JP2023522234A - 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ変異体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸をポリヌクレオチドに組み込む際に向上した効率を示す、様々な種由来の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体、および任意の所定の配列のポリヌクレオチドを合成する際のそのようなＴｄＴの使用に関する。【選択図】図１
Description
所定の配列の合成ポリヌクレオチドは、分子診断、ゲノムおよび診断配列決定、核酸増幅、治療抗体開発、合成生物学、核酸ベースの治療、ＤＮＡ折り紙、ＤＮＡベースのデータストレージなどを含む多くの技術の中心である。近年、テンプレートフリーポリメラーゼ（例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）など）を使用する酵素ベースの方法、例えば、Ｙｂｅｒｔら、国際特許公開第ＷＯ２０１５／１５９０２３号；Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｕ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔ ５７６３５９４；Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７：１８２１－１８３２（２０１８）；などが、そのような酵素の証明された効率および穏やかな非毒性反応条件の利益のため、化学ベースの合成方法を補足すること、またはそれと置き換えることにおいて関心を集めている。酵素ベースの合成におけるほとんどの手法は、ポリヌクレオチド産物中の所望の配列を得るために、可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸の使用を必要とする。しかしながら、残念なことに、天然のＴｄＴは、非修飾ヌクレオシド三リン酸と比較して、そのような修飾ヌクレオシド三リン酸を組み込みの効率が大幅に低下する。
上記を考慮して、より高い効率で可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸を組み込むことができる変異体ＴｄＴなどの新しいテンプレートフリーポリメラーゼが利用可能であれば、テンプレートフリーの酵素ベースのポリヌクレオチド合成の分野は進歩すると思われる。
本発明は、可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸をポリヌクレオチドに組み込む際に向上した効率を示す、様々な種由来の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体、および任意の所定の配列のポリヌクレオチドを合成する際のそれらの使用に関する。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４または４７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％同一のアミノ酸配列を含む末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体に関し、ここで、
配列番号２については、６１位のロイシンが置換され、１７０位のシステインが置換され、２０４位のアルギニンが置換され、３２６位のアルギニンが置換され、かつ３２９位のグリシンが置換されており；
配列番号５については、４８位のロイシンが置換され、１５８位のシステインが置換され、１９２位のアルギニンが置換され、３１４位のアルギニンが置換され、かつ３１７位のグリシンが置換されており；
配列番号８については、６１位のロイシンが置換され、１７１位のチロシンが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２７位のアルギニンが置換され、かつ３２９位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号１１については、６１位のロイシンが置換され、１７１位のチロシンが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２４位のアルギニンが置換され、かつ３２７位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号１４については、６１位のグリシンが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２７位のアルギニンが置換され、かつ３３０位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号１７については、６１位のアルギニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、１５８位のアラニンが置換され、１９２位のアルギニンが置換され、３１１位のアルギニンが置換され、かつ３１４位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号２０については、６１位のアルギニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、１７１位のプロリンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、２０５位のアルギニンが置換され、３２１位のスレオニンが置換され、かつ３２４位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号２３については、６１位のアルギニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、１７１位のアラニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、２０５位のアルギニンが置換され、３２２位のアラニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、かつ３２５位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号２６については、６１位のアルギニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、１７１位のアラニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、２０５位のアルギニンが置換され、３２２位のアルギニンが置換され、かつ３２５位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号２９については、４８位のメチオニンが置換され、１５８位のシステインが置換され、１９２位のアルギニンが置換され、３１０位のアルギニンが置換され、かつ３１３位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号３２については、６１位のメチオニンが置換され、１７１位のシステインが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２３位のアルギニンが置換され、かつ３２６位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号３５については、６１位のメチオニンが置換され、１７１位のシステインが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２３位のアルギニンが置換され、かつ３２６位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号３８については、６１位のメチオニンが置換され、１７１位のシステインが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２３位のアルギニンが置換され、かつ３２６位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号４１については、６１位のメチオニンが置換され、１７１位のシステインが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２３位のアルギニンが置換され、かつ３２６位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号４４については、４８位のメチオニンが置換され、１５８位のシステインが置換され、１９２位のアルギニンが置換され、３０９位のアルギニンが置換され、かつ３１２位のグルタミン酸が置換されており；ならびに
配列番号４７については、６１位のメチオニンが置換され、１７１位のシステインが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２３位のアルギニンが置換され、かつ３２６位のグルタミン酸が置換されており；
ここで、ＴｄＴ変異体は、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、かつ（ｉｉ）核酸断片の遊離３’－ヒドロキシルに３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを組み込むことができる。
配列番号２については、６１位のロイシンが置換され、１７０位のシステインが置換され、２０４位のアルギニンが置換され、３２６位のアルギニンが置換され、かつ３２９位のグリシンが置換されており；
配列番号５については、４８位のロイシンが置換され、１５８位のシステインが置換され、１９２位のアルギニンが置換され、３１４位のアルギニンが置換され、かつ３１７位のグリシンが置換されており；
配列番号８については、６１位のロイシンが置換され、１７１位のチロシンが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２７位のアルギニンが置換され、かつ３２９位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号１１については、６１位のロイシンが置換され、１７１位のチロシンが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２４位のアルギニンが置換され、かつ３２７位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号１４については、６１位のグリシンが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２７位のアルギニンが置換され、かつ３３０位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号１７については、６１位のアルギニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、１５８位のアラニンが置換され、１９２位のアルギニンが置換され、３１１位のアルギニンが置換され、かつ３１４位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号２０については、６１位のアルギニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、１７１位のプロリンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、２０５位のアルギニンが置換され、３２１位のスレオニンが置換され、かつ３２４位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号２３については、６１位のアルギニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、１７１位のアラニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、２０５位のアルギニンが置換され、３２２位のアラニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、かつ３２５位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号２６については、６１位のアルギニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、１７１位のアラニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、２０５位のアルギニンが置換され、３２２位のアルギニンが置換され、かつ３２５位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号２９については、４８位のメチオニンが置換され、１５８位のシステインが置換され、１９２位のアルギニンが置換され、３１０位のアルギニンが置換され、かつ３１３位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号３２については、６１位のメチオニンが置換され、１７１位のシステインが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２３位のアルギニンが置換され、かつ３２６位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号３５については、６１位のメチオニンが置換され、１７１位のシステインが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２３位のアルギニンが置換され、かつ３２６位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号３８については、６１位のメチオニンが置換され、１７１位のシステインが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２３位のアルギニンが置換され、かつ３２６位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号４１については、６１位のメチオニンが置換され、１７１位のシステインが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２３位のアルギニンが置換され、かつ３２６位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号４４については、４８位のメチオニンが置換され、１５８位のシステインが置換され、１９２位のアルギニンが置換され、３０９位のアルギニンが置換され、かつ３１２位のグルタミン酸が置換されており；ならびに
配列番号４７については、６１位のメチオニンが置換され、１７１位のシステインが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２３位のアルギニンが置換され、かつ３２６位のグルタミン酸が置換されており；
