CN115297964A - 用于核酸定序的磁性传感器阵列以及制造及使用其的方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于使用磁性标记(例如，磁性粒子)及磁性传感器进行核酸定序的装置。本文还公开了制造及使用这些装置的方法。用于核酸定序的装置包含多个磁性传感器；配置在所述多个磁性传感器上方的多个结合区域，所述结合区域各用于容纳流体；及至少一个管线，用于检测所述多个磁性传感器的至少第一磁性传感器的特性，所述特性指示存在或缺乏一个或一个以上耦合到与所述第一磁性传感器相关联的第一结合区域的磁性纳米粒子。

Description

用于核酸定序的磁性传感器阵列以及制造及使用其的方法

相关申请案的交叉参考

本申请案主张2020年3月10日申请且标题为“用于核酸定序的磁性传感器阵列及制造及使用其的方法”(第ROA-1001P-US/P35967-US号律师案卷)的第62/987,831号美国临时申请案的优先权，并通过全文引用的方式并入本文中。

背景技术

合成定序(SBS)已成为获得大量DNA定序数据的成功的商业可行方法。SBS涉及结合引子杂交的模板DNA，引入脱氧核苷三磷酸(dNTP)，及检测引入的dNTP。

当前定序***使用荧光信号检测。使用四个经荧光标记的核苷酸以平行定序数百万个群集。在DNA合成的连续循环期间，DNA聚合酶催化将经荧光标记的dNTP并入DNA模板链内。在各循环期间，将单个经标记的dNTP添加到核酸链。所述核苷酸标记充当聚合作用的“可逆终止子”。在已并入所述dNTP后，通过激光激发及成像鉴定荧光染料，然后酶促裂解以容许下一轮引入。在各循环期间，直接从信号强度测量鉴定碱基。

依赖于荧光信号检测的目前最佳技术定序***每次运行可以提供高达200亿个读段的通量。然而，实现此性能需要大面积流动池、高精度自由空间成像光学器件及昂贵的高功率激光器以产生足够的荧光信号来成功进行碱基检测。

两种通用策略已使SBS通量逐渐增加(例如，以每次运行的碱基读段为特征)。第一种方法已通过增加序列发生器中流动池的大小及数量来进行向外缩放。这种方法增加试剂的成本及所述定序***的价格，因为其需要额外的高功率激光器及高精度纳米***。

第二种方法涉及向内缩放，其中减小个别DNA测试位点的大小，使得在固定大小的流动池中定序的DNA链的数量更高。这第二种方法在降低总体定序成本方面更具吸引力，因为附加成本仅涉及实现更好的成像光学器件，同时保持消耗品成本不变。但必须采用更高数值孔径(NA)的透镜以区分信号与相邻的荧光团。这种方法具有局限性，因为瑞利(Rayleigh)标准将可分辨光点源之间的距离设置为0.61λ/NA，也就是说，即使在先进的光学成像***中，两个定序的DNA链之间的最小距离也无法减小超过约400nm。相似的分辨率限度适用于直接在成像阵列顶部定序，在所述成像阵列上，迄今为止获得的最小像素尺寸小于1μm。所述瑞利标准目前代表光学SBS***向内缩放的基本限制。克服这些限制可能需要超分辨率成像技术，其在高度多任务***中尚未实现。因此，目前阶段，增加光学SBS序列发生器通量的唯一可行方法是构建更大的流动池及更昂贵的光学扫描及成像***。

因此，仍需要改善SBS。

附图说明

结合附图，从某些实施例的下列描述，将显而易见本发明的目的、特征及优点，其中：

图1阐述根据一些实施例的磁性传感器的一部分。

图2A及2B阐述根据一些实施例的磁阻式(MR)传感器的电阻。

图3A阐述使用根据一些实施例的自旋转矩振荡器(STO)传感器的概念。

图3B显示当跨根据一些实施例的STO施加AC磁场时，通过延迟检测电路的STO的实验反应。

图3C及3D阐述STO可以用作根据一些实施例的纳米级磁场检测器的方式。

图4A是根据一些实施例的定序装置的一部分的俯视图。

图4B及4C是图4A中显示的定序装置的部分的横截面图。

图4D是显示根据一些实施例的图4A、4B及4C的装置的组件的方块图。

图5A及5B阐述选择根据一些实施例的磁性传感器的两种方法。

图6阐述一种制造根据一些实施例的定序装置的方法。

图7阐述一种根据一些实施例使用定序装置进行核酸定序的方法。

图8阐述一种使用其中根据一些实施例大体上同时引入多个核苷酸前体的定序装置的方法。

为促进理解，在可能的情况下，已使用相同的参考数字来指定所述图式共同的的相同组件。经审慎考虑，一个实施例中公开的组件可有利地用于其它实施例中而无需具体列举。此外，在一张附图的上下文中对组件的描述适用于说明所述组件的其它图式。

具体实施方式

本文公开了使用磁性标记(例如，磁性粒子)及磁性传感器进行核酸定序的装置。本文还公开了制造及使用这些装置的方法。为简单起见，下文中的一些讨论参考定序DNA作为实例。应了解本公开一般适用于核酸定序。

发明人知晓，如先前技术SBS中使用，荧光显微镜术及互补式金氧半导体图像(CMOS imagers)的分辨率限度不适用于电荷(例如，硅纳米线场效应晶体管(FET))或磁场传感器(例如，自旋阀、磁性隧道结(MTJ)、自旋转矩振荡器(STO)等)，其中与在目前最佳技术SBS***中相比，感测组件的尺寸小一个量级且多任务水平也更高。SBS中的磁场感测尤其吸引人，因为DNA及定序试剂是非磁性的，与CMOS组件中基于电子传输调制的电荷感测方案相比，这可以显着改善信噪比(SNR)。此外，磁性感测无需并入的碱基与结直接接触。可使用小型化磁场传感器以检测纳米级磁性纳米粒子以进行SBS。

使用磁性传感器阵列进行SBS可以通过提供另外向内缩放(例如，约100倍)显着增加通量并降低定序的成本，同时消除定序***中对高功率激光及高分辨率光学器件的需求。

本文件公开使用经磁性标记的核苷酸前体结合包括磁性感测组件(例如，MTJ、STO、自旋阀等)的阵列的定序器件一起的SBS方案。所述器件还包括一个或多个蚀刻的结合区域，所述区域容许磁性传感器检测经磁性标记的核苷酸前体中的磁性标记，同时保护所述磁性传感器免受损坏(例如，使用绝缘体薄层)。

在本公开中，公开一种用于核酸定序的装置，所述装置包含多个磁性传感器；配置在所述多个磁性传感器上方的多个结合区域，所述结合区域各用于容纳流体；及至少一个管线，用于检测所述多个磁性传感器中的至少第一磁性传感器的特性，所述特性指示存在或缺乏一个或多个耦合到与所述第一磁性传感器相关联的第一结合区域的磁性纳米粒子。在一些实施例中，所述第一磁性传感器包含磁阻式(MR)器件。所述MR器件可包含钉扎层、自由层，及配置在所述钉扎层与所述自由层之间的势垒层。在一些这类实施例中，在缺乏一个或多个耦合到第一结合区域的磁性纳米粒子的情况下，所述钉扎层的磁矩距所述自由层的磁矩约90度。

第一结合区域可包括经配置以将核酸锚定到第一结合区域的结构(例如，空腔或脊)。

在一些实施例中，第一磁性传感器的形状是大体上圆柱形或大体上立方形。在一些实施例中，所述第一磁性传感器的横向尺寸介于约10纳米(nm)与约1微米之间。

所述装置还可包括经由至少一个管线耦合到多个磁性传感器的感测电路。所述感测电路可经配置以将电流施加到所述至少一个管线以检测第一磁性传感器的特性(例如，磁场、电阻、磁场的变化、电阻的变化、噪声级等)。在一些实施例中，所述感测电路包含磁控振荡器，及所述特性是与所述磁控振荡器相关联或由其产生的信号的频率。

所述装置可具有配置在多个磁性传感器与多个结合区域之间的绝缘材料(例如，氧化物(例如，二氧化硅、氧化铝等)、氮化物(例如，氮化硅等))。在第一磁性传感器的顶部与第一结合区域之间的绝缘材料的厚度可(例如)介于约3nm与约20nm之间。

在一些实施例中，所述至少一个管线包括配置在第一磁性传感器的顶面上方的第一管线，及第一结合区域位于所述第一管线中的沟槽内，所述沟槽在所述第一磁性传感器的顶面上方。

在一些实施例中，多个磁性传感器是以矩形阵列安置，及所述至少一个管线包括至少第一管线及第二管线，所述第一管线是配置在第一磁性传感器上方及所述第二管线是配置在所述第一磁性传感器下方。一个或多个结合区域可位于所述第一管线中的沟槽内。在一些实施例中，所述第一管线是耦合到所述矩形阵列的行及所述第二管线是耦合到所述矩形阵列的列，或反之亦然。

本文还公开了用于核酸定序的装置的制造方法。在一些实施例中，核酸定序器件的制造方法包括制造第一管线，制造多个磁性传感器，在所述磁性传感器之间沉积绝缘材料，制造多个另外管线，及产生多个结合区域。在一些实施例中，将各磁性传感器的底面耦合到所述第一管线，及将各磁性传感器的顶面耦合到另外管线中的相应一者。

制造第一管线可包括在衬底上沉积金属层(例如，使用物理气相沉积、离子束沉积等)，及将所述金属层图案化为第一管线(例如，使用光刻、铣削及/或蚀刻)。

在一些实施例中，在制造第一管线后及在制造多个磁性传感器前，在第一管线上方沉积绝缘材料，然后使所述第一管线裸露(例如，使用化学机械抛光(CMP))，及在所述裸露的第一管线上制造多个磁性传感器。

多个磁性传感器的制造可通过在第一管线上沉积多个层，及将所述多个层图案化(例如，使用光刻及/或蚀刻)以形成多个磁性传感器，所述多个磁性传感器各具有预定形状(例如，大体上圆柱形、大体上立方形等)。沉积所述多个层可包括沉积第一铁磁性层，在所述第一铁磁性层上方沉积金属或绝缘层，及在所述金属或绝缘层上方沉积第二铁磁性层。所述多个磁性传感器中的每一个的横向尺寸可(例如)介于约10nm与约1微米之间。

