JP2008212031A - 核酸回収方法及び核酸回収装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】核酸が結合した固相を、核酸を用いた反応に適用できる反応液を構成する成分のうち少なくとも1成分を含む洗浄液に接触させて当該固相を洗浄し、上記洗浄液のうち所定量を残留させるように、上記固相から上記洗浄液を分離し、その後、上記核酸が結合した固相と溶出液とを接触させて当該溶出液中に核酸を回収する。
【選択図】図1
Description
本発明に係る核酸回収方法では、先ず、核酸が結合した固相を、核酸を用いた反応に適用できる反応液を構成する成分のうち少なくとも1成分を含む洗浄液に接触させて当該固相を洗浄する。ここで、核酸が結合した固相とは、特に限定されないが、核酸結合能を有する固相に核酸が結合した状態を意味する。なお、核酸と固相との結合とは、共有結合、イオン性結合、分子間力結合等の化学結合のうち如何なる様式をも含む意味である。固相としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、シリカ、ケイソウ土等のシリカ含有固相、或いはアセチルセルロース等の有機物等を挙げることができる。これらの物質を微粒子状や多孔性膜状に加工して固相を形成することができる。
1.試料
試料A:
pBR322 plasmid DNAを標準血清に添加した試料(1μg / 200μl)
試料B:
HBV陽性検体からの精製DNAを標準血清に添加した擬似陽性検体(103 copy / 200μl)。
溶解液A:
4.0M グアニジンチオシアン酸塩
100mM MES
25mM EDTA・2Na
20%(v/v) TritonX-100
第一洗浄液:
4.0M グアニジンチオシアン酸塩
100mM MES
25mM EDTA・2Na
1%(v/v) TritonX-100
第二洗浄液:
10mM Tris-HCl(pH 8.0)
80%(v/v) EtOH
第三洗浄液A:
10mM Tris-HCl(pH 8.0)
80%(v/v) EtOH
第三洗浄液B:
2.5M KCl
75mM MgCl
第三洗浄液C:
2.5M KCl
75mM MgCl
500mM Tris-HCl(pH 8.0)
第三洗浄液D:
2.5M KCl
75mM MgCl
500mM Tris-HCl(pH 8.0)
0.5% TritonX-100
第三洗浄液E:
500mM KCl
500mM (NH4)2SO4
200mM MgSO4
第三洗浄液F:
500mM KCl
500mM (NH4)2SO4
200mM MgSO4
1M Tris-HCl (pH 8.0)
第三洗浄液G:
500mM KCl
500mM (NH4)2SO4
200mM MgSO4
1M Tris-HCl (pH 8.0)
5% TritonX-100
溶出液A:
10mM Tris-HCl (pH 8.8)
溶出液B:
超純水
溶出液C:
10mM Tris-HCl (pH 8.8)
0.8mM dNTP mix(;dATP、dCTP、dGTP、dTTP)
0.5μM Primer 1
0.5μM Primer 2
2.5U Taq DNA Polymerase
溶出液 D:
20mM Tris-HCl (pH 8.8)
1M Betaine
1.6mM dNTP mix(;dATP、dCTP、dGTP、dTTP)
0.8μM Primer FIP
0.8μM Primer BIP
0.2μM Primer F3
0.2μM Primer B3
8U Bst DNA Polymerase
核酸抽出器具A:
核酸抽出器具Aの断面図を図4に示す。核酸抽出器具Aは、図4に示すように、ポリプロピレン樹脂を成形してなるピペット本体部40と、ピペット本体部40における開口している一方端部41に接続された加減圧機器(図示せず)と、ピペット本体部40における開口している他方端部42付近に配設された固相43と、固相43をピペット本体部40の所定の位置に位置決めする固相保持部材44とから構成されている。核酸抽出器具Aは、加減圧機器によって発生した圧力差によって、他方端部42から溶液を吸引するとともに吐出することができる。他方端部42から溶液を吸引することによってピペット本体部40内に吸引された溶液は、固相43及び固相保持部材44に浸潤することとなる。
核酸抽出器具Bの断面図を図5に示す。核酸抽出器具Bは、図5に示すように、容器本体部50と、容器本体部50において上方に開口する一方端部51の反対側に位置する他方端部52付近に配設された固相53と、固相53を位置決めする固相保持部材54と、容器本体部50を挿入する開口部を有する液受け容器55とから構成されている。核酸抽出器具Bにおいて、容器本体部50の一方端部51から溶液が供給される。容器本体部50に供給された溶液は、固相53及び固相保持部材54に達してこれらと接触する。この状態で核酸抽出器具Bに対して、容器本体部50の一方端部51から液受け容器55の底部に向かう遠心力を加えることによって、容器本体部50に供給された溶液は、容器本体部50の他方端部52から液受け容器55内に排出されることとなる。
