JP4990886B2 - 改良ポリメラーゼ - Google Patents
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Description
本発明は、ポリメラーゼ酵素に関し、より具体的には、DNAに対する親和性を有する、改変したDNAポリメラーゼに関し、当該のポリメラーゼは、各反応サイクルにおいて、1種又は複数のヌクレオチドを、複数の別々のDNA鋳型に取り込む能力を有し、且つ各反応サイクルにおいて、より多くの生産的なポリメラーゼ−DNA複合体を形成することができるようになっている。また、本発明の範囲には、当該の改変したポリメラーゼを、DNAシークエンシングに、特に、クラスターアレイに関連して、使用する方法も含まれる。
あるDNAポリメラーゼの3次元結晶構造は、3つの別々のサブドメインを明らかにし、これらは、掌(palm)、指(finger)及び親指(thumb)と名付けられており(Joyce,C.M.及びSteiz,T.A.(1994)Function and structure relationships in DNA polymerases,Annu.Rev.Biochem.,63,777−822)、それぞれがDNAの重合の際に重要な役割を有する。
本発明は、ポリメラーゼがDNA鋳型と密接に結合することは、必ずしも有利な特性であるとは限らないという認識に基づく。このことは、各反応サイクルで、単一のヌクレオチドの取り込みが1回のみ発生することが要求されるシークエンシング反応の場合に、特に当てはまる。したがって、DNAと密接に結合するポリメラーゼの場合、DNAに対する親和性が低いバリアントポリメラーゼと比較して、複数のDNA鎖上でヌクレオチドの取り込みに関与するポリメラーゼの能力が制限される。
は、[Pol:DNA]複合体を好む方へ大きくシフトしている。
[ただし、Zは、−C(R’)2−O−R’’、−C(R’)2−N(R’’)2、−C(R’)2−N(H)R’’、−C(R’)2−S−R’’及び−C(R’)2−Fのいずれかである]の構造の基に結合しており、
R’’が、取り除くことができる保護基であるか、その一部であり;
R’のそれぞれが、独立に、水素原子、アルキル、置換されているアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ若しくはアミド基、又は連結基を介して結合した検出可能な標識であるか;(R’)2が、式=C(R’’’)2(ただし、R’’’は、同一であってもよいし、異なっていてもよく、水素及びハロゲンの原子並びにアルキル基を含む群から選択される)のアルキリデン基を示し;且つ
前記の分子を反応させて、R’’のそれぞれが、Hに交換されているか、Zが、−C(R’)2−Fである場合には、Fが、OH、SH又はNH2、好ましくはOHに交換されているかである中間体を得ることができ、この中間体が、水性の状態下で解離して、遊離の3’OHを有する分子を産出するが;
Zが、−C(R’)2−S−R’’である場合には、両方のR’基は、水素ではない。
[ただし、Xは、O、S、NH及びNQ(Qは、C1−10の置換されている又は置換されていないアルキル基である)を含む群から選択され、Yは、O、S、NH及びN(アリル)を含む群から選択され、Tは、水素又はC1−10の置換されている若しくは置換されていないアルキル基であり、*は、当該の部分がどこでヌクレオチド又はヌクレオシドの残部と接続するかを示す]
を含む群から選択される部分を含有することを特徴とする。
(i)酸性アミノ酸、
(ii)芳香族アミノ酸、特に、チロシン(Y)又はフェニルアラニン(F);及び
(iii)非極性アミノ酸、特に、アラニン(A)、グリシン(G)又はメチオニン(M)
から選択されるアミノ酸に変換する。
(i)酸性アミノ酸、
(ii)芳香族アミノ酸、特に、チロシン(Y)又はフェニルアラニン(F);及び
(iii)非極性アミノ酸、特に、アラニン(A)、グリシン(G)又はメチオニン(M)
から選択されるアミノ酸に変換する。
(i)当該のポリメラーゼは、DNAに対する解離定数が、未変化/対照ポリメラーゼの少なくとも約、又はおよそ、2倍、3倍、4倍又は5倍を超え、及び/又は
(ii)約200nMから500nMの間、好ましくは、約200nMから300nMの間の濃度を有する塩化ナトリウム溶液を作用させると、少なくとも50%、60%、70%又は80%の当該のポリメラーゼが、当該のポリメラーゼが結合しているDNAから解離し、及び/又は
(iii)当該のポリメラーゼを発現させた細胞からの精製過程後に、約60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、3、1又は0.5ng/ml未満の内在性のDNAが、当該のポリメラーゼに結合して残留する
ようになっており;
当該の変化は、ヌクレオチド結合親和性に対しても、忠実度に対しても、顕著に不利に影響することがなく、したがって、当該のポリメラーゼは、
(a)反応サイクルの間中、より多くの生産的なポリメラーゼ−DNA複合体を形成する(反応の完了のレベルを改良する)こと、及び/又は