ここで、ＴｄＴ変異体は、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、かつ（ｉｉ）核酸断片の遊離３’－ヒドロキシルに３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、配列番号２、８もしくは１１の６１位または配列番号５の４８位のロイシンに対する上記置換は、ＲまたはＱからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、配列番号２の１７０位または配列番号５、２９もしくは４４の１５８位または配列番号３２、３５、３８、４１もしくは４７の１７１位のシステインに対する上記置換は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、ＱまたはＤからなる群から選択され、他の実施形態では、前述の位置のシステインに対する置換はＧまたはＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、配列番号８もしくは１１の１７１位のチロシンに対する上記置換は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、ＱまたはＤからなる群から選択され、他の実施形態では、前述の位置のチロシンに対する置換はＧまたはＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、配列番号１７の１５８位または配列番号２３もしくは２６の１７１位のアラニンに対する上記置換は、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、ＱまたはＤからなる群から選択され、他の実施形態では、前述の位置のアラニンに対する置換はＧまたはＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、配列番号２０の１７１位のプロリンに対する上記置換は、Ｇ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、ＱまたはＤからなる群から選択され、他の実施形態では、前述の位置のチロシンに対する置換はＧまたはＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、配列番号２の２０４位または配列番号５、１７、２９もしくは４４の１９２位または配列番号８、１１、１４、２０、２３、２６、３２、３５、３８、４１もしくは４７の２０５位のアルギニンに対する上記置換は、ＬまたはＮからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、配列番号２の３２６位または配列番号５の３１４位または配列番号８もしくは１４の３２７位または配列番号１１の３２４位または配列番号１７の３１１位または配列番号２０の３２１位または配列番号２３もしくは２６の３２２位または配列番号２９の３１０位または配列番号３２、３５、３８、４１もしくは４７の３２３位または配列番号４４の３０９位のアルギニンに対する上記置換は、Ｐ、ＮまたはＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、配列番号２０の３２１位のスレオニンに対する上記置換は、Ｐ、ＮまたはＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、配列番号２もしくは５の３２９位のグリシンに対する上記置換は、Ｎ、Ｌ、ＴまたはＳからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、配列番号８もしくは１４の３３０位または配列番号１１の３２７位または配列番号１７の３１１位または配列番号２０の３２４位または配列番号２３もしくは２６の３２５位または配列番号２９の３１３位または配列番号３２、３５、３８、４１もしくは４７の３２６位または配列番号４４の３１２位のグルタミン酸に対する上記置換は、Ｎ、Ｌ、ＴまたはＳからなる群から選択される。
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４または４７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％同一のアミノ酸配列を含む末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体に関し、上記置換およびさらなる置換は以下の通りである：
配列番号２については、３２７位のグルタミンが置換されており；
配列番号５については、３１５位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号８については、３２８位のグルタミンが置換されており；
配列番号１１については、３２５位のグルタミンが置換されており；
配列番号１４については、３２８位のグルタミンが置換されており；
配列番号１７については、３１２位のグルタミンが置換されており；
配列番号２０については、３２２位のグルタミンが置換されており；
配列番号２３については、３２３位のグルタミンが置換されており；
配列番号２６については、３２３位のメチオニンが置換されており；
配列番号２９については、３１１位のグルタミンが置換されており；
配列番号３２については、３２４位のグルタミンが置換されており；
配列番号３５については、３２４位のグルタミンが置換されており；
配列番号３８については、３２４位のグルタミンが置換されており；
配列番号４１については、３２４位のグルタミンが置換されており；
配列番号４４については、３１０位のグルタミンが置換されており；かつ
配列番号４７については、３２４位のグルタミンが置換されており；
ここで、ＴｄＴ変異体は、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、かつ（ｉｉ）核酸断片の遊離３’－ヒドロキシルに３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを組み込むことができる。いくつかの実施形態では、グルタミンおよびグルタミン酸の前述の置換は、Ｔ、Ｆ、ＬまたはＭである。
配列番号２については、３２７位のグルタミンが置換されており；
配列番号５については、３１５位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号８については、３２８位のグルタミンが置換されており；
配列番号１１については、３２５位のグルタミンが置換されており；
配列番号１４については、３２８位のグルタミンが置換されており；
配列番号１７については、３１２位のグルタミンが置換されており；
配列番号２０については、３２２位のグルタミンが置換されており；
配列番号２３については、３２３位のグルタミンが置換されており；
配列番号２６については、３２３位のメチオニンが置換されており；
配列番号２９については、３１１位のグルタミンが置換されており；
配列番号３２については、３２４位のグルタミンが置換されており；
配列番号３５については、３２４位のグルタミンが置換されており；
配列番号３８については、３２４位のグルタミンが置換されており；
配列番号４１については、３２４位のグルタミンが置換されており；
配列番号４４については、３１０位のグルタミンが置換されており；かつ
配列番号４７については、３２４位のグルタミンが置換されており；
ここで、ＴｄＴ変異体は、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、かつ（ｉｉ）核酸断片の遊離３’－ヒドロキシルに３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを組み込むことができる。いくつかの実施形態では、グルタミンおよびグルタミン酸の前述の置換は、Ｔ、Ｆ、ＬまたはＭである。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５または４８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体に関し、ここで、
配列番号３については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２７はＡであり、かつアミノ酸位３３０はＮであり；
配列番号６については、アミノ酸位４８はＲであり、アミノ酸位１５８はＲであり、アミノ酸位１９２はＬであり、アミノ酸位３１４はＰであり、かつアミノ酸位３１７はＮであり；
配列番号９については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２７はＡであり、かつアミノ酸位３３０はＮであり；
配列番号１２については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＡであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２４はＰであり、かつアミノ酸位３２７はＮであり；
配列番号１５については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２８はＰであり、かつアミノ酸位３３１はＮであり；
配列番号１８については、アミノ酸位４８はＲであり、アミノ酸位１５８はＲであり、アミノ酸位１９２はＬであり、アミノ酸位３１１はＰであり、かつアミノ酸位３１４はＮであり；
配列番号２１については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＰであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２１はＡであり、かつアミノ酸位３２４はＮであり；
配列番号２４については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＡであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２２はＡであり、かつアミノ酸位３２５はＮであり；
配列番号２７については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２７はＡであり、かつアミノ酸位３３０はＮであり；
配列番号３０については、アミノ酸位４８はＲであり、アミノ酸位１５８はＲであり、アミノ酸位１９２はＬであり、アミノ酸位３１０はＰであり、かつアミノ酸位３１３はＮであり；
配列番号３３については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２３はＰであり、かつアミノ酸位３２６はＮであり；
配列番号３６については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２３はＡであり、かつアミノ酸位３２６はＮであり；
配列番号３９については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２３はＰであり、かつアミノ酸位３２６はＮであり；
配列番号４２については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２３はＡであり、かつアミノ酸位３２６はＮであり；
配列番号４５については、アミノ酸位４８はＲであり、アミノ酸位１５８はＲであり、アミノ酸位１９２はＬであり、アミノ酸位３１０はＡであり、かつアミノ酸位３１３はＮであり；
配列番号４８については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２３はＰであり、かつアミノ酸位３２６はＮであり；
ここで、ＴｄＴ変異体は、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、かつ（ｉｉ）核酸断片の遊離３’－ヒドロキシルに３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、前述のＴｄＴ変異体において、配列番号３については、アミノ酸位３２８はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号６については、アミノ酸位３１５はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号９については、アミノ酸位３２８はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号１２については、アミノ酸位３２５はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号１５については、アミノ酸位３２９はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号１８については、アミノ酸位３１２はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号２１については、アミノ酸位３２２はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号２４については、アミノ酸位３２３はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号２７については、アミノ酸位３２８はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号３０については、アミノ酸位３１１はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号３３については、アミノ酸位３２４はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号３６については、アミノ酸位３２４はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号３９については、アミノ酸位３２４はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号４２については、アミノ酸位３２４はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号４５については、アミノ酸位３１１はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；かつ
配列番号４８については、アミノ酸位３２４はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択される。
配列番号３については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２７はＡであり、かつアミノ酸位３３０はＮであり；
配列番号６については、アミノ酸位４８はＲであり、アミノ酸位１５８はＲであり、アミノ酸位１９２はＬであり、アミノ酸位３１４はＰであり、かつアミノ酸位３１７はＮであり；
配列番号９については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２７はＡであり、かつアミノ酸位３３０はＮであり；
配列番号１２については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＡであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２４はＰであり、かつアミノ酸位３２７はＮであり；
配列番号１５については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２８はＰであり、かつアミノ酸位３３１はＮであり；
配列番号１８については、アミノ酸位４８はＲであり、アミノ酸位１５８はＲであり、アミノ酸位１９２はＬであり、アミノ酸位３１１はＰであり、かつアミノ酸位３１４はＮであり；
配列番号２１については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＰであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２１はＡであり、かつアミノ酸位３２４はＮであり；
配列番号２４については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＡであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２２はＡであり、かつアミノ酸位３２５はＮであり；
配列番号２７については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２７はＡであり、かつアミノ酸位３３０はＮであり；
配列番号３０については、アミノ酸位４８はＲであり、アミノ酸位１５８はＲであり、アミノ酸位１９２はＬであり、アミノ酸位３１０はＰであり、かつアミノ酸位３１３はＮであり；
配列番号３３については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２３はＰであり、かつアミノ酸位３２６はＮであり；
配列番号３６については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２３はＡであり、かつアミノ酸位３２６はＮであり；
配列番号３９については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２３はＰであり、かつアミノ酸位３２６はＮであり；
配列番号４２については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２３はＡであり、かつアミノ酸位３２６はＮであり；
配列番号４５については、アミノ酸位４８はＲであり、アミノ酸位１５８はＲであり、アミノ酸位１９２はＬであり、アミノ酸位３１０はＡであり、かつアミノ酸位３１３はＮであり；
配列番号４８については、アミノ酸位６１はＲであり、アミノ酸位１７１はＲであり、アミノ酸位２０５はＬであり、アミノ酸位３２３はＰであり、かつアミノ酸位３２６はＮであり；