在一些实施例中，多个磁性传感器是呈矩形阵列，且第一管线对应于所述矩形阵列的行，且所述多个另外管线各对应于所述矩形阵列的列，或反之亦然。

在一些实施例中，在磁性传感器之间沉积绝缘材料后及在制造多个另外管线前，进行化学机械抛光步骤以使所述多个磁性传感器中的每一个的顶面暴露。

在一些实施例中，制造多个另外管线包括沉积金属层，进行光刻以界定所述多个另外管线，及移除所述金属层的一部分。

在一些实施例中，产生多个结合区域包括在所述多个结合区域上方施加掩模，在所述掩模上方沉积(例如，使用原子层沉积)金属层，及摘取所述掩模。在摘取所述掩模后，然后可在所述多个另外管线及所述多个结合区域上方沉积另外绝缘材料(例如，厚度介于约3nm与约20nm之间的氧化物(比如二氧化硅等)或氮化物)。

本文还公开了使用本文公开的核酸定序装置定序核酸的方法。在一些实施例中，一种方法包括(a)将至少一个核酸链结合到第一结合区域，(b)在一或多轮添加中，向所述第一结合区域添加可延伸引子及核酸聚合酶，(c)向所述第一结合区域添加第一核苷酸前体，所述第一核苷酸前体由第一可裂解磁性标记进行标记，及(d)定序所述核酸链。所述第一可裂解磁性标记可包含磁性纳米粒子(例如，分子、超顺磁性纳米粒子、铁磁性纳米粒子等)。所述第一结合区域可在步骤(c)前加以清洗。在步骤(c)后，可将所述核酸聚合酶的另外分子添加到所述第一结合区域。在各重复期间，可以不同核苷酸前体重复步骤(c)及(d)，所述不同核苷酸前体各经磁性标记。所述第一核苷酸前体可包含dATP、dGTP、dCTP、dTTP，或等同物中的一种。所述第一及不同核苷酸前体各可选自经磁性标记的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶，或其等同物。

定序核酸链可包括使用至少一个管线以检测第一磁性传感器的特性，所述特性指示存在或缺乏第一可裂解磁性标记。所述特性可(例如)为磁场或电阻、与磁控振荡器相关联或由其产生的信号的频率、噪声级，或磁场的变化或电阻的变化。所述特性可由磁场的变化或电阻的变化产生。

所述方法还可包括扩增至少一个核酸链的步骤。如果进行，那么所述扩增步骤可在将所述至少一个核酸链结合到第一结合区域之前或之后进行。由于扩增，可将一个或多个扩增子结合到所述第一结合区域。

在一些实施例中，响应于特性指示存在一个或多个耦合到第一结合区域的磁性纳米粒子的判定，将所述第一核苷酸前体的互补碱基记录在所述核酸链的核酸序列的记录中。

在一些实施例中，第一核苷酸前体无法由所述核酸聚合酶延伸，及所述方法进一步包括在检测特性后，移除所述第一可裂解磁性标记且使所述第一核苷酸前体可由所述核酸聚合酶延伸。在一些实施例中，所述第一核苷酸前体无法由所述核酸聚合酶延伸。所述第一核苷酸前体可呈现为可通过化学裂解延伸。

在定序核酸链后，可裂解磁性标记可通过酶促或化学裂解移除。

在一些实施例中，第一可裂解磁性标记具有第一磁性，及所述方法进一步包括，在一或多轮添加中，向所述第一结合区域添加由具有第二磁性的第二可裂解磁性标记进行标记的第二核苷酸前体。在一些这些实施例中，所述方法进一步包括，在一或多轮添加中，向所述第一结合区域添加由具有第三磁性的第三可裂解磁性标记进行标记的第三核苷酸前体，及由具有第四磁性的第四可裂解磁性标记进行标记的第四核苷酸前体。

在一些实施例中，将至少一个核酸链结合到第一结合区域包括将衔接子结合到所述至少一个核酸链中的相应一者的末端，及将寡核苷酸偶合到所述第一结合区域，其中所述寡核苷酸能夠与所述衔接子杂交。在一些实施例中，将所述至少一个核酸链结合到所述第一结合区域包括将所述至少一个核酸链各共价结合到所述第一结合区域。在一些实施例中，将所述至少一个核酸链结合到所述第一结合区域包括经由不可逆的被动吸附或分子间的亲和力固定所述至少一个核酸链。在一些实施例中，所述第一结合区域包含空腔或脊，及将所述至少一个核酸链结合到所述第一结合区域包括将水凝胶施加到所述空腔或施加到所述脊。

在一些实施例中，核酸聚合酶是缺乏3’-5’核酸外切酶活性的B型聚合酶。在一些实施例中，所述核酸聚合酶是热稳定聚合酶。

在一些实施例中，使用至少一个管线包括将电流施加到所述至少一个管线。

磁性标记

用于本文描述的核酸定序的方法依赖于使用包含可裂解磁性标记的经磁性标记的核苷酸前体。这些可裂解磁性标记可包含(例如)磁性纳米粒子，比如，例如，分子、超顺磁性纳米粒子或铁磁性粒子。所述磁性标记可为具有高磁性各向异性的纳米粒子。具有高磁性各向异性的纳米粒子的实例包括(但不限于)Fe₃O₄、FePt、FePd及CoPt。为促进化学结合到核苷酸，可合成粒子并用SiO₂涂覆。参见，例如，米阿斯拉姆、L.Fu、S.Li及V.P.德拉维德，“FePt纳米粒子的二氧化硅囊封及磁性性质”，《胶体与界面科学杂志》，第290卷，第2期，2005年10月15日，第444到449页。因为这种尺寸的磁性标记具有永久磁矩，其方向在非常短的时间尺度上随机波动，所以下文进一步描述的一些实施例依赖于灵敏的感测方案，所述方案检测由磁性标记的存在引起的磁场波动。

存在许多方法以将磁性标记结合到核苷酸前体并在并入所述核苷酸前体后裂解所述磁性标记。例如，可将所述磁性标记结合到碱基，在这种情况下，所述磁性标记可化学裂解。作为另一实例，可将所述磁性标记结合到磷酸盐，在这种情况下所述磁性标记可由聚合酶裂解，或如果经由连接子结合，那么通过裂解所述连接子来裂解。

在一些实施例中，将磁性标记连接到核苷酸前体的含氮碱基(A、C、T、G，或衍生物)。在并入所述核苷酸前体并且通过定序器件检测(例如，如下文进一步详细描述)后，所述磁性标记自所述并入的核苷酸裂解。

在一些实施例中，磁性标记是经由可裂解连接子结合。可裂解连接子为所属技术领域中已知且已描述(例如)于第7,057,026、7,414,116号美国专利及其接续与修正案中。在一些实施例中，所述磁性标记是经由包含烯丙基或叠氮基的连接子结合到嘧啶中的5-位置或嘌呤中的7-位置。在其它实施例中，所述连接子包含二硫键、吲哚或齐贝尔(Sieber)基团。所述连接子可进一步含有一个或多个选自以下的取代基：烷基(C_1-6)或烷氧基(C_1-6)、硝基、氰基、氟基或具有相似性质的基团。简单来说，所述连接子可由水溶性膦或基于膦的含有过渡金属的触媒裂解。其它连接子及连接子裂解机制为所属技术领域中已知。例如，包含三苯甲基、对烷氧基苯甲酯及对烷氧基苯甲酰胺及第三丁氧基羰基(Boc)的连接子及缩醛***可在酸性条件下由释放质子的裂解剂裂解。硫缩醛或其它含硫连接子可使用喜硫金属(比如镍、银或汞)裂解。还可考虑裂解保护基用于制备合适的连接子分子。含酯及二硫键的连接子可在还原条件下裂解。含有三异丙基硅烷(TIPS)或第三丁基二甲基硅烷(TBDMS)的连接子可在F离子的存在下裂解。由不影响反应混合物的其它组分的波长裂解的可光裂解连接子包括包含O-硝基苯甲基的连接子。包含苯甲氧基羰基的连接子可由基于Pd的触媒裂解。

在一些实施例中，核苷酸前体包含结合到如(例如)第7,405,281号及第8,058,031号美国专利中描述的多磷酸盐部分的标记。简单来说，所述核苷酸前体包含核苷部分及3个或更多个磷酸基团的链，其中一或多个氧原子任选地经(例如)S取代。所述标记可直接或经由连接子结合到α、β、γ或更高的磷酸基团(如果存在)。在一些实施例中，所述标记是经由如(例如)第8,252,910号美国专利中描述的非共价连接子结合到磷酸基团。在一些实施例中，所述连接子是选自以下的烃基：经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的环烷基，及经取代或未经取代的杂环烷基；参见，例如，第8,367,813号美国专利。所述连接子还可包含核酸链；参见，例如，第9,464,107号美国专利。

在将磁性标记连接到磷酸基团的实施例中，通过核酸聚合酶将核苷酸前体并入初生链内，所述核酸聚合酶还裂解并释放可检测磁性标记。在一些实施例中，所述磁性标记是通过裂解所述连接子移除，例如，如第9,587,275号美国专利中描述。

在一些实施例中，核苷酸前体是不可延伸的“终止子”核苷酸，也就是说，由阻断“终止子”基团阻断3’-末端添加下一核苷酸的核苷酸。阻断基团为可逆终止子，可将它们移除以继续如本文描述的链合成工艺。将可移除阻断基团结合到核苷酸前体为所属技术领域中已知。参见，例如，第7,541,444号、第8,071,739号美国专利及其接续与修正案。简单来说，所述阻断基团可包含烯丙基，其可通过在水溶液中在膦或氮-膦配体的存在下与金属-烯丙基络合物反应裂解。合成定序中使用的可逆终止子核苷酸的其它实例包括以下中描述的经修饰的核苷酸：2019年12月16日申请并且标题为“3'-受保护的核苷酸”，2020年6月25日作为WO/2020/131759公开的第PCT/US2019/066670号国际申请案，其出于所有目的通过全文引用的方式并入本文中。