(b)全体的なレベルが改良された(/増加した/上昇した)ヌクレオチドの取り込みを触媒すること
が可能であり;
特に、DNAの濃度と比較して、ポリメラーゼの濃度が制限的である条件下で、これらのことが可能である。
別の態様では、本発明は、ヌクレオチドのポリヌクレオチド内への取り込みに用いる、本発明によるDNAに対する親和性が低下した、変化させたポリメラーゼの使用に関する。上記で述べたように、本発明の変化させたポリメラーゼは、当面のヌクレオチドに対する親和性を保持することから、ヌクレオチドの性質は、制限的ではない。
(i)本発明によるポリメラーゼ;
(ii)DNA鋳型;及び
(iii)ヌクレオチド溶液
が相互作用することを可能にするステップを含む方法にも関する。
上記で議論したように、本発明のポリメラーゼは、各反応サイクルで、単一のみ又は比較的少数のヌクレオチドの取り込みが要求される反応において特別の応用性を有する。しばしば、これらの反応では、ヌクレオチドの1種又は複数が標識化されるであろう。したがって、本発明は、標識化ヌクレオチドをDNA内に取り込むための方法であって、以下の成分:
(i)変化させてあるポリメラーゼであって、低下したDNAに対する親和性及び各反応サイクルで標識化ヌクレオチドを複数の別々のDNA鋳型内に取り込む能力を示すようになっているポリメラーゼ;
(ii)DNA鋳型;及び
(iii)ヌクレオチド溶液
が相互作用することを可能にするステップを含む方法を提供する。
−(上記に記載したような)本発明によるポリメラーゼ
−DNA鋳型;及び
−3’糖ヒドロキシルにおいて、置換基が天然の3’ヒドロキシル基より大きくなるように、修飾されているヌクレオチドを含有するヌクレオチド溶液
が相互作用することを可能にすることを含む方法を提供する。
−(上記に記載したような)本発明によるポリメラーゼ
−DNA鋳型;及び
−3’糖ヒドロキシルにおいて、置換基が天然の3’ヒドロキシル基より大きくなるように、修飾されているヌクレオチドを含有するヌクレオチド溶液が相互作用することを可能にし、次いで、取り込まれた修飾されたヌクレオチドを検出し、それによって、DNA鋳型のシークエンシングを可能にする
ことを含む方法を提供する。
(i)ポリメラーゼ中で変異誘発のための残基を選択すること;
(ii)(i)で実施した選択に従って、変異ポリメラーゼを作製すること;
(iii)変異ポリメラーゼのDNAに対する親和性を決定すること;
(iv)DNAに対する親和性が低下した場合、各反応サイクルにおいて、より多くの生産的なポリメラーゼ−DNA複合体を形成する能力に関して、当該のポリメラーゼを試験すること
を含む方法を提供する。
(実験の項)
(実施例1−変化させたポリメラーゼの調製)
(原理)
部位特異的変異を、酵素のDNAに対する親和性を低下させる試みで、9°N−7 YAV C223SポリメラーゼのC末端領域に導入した(野生型9°N−7ポリメラーゼは、DNAに対する親和性が非常に高い、Kd=50pM;Southworthら、1996.PNAS.93,5281)。
変異を、pSV19(9°N−7 YAV C223S exo− ポリメラーゼをコードするプラスミド)内に、Stratagene Quikchange XLキット及びそのプロトコールを使用してPCR法によって導入した(国際公開第2005/024010号パンフレットも参照)。
・ R743A。
順行(fwd) 5’−CCCGGCGGTGGAGGCGATTCTAAAAGCC−3’(配列番号9)
逆行(rev) 3’−GGGCCGCCACCTCCGCTAAGATTTTCGG−5’(配列番号10)
・ R713A
順行(fwd) 5’−GAAGGATAGGCGACGCGGCGATTCCAGCTG−3’(配列番号11)
逆行(rev) 3’−CTTCCTATCCGCTGCGCCGCTAAGGTCGAC−5’(配列番号12)
・ K705A
順行(fwd) 5’−GCTACATCGTCCTAGCGGGCTCTGGAAGG−3’(配列番号13)
逆行(rev) 3’−CGATGTAGCAGGATCGCCCGAGACCTTCC−5’(配列番号14)
・ Δ71(C末端704)
順行(fwd) 5’−GCTACATCGTCCTATGAGGCTCTGGAAGG−3’(配列番号15)
逆行(rev) 3’−CGATGTAGCAGGATACTCCGAGACCTTCC−5’(配列番号16)
・発現株Novagen製RosettaBlue DE3 pLysS内に形質転換した。
・国際公開第2005/024010号パンフレットの実験の項に記載されているように、増殖及び誘導を行った。
・国際公開第2005/024010号パンフレットの実験の項に記載されているように、回収及び溶解を行った。
・国際公開第2005/024010号パンフレットの実験の項に記載されているように、精製を行った。
変異酵素の過剰発現に成功した。全ての変異酵素が、過剰発現した。SDS−PAGEゲルを行い、構築物の過剰発現を調べた(−=未誘導;+=IPTG誘導)。得られたゲルを、図1に示す。