ここで、ＴｄＴ変異体は、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、かつ（ｉｉ）核酸断片の遊離３’－ヒドロキシルに３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、前述のＴｄＴ変異体において、配列番号３については、アミノ酸位３２８はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号６については、アミノ酸位３１５はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号９については、アミノ酸位３２８はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号１２については、アミノ酸位３２５はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号１５については、アミノ酸位３２９はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号１８については、アミノ酸位３１２はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号２１については、アミノ酸位３２２はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号２４については、アミノ酸位３２３はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号２７については、アミノ酸位３２８はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号３０については、アミノ酸位３１１はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号３３については、アミノ酸位３２４はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号３６については、アミノ酸位３２４はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号３９については、アミノ酸位３２４はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号４２については、アミノ酸位３２４はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号４５については、アミノ酸位３１１はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；かつ
配列番号４８については、アミノ酸位３２４はＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５または４８から選択されるアミノ酸配列を含む末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体に関する。
いくつかの実施形態では、前述のＴｄＴ変異体のそれぞれに対する同一性パーセント値は、示されている配列番号と少なくとも８０％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、示された配列番号と少なくとも９０％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、示された配列番号と少なくとも９５％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９７％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９８％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９９％の同一性である。本明細書で使用される場合、参照配列を変異体配列と比較するために使用される同一性パーセント値は、変異体配列の置換を含む明示的に指定されたアミノ酸位置を含まない。すなわち、パーセント同一性関係は、参照タンパク質の配列と、変異体中の置換を含む明示的に指定された位置の外側の変異体タンパク質の配列との間である。したがって、例えば、参照配列および変異体配列がそれぞれ１００個のアミノ酸を含み、変異体配列が２５位および８１位に突然変異を有する場合、パーセント相同性は配列１～２４、２６～８０および８２～１００に関するものとなる。上記（ｉｉ）に関して、いくつかの実施形態では、そのような３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドは、３’－Ｏ－ＮＨ２－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アリル－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－ニトロ－ヌクレオシド三リン酸または３’－Ｏ－プロパルギル－ヌクレオシド三リン酸を含み得る。他の実施形態では、そのような３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドは、３’－Ｏ－ＮＨ２－ヌクレオシド三リン酸または３’－Ｏ－アジドメチル－ヌクレオシド三リン酸を含み得る。
本発明はさらに、核酸断片に１または複数の３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを連続的に付加することによってテンプレートなしで核酸分子を合成するための、本発明のＴｄＴ変異体の使用に関する。いくつかの実施形態では、そのような方法は、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するオリゴヌクレオチドを含むイニシエーターを提供する工程；（ｂ）酵素的延長条件下で、３’－Ｏ－可逆的ブロックヌクレオシド三リン酸の存在下で、本発明のＴｄＴ変異体をイニシエーターまたは延長されたイニシエーターと反応させる工程、を含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、（ｃ）延長されたイニシエーターを脱ブロックして、遊離３’－ヒドロキシルを有する延長されたイニシエーターを形成する工程、および（ｄ）所定の配列の核酸分子が合成されるまで工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返す工程、をさらに含む。
さらなる実施形態では、本発明は、上記の変異体ＴｄＴｓをコードする核酸分子、そのような核酸分子を含む発現ベクター、および前述の核酸分子または前述の発現ベクターを含む宿主細胞を含む。なおさらなる実施形態では、本発明は、本発明の変異体ＴｄＴを産生する方法であって、宿主細胞が、前記変異体ＴｄＴをコードする核酸の発現を可能にする培養条件下で培養され、変異体ＴｄＴが任意選択的に回収される方法を含む。本発明はまた、任意の所定の配列のテンプレートフリーポリヌクレオチド伸長を行うためのキットであって、本発明のＴｄＴ変異体を含むキットを含む。そのようなキットは、ＤＮＡ伸長のためのＡ、Ｃ、ＧおよびＴのための３’－Ｏ－ブロックデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、またはＲＮＡ伸長のためのｒＡ、ｒＣ、ｒＧおよびＵのための３’－Ｏ－ブロックリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）をさらに含み得る。
本発明は、野生型ＴｄＴまたは以前に利用可能であったＴｄＴ変異体よりも高い効率またはより高い割合で３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを組み込む能力を有する新しいＴｄＴ変異体を提供することによって、３’－Ｏ－修飾ヌクレオシド三リン酸の効率的な組み込みに関連する、テンプレートフリー酵素的核酸合成の分野における問題を有利に克服する。いくつかの実施形態では、本発明はまた、野生型ＴｄＴと比較して安定性が増加した新規なＴｄＴ変異体を提供することによって、上記分野の問題を有利に克服する。
本発明は、様々な変更および代替形態を受け入れることができるが、その詳細は、例として図面に示されており、詳細に説明される。本発明を記載された特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解されたい。本発明の精神および範囲内にあるすべての変更、等価物、および代替形態を網羅することが意図されている。本発明の態様の指針は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを含む、当業者に周知の多くの利用可能な参考文献および論文に見い出される。
本発明は、テンプレート鎖を使用せずに所定の配列のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを合成するために使用することができるＴｄＴポリメラーゼの変異体を提供する。本発明のＴｄＴ変異体は、修飾ヌクレオチド、より具体的には３’Ｏ－可逆的ブロックヌクレオシド三リン酸を、ポリヌクレオチド合成の酵素ベースの方法で使用可能にする。本発明の変異体は、特定の残基におけるそれらの突然変異または置換に従って記載され、その位置は特定の配列番号について指定される。
本発明のＴｄＴ変異体は、それらのＢＲＣＴ様Ｎ末端アミノ酸配列を有さない天然ＴｄＴに由来する。そのような切断型配列は、本明細書では「切断型野生型」ＴｄＴと呼ばれることがある。より具体的には、本発明のＴｄＴ変異体は、以下の天然ＴｄＴに由来する。
表１
表１
いくつかの実施形態では、ＴｄＴ変異体は、共有結合または非共有結合；アミノ酸タグ（例えば、ポリ－アミノ酸タグ、ポリ－Ｈｉｓタグ、６Ｈｉｓタグ）；化合物（例えば、ポリエチレングリコール）；タンパク質－タンパク質結合ペア（例えば、ビオチン－アビジン）；アフィニティーカップリング；捕捉プローブ；またはこれらの任意の組み合わせを含むリンカー部分に動作可能に連結され得る。リンカー部分は、ＴｄＴ変異体とは別個であってもよく、ＴｄＴ変異体の一部であってもよい（例えば、以下の配列番号のペアによって例示される組換えＨｉｓタグ化ポリメラーゼ：（３、４）、（６、７）、（９、１０）、（１２、１３）、（１５、１６）、（１８、１９）、（２１、２２）、（２４、２５）、（２７、２８）、（３０、３１）、（３３、３４）、（３６、３７）、（３９、４０）、（４２、４３）、（４５、４６）および（４８、４９））。典型的には、リンカー部分は、ＴｄＴ変異体のヌクレオチド結合活性または触媒活性に干渉しない。
上記の実施形態のいくつかでは、３’Ｏ－修飾ヌクレオシド三リン酸を組み込む際の変異体ＴｄＴの効率は、以前に利用可能であったＴｄＴ野生型または変異体の効率の少なくとも１０５％であり、他の実施形態では、３’Ｏ修飾ヌクレオシド三リン酸を組み込む際の変異体ＴｄＴの効率は、以前に利用可能であったＴｄＴ野生型または変異体の効率の少なくとも１１０％であり、他の実施形態では、３’Ｏ修飾ヌクレオシド三リン酸を組み込む際の変異体ＴｄＴの効率は、以前に利用可能であったＴｄＴ野生型または変異体の効率の少なくとも１５０％である。
上記の本発明のＴｄＴ変異体はそれぞれ、示された置換の存在を条件として、特定の配列番号と配列同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、この様式で記載される本発明のＴｄＴ変異体と指定された配列番号との間の配列相違の数およびタイプは、置換、欠失および／または挿入によるものであり得、置換、欠失および／または挿入されたアミノ酸は、任意のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような欠失、置換および／または挿入は、天然に存在するアミノ酸のみを含む。いくつかの実施形態では、置換は、Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８５：８６２－８６４（１９７４）に記載されているような、保存的または同義のアミノ酸変化のみを含む。すなわち、アミノ酸の置換は、その同義アミノ酸のセットのメンバーの間でのみ起こり得る。いくつかの実施形態において、使用され得る同義アミノ酸のセットを表２Ａに示す。
表２Ａ：アミノ酸の同義セットＩ
表２Ａ：アミノ酸の同義セットＩ
いくつかの実施形態において、使用され得る同義アミノ酸のセットを表２Ｂに示す。
表２Ｂ：アミノ酸の同義セットＩＩ
表２Ｂ：アミノ酸の同義セットＩＩ
ヌクレオチド組み込み活性の測定
本発明の変異体によるヌクレオチド組み込みの効率は、例えばＢｏｕｌｅら（以下に引用）；Ｂｅｎｔｏｌｉｌａら（以下に引用）；およびＨｉａｔｔらの米国特許第５８０８０４５号（後者は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）または伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）アッセイによって測定することができる。簡潔には、そのようなアッセイの一形態では、遊離３’－ヒドロキシルを有する蛍光標識オリゴヌクレオチドを、可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸の存在下で、ＴｄＴ延長条件下で被験変異体ＴｄＴと所定の期間反応させ、その後、延長反応を停止させ、ゲル電気泳動による分離後に延長産物および非延長イニシエーターオリゴヌクレオチドの量を定量する。そのようなアッセイにより、変異体ＴｄＴの組み込み効率は、他の変異体の効率または野生型もしくは参照ＴｄＴもしくは他のポリメラーゼの効率と容易に比較することができる。いくつかの実施形態では、変異体ＴｄＴの効率の尺度は、同等のアッセイで野生型ＴｄＴを使用した延長産物の量に対する変異体ＴｄＴを使用した延長産物の量の割合（パーセンテージとして示される）であり得る。
本発明の変異体によるヌクレオチド組み込みの効率は、例えばＢｏｕｌｅら（以下に引用）；Ｂｅｎｔｏｌｉｌａら（以下に引用）；およびＨｉａｔｔらの米国特許第５８０８０４５号（後者は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）または伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）アッセイによって測定することができる。簡潔には、そのようなアッセイの一形態では、遊離３’－ヒドロキシルを有する蛍光標識オリゴヌクレオチドを、可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸の存在下で、ＴｄＴ延長条件下で被験変異体ＴｄＴと所定の期間反応させ、その後、延長反応を停止させ、ゲル電気泳動による分離後に延長産物および非延長イニシエーターオリゴヌクレオチドの量を定量する。そのようなアッセイにより、変異体ＴｄＴの組み込み効率は、他の変異体の効率または野生型もしくは参照ＴｄＴもしくは他のポリメラーゼの効率と容易に比較することができる。いくつかの実施形態では、変異体ＴｄＴの効率の尺度は、同等のアッセイで野生型ＴｄＴを使用した延長産物の量に対する変異体ＴｄＴを使用した延長産物の量の割合（パーセンテージとして示される）であり得る。
いくつかの実施形態では、以下の特定の延長アッセイを使用して、ＴｄＴの組み込み効率を測定することができる：使用されるプライマーは以下の通りである：
５’－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧ－３’（配列番号５０）
プライマーはまた、５’末端にＡＴＴＯ蛍光色素を有する。使用される代表的な修飾されたヌクレオチド（表３においてｄＮＴＰとして示される）としては、３’－Ｏ－アミノ－２’，３’－ジデオキシヌクレオチド－５’－三リン酸（ＯＮＨ２、Ｆｉｒｅｂｉｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、例えば３’－Ｏ－アミノ－２’，３’－ジデオキシアデノシン－５’－三リン酸が挙げられる。異なる被験変異体ごとに、一本のチューブを反応に使用する。試薬を、水から出発し、次いで表３の順序で、チューブに添加する。３７℃で３０分後、ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）の添加によって反応を停止させる。
表３：延長活性アッセイの試薬
活性バッファーは、例えば、ＣｏＣｌ２が補充されたＴｄＴ反応バッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能）を含む。
５’－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧ－３’（配列番号５０）
