス上での固相抽出を含み、そこでは血液試料をグアニジン溶液中で溶解し、細胞溶解物をエタノールと混合し、かつRNAを結合するシリカフィルターにかける。他の方法は、陽イオン界面活性剤中で(Macfarlane and Dahle, 1997)、または塩化リチウム/尿素溶液中での全血の溶解に基づいている。血液からRNAを単離するための市販の製品は、Ambion RiboPure-Bloodキット(Ambion)およびPAXgeneシステム(PreAnalytix)を含む。血液からRNAを単離するための上記方法の全ての限界は、RBCおよび網状赤血球を含む、全ての細胞が第1段階で溶解されることである。これは、グロビンmRNAの白血球RNAへの混入をもたらし、白血球サブセットのその後の分画を排除する可能性がある。このような混入を減ずる方法は有益である。
マイクロアレイ解析およびRT-PCRで使用のためのRNAの必要条件は、ノーザンブロットおよびヌクレアーゼ保護アッセイのような、従来用いられているRNA解析方法のためのものより、いくらか異なっている。もっとも重要な差異は、試料RNAのプローブにハイブリダイズする能力だけによるというよりむしろ、現行の方法はRNAが逆転写のための効果的な基質としての役割を果たすことを必要とするということである。逆転写は、蛍光ラベルまたは他の検出可能な部位を取り込むため(マイクロアレイ解析のため)、または耐熱性DNAポリメラーゼによるその後の増幅のためのcDNA鋳型を生ずるため(RT-PCRのため)に、試料RNAをcDNAに変換する。試料RNAのための重要な必要条件は、酵素的反応を阻害する混入物を含んではいけないということである。血液からのRNA抽出の場合、RNAが逆転写およびDNAポリメラーゼの周知の阻害因子であるヘムで汚染されていないことが重要である。発現試験のために必要とされるRNAの量の点からみると、マイクロアレイ解析は、〜2から20 μgの範囲の比較的多くの量を、従来必要としている。しかしながら、新しい傾向は、総RNAの極めてより少ない量を使用する。これは、インプットRNAの量を酵素的に増加する直線的な増幅戦略を用いることにより、かつ/またはシグナル増幅をもたらすより感度の良い検出方法を用いることにより可能とされる。これらの技術的前進は、数個の細胞のみを用いるマイクロアレイ試験を実施することを可能としている(Xiang et al., 2003)。これらの考察は、非培養初期白血球サブクラスに対するマイクロアレイ解析が可能であることを示唆する。
循環末梢血細胞における遺伝子発現の特徴的なパターンの決定が非侵襲性診断で広く有用であることを証明する可能性があることが、提案されている(Staudt and Brown, 2000)。試料として血液を用いて行われている多くのマイクロアレイ試験は、しばしばRNA抽出前に組織培養で増幅される、密度勾配分画された末梢血単核細胞(PBMC)を用いている。密度勾配遠心分離を経てのPBMCの分画は、しかしながら、血液に運ばれる病原菌に従事者がさらされ(それは開口管において行われるので)る高い危険性を帯び、かつ調製あたり血液のたった数ミリリットルだけしか用いられることが許容されない、多大な労力を要しかつ時間のかかる方法である。密度勾配分画および回収された細胞を培養することに対するさらに重大な欠点は、必要とされる操作が、mRNA発現プロファイリングアッセイの解釈を危ういものにすると考えられる、内因性mRNAレベルの変化をもたらす可能性があることである。もう1つの欠点は、密度勾配分画は全血から(骨髄細胞系列の)成熟WBCの主要なサブセットを回収できないということである。
本発明は概して、独自の白血球除去フィルターを用いて全血からWBCを迅速に分画するための、かつ続いて起こる、分画された細胞におけるRNAパターンを安定化するための方法に関する。発明はさらに、分画された細胞からRNA、およびいくつかの場合ではDNAを抽出する方法、ならびに、例えば発現プロファイリングおよびRT-PCRを含む様々な分子生物学的手法の任意のものでこれら核酸を利用する方法に関する。
本発明者らは、白血球を分画し、それらからmRNAを抽出するための、新しい方法を考案した。これらの方法は、白血球を捕捉するために、Pall社により生産されているような白血球除去フィルタの使用に関し、これには捕捉された白血球からのRNAの単離が続く。本発明者らは、1つの態様において、Pall白血球除去フィルター、例えば「LK4」と称されるフィルターが、その後のRNA抽出のために全血からWBCを回収することができることを示している。20 ml相当の全血量は、本方法を当技術分野におけるRNA抽出に修正可能にする手動のシリンジ形式を用いる採取の時点で迅速に濾過される(約1分)。遠心分離または他の溶液と混合することは、必要とされない。さらに、本発明者らは、血液に運ばれる病原菌にさらされる最小の危険性を提供する、WBC分画のための密閉されたチューブ形式を開発した。血液採取の1〜2分以内で完了させることができ、かつ細胞に遠心力の影響を供しないため、WBC濾過は、単離された白血球のmRNAプロファイルを乱すことが、任意の代替の白血球濾過方法よりも少ないことが期待される。この方法を用いて収集されたRNAの収率および質は優れている。