磁性传感器

本文公开的实施例使用磁性传感器以检测耦合到如(例如)上文描述的核苷酸前体的磁性标记的存在。

图1阐述根据一些实施例的磁性传感器105的一部分。图1的示范性磁性传感器105具有底面108及顶面109并且包含三个层，例如，由非磁性间隔层107隔开的两个铁磁性层106A、106B。所述非磁性间隔层107可为(例如)金属材料，比如，例如铜或银，在这种情况下所述结构称为自旋阀(SV)，或其可为绝缘体，比如，例如氧化铝或氧化镁，在这种情况下所述结构称为磁性隧道结(MTJ)。适用于铁磁性层106A、106B中的材料包括(例如)Co、Ni及Fe的合金(有时与其它元素混合)。在一些实施例中，所述铁磁性层106A、106B经工程化以使其磁矩定向于膜的平面中或垂直于所述膜的平面。另外材料可沉积于图1中显示的三个层106A、106B及107的下方及上方，以实现比如界面平滑、纹理化，及保护免于用于图案化装置100的处理的目的，但磁性传感器105的有源区域位于这三层结构中。因此，与磁性传感器105接触的组件可与三个层106A、106B或107中的一个接触，或其可与所述磁性传感器105的另一部分接触。

如图2A及2B中显示，MR传感器的电阻与1-cos(θ)成比例，其中θ是图1中显示的两个铁磁性层106A、106B的力矩之间的角度。为最大化由磁场产生的信号并向施加的磁场提供磁性传感器105的直线反应，所述磁性传感器105可经设计，使得在缺乏磁场的情况下，所述两个铁磁性层106A、106B的力矩相对于彼此定向为π/2或90度。这种定向可通过所属技术领域中已知的许多方法实现。例如，一种解决方案是使用反铁磁体通过称为交换偏置电压的效应“钉扎”所述铁磁性层中的一个(106A或106B，称为“FM1”)的磁化方向，然后用具有绝缘层及永久磁铁的双层涂覆所述传感器。所述绝缘层避免所述磁性传感器105的电气短路，且所述永久磁铁供应垂直于FM1钉扎方向的“硬偏置电压”磁场，所述磁场然后将旋转第二铁磁体(106B或106A，称为“FM2”)并产生所需配置。平行于FM1的磁场然后使FM2围绕这种90度配置旋转，且电阻的变化产生电压信号，其可经校准以测量作用于所述磁性传感器105上的磁场。通过这种方式，所述磁性传感器105充当磁场到电压转换器。

注意，尽管上文刚讨论的实例描述使用力矩在膜平面中相对于彼此呈90度定向的铁磁体，但垂直配置可替代地通过使铁磁性层106A、106B中的一个的力矩定向出所述薄膜平面来实现，这可以使用称为垂直磁性各向异性(PMA)的方法进行。

在一些实施例中，磁性传感器105使用称为自旋转移转矩的量子机械效应。在这些器件中，通过SV或MTJ中的一个铁磁性层106A(或106B)的电流优先容许自旋平行于所述层力矩的电子传输通过，而反平行自旋的电子更可能被反射。通过这种方式，所述电流变为自旋极化，其中一种自旋类型的电子比另一种更多。然后，这种自旋极化电流与第二铁磁性层106B(或106A)相互作用，以在所述层的力矩上施加转矩。所述转矩可在不同情况下引起所述第二铁磁性层106B(或106A)的力矩围绕作用于铁磁体的有效磁场进动，或其可引起所述力矩在由***中诱导的单轴各向异性定义的两个方向之间可逆切换。所得自旋转矩振荡器(STO)的频率可通过改变作用于其上的磁场加以调节。因此，其具有充当磁场到频率(或相位)转换器的能力，如图3A中显示，其阐述使用STO传感器的概念。图3B显示当将具有1GHz的频率及5mT的峰对峰振幅的AC磁场在整个STO施加时，通过延迟检测电路的STO的实验反应。这种结果及图3C及3D中针对短纳秒场脉冲显示的彼等结果阐述这些振荡器可用作纳米级磁场检测器的方式。更多细节可参见T.长崎、H.须滕、K.工藤、T.洋、K.水岛及R.佐藤，“纳秒脉冲磁场下自旋转矩振荡器频率调制信号的延迟检测”，《应用物理学杂志》，第111卷，07C908(2012)。

用于核酸定序的装置

图4A、4B及4C阐述根据一些实施例的用于核酸定序的装置100的部分。图4A是所述装置的俯视图。图4B是于由图4A中标记为“4B”的长虚线指示的位置处的横截面图，及图4C是于由图4A中标记为“4C”的长虚线指示的位置处的横截面图。如图4A中显示，所述装置100包含磁性传感器阵列110，所述阵列包括多个磁性传感器105，所述阵列110中显示十六个磁性传感器105。为避免混淆附图，图4A中标记仅七个磁性传感器105，即磁性传感器105A、105B、105C、105D、105E、105F及105G。(为简单起见，本文件一般由参考编号105指示磁性传感器。个别磁性传感器是以参考编号105后接字母给定)。所述装置100还包括至少一个管线120，且对于所述磁性传感器105中的至少一些，那些磁性传感器105中的每一个的结合区域115，下文进一步详细讨论所述两者。

使用虚线阐述磁性传感器105及磁性传感器阵列110内的管线120的部分以指示它们在装置100的俯视图中可能不可见。如下文进一步详细解释，所述磁性传感器105嵌入所述装置100中且受保护不受结合区域115的内容物(例如，绝缘体)侵害。因此，应了解各种本文阐述的组件(例如，管线120、磁性传感器105等)在所述装置100的物理实例化中可能不可见(例如，它们可能嵌入保护材料比如绝缘体中或由其覆盖)。

在一些实施例中，磁性传感器阵列110中的磁性传感器105各为薄膜器件，其使用磁阻(MR)效应以检测相关联结合区域115中的磁性标记，下文进一步详细描述。如下文更详细描述，各磁性传感器105可作为电位计操作，其中电阻随感测磁场的强度及/或方向变化而变化。

图4A的示范性实施例中的示范性磁性传感器阵列110是矩形阵列，其中磁性传感器105以行及列安置。换句话说，所述磁性传感器阵列110的多个磁性传感器105以矩形网格图案安置。应了解，如图4A中显示以网格图案安置磁性传感器105是许多可能安置中的一种。所属领域的一般技术人员应知晓，所述磁性传感器105的其它安置是可能的且于本文中本发明的范围内。

现参考图4B及4C，结合图4A一起，装置100的示范性实施例中阐述的各磁性传感器105具有圆柱形状。然而，应理解，通常，所述磁性传感器105可具有任何合适的形状。例如，所述磁性传感器105在三个维度上可为立方形。此外，不同磁性传感器105可具有不同形状(例如，一些可为立方形而另一些可为圆柱形等)。

如图4A、4B及4C的示范性实施例中显示，结合区域115是配置在各磁性传感器105上方。例如，所述结合区域115A是在所述磁性传感器105A上方；所述结合区域115B是在所述磁性传感器105B上方；所述结合区域115C是在所述磁性传感器105C上方；所述结合区域115D是在所述磁性传感器105D上方；所述结合区域115E是在所述磁性传感器105E上方；所述结合区域115F是在所述磁性传感器105F上方；及所述结合区域115G是在所述磁性传感器105G上方。图4A中显示的其它未标记的九个磁性传感器105也各配置在相应的结合区域115下方(图4A中也未标记)。

结合区域115容纳流体。磁性传感器105可检测所述结合区域115中的磁性标记(例如，纳米粒子)。因此，在一些实施例中，各结合区域115的表面116具有保护所述磁性传感器105免受所述结合区域115中的任何流体侵害的性质及特性，同时仍容许所述磁性传感器105检测所述结合区域115内的磁性标记。所述表面116(且可能所述结合区域115的剩余部分)的材料可为或包含绝缘体。例如，在一些实施例中，所述表面116包含聚丙烯、金、玻璃或硅。应了解所述表面116可为配置在位于所述磁性传感器105上方的所述(等)管线120上方的多层结构经暴露的表面。例如，在所述表面116包含导体(例如，金)的实施例中，可使用绝缘材料层以将所述导体与所述磁性传感器105上方的管线120隔开。(参见图4B及4C)。可选择所述表面116的厚度以使所述磁性传感器105距离所述结合区域115一定距离，使得所述磁性传感器105能够检测所述结合区域115内的磁性标记。在一些实施例中，所述表面116厚约3到20nm，以使磁性传感器105(下文进一步描述)的感测层在其相应的结合区域115中距磁性标记约5nm到约40nm。

在一些实施例中，结合区域115的表面116具有经配置以将核酸锚定到所述表面116的结构(或多种结构)。例如，所述结构(或所述多种结构)可包括空腔或脊。此外，在一些实施例中，所述表面116具有促进核酸扩增的特性。例如，所述装置100可促进桥接扩增以促进各所述结合区域115内单一核酸链的克隆群集的产生。

图4A、4B及4C的示范性实施例中显示的各结合区域115的形状为立方形(例如，如图4A中显示，当从顶部观察时，各结合区域115具有正方形且当从横截面观察时，那么为矩形)，但应知晓所述结合区域115可具有其它形状(例如，圆形、椭圆形、八边形等)。例如，所述结合区域的形状可与磁性传感器105的形状相似或相同(例如，如果所述磁性传感器105在三个维度上为圆柱形，那么所述结合区域115还可为半径比所述磁性传感器105的半径更大、更小或相同大小的圆柱形；如果所述磁性传感器105在三个维度上为立方形，那么所述结合区域115还可为表面116比所述磁性传感器105的顶部更大、更小或相同大小的立方形等)。此外，不同结合区域115及不同表面116可具有不同形状(例如，一些表面116可为圆形，一些可为矩形，一些可为正方形等)。另外，尽管图4B及4C显示所述结合区域115具有垂直边，但无需所述侧边垂直。一般而言，所述结合区域115及其表面116可具有促进由所述磁性传感器105检测所述结合区域115中的磁性纳米粒子的任何形状及特性。