プライマーはまた、５’末端にＡＴＴＯ蛍光色素を有する。使用される代表的な修飾されたヌクレオチド（表３においてｄＮＴＰとして示される）としては、３’－Ｏ－アミノ－２’，３’－ジデオキシヌクレオチド－５’－三リン酸（ＯＮＨ２、Ｆｉｒｅｂｉｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、例えば３’－Ｏ－アミノ－２’，３’－ジデオキシアデノシン－５’－三リン酸が挙げられる。異なる被験変異体ごとに、一本のチューブを反応に使用する。試薬を、水から出発し、次いで表３の順序で、チューブに添加する。３７℃で３０分後、ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）の添加によって反応を停止させる。
表３：延長活性アッセイの試薬
アッセイの産物を従来のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析する。例えば、上記アッセイの産物は、１６％ポリアクリルアミド変性ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において分析することができる。ゲルは、ポリアクリルアミドをガラスプレートの内側に注ぎ、それを重合させることによって分析の直前に作製される。ガラスプレート内のゲルは、電気泳動工程のためにＴＢＥバッファー（Ｓｉｇｍａ）が充填された適合タンクに取り付けられる。分析される試料は、ゲルの上部に装填される。室温で３～６時間、ゲルの上部と底部との間に５００～２，０００Ｖの電圧を印加する。分離後、ゲル蛍光を、例えばＴｙｐｈｏｏｎスキャナー（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてスキャンする。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）またはその等価物を使用してゲル画像を分析して、修飾ヌクレオチドの組み込みのパーセンテージを計算する。
ヘアピン完了アッセイ。一態様では、本発明は、ポリヌクレオチド（すなわち、「試験ポリヌクレオチド」）の３’末端にｄＮＴＰを組み込むポリメラーゼ、例えばＴｄＴ変異体の能力を測定する方法を含む。そのような方法の１つは、遊離３’ヒドロキシルを有する試験ポリヌクレオチドを、それが実質的に一本鎖のみであるが、ＴｄＴ変異体などのポリメラーゼによる延長時に、一本鎖ループおよび二本鎖ステムを含む安定なヘアピン構造を形成し、それにより、二本鎖ポリヌクレオチドの存在による３’末端の延長の検出を可能にする反応条件下で提供することを含む。二本鎖構造は、限定するものではないが、二本鎖構造へのインタカレーション時に優先的に蛍光を発する蛍光色素、延長されたポリヌクレオチド上のアクセプター（またはドナー）と、新たに形成されたヘアピンステムと三重鎖を形成するオリゴヌクレオチド上のドナー（またはアクセプター）との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、試験ポリヌクレオチドに両方とも結合し、ヘアピンの形成時にＦＲＥＴ近接するＦＲＥＴアクセプターおよびドナーなどを含む様々な方法で検出することができる。いくつかの実施形態では、単一ヌクレオチドによる延長後の試験ポリヌクレオチドのステム部分は、４～６塩基対長の範囲にあり、他の実施形態では、そのようなステム部分は、４～５塩基対長であり；さらに他の実施形態では、そのようなステム部分は４塩基対長である。いくつかの実施形態では、試験ポリヌクレオチドは１０～２０ヌクレオチドの範囲の長さを有し、他の実施形態では、試験ポリヌクレオチドは１２～１５ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、延長を伴わないステムと延長を伴うステムとの間の融解温度の差を最大にするヌクレオチドを用いて試験ポリヌクレオチドを延長させることが有利または好都合である。したがって、いくつかの実施形態では、試験ポリヌクレオチドはｄＣまたはｄＧで伸長される（したがって、試験ポリヌクレオチドはステム形成のための適切な相補的ヌクレオチドを有するように選択される）。
ヘアピン完了アッセイのための例示的な試験ポリヌクレオチドには、ｄＧＴＰで延長することによって完了するｐ８７５（５’－ＣＡＧＴＴＡＡＡＡＡＣＴ）（配列番号５１）；ｄＣＴＰで延長することによって完了するｐ８７６（５’－ＧＡＧＴＴＡＡＡＡＣＴ）（配列番号５２）；およびｄＧＴＰを用いて延長することによって完了するｐ８７７（５’－ＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴ）（配列番号５３）が含まれる。そのような試験ポリヌクレオチドについての例示的な反応条件は：２．５～５μＭの試験ポリヌクレオチド、１：４０００希釈のＧｅｌＲｅｄ（登録商標）（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ製のインタカレート色素）、２００ｍＭのカコジル酸ＫＯＨ ｐＨ ６．８、１ｍＭのＣｏＣｌ２、０～２０％のＤＭＳＯならびに所望の濃度の３’ＯＮＨ２ ｄＧＴＰおよびＴｄＴを含み得る。ヘアピンの完了は、３６０ｎｍに設定された励起フィルターおよび６３５ｎｍに設定された吸収フィルター（ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ）を使用して、２８～３８℃の反応温度でＴＥＣＡＮリーダーなどの従来の蛍光計を使用して、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）色素の蛍光の増加によってモニターすることができる。本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、ＴｄＴ変異体は、以下の工程によって、ヌクレオシド三リン酸のテンプレートフリー組み込みに対するそれらの能力について試験され得る：（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有する試験ポリヌクレオチド、ＴｄＴ変異体およびヌクレオシド三リン酸を、試験ポリヌクレオチドが一本鎖であるがヌクレオシド三リン酸の組み込み時に二本鎖ステム領域を有するヘアピンを形成する条件下で組み合わせる工程、ならびに（ｂ）ＴｄＴ変異体がヌクレオシド三リン酸を組み込む能力の尺度として形成された二本鎖ステム領域の量を検出する工程。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド三リン酸は、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸である。
オリゴヌクレオチドのテンプレートフリー酵素的合成
一般に、テンプレートフリー（または同等に、「テンプレート非依存」）酵素的ＤＮＡ合成の方法は、図１に示されているような、所定のヌクレオチドが各サイクルにおいてイニシエーターまたは成長鎖にカップリングされる工程の反復サイクルを含む。テンプレートフリー酵素的合成の一般的な要素は、以下の参考文献に記載されている：Ｙｂｅｒｔら、国際特許公開ＷＯ／２０１５／１５９０２３号パンフレット；Ｙｂｅｒｔら、国際特許公開ＷＯ／２０１７／２１６４７２号パンフレット；Ｈｙｍａｎ、米国特許第５４３６１４３号明細書；Ｈｉａｔｔら、米国特許第５７６３５９４号明細書；ｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７：１８２１－１８３２（２０１８）；Ｍａｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＤＯＩ：０．１０３９／ｃ６ｏｂ０１３７１ｆ（２０１６）；Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔ．，１（１１）：１７２９－１７３１（１９９９）。
一般に、テンプレートフリー（または同等に、「テンプレート非依存」）酵素的ＤＮＡ合成の方法は、図１に示されているような、所定のヌクレオチドが各サイクルにおいてイニシエーターまたは成長鎖にカップリングされる工程の反復サイクルを含む。テンプレートフリー酵素的合成の一般的な要素は、以下の参考文献に記載されている：Ｙｂｅｒｔら、国際特許公開ＷＯ／２０１５／１５９０２３号パンフレット；Ｙｂｅｒｔら、国際特許公開ＷＯ／２０１７／２１６４７２号パンフレット；Ｈｙｍａｎ、米国特許第５４３６１４３号明細書；Ｈｉａｔｔら、米国特許第５７６３５９４号明細書；ｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７：１８２１－１８３２（２０１８）；Ｍａｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＤＯＩ：０．１０３９／ｃ６ｏｂ０１３７１ｆ（２０１６）；Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔ．，１（１１）：１７２９－１７３１（１９９９）。
イニシエーターポリヌクレオチド（１００）は、例えば、遊離３’－ヒドロキシル基（１０３）を有する固体支持体（１０２）に結合して提供される。イニシエーターポリヌクレオチド（１００）（または後続のサイクルにおける伸長されたイニシエーターポリヌクレオチド）に、イニシエーターポリヌクレオチド（１００）（または伸長されたイニシエーターポリヌクレオチド）の３’末端への３’－Ｏ－保護－ｄＮＴＰの酵素的組み込みに有効な条件下で、３’－Ｏ－保護－ｄＮＴＰおよびテンプレートフリーポリメラーゼ、例えばＴｄＴまたはその変異体（例えば、Ｙｂｅｒｔら、国際公開第２０１７／２１６４７２号；Ｃｈａｍｐｉｏｎら、国際公開第２０１９／１３５００７号パンフレット）を添加する（１０４）。この反応は、３’－ヒドロキシルが保護されている伸長されたイニシエーターポリヌクレオチドを生成する（１０６）。伸長配列が完了していない場合、次いで追加の別のサイクルが実施される（１０８）。伸長されたイニシエーターポリヌクレオチドが競合配列（ｃｏｍｐｅｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む場合、その後３’－Ｏ－保護基を除去または脱保護することができ、所望の配列を元のイニシエーターポリヌクレオチドから切断することができる（１１０）。そのような切断は、様々な一本鎖切断技術のいずれかを使用して、例えば、元のイニシエーターポリヌクレオチド内の所定の位置に切断可能なヌクレオチドを挿入することによって行うことができる。例示的な切断可能なヌクレオチドは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼによって切断されるウラシルヌクレオチドであり得る。伸長されたイニシエーターポリヌクレオチドが完了した配列を含まない場合、その後３’－Ｏ－保護基を除去して遊離３’－ヒドロキシル（１０３）を露出させ、伸長されたイニシエーターポリヌクレオチドをヌクレオチド付加および脱保護の別のサイクルに供する。
本明細書で使用される場合、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３’－ヒドロキシルなどの特定の基に関して「保護された」および「ブロックされた」という用語は互換的に使用され、化学的または酵素的過程の際の基への化学的変化を防ぐ特定の基に共有結合的に結合している部分を意味することを意図している。特定の基がヌクレオシド三リン酸の３’－ヒドロキシル、または３’保護（またはブロック）ヌクレオシド三リン酸が組み込まれた延長断片（または「延長中間体」）であるときはいつでも、防止された化学変化は、酵素的カップリング反応による延長断片（または「延長中間体」）のさらなるまたはその後の伸長である。
本明細書で使用される場合、「イニシエーター」（または同等の用語、例えば、「イニシエーティング断片」、「イニシエーター核酸」、「イニシエーターオリゴヌクレオチド」など）は、通常、その末端に遊離３’－ヒドロキシルを有する、ＴｄＴなどのテンプレートフリーポリメラーゼによってさらに伸長することができる短いオリゴヌクレオチド配列を指す。一実施形態では、イニシエーティング断片はＤＮＡイニシエーティング断片である。代替的な実施形態では、イニシエーティング断片はＲＮＡイニシエーティング断片である。いくつかの実施形態では、イニシエーティング断片は、３～１００ヌクレオチド、特に３～２０ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、イニシエーティング断片は一本鎖である。代替的な実施形態では、イニシエーティング断片は二本鎖である。いくつかの実施形態では、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、その５’末端によって合成支持体に結合していてもよく、他の実施形態では、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、例えば共有結合を介して合成支持体に直接結合している相補的オリゴヌクレオチドと二重鎖を形成することによって、合成支持体に間接的に結合していてもよい。いくつかの実施形態では、合成支持体は、固体平面の固体の離散領域であり得るか、またはビーズであり得る固体支持体である。
いくつかの実施形態では、イニシエーターは、ＴｄＴが３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰを結合し得る遊離ヒドロキシルを有する非核酸化合物、例えばＢａｉｇａ、米国特許公開第２０１９／００７８０６５号および米国特許公開第２０１９／００７８１２６号を含み得る。
合成が完了した後、所望のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、切断によってイニシエーターおよび固体支持体から放出され得る。多種多様な切断可能な結合または切断可能なヌクレオチドをこの目的のために使用することができる。いくつかの実施形態では、所望のポリヌクレオチドを切断すると、切断された鎖上に天然の遊離５’－ヒドロキシルが残る。しかし、代替的な実施形態では、切断工程は、後続の工程で、例えばホスファターゼ処理によって除去され得る部分、例えば５’－リン酸を残し得る。切断工程は、化学的、熱的、酵素的または光化学的方法によって実施することができる。いくつかの実施形態では、切断可能なヌクレオチドは、特異的グリコシラーゼ（例えば、それぞれ、ウラシルデオキシグリコシラーゼとそれに続くエンドヌクレアーゼＶＩＩＩおよび８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ）によって認識されるデオキシウリジンまたは８－オキソ－デオキシグアノシンなどのヌクレオチドアナログであり得る。いくつかの実施形態では、切断は、最後から２番目の３’ヌクレオチドとしてデオキシイノシンを有するイニシエーターを提供することによって達成することができ、これは、イニシエーターの３’末端でエンドヌクレアーゼＶによって切断され、放出されたポリヌクレオチド上に５’－リン酸を残し得る。一本鎖ポリヌクレオチドを切断するためのさらなる方法は、参照により組み込まれる以下の参考文献に開示されており：米国特許第５，７３９，３８６号、同第５，７００，６４２号、同第５，８３０，６５５号；および米国特許公開第２００３／０１８６２２６号および同第２００４／０１０６７２８号；ならびにＵｒｄｅａ ａｎｄ Ｈｏｒｎの米国特許第５３６７０６６号に記載されている。
いくつかの実施形態では、グリコシラーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼによる切断は、二本鎖ＤＮＡ基質を必要とし得る。
図１に戻ると、いくつかの実施形態では、各合成ステップにおいて、３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰの存在下で、ＴｄＴなどのテンプレートフリーポリメラーゼを使用して、ヌクレオチドの要求された配列がイニシエーター核酸にカップリングされる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドを合成する方法は、（ａ）遊離３’－ヒドロキシル（１０３）を有するイニシエーター（例えば、（１００））を提供する工程；（ｂ）延長条件下で、イニシエーターまたは遊離３’－ヒドロキシルを有する延長中間体とテンプレートフリーポリメラーゼとを、３’－Ｏ－保護ヌクレオシド三リン酸の存在下で反応させて、３’－Ｏ－保護延長中間体（１０６）を生成する工程（１０４）；（ｃ）延長中間体を脱保護して、遊離３’－ヒドロキシルを有する延長中間体を生成する工程；ならびに（ｄ）ポリヌクレオチドが合成される（１１０）まで工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返す工程（１０８）；を含む。（「延長中間体」および「伸長断片」という用語は互換的に使用されるときがある）。いくつかの実施形態では、イニシエーターは、例えばその５’末端によって固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドとして提供される。上記の方法はまた、反応または延長の工程の後、ならびに脱保護工程の後に洗浄工程を含んでもよい。例えば、反応の工程は、所定のインキュベーション期間または反応時間の後に、例えば洗浄によって、組み込まれていないヌクレオシド三リン酸を除去するサブ工程を含んでもよい。そのような所定のインキュベーション期間または反応時間は、数秒、例えば３０秒～数分、例えば３０分であり得る。