全血からWBCを単離するための様々な様式が存在し、その多くは上記に考察されている。しかしながら、本発明の関係において、好ましい単離の方法は、WBCを捕集するが、RBC、血漿、および他の非WBC血液成分は通過させることができるフィルター媒体の使用を含む。この目的を成し遂げるであろうフィルター媒体の任意の形態は、本発明の状況において有用であることが期待される。さらに、本明細書の教示に従うことにより、当業者は、実施例において教示されているようなアッセイ手法で可能性のあるフィルターを使用し結果を解析することによって、本発明の方法における適性について任意の可能性のあるフィルターを試験することができる。
当業者に公知である、細胞からRNAを単離するための多くの方法が存在し、その多くまたは全ては本発明に適合できる。
本発明の様式でWBCから単離されたRNAおよびDNAは、当業者により理解されているように、DNAまたはRNAが関与する任意の分子生物学的技術で用いられる可能性がある。
本発明を用いて分画された血液細胞から回収されたRNAは、疾患、予後、および治療に対する反応と相互に関係があるmRNAレベルのパターンの発見を助ける発現プロファイリング実験のためのインプットとして使用され得る。
以下の実施例は、発明の様々な局面をさらに例示するために含まれる。以下の実施例で開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するために、本発明者らにより発見された技術および/または組成物を提示し、したがってその実施のために好ましい様式の構成要素となると見なされうることが、当業者に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして多くの変更が開示されている特定の態様において成されることができ、それでもなお、本発明の精神と範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果をもたらすことを認識するべきである。
白血球除去マトリックスの白血球の捕捉の有効性
試験が、試作品デバイスを用いて全血から白血球が捕捉される有効性を明らかにするために実施された。6つのEDTA血液の10 ml試料を、Pall社のLK4フィルターを通過させ、濾液を未使用のチューブ中に収集した。白血球層分画として捕捉されなかった任意のWBCを回収するために、濾液をその後スイングバケット遠心分離(swinging bucket centrifuge)で3,200rpmで15分間遠心分離した。白血球層を使い捨ての広径トランスファーピペットを用いて収集した。
高品質RNAはフィルターマトリックスで分画された白血球から回収され得る
図2、図3Aおよび図3Bは、本発明の方法を用いてLK4で分画された細胞から回収されたRNAの収率および質を示す。
RNAlater処理は、分画されたWBC中のRNAを保存する
図4で示されるデータは、未処理試料と比較した、RNAlaterで処理した試料における18Sおよび28SリボソームRNAバンドのより強い染色により示されるように、RNAが無傷であることを保つために、RNAlaterでLK4により捕捉された細胞を処理する事の利点を示す。LK4で捕捉された細胞をRNAlaterで処理する特定の長所は、該処理が、捕捉された細胞を含有するデバイスを、外界温度で試料採取地点からRNA抽出および解析のための離れた場所のラボへ移動させることを可能にすることである。外界温度での試料の移動は、RNA解析に関連する費用を減ずる。
RNAlater処理はゲノムDNA混入を減ずる
図5は、ゲノムDNA混入を減ずるための、濾過した白血球のRNAlaterへの曝露の長所を示す。全ての試料は、示されたように、直径2.5 cm LK4フィルターを通して濾過し、室温で4日間保存した、10 mlのEDTA-血液に由来する。各調製物から回収されたRNAの約7%を変性アガロースゲルで解析した。レーン1では、フィルターは処理していない。レーン2では、フィルターを、2.4 mlのグアニジンチオシアネート溶解溶液中で保存した。レーン3では、フィルターを保存前に、3 mlのRNAlaterで処理した。レーン4は、処理していない、保存していない、および溶出後DNaseで処理したフィルターでの陽性対照RNAを示す。GuSCN溶液中に室温で4日間保存したフィルター中のRNA(レーン2)の深刻な分解があったことに留意されたい。さらに、DNAの混入は、抽出前にRNAlaterで処理した試料(レーン3)で著しく減ぜられたことに留意されたい。
WBCのフィルターマトリックス分画はグロビンmRNAの混入を減ずる
全血からまたは遠心分離によって分画したWBCからのグロビンmRNAに由来する増幅されたRNAの量と比較して、混入しているグロビンmRNAの望ましくない産物をLK4分画が増幅されたRNA(aRNA)において減ずる程度を評価するために、試験を実施した。
網状赤血球の溶解はグロビンmRNAの混入を減ずる
さらなる試験を、網状赤血球の溶解が血液からのRNA調製物中のαおよびβ-グロビン転写産物のレベルを減じ得るかどうか示すために実施した。