在一些实施例中(比如图4A、4B及4C中阐述的示范性实施例)，多个磁性传感器105各耦合到至少一个管线120。(为简单起见，本文件一般由参考编号120指示管线。个别管线以参考编号120后接字母给定)。在图4A、4B及4C显示的示范性实施例中，磁性传感器阵列110中的各磁性传感器105是耦合到两个管线120。例如，磁性传感器105A是耦合到管线120A及120H；磁性传感器105B是耦合到管线120B及120H；磁性传感器105C是耦合到管线120C及120H；磁性传感器105D是耦合到管线120D及120H；磁性传感器105E是耦合到管线120D及120E；磁性传感器105F是耦合到管线120D及120F；及磁性传感器105G是耦合到管线120D及120G。在图4A、4B及4C的示范性实施例中，显示管线120A、120B、120C及120D位于磁性传感器105下，且显示管线120E、120F、120G及120H位于所述磁性传感器105上方。

图4B显示磁性传感器105E与管线120D及120E相关，磁性传感器105F与管线120D及120F相关，磁性传感器105G与管线120D及120G相关，及磁性传感器105D与管线120D及120H相关。图4C显示磁性传感器105D与管线120D及120H相关，磁性传感器105C与管线120C及120H相关，磁性传感器105B与管线120B及120H相关，及磁性传感器105A与管线120A及120H相关。

图4A、4B及4C的示范性实施例的管线120各识别磁性传感器阵列110的行或列。例如，管线120A、120B、120C及120D各识别所述磁性传感器阵列110的不同行，且管线120E、120F、120G及120H各识别所述磁性传感器阵列110的不同列。如图4B中显示，管线120E、120F、120G及120H各与磁性传感器105中的一个沿横截面接触(也就是说，管线120E与磁性传感器105E的顶部接触，管线120F与磁性传感器105F的顶部接触，管线120G与磁性传感器105G的顶部接触，及管线120H与磁性传感器105D的顶部接触)，及管线120D与磁性传感器105E、105F、105G及105D中的每一个的底部接触。同样，及如图4C中显示，管线120A、120B、120C及120D各与所述磁性传感器105中的一个的底部沿横截面接触(也就是说，管线120A与磁性传感器105A的底部接触，管线120B与磁性传感器105B的底部接触，管线120C与磁性传感器105C的底部接触，及管线120D与磁性传感器105D的底部接触)，及管线120H与所述磁性传感器105D、105C、105B及105A中的每一个的顶部接触。

在一些实施例中，结合区域115中的一些或所有位于通过磁性传感器105上方的管线120中的沟槽内。例如，如图4C中显示，管线120H在所述磁性传感器105上方比其在所述磁性传感器105之间更薄。例如，所述管线120H在磁性传感器105D上方具有第一厚度，在磁性传感器105D与105C之间具有第二、更大的厚度，及在磁性传感器105C上方具有第一厚度。

为简化说明，图4A、4B及4C阐述磁性传感器阵列110中具有仅十六个磁性传感器105，仅十六个相应结合区域115，及八个管线120的示范性装置100。应知晓所述装置100的所述磁性传感器阵列110可具有更少或更多磁性传感器105，及其可具有更多或更少结合区域115，且其可具有更多或更少管线120。一般而言，可使用容许磁性传感器105检测结合区域115中的磁性标记的磁性传感器105及结合区域115的任何配置。同样，可使用容许判定所述磁性传感器105是否具有感测的一个或多个磁性标记的一个或多个管线120的任何配置。

图4D是显示根据一些实施例的装置100的组件的方块图。如图所示，所述装置100包括磁性传感器阵列110，其由管线120耦合到感测电路130。在操作中，所述感测电路130可将电流施加到所述管线120以检测所述磁性传感器阵列110中多个磁性传感器105中的至少一个的特性，其中所述特性指示结合区域115中存在或缺乏经磁性标记的核苷酸前体。例如，在一些实施例中，所述特性是磁场或电阻，或磁场的变化或电阻的变化。在一些实施例中，所述特性是噪声级。在一些实施例中，所述磁性传感器包含磁控振荡器，且所述特性是与所述磁控振荡器相关联或由其产生的信号的频率。

在一些实施例中，感测电路130检测磁性传感器阵列110中的磁性传感器105中的一些或所有的磁性环境的偏差或波动。例如，与存在磁性标记的情况下的磁性传感器105相比，在缺乏磁性标记的情况下的MR类型的磁性传感器105在高于一定频率下应具有相对较小的噪声，因为来自所述磁性标记的磁场波动将引起感测铁磁体力矩的波动。这些波动可使用外差检测(例如，通过测量噪声功率密度)或通过直接测量所述磁性传感器105的电压来测量并使用比较器电路评估以与不感测结合区域115的虚拟传感器组件进行比较。在所述磁性传感器105包括STO组件的情况下，由于频率的瞬时变化，来自磁性标记的波动磁场将引起所述磁性传感器的相位跳变，其可使用相位检测电路检测。另一选择是设计STO以使其仅于小磁场范围内振荡，使得磁性标记的存在将关闭所述振荡。应了解上文提供的实例是仅示范性的。其它检测方法也经审慎考虑并且在本发明的范围内。

在一些实施例中，磁性传感器阵列110包括选择器组件，所述选择器组件减小可传输通过相邻组件并降低所述磁性传感器阵列110的性能的“潜泄”电流的可能性。图5A及5B阐述根据一些实施例的两种方法。在图5A中，CMOS晶体管是与磁性传感器105串联耦合。关于针对图5A中显示的配置的更多细节，参见B.N.恩格尔、J.奥克曼、B.布彻、R.W.戴夫、M.德赫雷拉、M.杜兰姆、G.格林克维奇、J.简斯基、S.V.皮埃坦巴拉姆、N.D.里佐、J.M.斯劳特、K.史密斯、J.J.孙及S.特拉尼，“一种基于新型位及切换方法的4-Mb触发型MRAM”，《IEEE磁学汇刊》，第41卷，132(2005)。

在图5B中，二极管或二极管样组件是与磁性膜一起沉积及然后放置于“交叉点”架构内，其中磁性传感器阵列110***的CMOS晶体管导通个别管线120(例如，字线及位线)以寻址所述阵列中的个别磁性传感器105。使用CMOS选择晶体管可由于可用于制造前端的铸造厂(例如，建造CMOS晶体管及底层电路的所有纳米制造)的普及而变得更简单，但操作所需的电流类型可需交叉点设计以最终实现所述磁性传感器阵列110所需的密度。关于图5B中显示的配置的另外细节可参见C.查伯特、A.费尔特及F.N.范道尔，“自旋电子学在数据存储中的兴起”，《自然材料》，第6卷，813(2007)。

在一些实施例中，使用装置100容许核酸的扩增，比如，例如使用桥接扩增(下文进一步讨论)。通过扩增程序(比如下文更详细描述)产生的克隆群集中个别链之间的距离可经估算以选择磁性传感器阵列110中的磁性传感器105的尺寸及密度。例如，为估算所述距离，技术人员可同时考虑200个碱基对(BP)双链DNA的轮廓长度(例如，DNA的拉直链的长度)及持久性长度(例如，在桥接扩增程序期间，链弯曲后的平均长度)，进行选择，因为许多核酸定序扩增的平均链长度为200BP，及双链DNA的柔性低于单链DNA，并因此提供上限。所述平均轮廓长度是约65nm，及所述持久性长度是约35nm(参见，例如，S.布尔克斯等人，“使用暗场拴系粒子运动确定双链DNA的持久长度”，《化学物理学杂志》(2009)130:215105)。因为DNA在桥接扩增过程期间弯曲，所以扩增克隆之间的平均距离应介于轮廓长度与持久性长度之间。因此，所述距离可估算为约40nm。假设从信噪比(SNR)的角度来看，可需介于数十与数百之间的复制链以定序各初始结合的目标链，所述磁性传感器105可具有(例如)约10nm到约1μm的量级的尺寸。应知晓因为所述定序使用磁性纳米粒子而非荧光，所以相邻磁性传感器105之间之间隔可比光学***所需之间隔小得多，其受衍射效应限制。例如，在本文公开的装置100的实施例中，相邻磁性传感器105可相距介于约20nm与约30nm之间。

制造定序装置的方法

在一些实施例中，使用光刻工艺及薄膜沉积制造装置100。

图6阐述一种制造根据一些实施例的装置100的方法150。在152，所述方法开始。在154，在衬底上制造至少一个管线120(例如，第一管线120)，例如，通过在衬底上沉积金属层，及将所述金属层图案化为所述至少一个管线120。金属层可(例如)使用物理气相沉积(PVD)或离子束沉积(IBD)进行沉积。将所述金属层图案化为所述至少一个管线120可使用光刻、铣削及/或蚀刻进行。

任选地，在156，可在至少一个管线120上方沉积绝缘材料，及然后，还任选地，在158，可使所述至少一个管线120裸露。例如，所述至少一个管线120可使用化学机械抛光(CMP)裸露。

在160，在至少一个管线120上制造多个磁性传感器105(例如，磁性传感器阵列110)。所述多个磁性传感器105可例如通过在所述至少一个管线120上沉积多个层，及然后将所述多个层图案化以形成所述多个磁性传感器105来制造。所述多个层可使用任何合适的技术沉积。例如，所述多个层可通过以下沉积：沉积第一铁磁性层(例如，图1中显示的层106B)，在第一铁磁性层上方沉积金属或绝缘层(例如，图1中显示的层107)，及在金属或绝缘层上方沉积第二铁磁性层(例如，图1中显示的层106A)。将所述多个层图案化以形成所述多个磁性传感器105可使用任何合适的技术(比如，例如光刻或蚀刻)进行。

在一些实施例中，磁性传感器阵列110的各磁性传感器105具有底面108及顶面109。(参见，例如，图1)。所述底面108是耦合到所述至少一个管线120中的一个(例如，所述底面108是耦合到第一管线120)。在一些实施例中，各磁性传感器105的底面108是与所述至少一个管线120中的一个(例如，第一管线120)接触。

在一些实施例中，多个磁性传感器105各具有预定形状，所述预定形状对于所述多个磁性传感器105的所有磁性传感器105可为相同的或对于两个或更多个磁性传感器105可为不同的。所述预定形状可为任何合适的形状，包括(例如)大体上圆柱形或大体上立方形。所述多个磁性传感器105中的每一个的横向尺寸可为(例如)介于约10nm与约1μm之间。如本文使用，术语“横向尺寸”表示图4A中显示的x-y平面中的尺寸，例如，当从顶部观察所述装置100时。例如，当磁性传感器105为圆柱形时，横向尺寸是所述圆柱体的顶面109的直径。作为另一实例，当磁性传感器105为立方形时，其横向尺寸包括其顶面的尺寸(例如，其顶面109的长度、宽度或对角线尺寸)。