核酸抽出器具Cは、図示しないが、平均粒径5μmのガラス粒子である。固相であるガラス粒子は所定の容器内にて溶液と混合され、遠心力によって液相と分離される。
核酸抽出器具Aによる核酸抽出方法は以下の通りである。なお、以下の核酸抽出方法は、試料、洗浄液及び溶出液等の種別に拘わらず適用できる方法である。
(1)試料0.2 mlに溶解液0.8mlを添加し混合する。
(2)核酸抽出器具Aに加減圧機器を接続し、混合液を5回吸引吐出する。
(3)混合液を廃棄する。
(4)第一洗浄液1.0mlを3回吸引吐出する。
(5)洗浄液を廃棄する。
(6)第二洗浄液1.0mlを3回吸引吐出する。
(7)洗浄液を廃棄する。
(8)氷上で冷却した第三洗浄液0.5mlを1回吸引吐出する。
(9)洗浄液を廃棄する(残留液量は2μl)。
(10)60℃に加温した溶出液0.1mlを10回吸引吐出する。
(11)溶出液を回収する。
(1)試料0.2 mlに溶解液0.8mlを添加し混合する。
(2)核酸抽出器具Bに投入し、遠心分離を行う。
(3)液受け容器の混合液を廃棄する。
(4)第一洗浄液1.0mlを投入し、遠心分離を行う。
(5)液受け容器の洗浄液を廃棄する。
(6)第二洗浄液1.0mlを投入し、遠心分離を行う。
(7)液受け容器の洗浄液を廃棄する。
(8)氷上で冷却した第三洗浄液0.5mlを投入し、遠心分離を行う。
(9)新規の液受け容器を設置する(残留液量は2μl)。
(10)60℃に加温した溶出液0.1mlを投入し、遠心分離を行う。
(11)溶出液を回収する。
(1)試料0.2 mlに溶解液0.8mlとガラス粒子10mgを添加する。
(2)10分間混合する。
(3)遠心器によりB/F分離し、液相を廃棄する。
(4)第一洗浄液1.0mlを添加し、混合する。
(5)遠心器によりB/F分離し、液相を廃棄する。
(6)第二洗浄液1.0mlを添加し、混合する。
(7)遠心器によりB/F分離し、液相を廃棄する。
(8)氷上で冷却した第三洗浄液0.5mlを添加し、混合する。
(9)遠心器によりB/F分離し、液相を廃棄する(残留液量は2μl)。
(10)溶出液0.1mlを添加し、60℃で5分間加温する。
(11)遠心器によりB/F分離し、溶出液を回収する。
洗浄液に含まれる核酸は、試料に含まれるDNAを2本鎖DNAに特異的な蛍光色素で染色し、蛍光光度計により蛍光強度を測定してDNA量を算出した。蛍光色素としてはPicoGreen dsDNA Quantitation Kit (Molecular Probe社)を使用し、蛍光光度計としてはARVO sx 1420 Multilabel Counter (wallac社)を使用した。
本実施例では、核酸分析方法の例として以下の要領でPCR法及びLAMP法を行った。なお、PCR法及びLAMP法による増幅産物の確認は、0.8%アガロースゲルを支持体とする電気泳動を実施し、2本鎖DNAに特異的な蛍光色素で染色し、トランスイルミネーターによる紫外線照射下において確認した。蛍光色素としてはSYBR Green I nucleic acid gel stain (Molecular Probe社)を使用した。
PCR:
HBV 由来DNAを鋳型DNAとするPCRは、(J. Clin. Microbiol., 29(9), 1804-1811 (1991))の報告に基づいて下記のPrimer及び温度条件において実施した。
Primer 1:5'-GCG GAT CCG AGT TAC TCT CGT TTT TGC-3'(配列番号1)
Primer 2:5'-GCA AGC TTT CTA ACA ACA GTA GTT TCC GG-3'(配列番号2)
温度条件:
94℃で5min維持した後、94℃で1min、55℃で1min及び72℃で1minを1サイクルとして30サイクル行い、最後に72℃で10min維持した。
HBV 由来DNAを鋳型DNAとするLAMPは、(Nucleic Acid Research, 28(12), e63(2000))の報告に基づいて下記のPrime、及び温度条件においてLAMPを実施した。
Primer FIP:5'-CCT GCT GCT ATG CCT CAT CTT CTT TGA CAA ACG GGC AAC ATA CCT T-3'(配列番号3)
Primer BIP:5'-GAT AAA ACG CCG CAG ACA CAT CCT TCC AAC CTC TTG TCC TCC AA-3'(配列番号4)
Primer F3:5'-GGT GGT TGA TGT TCC TGG A-3'(配列番号5)
Primer B3:5'-CAA AAT TCG CAG TCC CCA AC-3'(配列番号6)
温度条件:
95℃で5min維持した後に氷上で3min放置し、その後Bst DNA Polymeraseを添加し、65℃で1h反応させ、最後に80℃で10min維持した。
試料A、溶解試薬A、第一洗浄試薬A、第二洗浄液A、溶出液A、核酸抽出器具Aを用いたDNA抽出において、第三洗浄液をA、Bの希釈液(溶質濃度:100%、80%、60%、40%、20%)、及びEの希釈液(溶質濃度:100%、80%、60%、40%、20%)、としてDNA抽出を実施した。第三洗浄液Aの希釈液、第三洗浄液Bの希釈液及び第三洗浄液Eの希釈液のそれぞれにおいて、DNA回収量を定量した。そして、第三洗浄液AにおけるDNA回収量に対する第三洗浄液B及び第三洗浄液Eを使用した場合のDNA回収率を対応する希釈液毎に算出した。