白血球からmRNAを単離するための例示的な手法
本発明の好ましい方法において、白血球除去フィルター、例えばLK4フィルターは、血液を濾過した後に、フィルターが回収されることを可能にするシリンジフィルター単位に合うよう切断または提供される。この方法は、フィルターが目詰ますることなく、40 mlまたはより多くの血液を濾過するために用いられ得る。
a. 2.4 mlのグアニジンチオシアネート溶解溶液および0.15 mlの酢酸ナトリウム溶液を、フィルターを備える15 mlチューブに加え、30秒間振とうさせる。
b. 1.5 mlの酸性フェノール/クロロフォルムをチューブへ加えて30秒間振とうさせ、その後調製物を室温で5分間保つ。
c. 調製物を卓上遠心分離器で、10分間、3,200 rpmで遠心分離する。
d. 水相を第2の15 mlチューブの中に吸引または流し出し、1/2量のエタノールを加え、ボルテックスして混合する、この段階での調製物の量は〜4.5 mlである。
e. 調製物をマイクロ遠心分離カートリッジ形式中のシリカフィルター(RNAqueousフィルターカートリッジ)上に通過させ、これは、それぞれ10秒間回転する〜6回の通過を必要とするが、遠心機を用いる場合、真空多岐管またはシリンジ形式を用いてより簡単に行い得る。
f. フィルターを0.7 mlの洗浄溶液#1で洗浄する。
g. フィルターを2回、各回で0.7 mlの洗浄溶液#2/3で洗浄し、その後フィルターを1分間遠心分離して乾燥させる。
h. フィルターからRNAを、〜75℃に予熱された〜200 μlの溶出溶液で溶出する。
WBCの迅速な分画のための例示的な閉鎖システム
本発明は、全血からのWBCの迅速な分画のための密閉されたシステムを可能にさせる。
Claims (51)
- 白血球除去マトリックスを用いて全血から白血球を分画する段階;および
分画された白血球を溶解してRNAを含む溶解物を得る段階
を含む、RNAを含む白血球溶解物を得る方法。 - 溶解時、白血球がマトリックス上に含まれる、請求項1記載の方法。
- 溶解前に、白血球がマトリックスから流し出される、請求項1記載の方法。
- 白血球の溶解前に、マトリックスを含む白血球がある期間保存される、請求項2記載の方法。
- 分画された白血球が、溶解溶液と接触する、請求項1記載の方法。
- 溶解溶液が、界面活性剤を含む、請求項5記載の方法。
- 界面活性剤が、Triton X-100、Tween-20、SDS(sodium dodecyl sulfate)、サルコシル(sarcosyl)、またはデオキシコール酸である、請求項6記載の方法。
- 溶解溶液がカオトロピック剤を含む、請求項5記載の方法。
- カオトロピック剤がグアニジン塩である、請求項8記載の方法。
- グアニジン塩がグアニジンチオシアネートである、請求項9記載の方法。
- 溶解溶液がリボヌクレアーゼ阻害因子を含む、請求項5記載の方法。
- 溶解溶液がプロテアーゼを含む、請求項5記載の方法。
- プロテアーゼがプロテイナーゼKである、請求項12記載の方法。
- 溶解物からRNAを抽出する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- RNAを抽出する段階が有機抽出によって行われる、請求項14記載の方法。
- 有機抽出がフェノール/クロロフォルム抽出である、請求項15記載の方法。
- 溶解物からRNAおよびDNAを抽出する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
- 溶解前に、白血球に浸透しかつ保存組成物で処理されていない細胞中のRNAと比較してRNAの安定性を増大させる塩を含むRNA保存組成物で、分画された白血球を処理する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 塩が硫酸塩である、請求項18記載の方法。
- 塩が硫酸アンモニウムである、請求項19記載の方法。
- 保存組成物中の最終塩濃度が、10 g/100 mlから飽和濃度の間である、請求項18記載の方法。
- 塩が、20 g/100 mlから塩の飽和濃度の間の最終濃度で保存組成物中に存在する、請求項20記載の方法。
- 塩が、30g/100 mlから80 g/100 mlの間の最終濃度で保存組成物中に存在する、請求項20記載の方法。
- RNA保存組成物が、少なくとも2つの塩を含む、請求項18記載の方法。
- 総塩濃度が、20 g/100 mlから100 g/100 mlの間の最終濃度で保存組成物中に存在する、請求項24記載の方法。
- 分画された白血球が白血球除去マトリックス上に含まれ、マトリックスがRNA保存組成物と接触する、請求項18記載の方法。
- 分画された白血球から有機抽出でRNAを抽出する段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
- 抽出されたRNAが、RNA保存媒体で処理されなかった分画された白血球から抽出されたRNAよりも少ないDNA混入物を有する、請求項27記載の方法。