合成支持体上のポリヌクレオチドの配列が逆相補的部分配列を含む場合、逆相補的領域間の水素結合の形成によって二次分子内または交差分子構造が作出され得る。いくつかの実施形態では、環外アミンのための塩基保護部分は、保護された窒素の水素が水素結合に関与することができず、それにより、そのような二次構造の形成が妨げられるように選択される。すなわち、塩基保護部分は、例えばヌクレオシドＡとＴとの間およびＧとＣとの間の通常の塩基ペアリングにおいて形成されるような水素結合の形成を防止するために使用することができる。合成の終わりに、塩基保護部分は除去することができ、ポリヌクレオチド産物は、例えば、そのイニシエーターから切断することによって固体支持体から切断することができる。
塩基保護基を有する３’－Ｏ－ブロックｄＮＴＰモノマーを提供することに加えて、熱安定性テンプレートフリーポリメラーゼを使用して高温で伸長反応を行うことができる。例えば、４０℃を超える活性を有する熱安定性テンプレートフリーポリメラーゼを使用することができ、または、いくつかの実施形態では、４０～８５℃の範囲の活性を有する熱安定性テンプレートフリーポリメラーゼを使用することができ、またはいくつかの実施形態では、４０～６５℃の範囲の活性を有する熱安定性テンプレートフリーポリメラーゼを使用することができる。
いくつかの実施形態では、伸長条件は、水素結合または塩基スタッキングを阻害する溶媒を伸長反応混合物に添加することを含み得る。そのような溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノールなどの低誘電率の水混和性溶媒が挙げられる。同様に、いくつかの実施形態では、伸長条件は、限定するものではないが、ｎ－ブタノール、エタノール、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２－プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオウレア、尿素などを含むカオトロピック剤の提供を含み得る。いくつかの実施形態では、伸長条件は、二次構造抑制量のＤＭＳＯの存在を含む。いくつかの実施形態では、伸長条件は、二次構造の形成を阻害するＤＮＡ結合タンパク質の提供を含むことができ、そのようなタンパク質には、限定するものではないが、一本鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、ＤＮＡグリコラーゼなどが含まれる。
塩基保護されていない３’－Ｏ－ブロックｄＮＴＰは、市販の販売業者から購入することができ、または公開されている技術、例えば米国特許第７０５７０２６号；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０５（２７）：９１４５－９１５０（２００８）；Ｂｅｎｎｅｒ，Ｕ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔｓ ７５４４７９４ ａｎｄ ８２１２０２０；国際特許公開第ＷＯ２００４／００５６６７号、第ＷＯ９１／０６６７８号；Ｃａｎａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ（本明細書に引用）；Ｍｅｔｚｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４２５９－４２６７（１９９４）；Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１４：３２４８－３２５２（３００６）；米国特許公開第２００５／０３７９９１号を使用して合成することができる。塩基保護された３’－Ｏ－ブロックｄＮＴＰは、以下に記載のように合成することができる。
塩基保護ｄＮＴＰが使用される場合、図１の上記方法は、塩基保護部分を除去する工程（ｅ）をさらに含んでもよく、（例えば）アシルまたはアミジン保護基の場合には工程（ｅ）は濃アンモニアで処理することを含み得る。
上記の方法はまた、反応または延長の工程の後、ならびに脱保護工程の後に（１または複数の）キャッピング工程および洗浄工程を含んでもよい。上述のように、いくつかの実施形態では、非延長遊離３’－ヒドロキシルを、キャッピングされた鎖のさらなる伸長を完全に防止する化合物と反応させるキャッピング工程を含めることができる。いくつかの実施形態において、そのような化合物は、ジデオキシヌクレオシド三リン酸であり得る。他の実施形態では、遊離３’－ヒドロキシルを有する非延長鎖は、それらを３’－エキソヌクレアーゼ活性、例えばＥｘｏ Ｉで処理することによって分解することができる。例えば、Ｈｙｍａｎの米国特許第５４３６１４３号を参照されたい。同様に、いくつかの実施形態では、脱ブロックされない鎖を処理して、鎖を除去するか、またはさらなる延長に対して不活性にすることができる。
いくつかの実施形態において、伸長工程（延長工程またはカップリング工程とも呼ばれることもある）のための反応条件は、以下を含み得る：２．０μＭの精製ＴｄＴ；１２５～６００μＭの３’－Ｏ－ブロックｄＮＴＰ（例えば、３’－Ｏ－ＮＨ２－ブロックｄＮＴＰ）；約１０～約５００ｍＭのカコジル酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５～７．５の間）および約０．０１～約１０ｍＭの二価カチオン（例えば、ＣｏＣｌ２またはＭｎＣｌ２）、ここで、伸長反応は、５０μＬの反応体積において、ＲＴ～４５℃の範囲内の温度で３分間行うことができる。３’－Ｏ－ブロックｄＮＴＰが３’－Ｏ－ＮＨ２－ブロックｄＮＴＰである実施形態では、脱ブロック工程のための反応条件は、以下を含み得る：７００ｍＭのＮａＮＯ２；１Ｍの酢酸ナトリウム（酢酸を用いてｐＨ４．８～６．５の範囲に調整）、ここで、脱ブロック反応は、５０μＬの体積において、ＲＴ～４５℃の範囲内の温度で３０秒～数分間行うことができる。カップリング反応の成分（例えば、酵素、モノマー、二価カチオン）を含まないカコジル酸バッファーを用いて洗浄を行うことができる。
特定の用途に応じて、脱ブロックおよび／または切断の工程は、様々な化学的または物理的条件、例えば、光、熱、ｐＨ、特定の化学結合を切断することができる酵素などの特異的試薬の存在を含み得る。３’－Ｏ－ブロッキング基および対応する脱ブロッキング条件を選択する際の指針は、参照により組み込まれる以下の参考文献に見出すことができる：Ｂｅｎｎｅｒ、米国特許第７５４４７９４号および第８２１２０２０号；米国特許第５８０８０４５号；米国特許第８８０８９８８号；国際特許公開第ＷＯ９１／０６６７８号；および以下に引用される参考文献。いくつかの実施形態では、切断剤（脱ブロッキング試薬または脱ブロッキング剤と呼ばれることもある）は、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの化学的切断剤である。代替的な実施形態では、切断剤は、３’－リン酸ブロッキング基を切断し得る、例えばホスファターゼなどの酵素的切断剤であり得る。脱ブロッキング剤の選択は、使用される３’－ヌクレオチドブロッキング基のタイプ、１または複数のブロッキング基が使用されているかどうか、イニシエーターが生細胞または生物体または固体支持体に結合しているかどうかなどに依存し、穏やかな処理を必要とすることが当業者によって理解されると思われる。例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などのホスフィンを使用して３’Ｏ－アジドメチル基を切断することができ、パラジウム錯体を使用して３’Ｏ－アリル基を切断することができ、または亜硝酸ナトリウムを使用して３’Ｏ－アミノ基を切断することができる。特定の実施形態では、切断反応は、ＴＣＥＰ、パラジウム錯体または亜硝酸ナトリウムを含む。
上述したように、いくつかの実施形態では、直交脱ブロッキング条件を使用して除去することができる２つ以上のブロッキング基を使用することが望ましい。以下の例示的なブロッキング基のペア（表４）を並列合成実施形態で使用することができる。本発明のこれらの実施形態で使用するために、他のブロッキング基ペア、または３つ以上を含む基が利用可能であり得ることが理解されよう。
表４：ブロッキング基の例示的なペア
表４：ブロッキング基の例示的なペア
生細胞上でオリゴヌクレオチドを合成するには、穏やかな脱ブロックまたは脱保護条件、すなわち、細胞膜を破壊せず、タンパク質を変性させず、重要な細胞機能に干渉しない条件などが必要である。いくつかの実施形態では、脱保護条件は、細胞生存に適合する生理的条件の範囲内である。そのような実施形態では、酵素的脱保護は、生理的条件下で行われ得るので望ましい。いくつかの実施形態では、特異的酵素的に除去可能なブロッキング基は、それらの除去のために特異的酵素と会合する。例えば、エステルまたはアシルベースのブロッキング基は、アセチルエステラーゼなどのエステラーゼまたは同様の酵素で除去することができ、リン酸ブロッキング基は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼなどの３’ホスファターゼで除去することができる。例として、３’－Ｏ－リン酸を、１００ｍＭ トリス－ＨＣｌ（ｐＨ ６．５）の溶液としての１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭの２－メルカプトエタノール、および１単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでの処理によって除去することができる。反応は３７℃の温度で１分間進行させる。
「３’－リン酸ブロック」または「３’－リン酸保護」ヌクレオチドは、３’位のヒドロキシル基がリン酸含有部分の存在によってブロックされているヌクレオチドを指す。本発明による３’－リン酸ブロックヌクレオチドの例は、ヌクレオチジル－３’－リン酸モノエステル／ヌクレオチジル－２’，３’－環状リン酸、ヌクレコチジル－２’－リン酸モノエステルおよびヌクレオチジル－２’または３’－アルキルリン酸ジエステル、ならびにヌクレオチジル－２’または３’－ピロリン酸である。置換が脱リン酸化を妨げず、ホスファターゼにより遊離３’－ＯＨをもたらすことを条件として、チオリン酸またはそのような化合物の他のアナログも使用することができる。
３’－Ｏ－エステル保護ｄＮＴＰまたは３’－Ｏ－リン酸保護ｄＮＴＰの合成および酵素的脱保護のさらなる例は、以下の参考文献に記載されている：Ｃａｎａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：１０８５９－１０８６３（１９９５）；Ｃａｎａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１４８：１－６（１９９４）；Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６（２３）：５１２０－５１２６（１９７７）；Ｒａｓｏｌｏｎｊａｔｏｖｏ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１８（４＆５）：１０２１－１０２２（１９９９）；Ｆｅｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ ｆｕｒ Ｃｈｅｍｉｅ，１３１：５８５－６１６（２０００）；Ｔａｕｎｔｏｎ－Ｒｉｇｂｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３８（５）：９７７－９８５（１９７３）；Ｕｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３０（２９）：３８１９－３８２０（１９８９）；Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２（５）：９３６－９５０（１９６７）；Ｔｓｉｅｎ、国際特許公開第ＷＯ１９９１／００６６７８号。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、プリンまたはピリミジン塩基と、それに共有結合的に結合した除去可能な３’－ＯＨブロッキング基を有するリボースまたはデオキシリボース糖部分とを含む修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシド分子を含み、その結果、３’炭素原子は、以下の構造の基と結合している：
－Ｏ－Ｚ
（式中、－Ｚは、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｏ－Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’’）２、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｓ－Ｒ’’および－Ｃ（Ｒ’）２－Ｆのいずれかであり、各Ｒ’’は、除去可能な保護基であるか、または除去可能な保護基の一部であり；各Ｒ’は、独立して、水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環式、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、または結合基を介して結合した検出可能な標識であり；ただし、いくつかの実施形態では、そのような置換基は、最大１０個の炭素原子および／または最大５個の酸素または窒素ヘテロ原子を有し；または（Ｒ’）２は、式＝Ｃ（Ｒ’’’）２の基を表し（式中、各Ｒ’’’は、同じであっても異なっていてもよく、水素およびハロゲン原子ならびにアルキル基を含む群から選択され、ただし、いくつかの実施形態では、各Ｒ’’’のアルキルは、１～３個の炭素原子を有する）；ならびにここで、該分子を反応させて、各Ｒ’’がＨと交換されているか、またはＺが－（Ｒ’）２－Ｆである場合、該ＦがＯＨ、ＳＨもしくはＮＨ２、好ましくはＯＨと交換されている中間体を得てもよく、該中間体は水性条件下で解離して、遊離３’－ＯＨを有する分子をもたらす；ただし、Ｚが－Ｃ（Ｒ’）２－Ｓ－Ｒ’’である場合、Ｒ’基は両方ともＨではない）。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドのＲ’はアルキルまたは置換アルキルであり、ただし、そのようなアルキルまたは置換アルキルは１～１０個の炭素原子および０～４個の酸素または窒素ヘテロ原子を有する。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドの－Ｚは式－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ３のものである。ある特定の実施形態では、Ｚは、アジドメチル基である。
－Ｏ－Ｚ
（式中、－Ｚは、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｏ－Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’’）２、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｓ－Ｒ’’および－Ｃ（Ｒ’）２－Ｆのいずれかであり、各Ｒ’’は、除去可能な保護基であるか、または除去可能な保護基の一部であり；各Ｒ’は、独立して、水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環式、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、または結合基を介して結合した検出可能な標識であり；ただし、いくつかの実施形態では、そのような置換基は、最大１０個の炭素原子および／または最大５個の酸素または窒素ヘテロ原子を有し；または（Ｒ’）２は、式＝Ｃ（Ｒ’’’）２の基を表し（式中、各Ｒ’’’は、同じであっても異なっていてもよく、水素およびハロゲン原子ならびにアルキル基を含む群から選択され、ただし、いくつかの実施形態では、各Ｒ’’’のアルキルは、１～３個の炭素原子を有する）；ならびにここで、該分子を反応させて、各Ｒ’’がＨと交換されているか、またはＺが－（Ｒ’）２－Ｆである場合、該ＦがＯＨ、ＳＨもしくはＮＨ２、好ましくはＯＨと交換されている中間体を得てもよく、該中間体は水性条件下で解離して、遊離３’－ＯＨを有する分子をもたらす；ただし、Ｚが－Ｃ（Ｒ’）２－Ｓ－Ｒ’’である場合、Ｒ’基は両方ともＨではない）。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドのＲ’はアルキルまたは置換アルキルであり、ただし、そのようなアルキルまたは置換アルキルは１～１０個の炭素原子および０～４個の酸素または窒素ヘテロ原子を有する。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドの－Ｚは式－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ３のものである。ある特定の実施形態では、Ｚは、アジドメチル基である。