試料B、溶解試薬A、第一洗浄試薬A、第二洗浄液A、核酸抽出器具Aを用いたDNA抽出において、第三洗浄液、溶出液、核酸分析反応液残成分、核酸分析を下表の通りとして実施し、核酸分析反応による核酸増幅の可否を判定した。
実験系と実験結果をまとめて表1に示す。
試料B、溶解試薬A、第一洗浄試薬A、第二洗浄液A、第三洗浄液C、溶出液Bを用いたDNA回収及びその後のPCRにおいて、核酸抽出器具をA、B、Cとして実施し、PCR増幅の可否を判定した。その結果を表2に示す。
Claims (19)
- 核酸が結合した固相を、核酸を用いた反応に適用できる反応液を構成する成分のうち少なくとも1成分を含む洗浄液に接触させて当該固相を洗浄し、
上記洗浄液のうち所定量を残留させるように、上記固相から上記洗浄液を分離し、
上記核酸が結合した固相と溶出液とを接触させて当該溶出液中に核酸を回収する、核酸回収方法。 - 上記溶出液は、上記固相に残留した洗浄液と合わさって、上記核酸を用いた反応に適用できる反応液となる組成を有することを特徴とする請求項1記載の核酸回収方法。
- 上記溶出液中に核酸を溶出した後、上記固相に残留した洗浄液と合わさって、上記核酸を用いた反応に適用できる反応液となるように成分を添加することを特徴とする請求項1記載の核酸回収方法。
- 上記洗浄液は塩及び/又は界面活性剤を含有することを特徴とする請求項1記載の核酸回収方法。
- 上記洗浄液の添加量と廃棄量を調節することにより、上記洗浄液のうち所定量を残留させることを特徴とする請求項1記載の核酸回収方法。
- 上記固相の含水量と、上記固相を位置決めする固相保持部材の含水量によって、上記洗浄液のうち所定量を残留させることを特徴とする請求項1記載の核酸回収方法。
- 上記洗浄液の上記固相からの分離における吐出圧力や遠心力を調節することによって、上記洗浄液のうち所定量を残留させることを特徴とする請求項1記載の核酸回収方法。
- 上記反応はポリメラーゼ連鎖反応(PCR:Polymerase Chain Reaction)であることを特徴とする請求項1記載の核酸回収方法。
- 上記反応はLAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法であることを特徴とする請求項1記載の核酸回収方法。
- 上記洗浄液が塩化カリウム(KCl)、塩化マグネシウム(MgCl)、硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)、硫酸マグネシウム(MgSO4)、Tris-HCl及びポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートから選ばれる少なくとも1成分を含有することを特徴とする請求項1記載の核酸回収方法。
- 核酸を含有する溶液に固相を接触させ、当該核酸を固相に結合させる処理を更に含むことを特徴とする請求項1記載の核酸回収方法。
- 核酸結合能を有する固相に対して、核酸を用いた反応に適用できる反応液を構成する成分のうち少なくとも1成分を含む洗浄液を供給する洗浄液供給手段と、
上記固相に対して供給された洗浄液のうち所定量を残留させるように、上記固相から上記溶液を分離する洗浄液分離手段と、
上記洗浄液分離手段によって洗浄液が除去された後、上記核酸を結合した固相に溶出液を供給する溶出液供給手段とを備え、
上記溶出液供給手段によって供給された溶出液内に核酸を回収する、核酸回収装置。 - 上記溶出液は、上記固相に残留した洗浄液と合わさって、上記核酸を用いた反応に適用できる反応液となる組成を有することを特徴とする請求項12記載の核酸回収装置。
- 上記溶出液中に核酸を溶出した後、上記固相に残留した洗浄液と合わさって、上記核酸を用いた反応に適用できる反応液となるように成分を添加する成分添加手段を更に有することを特徴とする請求項12記載の核酸回収装置。
- 上記洗浄液供給手段は、上記固相を収容する容器内に洗浄液を充填するものであることを特徴とする請求項12記載の核酸回収装置。
- 上記洗浄液分離手段は、上記固相を収容する容器内に充填された洗浄液を除去するものであることを特徴とする請求項12記載の核酸回収装置。
- 上記溶出液供給手段は、上記固相を収容する容器内に溶出液を充填するものであることを特徴とする請求項12記載の核酸回収装置。
- 上記固相は容器内に保持されており、上記洗浄液供給手段により当該容器内に洗浄液が吸引され、上記洗浄液分離手段により当該容器内の洗浄液が吐出され、上記溶出液供給手段により当該容器内に溶出液が吸引されることを特徴とする請求項12記載の核酸回収装置。
- 上記容器は当該固相を位置決めする固相保持部材を備え、当該固相保持部材及び/又は上記固相が洗浄液のうち所定量を保持することを特徴とする請求項18記載の核酸回収装置。
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