変異酵素のわずか5mlの培養液を(直接比較のために、YAV C223S exo− の培養液も)、国際公開第2005/024010号パンフレットに概要を述べるように熱処理のステップまで迅速精製を行った。この時点で、検体は、活性を試験するには、十分な純度であるとみなした。
(5’−CGATCACGATCACGATCACGATCACGATCACGATCACGCTGATGTGCATGCTGTTGTTTTTTTACAACAGCATGCACATCAGCG−3’)(配列番号17)
をNUNC−ヌクレオリンクストリップに、メーカーのプロトコールに従って結合させた。
1=20μlの酵素学的緩衝液のみ+1μlの100μM ffT−N3−647
2=20μlの粗YAV C223S exo− +1μlの100μM ffT−N3−647
3=20μlの粗YAV C223S R743A exo− (クローン12)+1μlの100μM ffT−N3−647
4=20μlの粗YAV C223S K705A exo− (クローン15)+1μlの100μM ffT−N3−647
5=20μlの粗YAV C223S R743A exo− (クローン16)+1μlの100μM ffT−N3−647
6=20μlの粗YAV C223S R713A exo− (クローン24)+1μlの100μM ffT−N3−647
7=20μlの粗YAV C223S Δ71 exo− (クローン38)+1μlの100μM ffT−N3−647
8=20μlの粗YAV C223S R713A exo− (クローン39)+1μlの100μM ffT−N3−647
酵素学的応答が、バックグラウンドのウェル(ミリQのみ)及びウェル1(酵素を含有しない対照)を除く、全てのウェルで観察された。蛍光の密度は、ffTTPの取り込み量に比例し、ウェルが濃いほど、取り込みのレベルが高い。変異酵素の性能を、YAV(クローン9)(YAV C223S exo−)と比較して議論するものとする。親指サブドメインの先端部の欠失(Δ71変異体)の結果、触媒活性が大幅に損なわれている酵素を得、取り込みは、クローン9で認められるレベルの35%に過ぎない。変異体K705Aは、クローン9と同等であった。2種のアルギニンの変異体であるR743A及びR713Aは、取り込みのレベルが上昇し、クローン9より約45%改良した。
変異酵素であるK705A、R713A及びR743Aは、改良されたレベルの取り込み、及び酵素の低下したDNAに対する親和性を示す。これら3つの塩基性の残基の全てを取り除き、さらに、追加の残基を除去すると、活性が消滅する(Δ71変異体)。3つの残基全てを置換しても、さらなる変異/欠失がなければ、活性の低下には至らないであろうと思われる。
酵素の粗調製物の活性(濃度を規準化した)を、国際公開第2005/024010号パンフレットに記載されているように、一塩基取り込みアッセイを使用して測定した。30μg/ml又は3μg/mlの酵素の粗調製物のいずれかを用いて、2μM ffT−N3−cy3及び20nM 10AヘアピンDNA(32Pで標識化されている)の存在下で、10分間インキュベートし、一定量の反応混合液を、0、30、60、180及び600秒で取り出し、12%アクリルアミドゲル上に供した。
ゲルの画像を、図3に示す。
クローン9のポリメラーゼ(YAV C223S exo−)、並びに親指ドメインの変異体あるK705A、R713A及びR743Aの酵素の精製した標品の活性を、国際公開第2005/024010号パンフレットに記載されているように、一塩基取り込みアッセイを使用して測定した。それぞれのDNA及びポリメラーゼの濃度が、およそ5:1の比であるようにして、実験を行った。こうして、単一の反応サイクルでヌクレオチドを複数のDNA鋳型内に取り込む酵素の能力を調べた。4nMの精製した酵素を用いて、20nM 10AヘアピンDNA(32Pで標識化されている)及び2μM ffT−N3−cy3の存在下で、30分間インキュベートし、一定量の反応混合液を、0、15、30、60、180、480、900及び1800秒の間隔で取り出し、12%アクリルアミドゲル上に供した。
バンドの強度を、ImageQuantを使用して定量化し、蛍光強度を、(ゲル上の出発物質及び最終産物のバンドの相対強度に基づく)完了パーセントに変換し、これを、インキュベートした時間に対しプロットして、図5に示す時間経過を得た。
洗浄アッセイを用いて、精製した酵素調製物のDNAに対する親和性を定性的に評価する。2pmolの5’−アミノA−鋳型ヘアピン、オリゴ815
(5’H2N−CGATCACGATCACGATCACGATCACGATCACGATCACGCTGATGTGCATGCTGTTGTTTTTTTACAACAGCATGCACATCAGCG−3’)(配列番号18)を用いて、メーカーのプロトコールに従って、4本のNUNC−ヌクレオリンクストリップ(1×8)に機能性をもたせた。
NUNC製ウェルの蛍光画像を、図6に示す。
酵素反応速度論の特徴付けを、NUNC製チューブのアッセイを使用して行い、種々の[ffTTP]における[DNA]<<[pol]又は[ffNTP]の場合の、ffT N3 cy3の一次の取り込みの速度定数を測定した。以下に、試験した3種のポリメラーゼのそれぞれに使用した方法を記載する。