いくつかの実施形態では、Ｚは、２００以下の分子量を有する、ヘテロ原子を含んでも含まなくてもよい切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、１００以下の分子量を有する、ヘテロ原子を含んでも含まなくてもよい切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、５０以下の分子量を有する、ヘテロ原子を含んでも含まなくてもよい切断可能な有機部分である。いくつかの実施形態では、Ｚは、２００以下の分子量を有する、ヘテロ原子を含んでも含まなくてもよい酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、１００以下の分子量を有する、ヘテロ原子を含んでも含まなくてもよい酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、５０以下の分子量を有する、ヘテロ原子を含んでも含まなくてもよい酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、２００以下の分子量を有する、酵素的に切断可能なエステル基である。他の実施形態では、Ｚは、３’－ホスファターゼによって除去可能なリン酸基である。いくつかの実施形態では、以下の３’－ホスファターゼの１または複数を製造業者の推奨プロトコールと共に使用することができる：Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ、組換えシュリンプアルカリホスファターゼ（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡから入手可能）
さらなる実施形態では、３’－ブロックヌクレオチド三リン酸は、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ＮＨ２または３’－Ｏ－アリル基のいずれかによってブロックされる。他の実施形態では、本発明の３’－Ｏ－ブロッキング基は、３’－Ｏ－メチル、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）、３’－Ｏ－アリル、３’－Ｏ－アミン、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブトキシエトキシ、３’－Ｏ－（２－シアノエチル）、３’－Ｏ－ニトロ、および３’－Ｏ－プロパルギルを含む。他の実施形態では、３’－ブロックヌクレオチド三リン酸は、３’－Ｏ－アジドメチルまたは３’－Ｏ－ＮＨ２のいずれかによってブロックされる。そのような３’－ブロックヌクレオシド三リン酸の合成および使用は、以下の参考文献に開示されている：米国特許第９４１０１９７号；同第８８０８９８８号；同第６６６４０９７号；同第５７４４５９５号；同第７５４４７９４号；同第８０３４９２３号；同第８２１２０２０号；同第１０４７２３８３号；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０５（２７）：９１４５－９１５０（２００８）；および同様の参考文献。
いくつかの実施形態では、３’－Ｏ－保護基は電気化学的に不安定な基である。すなわち、保護基の脱保護または切断は、切断をもたらす保護基の近傍の電気化学的条件を変化させることによって達成される。そのような電気化学的条件の変化は、電圧差または光などの物理量を変化または印加して補助種を活性化することによってもたらすことができ、これにより、ｐＨの上昇または低下などの保護基の部位における電気化学的条件の変化が引き起こされる。いくつかの実施形態では、電気化学的に不安定な基としては、例えば、ｐＨが所定の値に変化するたびに切断されるｐＨ感受性保護基が挙げられる。他の実施形態では、電気化学的に不安定な基としては、例えば保護基の部位での電圧差を増加または減少させることによって、還元または酸化条件が変更されるたびに直接切断される保護基が挙げられる。
変異体ＴｄＴの作製
本発明の変異体は、公知の参照ＴｄＴコードポリヌクレオチドまたは野生型ＴｄＴコードポリヌクレオチドを突然変異させ、次いで従来の分子生物学技術を用いてそれを発現させることによって作製することができる。例えば、所望の配列のポリペプチドをコードする所望の遺伝子またはＤＮＡ断片は、従来の分子生物学技術を使用して、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１６４：４９－５３（１９９５）；Ｋｏｄｕｍａｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０１：１５５７３－１５５７８（２００４）；などよって記載されたプロトコールを使用して組立てることができ、またはそのような遺伝子もしくはＤＮＡ断片は、Ｂｏｕｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１９９－２０８（１９９８）、もしくはＢｅｎｔｏｌｉｌａ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：４２２１－４２２９（１９９５）；などによって記載された従来のプロトコールを使用して、選択された種の細胞から直接クローニングすることができる。
本発明の変異体は、公知の参照ＴｄＴコードポリヌクレオチドまたは野生型ＴｄＴコードポリヌクレオチドを突然変異させ、次いで従来の分子生物学技術を用いてそれを発現させることによって作製することができる。例えば、所望の配列のポリペプチドをコードする所望の遺伝子またはＤＮＡ断片は、従来の分子生物学技術を使用して、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１６４：４９－５３（１９９５）；Ｋｏｄｕｍａｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０１：１５５７３－１５５７８（２００４）；などよって記載されたプロトコールを使用して組立てることができ、またはそのような遺伝子もしくはＤＮＡ断片は、Ｂｏｕｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１９９－２０８（１９９８）、もしくはＢｅｎｔｏｌｉｌａ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：４２２１－４２２９（１９９５）；などによって記載された従来のプロトコールを使用して、選択された種の細胞から直接クローニングすることができる。
所望のＴｄＴ変異体をコードする単離された遺伝子を、ｐＥＴ３２（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの発現ベクターに挿入して発現ベクターを得て、次いでこれを使用して、従来のプロトコールを使用して変異体ＴｄＴタンパク質を作製および発現させることができる。正しい配列を有するベクターにより産生株の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換させることができる。
形質転換株を従来の技術を用いて培養して、ペレット化し、それからＴｄＴタンパク質を抽出する。例えば、予め調製したペレットを３０～３７℃の水浴中で解凍する。完全に解凍したら、ペレットを、５０ｍＭのトリス－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭのメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５％のグリセロール（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）および１００ｍＬに対して１錠のプロテアーゼカクテル阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で構成される溶解バッファーに再懸濁する。未成熟溶菌および凝集物の残存を回避するために、慎重な再懸濁が行われる。再懸濁した細胞を、フルカラー均一性が得られるまで、数サイクルのフレンチプレスを通して溶解する。使用される通常の圧力は１４，０００ｐｓｉである。次いで、溶解物を１０，０００ｒｐｍで１時間～１時間３０分遠心分離する。カラム精製の前に、遠心分離物を０．２μｍフィルターに通してあらゆるデブリを除去する。
ＴｄＴタンパク質は、一工程のアフィニティー手順で遠心分離物から精製することができる。例えば、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＴｄＴポリメラーゼを結合することができる。最初に、カラムを洗浄し、１５カラム容積の５０ｍＭトリス－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）および２０ｍＭのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で平衡化する。ＴｄＴポリメラーゼを、平衡化後にカラムに結合させ、次いで、例えば、５０ｍＭのトリス－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）および２０ｍＭのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で構成される洗浄バッファーを１５カラム容積でカラムに適用することができる。そのような洗浄後、ＴｄＴポリメラーゼを５０ｍＭのトリス－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）および０．５Ｍのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で溶出する。目的のＴｄＴポリメラーゼの最高濃度に対応する画分を回収し、単一試料にプールする。プールした画分を透析バッファー（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ ６．８、２００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭｇＯＡｃ、１００ｍＭの［ＮＨ４］２ＳＯ４）に対して透析する。その後、透析液を濃縮フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－３０、Ｍｅｒｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮する。濃縮された酵素を少量のアリコートに分配し、最終濃度５０％のグリセロールを添加し、次いで、それらのアリコートを－２０℃で凍結し、長期間保存する。精製酵素の５μＬの様々な画分をＳＤＳＰＡＧＥゲルで分析する。
いくつかの実施形態では、ＴｄＴ変異体は、共有結合または非共有結合；アミノ酸タグ（例えば、ポリ－アミノ酸タグ、ポリ－Ｈｉｓタグ、６Ｈｉｓタグ）；化合物（例えば、ポリエチレングリコール）；タンパク質－タンパク質結合ペア（例えば、ビオチン－アビジン）；アフィニティーカップリング；捕捉プローブ；またはこれらの任意の組み合わせを含むリンカー部分に動作可能に連結され得る。リンカー部分は、ＴｄＴ変異体とは別個であってもよく、ＴｄＴ変異体の一部であってもよい。本発明のＴｄＴ変異体に使用するための例示的なＨｉｓタグは、ＭＡＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＳＥＮＬＹＦＱＴＧＳＳＧ－（配列番号５４））である。タグ－リンカー部分は、ＴｄＴ変異体のヌクレオチド結合活性または触媒活性に干渉しない。
上記の方法または同等の方法は、活性および／または保存に必要または有用な塩、ｐＨバッファー、担体化合物などの様々な試薬と混合することができる単離されたＴｄＴ変異体をもたらす。
本発明の方法を実施するためのキット
本発明は、本発明の方法を実施するための様々なキットを含む。一態様では、本発明のキットは、本明細書に記載のテンプレートフリー酵素的ポリヌクレオチド合成を実施するのに適した製剤中に本発明のＴｄＴ変異体を含む。そのようなキットはまた、成長鎖への３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰのテンプレートフリー付加または組み込みを最適化するための反応条件を提供する合成バッファーを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、３’－Ｏ－可逆的保護ｄＮＴＰをさらに含む。そのような実施形態では、３’－Ｏ－可逆的保護ｄＮＴＰは、３’－Ｏ－アミノ－ｄＮＴＰまたは３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰを含み得る。さらなる実施形態では、キットは、以下の品目１または複数を、個別または上述の品目と一緒のいずれかで含み得る：（ｉ）本明細書に記載の脱保護工程を実施するための脱保護試薬、（ｉｉ）イニシエーターが結合した固体支持体、（ｉｉｉ）完了したポリヌクレオチドを固体支持体から放出するための切断試薬、（ｉｖ）酵素的付加またはカップリング工程の終了時に未反応の３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰを除去するための洗浄試薬またはバッファー、および（ｖ）合成後処理試薬、例えば精製カラム、脱塩試薬、溶出試薬など。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、単一操作で複数の合成反応を実施するための反応ウェルのアレイを含み得る。いくつかの実施形態では、そのようなアレイは、２４、４８、９６、３８４または１５３６ウェルを含む従来のフィルタープレートであり得る。
本発明は、本発明の方法を実施するための様々なキットを含む。一態様では、本発明のキットは、本明細書に記載のテンプレートフリー酵素的ポリヌクレオチド合成を実施するのに適した製剤中に本発明のＴｄＴ変異体を含む。そのようなキットはまた、成長鎖への３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰのテンプレートフリー付加または組み込みを最適化するための反応条件を提供する合成バッファーを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、３’－Ｏ－可逆的保護ｄＮＴＰをさらに含む。そのような実施形態では、３’－Ｏ－可逆的保護ｄＮＴＰは、３’－Ｏ－アミノ－ｄＮＴＰまたは３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰを含み得る。さらなる実施形態では、キットは、以下の品目１または複数を、個別または上述の品目と一緒のいずれかで含み得る：（ｉ）本明細書に記載の脱保護工程を実施するための脱保護試薬、（ｉｉ）イニシエーターが結合した固体支持体、（ｉｉｉ）完了したポリヌクレオチドを固体支持体から放出するための切断試薬、（ｉｖ）酵素的付加またはカップリング工程の終了時に未反応の３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰを除去するための洗浄試薬またはバッファー、および（ｖ）合成後処理試薬、例えば精製カラム、脱塩試薬、溶出試薬など。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、単一操作で複数の合成反応を実施するための反応ウェルのアレイを含み得る。いくつかの実施形態では、そのようなアレイは、２４、４８、９６、３８４または１５３６ウェルを含む従来のフィルタープレートであり得る。
上記品目（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に関して、特定のイニシエーターおよび切断試薬は相伴う。例えば、イノシン切断可能ヌクレオチドを含むイニシエーターは、エンドヌクレアーゼＶ切断試薬を伴うことができ；ニトロベンジル光開裂性リンカーを含むイニシエーターは、光開裂性リンカーを切断するための適切な光源を伴うことができ；ウラシルを含むイニシエーターはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ切断試薬を伴うことができる；などである。