再次参考图6的方法实施例，在162，在磁性传感器阵列110的磁性传感器105之间沉积绝缘材料(例如，电介质材料)。所述绝缘材料可为任何合适的材料，比如，例如氧化物或氮化物。例如，所述绝缘材料可包含二氧化硅(SiO₂)、氧化铝(Al₂O₃)或氮化硅(Si₃N₄)。

任选地，在164，可进行化学机械抛光步骤以使多个磁性传感器105中的每一个的顶面109暴露。

在166，使用任何合适的技术制造至少一个另外管线120。例如，所述至少一个另外管线120的制造可通过沉积金属层，进行光刻以界定所述至少一个另外管线120，及移除所述金属层的一部分，从而留下所述至少一个另外管线120。

在一些实施例中，至少一个另外管线120各耦合到磁性传感器阵列110中的至少一个磁性传感器105的顶面109。在一些实施例中，各磁性传感器105的顶面109是与相同管线120接触。在一些实施例中，磁性传感器105的底面108是与第一管线120A接触，且所述磁性传感器105的顶面109是与第二管线120B接触。

在一些实施例中，多个磁性传感器105是于矩形磁性传感器阵列110中。在这些实施例中，至少一个管线120(例如，第一或底部管线120)可对应于所述矩形阵列的一或多行，且所述至少一个另外管线120(例如，第二或顶部管线120)可对应于所述矩形阵列的一或多列，或反之亦然。

在168，使用任何合适的技术产生多个结合区域115。例如，所述多个结合区域115可通过以下产生：在对应于所述多个结合区域115的区域上方施加掩模，在所述掩模上方沉积金属层，及摘取所述掩模。例如，可进行光刻以界定聚合物中的窗口与顶部管线120重叠的掩模，除直接在磁性传感器105上方外。然后，可进行后续金属沉积及摘取，以使所述顶部管线120远离所述磁性传感器105变厚，这在各磁性传感器105上方产生浅沟槽并减小所述顶部管线120的电阻以改善噪声性能。这些浅沟槽可界定所述结合区域115。

因此，在一些实施例中，通过以下产生多个结合区域115：在对应于磁性传感器105的顶部的位置，在顶部管线120中制造沟槽，及然后在所述沟槽上方沉积绝缘材料。例如，在所述多个磁性传感器105以矩形阵列110安置，其中一些管线120(底部管线120)在所述磁性传感器105下方及其它管线120(顶部管线120)在所述磁性传感器105上方的实施例中，沟槽可在所述顶部管线120的每一个中于所述顶部管线通过所述磁性传感器105上方的位置处蚀刻。然后由所述磁性传感器105上方的沟槽界定所述结合区域115(例如，如图4C中显示)。

在一些实施例中，在产生结合区域115后(例如，在摘取掩模及/或产生上文描述的沟槽后)，在多个另外管线120及多个结合区域115上方沉积(例如，使用原子层沉积)另外绝缘材料(例如，氧化物，比如SiO₂或氮化物)的薄层。所述另外绝缘材料的厚度可(例如)介于约3nm与约20nm之间。出于此目的，可使用将磁性传感器105与所述结合区域115中的磁性标记电隔离，并保护所述磁性传感器105免受预期添加到所述结合区域115的流体侵害的任何合适的绝缘材料。例如，所述另外绝缘材料可包含二氧化硅(SiO₂)、氧化铝(AlO_x)或氮化硅(SiN)，或诸如此类。

在170，方法150结束。

定序方法

在一些实施例中，核酸是使用固定化核酸链(可能在克隆群集中)定序，所述固定化核酸链是栓系到装置100的磁性传感器阵列110的磁性传感器105附近。然后可同时或一次一个添加四种类型的可逆终止子碱基(RT-碱基)，并冲走未并入的核苷酸。然后可从所述核酸链化学移除磁性标记连同末端3’阻断剂，然后开始下一定序循环。

核酸链可以任何合适的方式制备。例如，所述核酸链可通过随机断裂核酸样本，接着5’及3’衔接子连接来制备。然后，所述核酸的这些链可被捕获在结合或连接到结合区域115中的至少一些的表面116的寡核苷酸上。可使用线性或指数扩增(包括桥接扩增)以在定序前扩增所述链。

桥接扩增及其它扩增技术为所属技术领域中熟知且可与根据一些实施例的装置100一起使用。为开始桥接扩增，欲定序的核酸可使用(例如)固定于水凝胶中的(例如)衔接子链附接到衬底。然后，可将聚合酶、引子及核苷酸前体引入结合区域115内以从单目标链产生双链核酸。接着，可使所述双链变性，此将所述双侧核酸链分成彼此为互补体的两个单链。如本文显示，桥形成涉及引起所述单链折叠并附接到固定于衬底上的互补衔接子链的化学过程。再一次，将聚合酶、引子及核苷酸前体引入所述结合区域115内以将个别单链“桥”转化为双侧链。在这个步骤后，使所述双链变性以产生互补单链，一个为原始“正向”链而另一个为复制“反向”链。在重复这些步骤多次后，形成具有正向及反向复本两者的克隆群集。然后，两个群集中的一个(例如，反向链)可从所述结合区域115裂解，然后定序残余的群集(例如，正向链)。

扩增程序与用于核酸定序的装置100的结合使用可改善定序过程的SNR，并从而改善所述定序的精确度。由于结合区域115内欲定序的相同核酸链的许多复本的存在所致的SNR改善结果容许将较大量的经磁性标记的核苷酸前体并入所述结合区域115内。并入较大量的经磁性标记的核苷酸前体进一步增加与所述结合区域115相关联的磁性传感器105将检测所述结合区域115内的所述磁性标记的存在的可能性。因此，具有欲定序链的较大量复本降低所述磁性传感器105将错过经磁性标记的核苷酸前体的并入并从而产生定序错误的可能性。

如下文描述，为定序核酸链，经磁性标记的核苷酸前体可一次一个或一次全部引入。

在一些实施例中，经磁性标记的核苷酸前体是一次一个引入。在这些实施例中，相同磁性标记可用于所有所述核苷酸前体。应了解，如本文使用，短语“相同磁性标记”不是指单个磁性标记的相同物理实例(也就是说，其不表示重复利用物理标记的特定实例)；相反，其是指磁性标记的多个物理实例化，其均具有使得其个别实例无法彼此区分的相同特性或性质。相反，短语“不同磁性标记”是指磁性标记(个别地或作为一组)具有容许其(无论个别地或作为一组)均可与其它磁性标记加以区分的不同特性或性质。

在一些实施例中，核酸链一次延伸一个核苷酸，及磁性传感器阵列110用于识别结合的经磁性标记的核苷酸前体。

图7是阐述根据一些实施例的使用装置100或使用磁性传感器感测存在或缺乏磁性标记的另一装置进行核酸定序的方法200的流程图。在202，所述方法开始。在204，如上文描述，一个或多个核酸链结合到所述定序装置100的一个或多个结合区域115的表面116。存在许多方法以将所述一个或多个核酸链结合到所述表面116。例如，所述核酸链可通过将衔接子结合到核酸链的末端并使寡核苷酸偶合到所述结合区域115的表面116以结合到所述表面116，其中所述寡核苷酸与所述衔接子互补。作为另一实例，所述核酸链可通过将核酸链共价结合到表面116以结合到所述表面116。作为又另一实例，所述核酸链可通过经由不可逆的被动吸附或分子间的亲和力固定所述核酸链以结合到所述表面116。在一些实施例中，如上文描述，所述表面116包含空腔或脊，及将所述核酸链结合到近端壁包括将水凝胶施加到所述空腔或施加到所述脊。

在可选步骤206，所述(若干)核酸链可使用任何合适的方法扩增，比如，例如通过利用聚合酶链反应(PCR)或线性扩增。

在208，将可延伸引子添加到结合区域115。

在210，将核酸聚合酶添加到结合区域115。所述核酸聚合酶可为任何合适的核酸聚合酶。用于核酸定序中的核酸聚合酶(比如DNA聚合酶)的所需特性包括以下中的一种或多种：针对核酸模板及核苷酸前体的快速结合速率，或针对核酸模板及核苷酸前体的缓慢解离速率(结合及解离速率为在确定的一组反应条件下，核酸聚合酶的动力学特性)；高保真度、低或不可检测的核酸外切酶活性，包括低或不可检测的3’-5’核酸外切酶(校对)活性或低或不可检测的5’-3’核酸外切酶活性；有效DNA链置换、高稳定性、高可加工性(包括长阅读长度)、耐盐性及并入经修饰的核苷酸前体(包括本文描述的前体)的能力。

合适聚合酶的一些实例包括缺乏3’-5’核酸外切酶活性的B家族(B型)聚合酶。

在一些实施例中，聚合酶是热稳定聚合酶。热稳定核酸聚合酶包括水生栖热菌(Thermus aquaticus)Taq DNA聚合酶、栖热菌属(Thermus sp.)Z05聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavus)聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)聚合酶(比如TMA-25及TMA-30聚合酶)、Tth DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)、瓦氏火球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)、海栖热袍菌(Thermatoga maritima)(Tma)及嗜热高温球菌(Thermococcus Litoralis)(Tli或Vent)及诸如此类。

在一些实施例中，聚合酶缺乏可检测5’-3’核酸外切酶活性。大体上缺乏5′到3′核酸酶活性的DNA聚合酶的实例包括大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I的克列诺(Klenow)片段；缺乏N末端235个氨基酸(“斯托菲尔(Stoffel)片段”)的水生栖热菌DNA聚合酶(Taq)，参见第5,616,494号美国专利。其它实例包括具有足够删除(例如，N末端删除)、突变或修饰以便于消除或不活化负责5′-3′核酸酶活性的域的热稳定DNA聚合酶。参见，例如，第5,795,762号美国专利。

在一些实施例中，聚合酶缺乏可检测3’-5’核酸外切酶活性。大体上缺乏3’-5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶的实例包括Taq聚合酶及其衍生物，及具有校对域的天然生成或经工程化删除的任何B家族(B型)聚合酶。