試験した酵素に関するffT−N3−cy3の取り込みの反応速度論的な特徴を、以下にまとめる。
(DNA汚染)
PicoGreenアッセイ
( Molecular Probesキット、カタログ番号P11496)
TE緩衝液
10mM Tris HCl pH7.5
1mM EDTA
40mLを必要とし、2mLの20×TE緩衝液を38mLのH2Oに添加する
溶液1(2μg/mL λDNA):15μLのλDNAを、735λLの1×TE緩衝液で希釈する。
溶液2(50ng/mL λ):25μLのλDNAを、975μLの1×TE緩衝液で希釈する。
2mLのエッペンドルフチューブ内に、以下の検体を調製した:
5mLの小型の瓶内に、以下の検体を調製した:
PicoGreen溶液を調製した。
新型の読み取りプログラムであるCary Eclipseファイルを用いた。励起波長を480nmに設定し、発光波長を520nmに設定し、1000ボルトを使用した。
検量線用のデータを、GraphPad Prismに入力した。式:y=ax+cの検量線を当てはめた。次いで、濃度の値であるxを決定した。
配列番号1に示すアミノ酸配列を、要求される/望ましいアミノ酸をコードする各コドンにおいて最適な核酸配列を使用して、核酸配列に翻訳した。
(クローン9のコドン最適化遺伝子の合成)
配列番号19の核酸配列は、GENEARTによって、合成され、pPCR−Scriptに供給された。DNA配列及びタンパク質配列を確認した(結果は表示されていない)。
(pET11−aベクターの調製)
pET11−aベクター(Novagen、カタログ番号69436−3)を、Nde I及びNhe Iを用いて消化し、脱リン酸化し、未消化のベクターをいずれも、標準的な手法を使用してライゲーションした。
pPCRScriptベクター中の、GENEARTによって合成されたクローン9のコドン改変遺伝子(以下、pSV57)を、Nde I及びNheを用いて消化した。
pET11−aベクター及び挿入断片を、Nde I及びNhe Iの制限部位において、Quickライゲーションキット(NEB、M2200S)を使用してライゲーションした(1:3の比)。
2μlのライゲーション混合液を使用して、XL10−goldウルトラコンピテント細胞(Stratagene、カタログ番号200315)を形質転換した。挿入断片を含有するコロニーのPCRスクリーニング。
pVent(pNEB917由来ベクター)、pSV43(pET11−a中のクローン9)、pSV54(pET11−a中のコドン最適化クローン)、及びpSV57(GENEARTによって供給されたpPCR−Script中のコドン改変遺伝子)を、制限酵素処理し(restricted)、サザンブロットして、遺伝子間のクロスハイブリダイゼーションを調べた(結果は表示されていない)。
pSV52(クローン1、2及び4)を、発現宿主大腸菌BL21−CodonPlus(DE3)RIL(Stratagene、カタログ番号230245)へ形質転換。
SOL10354:RIL−pSV43(pET11−aベクター中のクローン9)
単一の形質転換した大腸菌コロニーを使用して、3mlのLBCC培養液のスターターカルチャーを、カルチャーチューブ内に播種し、振とう(225rpm)しながら、37℃にて、一晩インキュベートした。
細胞ペレットを解凍し、培養液の容積の1/50の1×洗浄緩衝液(50mM Tris−HCl pH7.9、50mMグルコース、1mM EDTA)であって、新たに添加された4mg/mlのリゾチームを含有する1×洗浄緩衝液中に、再懸濁させた後、室温にて、15分間インキュベートした。
Pol52及びクローン9のDNAポリメラーゼの発現を、未誘導及び誘導の対照検体の粗溶菌液をSDS−PAGE上で分析し、次いで、クーマシーブルーで染色することによって評価した。
10μlの(未誘導検体及び誘導検体からの)規準化した粗溶菌液を、143mM DTTを含有する10μlのローディング緩衝液(loading buffer)と混合した。
誘導検体からの規準化した粗溶菌液のみを、蒸留水中で1/10に希釈し、最終容積を10μlとし、143mM DTTを含有する10μlのローディング緩衝液と混合した。
NuPage(登録商標)4−12%Bis−Trisゲル(Invitrogen、カタログ番号NP0321BOX)を、メーカーの指示に従って調製した。
SDS−PAGEの結果を、図10に示す。
本実験で推定される発現レベルは、培養液中20mg/Lである。
発現ベクターpET11−aを使用して、大腸菌宿主BL21−CodonPlus(DE3)−RIL(Pol52)中のクローン9のコドン改変遺伝子の同様の発現レベルが、発現ベクターpNEB917(Pol19)又はpET11(Pol43)のいずれかを使用した同一の細胞中のクローン9の未改変の遺伝子と比較した場合に、得られた。
・ Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2Å resolution.
Doublie et al.1998.Nature 391,251.