実施例１
ＴｄＴ変異体の組み込み活性の試験
表５に列挙したＴｄＴ変異体を従来の技術を用いて調製し、精製し、３’－Ｏ－アミノ－２’－デオキシヌクレオシド三リン酸モノマーを使用して上記の２つの別個のヘアピンアッセイで試験した。アッセイにおけるそれらの性能を、高い組み込み率を有することが公知のマウス－ウシキメラＴｄＴ（Ｍ５７と呼ばれる、配列番号５５）の性能と比較した。
表５
データから分かるように、ＴｄＴ変異体の多くは、標準のＭ５７よりもはるかに高いカップリング効率を有する。低濃度の３’末端ｄＮＴＰ（２０μＭ）の存在下で反応を行ったので、その増加は主に、特定のｄＮＴＰに対するより良好な親和性に起因する。発現レベルは、Ｎｉ－ＮＴＡ（合計３００μＬ、培養物５０ｍｌに由来する）からの溶出後のタンパク質濃度に対応する。
ＴｄＴ変異体の組み込み活性の試験
表５に列挙したＴｄＴ変異体を従来の技術を用いて調製し、精製し、３’－Ｏ－アミノ－２’－デオキシヌクレオシド三リン酸モノマーを使用して上記の２つの別個のヘアピンアッセイで試験した。アッセイにおけるそれらの性能を、高い組み込み率を有することが公知のマウス－ウシキメラＴｄＴ（Ｍ５７と呼ばれる、配列番号５５）の性能と比較した。
表５
定義
アミノ酸は、以下の命名法に従ってそれらの１文字または３文字コードのいずれかによって表される：Ａ：アラニン（Ａｌａ）；Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）；Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）；Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）；Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）；Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）；Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）；Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）；Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）；Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）；Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）；Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）；Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）；Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）；Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）；Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）；Ｖ：バリン（Ｖａｌ）；Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）およびＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。
アミノ酸は、以下の命名法に従ってそれらの１文字または３文字コードのいずれかによって表される：Ａ：アラニン（Ａｌａ）；Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）；Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）；Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）；Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）；Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）；Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）；Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）；Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）；Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）；Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）；Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）；Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）；Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）；Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）；Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）；Ｖ：バリン（Ｖａｌ）；Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）およびＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。
置換残基に関して「機能的に等価」とは、変異体ＴｄＴの置換残基が、配列番号１と相同な配列を有する別のＴｄＴの配列中の残基と同一の機能的役割を有することを意味する。機能的に等価な残基は、配列アラインメントを使用することによって、例えば、Ｍｕｔａｌｉｎラインアライメントソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｍｕｌｔａｌｉｎ／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｈｔｍｌ；１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６（２２），２５ １０８８１－１０８９０）を使用することによって同定することができる。アラインメント後、機能的に等価な残基は、考慮される異なる配列上の相同位置にある。配列アラインメントおよび機能的に等価な残基の同定は、任意のＴｄＴと、種間を含むそれらの天然変異体との間で決定することができる。
タンパク質に関して「単離された」とは、その天然環境の成分または不均一な反応混合物から同定および分離および／または回収されたような化合物を意味する。天然環境または反応混合物の夾雑物成分は、タンパク質の機能に干渉する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質は、（１）ローリー法によって決定される場合、９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超まで精製され、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで精製され、または（３）クーマシーブルーもしくは、好ましくは銀染色を使用して還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。組換え方法論によって製造される場合、本発明の単離されたタンパク質は、タンパク質の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内にｉｎ ｓｉｔｕで本発明のタンパク質を含み得る。通常、本発明の単離されたタンパク質は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
「キット」は、本発明の方法を実施するための材料または試薬を送達するための任意の送達系を指す。反応アッセイの文脈において、そのような送達系は、ある場所から別の場所への反応試薬（例えば、適切な容器中の１または複数のＴｄＴ変異体、反応バッファー、３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰ、脱保護試薬、イニシエーターが結合した固体支持体など）の貯蔵、輸送または送達を可能にする系および／もしくは化合物（例えば、希釈剤、界面活性剤、担体など）、ならびに／または補助材料（例えば、バッファー、アッセイを実施するための書面の説明書など）を含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支持材料を含む１または複数のエンクロージャ（例えば、ボックス）を含む。そのような内容物は、目的のレシピエントに一緒にまたは別々に送達することができる。例えば、第１の容器は、合成方法で使用するための１または複数のＴｄＴ変異体を含んでもよく、第２の容器または追加の容器は、脱保護剤、イニシエーターを有する固体支持体、３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰなどを含んでもよい。
互換的に使用される「突然変異体」または「変異体」は、本明細書に記載の天然または参照のＴｄＴポリペプチドに由来し、１または複数の位置に変更または改変、すなわち置換、挿入および／または欠失を含むポリペプチドを指す。変異体は、当該技術分野で周知の様々な技術によって得ることができる。特に、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変するための技術の例としては、限定するものではないが、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、配列シャッフリングおよび合成オリゴヌクレオチド構築が挙げられる。突然変異誘発活性は、タンパク質の配列中の、または本発明の場合はポリメラーゼの配列中の１個または数個のアミノ酸の欠失、挿入または置換からなる。置換を指定するために以下の用語が使用される：Ｌ２３８Ａは、参照または野生型配列の２３８位のアミノ酸残基（ロイシン、Ｌ）がアラニン（Ａ）に変更されることを示す。Ａ１３２Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の１３２位のアミノ酸残基（アラニン、Ａ）が、以下のアミノ酸：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはメチオニン（Ｍ）のいずれかによって置換されていることを示す。置換は、保存的置換であっても、または非保存的置換であってもよい。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギンおよびスレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システインおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）および小アミノ酸（グリシン、アラニンおよびセリン）の群の内である。
「配列同一性」は、２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列などの２つの配列間の一致（例えば、同一のアミノ酸残基）の数（または画分、通常パーセンテージとして表される）を指す。配列同一性は、配列ギャップを最小化しながら重複および同一性を最大化するように整列されたときの配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、いくつかの数学的にグローバルまたはローカルなアライメントアルゴリズムのいずれかを使用して決定することができる。類似の長さの配列は、好ましくは、配列を全長にわたって最適にアラインメントするグローバルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を使用してアラインメントされ、一方、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１）またはＡｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００５））を使用してアラインメントされる。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のアラインメントは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／またはｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／などのインターネットウェブサイトで利用可能な公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の技能の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本明細書の目的のために、アミノ酸配列同一性％値とは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して２つの配列の最適なグローバルアライメントを作成するペアワイズ配列アラインメントプログラムＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して生成された値を指し、すべての検索パラメータはデフォルト値、すなわちＳｃｏｒｉｎｇ行列＝ＢＬＯＳＵＭ ６２、Ｇａｐ ｏｐｅｎ＝１０、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ＝０．５、Ｅｎｄ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝ｆａｌｓｅ、Ｅｎｄ ｇａｐ ｏｐｅｎ＝１０およびＥｎｄ ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ＝０．５に設定される。