在一些实施例中，聚合酶已经修饰或工程化以能够并入或增强并入核苷酸类似物，比如3’-修饰的核苷酸；参见，例如，第10,150,454号、第9,677,057号及第9,273,352号美国专利。

在一些实施例中，聚合酶已经修饰或工程化以可并入或增强并入核苷酸类似物，比如5’-磷酸盐-修饰的核苷酸；参见，例如，第10,167,455号及第8,999,676号美国专利。在一些实施例中，这些聚合酶是phi29衍生的聚合酶；参见，例如，第8,257,954号及第8,420,366号美国专利。在一些实施例中，这些聚合酶是phiCPV4衍生的聚合酶；参见，例如，第US20180245147号美国专利公开案。

在一些实施例中，聚合酶是通过选择加以修饰或工程化，以成功并入所需经修饰的核苷酸或以所需精确度及可加工性并入核苷酸及核苷酸类似物。选择这些经修饰的聚合酶的方法为所属技术领域中已知；参见，例如，标题为“聚合酶组合物及制造并使用其的方法”的第US20180312904A1号美国专利公开案。

应了解步骤208及210可组合或其顺序可调换。

任选地，在212，可清洗结合区域115，然后在步骤214添加经磁性标记的核苷酸前体。

在228，选择经磁性标记的核苷酸前体用于定序循环。在一些实施例中，所述经磁性标记的核苷酸前体选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶，或其等同物。在一些实施例中，所述经磁性标记的核苷酸前体包含经磁性标记的dATP、dGTP、dCTP、dTTP，或等同物中的一种。所述经磁性标记的核苷酸前体可标记为常规、天然、非常规或类似的核苷酸。术语“常规”或“天然”在涉及核苷酸前体时是指彼等天然生成者(也就是说，针对DNA，这些为dATP、dGTP、dCTP及dTTP)。术语“非常规”或“类似”在涉及核苷酸前体时包括核苷酸前体中常规碱、糖部分或核苷酸间连接的修饰或类似物。例如，dITP、7-去氮-dGTP、7-去氮-dATP、烷基-嘧啶核苷酸(包括丙炔基dUTP)是具有非常规碱的核苷酸的实例。一些非常规糖修饰包括于2’-位置的修饰。例如，具有2’-OH的核糖核苷酸(也就是说，ATP、GTP、CTP、UTP)是DNA聚合酶的非常规核苷酸。其它糖类似物及修饰包括D-核糖基、2'或3'D-脱氧核糖基、2',3'-D-二脱氧核糖基、2',3'-D-二去氢二脱氧核糖基、2'或3'烷氧基核糖基、2'或3'胺基核糖基、2'或3'巯基核糖基、2'或3'烷硫基核糖基、无环、碳环或其它经修饰的糖部分。另外实例包括2'-PO₄类似物，其为终止子核苷酸。(参见，例如，第7,947,817号美国专利或文中描述的其它实例)。非常规连接核苷酸包括硫代磷酸酯dNTP([α-S]dNTP)、5'-[α-硼烷]-dNTP及[α]-甲基-膦酸酯dNTP。

在214，将选择的经磁性标记的核苷酸前体添加到结合区域115。

在216，进行定序以判定选择的经磁性标记的核苷酸前体是否已结合到聚合酶或是否已并入可延伸引子内。如图7中显示，定序步骤216可包括多个子步骤。例如，在子步骤218，使用装置100的一个或多个管线120以检测磁性传感器阵列110的磁性传感器105的特性。如上文解释，所述特性可为(例如)电阻、电阻的变化、磁场、磁场的变化、频率、频率的变化或噪声。

在决定点220，判定检测结果是否指示经磁性标记的核苷酸前体已结合到聚合酶或已并入可延伸引子内。例如，所述判定可基于存在或缺乏特性，例如，如果检测到特性，那么认为经磁性标记的核苷酸前体已结合到聚合酶或已并入可延伸引子内，及如果未检测到特性，那么认为经磁性标记的核苷酸前体尚未结合到聚合酶或尚未并入可延伸引子内。作为另一实例，所述判定可基于特性的量级或值，例如，如果所述量级或值在规定范围内，那么认为经磁性标记的核苷酸前体已结合到聚合酶或已并入可延伸引子内，及如果所述量级或值不在规定范围内，那么认为经磁性标记的核苷酸前体尚未结合到聚合酶或尚未并入可延伸引子内。

检测(子步骤218)及判定(决定点220)可使用或依赖于磁性传感器阵列110中的所有或少于所有的磁性传感器105。判定特性是否存在或缺乏，或所述特性的值(决定点220)，可基于聚集、平均或另外处理来自磁性传感器阵列110中的一些或所有磁性传感器105的检测结果(子步骤218)。

如果在决定点220，判定经磁性标记的核苷酸前体已结合到聚合酶或已并入可延伸引子内，那么在步骤222，将经磁性标记的核苷酸前体的互补碱基的指示记录在核酸链的核酸序列的记录中。

在一些实施例中，经磁性标记的核苷酸前体无法由核酸聚合酶延伸，且因此，在检测到特性后，必须移除所述磁性标记以使所述经磁性标记的核苷酸前体可由所述核酸聚合酶延伸。在一些实施例中，第一经磁性标记的核苷酸前体的一部分无法由核酸聚合酶延伸，及所述第一经磁性标记的核苷酸前体的部分可通过化学裂解延伸。如图7中阐述，如果欲进行另外定序循环(决定点224的“否”路径)，那么在226使用任何合适的方式(例如，化学、酶促方式或通过其它方式)移除磁性标记。

已在226移除磁性标记后，在228选择另一经磁性标记的核苷酸前体。然后，在步骤214，将最新选择的经磁性标记的核苷酸前体(其可与刚刚完成的循环中用户相同或不同)添加到结合区域115，及再次进行定序步骤216以确定最新选择的经磁性标记的核苷酸前体是否已结合到聚合酶或已并入可延伸引子内。

如果在决定点220，判定经磁性标记的核苷酸前体尚未结合到聚合酶及未并入可延伸引子内，那么方法移动到步骤228，在所述步骤228，选择另一经磁性标记的核苷酸前体。在此情况下，因为先前尝试的经磁性标记的核苷酸前体不匹配，所以选择的经磁性标记的核苷酸前体应与刚刚完成的循环中使用的不同。

尽管图7显示在步骤210与214之间发生单个可选清洗步骤212，但应了解另外清洗步骤可包括于方法中。例如，可在步骤228与214之间或在步骤226后，清洗所述(若干)结合区域115(例如，以大体上移除先前引入的经磁性标记的核苷酸前体及步骤226中移除的任何磁性标记)。在230，方法200结束。

应了解在一些数量的定序循环后，可需要或必需进行步骤210以将核酸聚合酶的另外分子添加到所述(若干)结合区域115以补充所述聚合酶。

上文讨论的图7阐述一次一个引入经磁性标记的核苷酸前体的实施例。在其它实施例中，大体上同时引入多个核苷酸前体(例如，二、三或四个核苷酸前体)。在这些实施例中，不同磁性标记用于大体上同时引入的不同核苷酸前体。引入的前体的磁性标记各具有不同磁性，使得磁性传感器105以在用于大体上同时引入的不同核苷酸前体的不同磁性标记之间加以区分。

图8阐述方法250的实施例，其中将多个核苷酸前体大体上同时引入到装置100或使用磁性传感器及磁性标记用于检测的另一装置。出于阐述目的，图8显示大体上同时引入的四个核苷酸前体，但应了解本文公开的方法可用于测试多于或少于四个核苷酸前体。

在252，方法250开始。步骤254、256、258、260及262与图7的上下文中显示并描述的步骤204、206、208、210及212相同。此处不重复所述描述。

在步骤264，将多达四个经磁性标记的核苷酸前体添加到装置100的所述(若干)结合区域115。添加的经磁性标记的核苷酸前体各用不同磁性标记进行标记，使得磁性传感器105可在不同的经磁性标记的核苷酸前体之间加以区分。明确来说，所述磁性标记各具有不同且可区分的磁性(例如，用于第一经磁性标记的核苷酸前体的第一磁性标记具有第一磁性，用于第二经磁性标记的核苷酸前体的第二磁性标记具有第二磁性等)。

在266，进行定序以判定哪些添加的经磁性标记的核苷酸前体中已结合到聚合酶或并入可延伸引子内。如图8中显示，定序步骤266可包括多个子步骤。例如，在图8阐述的方法250中，在子步骤268，使用装置100的一个或多个管线120以检测磁性传感器阵列110的磁性传感器105的特性，其中所述特性识别并入的经磁性标记的核苷酸前体的磁性。如上文解释，所述特性可为(例如)电阻、电阻的变化、磁场、磁场的变化、频率、频率的变化或噪声。

在决定点270，判定是否已检测到第一磁性，其中所述第一磁性指示第一经磁性标记的核苷酸前体已结合到聚合酶或已并入可延伸引子内。所述判定可基于(例如)存在或缺乏第一磁性，例如，如果检测到第一磁性，那么认为第一经磁性标记的核苷酸前体已结合到聚合酶或已并入可延伸引子内，及如果未检测到第一磁性，那么认为第一经磁性标记的核苷酸前体尚未结合到聚合酶或并入可延伸引子内。作为另一实例，所述判定可基于第一磁性的量级或值，例如，如果所述量级或值在规定范围内，那么认为第一经磁性标记的核苷酸前体已结合到聚合酶或并入可延伸引子内，及如果所述量级或值不在规定范围内，那么认为第一经磁性标记的核苷酸前体尚未结合到聚合酶或尚未并入可延伸引子内。

如果在决定点270，判定已检测到第一磁性，那么方法移动到步骤278，在此步骤，将第一经磁性标记的核苷酸前体的互补碱基记录在核酸链的核酸序列的记录中。

如果在决定点270，判定尚未检测到第一磁性，那么方法250移动到决定点272，在所述决定点272，判定是否已检测到第二磁性，其中所述第二磁性指示第二经磁性标记的核苷酸前体已结合到聚合酶或并入可延伸引子内。所述判定可以上文针对判定第一磁性描述的任何方法进行。如果在决定点272判定已检测到所述第二磁性，那么方法移动到步骤278，在此步骤，将第二经磁性标记的核苷酸前体的互补碱基记录在核酸链的核酸序列的记录中。

