JP2008539750A5 - - Google Patents

Claims (24)

1. 変異していない対照ポリメラーゼと比較して、ＤＮＡに対する低下した親和性を有する変異させたポリメラーゼであって、
   ９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｙｓ７０５、Ａｒｇ７１３及び／又はＡｒｇ７４３、あるいは、
   ＲＢ６９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｙｓ７９０、Ｌｙｓ８００、Ａｒｇ８０６、Ｌｙｓ８４４、Ｌｙｓ８７４及び／又はＬｙｓ８７８
   と位置的に同等な１つ又は複数の位置における、非塩基性のアミノ酸への少なくとも１つのアミノ酸置換変異を有することを特徴とする、
   ポリメラーゼ。
2. さらに、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｅｕ４０８Ｔｙｒ及びＴｙｒ４０９Ａｌａ及びＰｒｏ４１０Ｖａｌと位置的に同等な置換変異を含む、請求項１に記載のポリメラーゼ。
3. さらに、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＣｙｓ２２３Ｓｅｒと位置的に同等な置換変異を含む、請求項１に記載のポリメラーゼ。
4. 変異していない対照ポリメラーゼが、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２又は３に記載のポリメラーゼ。
5. 変異していない対照ポリメラーゼが、ファミリーＢタイプのＤＮＡポリメラーゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
6. 変異していない対照ポリメラーゼが、ファミリーＢの古細菌ＤＮＡポリメラーゼのいずれか、ヒトＤＮＡポリメラーゼα、並びにＴ４、ＲＢ６９及びφ２９ファージのＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項５に記載のポリメラーゼ。
7. ファミリーＢの古細菌ＤＮＡポリメラーゼが、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、９°Ｎ及びＰｆｕのポリメラーゼからなる群から選択される、請求項６に記載のポリメラーゼ。
8. １つ、２つ又は３つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換変異を、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｙｓ７０５、Ａｒｇ７１３及び／又はＡｒｇ７４３と位置的に同等な１つ又は複数の位置において含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
9. １つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換変異を、ＲＢ６９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｙｓ７９０、Ｌｙｓ８００、Ａｒｇ８０６、Ｌｙｓ８４４、Ｌｙｓ８７４及び／又はＬｙｓ８７８と位置的に同等な１つ又は複数の位置において含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
10. １つ又は複数の置換変異が、置換されるアミノ酸を、
    （ｉ）酸性アミノ酸；
    （ｉｉ）芳香族アミノ酸；及び
    （ｉｉｉ）非極性アミノ酸
    からなる群から選択されるアミノ酸に変換する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
11. １つ又は複数の置換変異が、置換されるアミノ酸をアラニンに変換する、請求項１０に記載のポリメラーゼ。
12. ９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｙｓ７０５Ａｌａ及び／又はＡｒｇ７１３Ａｌａ及び／又はＡｒｇ７４３Ａｌａと位置的に同等な１つ又は複数の置換変異を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
13. 配列番号１、３、５のいずれか１つであるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリメラーゼ。
14. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリメラーゼをコードする核酸分子。
15. 変異させた９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼをコードする、請求項１４に記載の核酸分子であって、配列番号２、４又は６のヌクレオチド配列を含む核酸分子。
16. 配列番号１９のヌクレオチド配列を含む核酸分子。
17. 請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
18. 請求項１７に記載のベクターを含有する宿主細胞。
19. ヌクレオチドをポリヌクレオチド内に取り込むための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリメラーゼの使用。
20. 取り込みがクラスターアレイ上で起きる、請求項１９に記載の使用。
21. ヌクレオチドをＤＮＡ内に取り込む方法であって、以下の成分：
    （ｉ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリメラーゼと
    （ｉｉ）ＤＮＡ鋳型と
    （ｉｉｉ）ヌクレオチド溶液と
    を相互作用させることを含む方法。
22. ヌクレオチド取り込み反応を行う場合に使用するキットであって、
    請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリメラーゼと、ヌクレオチド溶液とを含むキット。
23. ヌクレオチド溶液が、標識化ヌクレオチドを含む、請求項２２に記載のキット。
24. 置換基が天然の３’ヒドロキシル基より大きくなるように、ヌクレオチドが３’糖ヒドロキシル基において修飾されている、請求項２３に記載のキット。