・ Function of the C−terminus of Phi29 DNA polymerase in DNA and terminal protein binding.
Truniger et al.2004.Nucleic Acids Research 32,371.
・ A thumb subdomain mutant of the large fragment of Escherichia coli DNA.polymerase I with reduced DNA binding affinity,processivity and frameshift fidelity.
Minnick et al.1996.J.Biol.Chem.,271.24954.
・ Identification of residues critical for the polymerase activity of the Klenow fragment of DNA polymerase I from Escherichia coli.
Polesky et al.1990.J.Biol.Chem.,265,14579.
・ Cloning of thermostable DNA polymerases from hyperthermophilic marine archaea with emphasis on Thermococcus sp.9°N−7 and mutations affecting 3’−5’exonuclease activity.
Southworth et al.1996.PNAS.93,5281
・ Structure of the replicating complex of a pol alpha family DNA polymerase.
Franklin et al.2001.Cell 105,657.
・ Crystal structure of a pol alpha family DNA polymerase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus sp.9°N−7. Rodriguez et al.2000.J.Mol.Biol.,299,471.
Claims (14)
- 配列番号22のアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼと比較して、DNAに対する低下した親和性を有する変異させた9°Nポリメラーゼであって、
配列番号22のアミノ酸配列中のArg713及び/又はArg743の1つ又は複数の位置における、非塩基性のアミノ酸への少なくとも1つのアミノ酸置換変異を有することを特徴とする、
ポリメラーゼ。 - 1つ又は複数の置換変異が、置換されるアミノ酸を、非極性アミノ酸から選択されるアミノ酸に変換する、請求項1に記載のポリメラーゼ。
- 1つ又は複数の置換変異が、置換されるアミノ酸をアラニンに変換する、請求項2に記載のポリメラーゼ。
- 配列番号3又は5であるアミノ酸配列を含む、請求項3に記載のポリメラーゼ。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリメラーゼをコードする核酸分子。
- 変異させた9°N DNAポリメラーゼをコードする、請求項5に記載の核酸分子であって、配列番号4又は6のヌクレオチド配列を含む核酸分子。
- 請求項5又は6に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項7に記載のベクターを含有する宿主細胞。
- ヌクレオチドをポリヌクレオチド内に取り込むための、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリメラーゼの使用。
- 取り込みがクラスターアレイ上で起きる、請求項9に記載の使用。
- ヌクレオチドをDNA内に取り込む方法であって、以下の成分:
(i)請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリメラーゼと
(ii)DNA鋳型と
(iii)ヌクレオチド溶液と
を相互作用させることを含む方法。 - ヌクレオチド取り込み反応を行う場合に使用するキットであって、
請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリメラーゼと、ヌクレオチド溶液とを含むキット。 - ヌクレオチド溶液が、標識化ヌクレオチドを含む、請求項12に記載のキット。
- 置換基が天然の3’ヒドロキシル基より大きくなるように、ヌクレオチドが3’糖ヒドロキシル基において修飾されている、請求項13に記載のキット。
Applications Claiming Priority (5)
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---|---|---|---|
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