如果在决定点272，判定尚未检测到第二磁性，那么方法250移动到决定点274，在所述决定点274，判定是否已检测到第三磁性，其中所述第三磁性指示第三经磁性标记的核苷酸前体已结合到聚合酶或并入可延伸引子内。所述判定可以上文针对确定第一磁性描述的任何方法进行。如果在决定点274判定已检测到所述第三磁性，那么方法移动到步骤278，在此步骤，将第三经磁性标记的核苷酸前体的互补碱基记录在核酸链的核酸序列的记录中。

最后，如果在决定点274，判定尚未检测到第三磁性，那么方法250移动到决定点276，在此决定点276，判定是否已检测到第四磁性，其中所述第四磁性指示第四经磁性标记的核苷酸前体已结合到聚合酶或并入可延伸引子内。所述判定可以上文针对确定第一磁性描述的任何方法进行。如果在决定点276判定已检测到所述第四磁性，那么方法移动到步骤278，在此步骤，将第三经磁性标记的核苷酸前体的互补碱基记录在核酸链的核酸序列的记录中。如果在决定点276，判定尚未检测到所述第四磁性，那么方法250移动返回到步骤264。

检测(子步骤268)及判定(决定点270、272、274及276)可使用或依赖于磁性传感器阵列110中的所有或少于所有的磁性传感器105。判定特定磁性是否存在或缺乏，或特性的值，可基于聚集、平均或另外处理来自磁性传感器阵列110中的一些或所有磁性传感器105的检测结果(子步骤268)。

在图8阐述的实施例中，哪些添加的经磁性标记的核苷酸前体已结合到聚合酶或已并入可延伸引子内的判定是针对候选经磁性标记的核苷酸前体中的每一个分别进行“是/否”判定的结果。应知晓所述判定可另外在单个步骤中进行，比如，例如通过将检测的特性的值与关键值进行比较。例如，所述关键值可指示如果由磁性传感器105检测的特性具有于第一范围内的值，那么第一经磁性标记的核苷酸前体已结合到聚合酶或并入可延伸引子内；如果由磁性传感器105检测的特性具有于第二范围内的值，那么第二经磁性标记的核苷酸前体已结合到聚合酶或并入可延伸引子内；如果由磁性传感器105检测的特性具有于第三范围内的值，那么第三经磁性标记的核苷酸前体已结合到聚合酶或并入可延伸引子内；及如果由磁性传感器105检测的特性具有于第四范围内的值，那么第四经磁性标记的核苷酸前体已结合到聚合酶或并入可延伸引子内。所述特性的值可基于聚集、平均或另外处理来自磁性传感器阵列110中的一些或所有磁性传感器105的检测结果(子步骤268)。

如上文解释，在一些实施例中，经磁性标记的核苷酸前体无法由核酸聚合酶延伸，且因此，在检测到特性后，必须移除所述磁性标记以使所述经磁性标记的核苷酸前体可由所述核酸聚合酶延伸。在一些实施例中，第一经磁性标记的核苷酸前体的一部分无法由核酸聚合酶延伸，及所述第一经磁性标记的核苷酸前体的部分可通过化学裂解延伸。在经磁性标记的核苷酸前体无法由所述核酸聚合酶延伸的实施例中，在步骤278，已增加(或开始)核酸链的核酸序列的记录后，在决定点280，判定是否进行另外定序循环。如果如此(决定点280的“否”分支)，那么移除并入的核苷酸前体的磁性标记。磁性标记可通过化学、酶促或通过所属技术领域中已知的其它方式移除，且方法250进行到步骤264，在此步骤，将多达四个经磁性标记的核苷酸前体添加到结合区域115(可能在进行与阐述的步骤262相似或相同的清洗步骤后)。然后，再次进行定序步骤266以识别下一个结合到聚合酶的经磁性标记的核苷酸前体。

如果在决定点280，判定不进行另外定序循环(决定点280的“是”分支)，那么方法250在284结束。

在前述说明书及附图中，已阐述特定术语以提供本文公开的实施例的透彻了解。在一些情况下，术语或图式可暗示实践本发明无需的特定细节。

为避免不必要地混淆本公开，熟知的组件以方块图形式显示及/或不详细讨论，或在一些情况下，根本不讨论。

除非本文另有明确定义，否则所有术语均以其最广泛的可能解释给定，包括说明书及图式所暗含的含义及所属领域的技术人员所了解及/或如字典、专着等中定义的含义。如本文明确阐述，一些术语可与其一般或习惯含义不符。

如说明书及所附权利要求书中使用，除非另有规定，否则单数形式“一”、“一个”及“所述”不排除多个参考物。除非另有规定，否则措辞”或“应解释为包括性的。因此，短语“A或B”应解释为表示以下中的所有：“A及B两者”、“A但非B”及“B但非A”。本文中“及/或”的任何使用不表示措辞“或”单独暗示排他性。

如说明书及所附权利要求书中使用，短语形式“A、B及C中的至少一个”、“A、B或C中的至少一个”、“A、B或C中的一或多个”及“A、B及C中的一或多个”可互换，且各包含下列含义中的所有：“仅A”、“仅B”、“仅C”、“A及B但非C”、“A及C但非B”、“B及C但非A”及“A、B及C中的所有”。

在具体实施方式或权利要求书中使用术语“包括”、“具有(having、has、with)”及其变体的程度，这些术语希望以与术语“包含”相似的方式上为包括性，也就是说，表示“包括(但不限于)”。使用术语“示范性”及“实施例”以表示实例，而非偏好或要求。本文使用术语“耦合”以表示直接连接/结合，及通过一个或多个介入组件或结构连接/结合。

本文使用术语“在……上方”、“在……下方”、“介于……之间”及“在……上”是指一个特征相对于另一特征的相对位置。例如，配置在另一特征“上方”或“下方”的一个特征可与所述另一特征直接接触或可具有介入材料。此外，配置在两个特征“之间”的一个特征可与所述两个特征直接接触或可具有一种或多种介入特征或材料。相反，第二特征“上”的第一特征是与所述第二特征接触。

使用术语“大体上”及“近似”以描述结构、配置、尺寸等在很大程度上或接近于所规定，但由于制造公差及诸如此类，而可在实践中导致所述结构、配置、尺寸等非始终或不一定完全如所规定的情况。例如，将两个长度描述为“大体上相等”或“近似相等”表示出于所有实际目的，所述两个长度是相同的，但它们在足够小的比例上可非(且无需)完全相等。作为另一实例，出于所有实际目的，将认为“大体上垂直”或“近似垂直”的结构是垂直的，即使相对于水平面其并非完全呈90度。

图式未必成比例，且特征的尺寸、形状及大小可大体上不同于图式中说明它们的方式。

尽管本文已公开特定实施例，但将显而易见，可对其作出各种修饰及变化而不背离本公开更广泛的精神及范围。例如，任一实施例的特征或方面可在至少在可行的情况下与任何其它实施例组合使用或代替其对应特征或方面。因此，应认为说明书及图式为说明性而非限制性的。

Claims (75)

1.一种用于核酸定序的装置，所述装置包含：

多个磁性传感器；

配置在所述多个磁性传感器上方的多个结合区域，所述结合区域各用于容纳流体；及

至少一个管线，用于检测所述多个磁性传感器中的至少第一磁性传感器的特性，所述特性指示存在或缺乏一个或多个耦合到与所述第一磁性传感器相关联的第一结合区域的磁性纳米粒子。

2.根据权利要求1所述的装置，其中所述第一磁性传感器包含磁阻式器件。

3.根据权利要求2所述的装置，其中所述磁阻式器件包含：

钉扎层；

自由层；及

配置在所述钉扎层与所述自由层之间的势垒层。

4.根据权利要求3所述的装置，其中，在缺乏所述一个或多个耦合到所述第一结合区域的磁性纳米粒子的情况下，所述钉扎层的磁矩距所述自由层的磁矩约90度。

5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的装置，其中所述第一磁性传感器的形状是大体上圆柱形或大体上立方形。

6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的装置，其中所述第一磁性传感器的横向尺寸介于约10纳米与约1微米之间。

7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的装置，其进一步包含经由所述至少一个管线耦合到所述多个磁性传感器的感测电路，其中所述感测电路经配置以：

将电流施加到所述至少一个管线以检测所述第一磁性传感器的所述特性。

8.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的装置，其中所述特性包含磁场或电阻。

9.根据权利要求1到8中任一权利要求所述的装置，其中所述特性包含磁场的变化或电阻的变化。

10.根据权利要求7到9中任一权利要求所述的装置，其中所述感测电路包含磁控振荡器，且其中所述特性包含与所述磁控振荡器相关联或由其产生的信号的频率。

11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的装置，其中所述特性包含噪声级。

12.根据权利要求1到11中任一权利要求所述的装置，其进一步包含配置在所述多个磁性传感器与所述多个结合区域之间的绝缘材料。

13.根据权利要求12所述的装置，其中所述绝缘材料包含二氧化硅、氧化铝或氮化硅中的至少一种。

14.根据权利要求12或权利要求13所述的装置，其中所述绝缘材料包含氧化物或氮化物中的至少一种。

15.根据权利要求12到14中任一权利要求所述的装置，其中在所述第一磁性传感器的顶部与所述第一结合区域之间的所述绝缘材料的厚度是介于约3纳米与约20纳米之间。

16.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的装置，其中所述至少一个管线包括配置在所述第一磁性传感器的顶面上方的第一管线，且其中所述第一结合区域位于所述第一管线中的沟槽内，所述沟槽在所述第一磁性传感器的所述顶面上方。

17.根据权利要求1到16中任一权利要求所述的装置，其中所述多个磁性传感器是以矩形阵列安置，且其中所述至少一个管线包括至少第一管线及第二管线，其中所述第一管线是配置在所述第一磁性传感器上方且所述第二管线是配置在所述第一磁性传感器下方。