- 網状赤血球の混入を減ずるために、分画された白血球を溶液で処理する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 溶液がRBC溶出緩衝剤である、請求項29記載の方法。
- 溶液がRBC溶解溶液である、請求項29記載の方法。
- RBC溶解溶液が、水または塩化アンモニウム溶解溶液である、請求項31記載の方法。
- 白血球除去マトリックスで捕捉することにより血液から白血球を分画する段階;
分画された白血球を溶解して溶解物を生じさせる段階;
溶解物を有機溶液で抽出して有機相および水相を形成させる段階;
有機相および水相を分離する段階;および
水相からRNAを単離する段階
を含むように、さらに定義される、請求項1記載の方法。 - 白血球除去マトリックスで捕捉することにより血液から白血球を分画する段階;
白血球へ浸透する塩を含み、RNAの安定性を増大させるRNA保存組成物で、分画された白血球を処理する段階;
分画された白血球を溶解して溶解物を生じさせる段階;
溶解物を有機溶液で抽出して有機相および水相を形成させる段階;
有機相および水相を分離する段階;および
水相からRNAを単離する段階
を含むように、さらに定義される、請求項1記載の方法。 - 白血球除去マトリックスで捕捉することにより血液から白血球を分画する段階;
白血球へ浸透する塩を含み、RNAの安定性を増大させるRNA保存組成物で、分画された白血球を処理する段階;
分画された白血球を溶解して溶解物を生じさせる段階;および
溶解物からRNAを単離する段階
を含むように、さらに定義される、請求項1記載の方法。 - 白血球除去マトリックスで捕捉することにより血液から白血球を分画する段階;
分画された白血球を溶解して溶解物を生じさせる段階;および
溶解物からRNAを単離する段階
を含むように、さらに定義される、請求項1記載の方法。 - 白血球除去マトリックスで捕捉することにより血液から白血球を分画する段階;
網状赤血球の混入を減ずるために、分画された白血球を溶液で処理する段階;
分画された白血球を溶解して溶解物を生じさせる段階;
有機溶液で溶解物を抽出して有機相および水相を形成させる段階;
有機相および水相を分離する段階;および
水相からRNAを単離する段階
を含むように、さらに定義される、請求項1記載の方法。 - 白血球除去マトリックスで捕捉することにより血液から白血球を分画する段階;
網状赤血球混入を減ずるために、分画された白血球を溶液で処理する段階;
白血球へ浸透し、RNAの安定性を増大させる塩を含むRNA保存組成物で、分画された白血球を処理する段階;
分画された白血球を溶解して溶解物を生じさせる段階;
有機溶液で溶解物を抽出して有機相および水相を形成させる段階;
有機相および水相を分離する段階;および
水相からRNAを単離する段階
を含むように、さらに定義される、請求項1記載の方法。 - 溶解物中の1つまたは複数のRNAの存在または量をアッセイする段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- アッセイする段階が、Northernブロット、RNAase保護アッセイ、ハイブリダイゼーション反応、マイクロアレイ解析、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応解析を含む、請求項39記載の方法。
- アッセイする段階が、リアルタイムRT-PCRまたはエンドポイントRT-PCRとしてさらに定義される逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項40記載の方法。
- アッセイする段階が、マイクロアレイ解析を含む、請求項40記載の方法。
- マイクロアレイ解析が、cDNAアレイ、スポットオリゴヌクレオチドアレイ(spotted oligonucleotide array)、インサイチュー合成オリゴヌクレオチドアレイの使用を含む、請求項42記載の方法。
- 白血球除去マトリックス、および白血球溶解溶液を含む、白血球から総RNAを抽出するためのキット。
- 白血球除去マトリックスが、使用中に血液がマトリックスを通過することを可能にするよう適合された担体中に含まれる、請求項44記載のキット。
- 担体が、シリンジに合うよう適合される、請求項45記載のキット。
- 全血が密閉された容器からマトリックスを通り、白血球除去血としてさらに密閉された容器の中に移動することを可能にする様式での機能に適合されるとさらに定義される、請求項44記載のキット。
- RBC溶解溶液および/またはRBC溶出緩衝剤をさらに含む、請求項44記載のキット。
- 白血球に浸透しかつ白血球中のRNAの安定性を増大させる塩を含むRNA保存組成物をさらに含む、請求項44記載のキット。
- 有機抽出試薬をさらに含む、請求項44記載のキット。
- RNAの溶出前に、不純物を取り除くためにマトリックスを洗浄するための固相抽出マトリックスおよび試薬をさらに含む、請求項50記載のキット。
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