18.根据权利要求17所述的装置，其中所述第一结合区域位于所述第一管线中的沟槽内。

19.根据权利要求17或权利要求18所述的装置，其中所述第一管线是耦合到所述矩形阵列的行且所述第二管线是耦合到所述矩形阵列的列，或反之亦然。

20.根据权利要求1到19中任一权利要求所述的装置，其中所述第一结合区域包含经配置以将核酸锚定到所述第一结合区域的结构。

21.根据权利要求20所述的装置，其中所述结构包含空腔或脊。

22.一种使用装置定序核酸的方法，所述装置包含多个磁性传感器；配置在所述多个磁性传感器上方的多个结合区域，所述结合区域各用于容纳流体；及至少一个管线，用于检测所述多个磁性传感器中的至少第一磁性传感器的特性，所述方法包括：

(a)将至少一个核酸链结合到第一结合区域；

(b)在一或多轮添加中，向所述第一结合区域添加可延伸引子及核酸聚合酶；

(c)向所述第一结合区域添加第一核苷酸前体，所述第一核苷酸前体由第一可裂解磁性标记进行标记；及

(d)定序所述核酸链，

其中定序所述核酸链包括：

使用所述至少一个管线，检测所述第一磁性传感器的所述特性，所述特性指示存在或缺乏所述第一可裂解磁性标记。

23.根据权利要求22所述的方法，其进一步包括扩增所述至少一个核酸链。

24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其进一步包括在将所述至少一个核酸链结合到所述第一结合区域后，扩增所述至少一个核酸链。

25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中，由于所述扩增，将一个或多个扩增子结合到所述第一结合区域。

26.根据权利要求22到25中任一权利要求所述的方法，其中定序所述核酸链进一步包括：

响应于所述特性指示存在一个或多个耦合到所述第一结合区域的磁性纳米粒子的判定，将所述第一核苷酸前体的互补碱基记录在所述核酸链的核酸序列的记录中。

27.根据权利要求22到26中任一权利要求所述的方法，其中所述第一核苷酸前体无法由所述核酸聚合酶延伸，且所述方法进一步包括：

在检测所述特性后，移除所述第一可裂解磁性标记且使所述第一核苷酸前体能够由所述核酸聚合酶延伸。

28.根据权利要求22到26中任一权利要求所述的方法，其中所述第一核苷酸前体无法由所述核酸聚合酶延伸。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一核苷酸前体呈现为能够通过化学裂解延伸。

30.根据权利要求22到29中任一权利要求所述的方法，其进一步包括在定序所述核酸链后，通过酶促或化学裂解移除所述可裂解磁性标记。

31.根据权利要求22到30中任一权利要求所述的方法，其进一步包括：

在各重复期间，以不同核苷酸前体重复步骤(c)及(d)，所述不同核苷酸前体各经磁性标记。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一及不同核苷酸前体各选自经磁性标记的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶，或其等同物。

33.根据权利要求22到32中任一权利要求所述的方法，其进一步包括在步骤(c)前，清洗所述第一结合区域。

34.根据权利要求22到33中任一权利要求所述的方法，其中所述第一可裂解磁性标记具有第一磁性，且其中所述方法进一步包括：

在所述一或多轮添加中，向所述第一结合区域添加由具有第二磁性的第二可裂解磁性标记进行标记的第二核苷酸前体。

35.根据权利要求34所述的方法，其进一步包括：

在所述一或多轮添加中，向所述第一结合区域添加由具有第三磁性的第三可裂解磁性标记进行标记的第三核苷酸前体，及由具有第四磁性的第四可裂解磁性标记进行标记的第四核苷酸前体。

36.根据权利要求22到35中任一权利要求所述的方法，其中将所述至少一个核酸链结合到所述第一结合区域包括：

将衔接子结合到所述至少一个核酸链中的相应一者的末端；及

将寡核苷酸偶合到所述第一结合区域，其中所述寡核苷酸能够与所述衔接子杂交。

37.根据权利要求22到36中任一权利要求所述的方法，其中将所述至少一个核酸链结合到所述第一结合区域包括将所述至少一个核酸链各共价结合到所述第一结合区域。

38.根据权利要求22到37中任一权利要求所述的方法，其中将所述至少一个核酸链结合到所述第一结合区域包括经由不可逆的被动吸附或分子间的亲和力固定所述至少一个核酸链。

39.根据权利要求22到38中任一权利要求所述的方法，其中所述第一结合区域包含空腔或脊，且其中将所述至少一个核酸链结合到所述第一结合区域包括将水凝胶施加到所述空腔或施加到所述脊。

40.根据权利要求22到39中任一权利要求所述的方法，其进一步包括：

在步骤(c)后，向所述第一结合区域添加所述核酸聚合酶的另外分子。

41.根据权利要求22到40中任一权利要求所述的方法，其中所述第一可裂解磁性标记包含磁性纳米粒子。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述磁性纳米粒子是分子。

43.根据权利要求41所述的方法，其中所述磁性纳米粒子是超顺磁性纳米粒子。

44.根据权利要求41所述的方法，其中所述磁性纳米粒子是铁磁性纳米粒子。

45.根据权利要求22到44中任一权利要求所述的方法，其中所述第一核苷酸前体包含dATP、dGTP、dCTP、dTTP，或等同物中的一种。

46.根据权利要求22到45中任一权利要求所述的方法，其中所述核酸聚合酶包含缺乏3’-5’核酸外切酶活性的B型聚合酶。

47.根据权利要求22到46中任一权利要求所述的方法，其中所述核酸聚合酶包含热稳定聚合酶。

48.根据权利要求22到47中任一权利要求所述的方法，其中使用所述至少一个管线包括将电流施加到所述至少一个管线。

49.根据权利要求22到48中任一权利要求所述的方法，其中所述特性包含磁场或电阻。

50.根据权利要求22到49中任一权利要求所述的方法，其中所述特性包含与磁控振荡器相关联或由其产生的信号的频率。

51.根据权利要求22到50中任一权利要求所述的方法，其中所述特性包含噪声级。

52.根据权利要求22到51中任一权利要求所述的方法，其中所述特性包含磁场的变化或电阻的变化。

53.根据权利要求22到52中任一权利要求所述的方法，其中所述特性由磁场的变化或电阻的变化产生。

54.一种制造核酸定序器件的方法，所述方法包括：

制造第一管线；

制造多个磁性传感器，各磁性传感器均具有底面及顶面，其中各底面是耦合到所述第一管线；

在所述磁性传感器之间沉积绝缘材料；

制造多个另外管线，所述多个另外管线各耦合到所述多个磁性传感器的相应磁性传感器的所述顶面；及

产生多个结合区域。

55.根据权利要求54所述的方法，其中制造所述第一管线包括：

在衬底上沉积金属层；及

将所述金属层图案化为所述第一管线。

56.根据权利要求55所述的方法，其中在所述衬底上沉积所述金属层包括使用物理气相沉积或离子束沉积，沉积所述金属层。

57.根据权利要求55或权利要求56所述的方法，其中将所述金属层图案化为第一管线包括使用光刻、铣削或蚀刻中的一或多种来图案化所述金属层。

58.根据权利要求54到57中任一权利要求所述的方法，其进一步包括在制造所述第一管线后及在制造所述多个磁性传感器前：

在所述第一管线上方沉积绝缘材料；及

使所述第一管线裸露，

且其中制造所述多个磁性传感器包括在所述裸露的第一管线上制造所述多个磁性传感器。

59.根据权利要求58所述的方法，其中使所述第一管线裸露包括使用化学机械抛光(CMP)。

60.根据权利要求54到59中任一权利要求所述的方法，其中制造所述多个磁性传感器包括：

在所述第一管线上沉积多个层；及

将所述多个层图案化以形成所述多个磁性传感器，所述多个磁性传感器各具有预定形状。

61.根据权利要求60所述的方法，其中沉积所述多个层包括：

沉积第一铁磁性层；

在所述第一铁磁性层上方沉积金属或绝缘层；及

在所述金属或绝缘层上方沉积第二铁磁性层。

62.根据权利要求60或权利要求61所述的方法，其中将所述多个层图案化以形成所述多个磁性传感器包括进行光刻或蚀刻中的至少一种。

63.根据权利要求60至62中任一权利要求所述的方法，其中所述预定形状是大体上圆柱形或大体上立方形。

64.根据权利要求54至63中任一权利要求所述的方法，其中所述多个磁性传感器中的每一个的横向尺寸介于约10纳米与约1微米之间。

65.根据权利要求54至64中任一权利要求所述的方法，其中：

制造所述多个磁性传感器包括制造呈矩形阵列的所述多个磁性传感器，

且其中所述第一管线对应于所述矩形阵列的行，且所述多个另外管线各对应于所述矩形阵列的列。

66.根据权利要求54至64中任一权利要求所述的方法，其中：

制造所述多个磁性传感器包括制造呈矩形阵列的所述多个磁性传感器，

且其中所述第一管线对应于所述矩形阵列的列，且所述多个另外管线各对应于所述矩形阵列的行。

67.根据权利要求54到66中任一权利要求所述的方法，其进一步包括在所述磁性传感器之间沉积所述绝缘材料后及在制造所述多个另外管线前：

进行化学机械抛光步骤以暴露所述多个磁性传感器中的每一个的所述顶面。

68.根据权利要求54到67中任一权利要求所述的方法，其中制造所述多个另外管线包括：

沉积金属层；

进行光刻以界定所述多个另外管线；及

移除所述金属层的一部分。

69.根据权利要求54到68中任一权利要求所述的方法，其中产生所述多个结合区域包括：

在所述多个结合区域上方施加掩模；

在所述掩模上方沉积金属层；及

摘取所述掩模。

70.根据权利要求69所述的方法，其进一步包括：

在摘取所述掩模后，在所述多个另外管线及所述多个结合区域上方沉积另外绝缘材料。

71.根据权利要求70所述的方法，其中所述另外绝缘材料的厚度是介于约3纳米与约20纳米之间。

72.根据权利要求70或权利要求71所述的方法，其中所述另外绝缘材料包含氧化物或氮化物。

73.根据权利要求70到72中任一权利要求所述的方法，其中所述另外绝缘材料包含二氧化硅(SiO₂)。

74.根据权利要求70到73中任一权利要求所述的方法，其中沉积包括进行原子层沉积。

75.根据权利要求54到74中任一权利要求所述的方法，其中制造包括沉积。

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