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用され、それぞれヌクレオチドモノマーまたはそのアナログの直鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、ワトソン－クリック型の塩基ペアリング、塩基スタッキング、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の塩基ペアリングなど、モノマーとモノマーとの相互作用の規則的なパターンによって天然のポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。そのようなモノマーおよびそれらのヌクレオシド間結合は、天然に存在してもよく、またはそのアナログ、例えば天然に存在するアナログまたは天然に存在しないアナログであってもよい。天然に存在しないアナログとしては、ＰＮＡ、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、フルオロフォアまたはハプテンなどの標識の結合を可能にする結合基を含む塩基などを挙げることができる。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用が、ポリメラーゼによる延長、リガーゼによるライゲーションなどの酵素的処理を必要とするときはいつでも、当業者は、それらの事例においてオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、任意の位置またはいくつかの位置にヌクレオシド間結合、糖部分または塩基の特定のアナログを含有しないことを理解するであろう。ポリヌクレオチドは、典型的には、それらが通常「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる場合数個のモノマー単位、例えば５～４０個から、数千個のモノマー単位のサイズの範囲である。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ、」などの文字の配列（大文字または小文字）によって表されるときはいつでも、別途指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、ヌクレオチドは左から右に向かって５’→３’の順序であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを表し、「Ｃ」はデオキシシチジンを表し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを表し、「Ｔ」はチミジンを表し、「Ｉ」はデオキシイノシンを表し、「Ｕ」はウリジンを表すことが理解されよう。特に明記しない限り、用語および原子番号付けの慣習は、Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）に開示されているものに従う。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された４つの天然ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡについてはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはＲＮＡについてはそれらのリボース対応物）を含む。しかしながら、それらは、例えば修飾塩基、糖類またはヌクレオシド間結合を含む非天然ヌクレオチドアナログも含み得る。酵素が、活性のための特異的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質の要件、例えば、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖などを有する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質に対する適切な組成物の選択が、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）および同様の参考文献などの論文からの指針により、十分に当業者の知識の範囲内であることは当業者には明らかである。同様に、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、一本鎖形態または二本鎖形態（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとそのそれぞれの相補体との二重鎖）のいずれかを指し得る。どの形態または両方の形態が用語の使用の文脈から意図されているかは、当業者には明らかであろう。
「プライマー」は、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドテンプレートと二重鎖を形成する際に核酸合成の開始点として作用し、その３’末端からテンプレートに沿って延長され、延長された二重鎖を形成することができるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの延長は、通常、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼを用いて行われる。延長過程で付加されるヌクレオチドの配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって延長される。プライマーは、通常、１４～４０ヌクレオチドの範囲、または１８～３６ヌクレオチドの範囲の長さを有する。プライマーは、様々な核酸増幅反応、例えば、単一のプライマーを使用する線形増幅反応、または２つ以上のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応で使用される。特定の用途のためのプライマーの長さおよび配列を選択するための指針は、参照により組み込まれる以下の参考文献によって証明されるように、当業者に周知である：Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３）。
「置換」とは、あるアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられることを意味する。好ましくは、「置換」という用語は、天然に存在する標準的な２０アミノ酸残基、希少な天然に存在するアミノ酸残基（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、６－Ｎ－メチルリジン、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン）、およびしばしば合成的に作製される天然に存在しないアミノ酸残基（例えばシクロヘキシル－アラニン）から選択される別のものによるアミノ酸残基の置き換えを指す。好ましくは、「置換」という用語は、天然に存在する標準的な２０アミノ酸残基から選択される別のものによるアミノ酸残基の置き換えを指す。記号「＋」は、置換の組み合わせを示す。
本開示は、記載された特定の形態の範囲に限定されることを意図するものではなく、本明細書に記載の変形形態の代替形態、修正形態、および等価物を包含することを意図している。さらに、本開示の範囲は、本開示を考慮して当業者に明らかになり得る他の変形を完全に包含する。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
Claims (12)
- 配列番号２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４または４７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体であって、
配列番号２については、６１位のロイシンが置換され、１７０位のシステインが置換され、２０４位のアルギニンが置換され、３２６位のアルギニンが置換され、かつ３２９位のグリシンが置換されており；
配列番号５については、４８位のロイシンが置換され、１５８位のシステインが置換され、１９２位のアルギニンが置換され、３１４位のアルギニンが置換され、かつ３１７位のグリシンが置換されており；
配列番号８については、６１位のロイシンが置換され、１７１位のチロシンが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２７位のアルギニンが置換され、かつ３２９位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号１１については、６１位のロイシンが置換され、１７１位のチロシンが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２４位のアルギニンが置換され、かつ３２７位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号１４については、６１位のグリシンが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２７位のアルギニンが置換され、かつ３３０位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号１７については、６１位のアルギニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、１５８位のアラニンが置換され、１９２位のアルギニンが置換され、３１１位のアルギニンが置換され、かつ３１４位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号２０については、６１位のアルギニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、１７１位のプロリンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、２０５位のアルギニンが置換され、３２１位のスレオニンが置換され、かつ３２４位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号２３については、６１位のアルギニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、１７１位のアラニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、２０５位のアルギニンが置換され、３２２位のアラニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、かつ３２５位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号２６については、６１位のアルギニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、１７１位のアラニンは置換されていても、または置換されていなくてもよく、２０５位のアルギニンが置換され、３２２位のアルギニンが置換され、かつ３２５位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号２９については、４８位のメチオニンが置換され、１５８位のシステインが置換され、１９２位のアルギニンが置換され、３１０位のアルギニンが置換され、かつ３１３位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号３２については、６１位のメチオニンが置換され、１７１位のシステインが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２３位のアルギニンが置換され、かつ３２６位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号３５については、６１位のメチオニンが置換され、１７１位のシステインが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２３位のアルギニンが置換され、かつ３２６位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号３８については、６１位のメチオニンが置換され、１７１位のシステインが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２３位のアルギニンが置換され、かつ３２６位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号４１については、６１位のメチオニンが置換され、１７１位のシステインが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２３位のアルギニンが置換され、かつ３２６位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号４４については、４８位のメチオニンが置換され、１５８位のシステインが置換され、１９２位のアルギニンが置換され、３０９位のアルギニンが置換され、かつ３１２位のグルタミン酸が置換されており；ならびに
配列番号４７については、６１位のメチオニンが置換され、１７１位のシステインが置換され、２０５位のアルギニンが置換され、３２３位のアルギニンが置換され、かつ３２６位のグルタミン酸が置換されており；
（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、かつ（ｉｉ）核酸断片の遊離３’－ヒドロキシルに３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを組み込むことができる、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体。 - 配列番号２、８もしくは１１の６１位または配列番号５の４８位のロイシンに対する前記置換が、ＲまたはＱからなる群から選択され；
配列番号２の１７０位または配列番号５、２９もしくは４４の１５８位または配列番号３２、３５、３８、４１もしくは４７の１７１位のシステインに対する前記置換が、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、ＱまたはＤからなる群から選択され、他の実施形態では、前述の位置のシステインに対する置換がＧまたはＲからなる群から選択され；
配列番号８もしくは１１の１７１位のチロシンに対する前記置換が、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、ＱまたはＤからなる群から選択され、他の実施形態では、前述の位置のチロシンに対する置換がＧまたはＲからなる群から選択され；
配列番号１７の１５８位または配列番号２３もしくは２６の１７１位のアラニンに対する前記置換が、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、ＱまたはＤからなる群から選択され、他の実施形態では、前述の位置のアラニンに対する置換がＧまたはＲからなる群から選択され；
配列番号２０の１７１位のプロリンに対する前記置換が、Ｇ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、ＱまたはＤからなる群から選択され、他の実施形態では、前述の位置のチロシンに対する置換がＧまたはＲからなる群から選択され；
配列番号２の２０４位または配列番号５、１７、２９もしくは４４の１９２位または配列番号８、１１、１４、２０、２３、２６、３２、３５、３８、４１もしくは４７の２０５位のアルギニンに対する前記置換が、ＬまたはＮからなる群から選択され；
配列番号２の３２６位または配列番号５の３１４位または配列番号８もしくは１４の３２７位または配列番号１１の３２４位または配列番号１７の３１１位または配列番号２０の３２１位または配列番号２３もしくは２６の３２２位または配列番号２９の３１０位または配列番号３２、３５、３８、４１もしくは４７の３２３位または配列番号４４の３０９位のアルギニンに対する前記置換が、Ｐ、ＮまたはＡからなる群から選択され；
配列番号２０の３２１位のスレオニンに対する前記置換が、Ｐ、ＮまたはＡからなる群から選択され；
配列番号２もしくは５の３２９位のグリシンに対する前記置換が、Ｎ、Ｌ、ＴまたはＳからなる群から選択され；
配列番号８もしくは１４の３３０位または配列番号１１の３２７位または配列番号１７の３１１位または配列番号２０の３２４位または配列番号２３もしくは２６の３２５位または配列番号２９の３１３位または配列番号３２、３５、３８、４１もしくは４７の３２６位または配列番号４４の３１２位のグルタミン酸に対する前記置換が、Ｎ、Ｌ、ＴまたはＳからなる群から選択される、
請求項１に記載のＴｄＴ変異体。 - 配列番号２については、３２７位のグルタミンが置換されており；
配列番号５については、３１５位のグルタミン酸が置換されており；
配列番号８については、３２８位のグルタミンが置換されており；
配列番号１１については、３２５位のグルタミンが置換されており；
配列番号１４については、３２８位のグルタミンが置換されており；
配列番号１７については、３１２位のグルタミンが置換されており；
配列番号２０については、３２２位のグルタミンが置換されており；
配列番号２３については、３２３位のグルタミンが置換されており；
配列番号２６については、３２３位のメチオニンが置換されており；
配列番号２９については、３１１位のグルタミンが置換されており；
配列番号３２については、３２４位のグルタミンが置換されており；
配列番号３５については、３２４位のグルタミンが置換されており；
配列番号３８については、３２４位のグルタミンが置換されており；
配列番号４１については、３２４位のグルタミンが置換されており；
配列番号４４については、３１０位のグルタミンが置換されており；かつ
配列番号４７については、３２４位のグルタミンが置換されている、
請求項１または２に記載のＴｄＴ変異体。 - 前記グルタミンが、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、ＶおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項３に記載のＴｄＴ変異体。
- 前記３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドが、３’－Ｏ－アミノ－２’－デオキシヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－２’－デオキシヌクレオシド三リン酸および３’－Ｏ－アリル－２’－デオキシヌクレオシド三リン酸からなる群から選択される、請求項１、２、３または４のいずれかに記載のＴｄＴ変異体。
- 配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５または４８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体であって、
配列番号３については、アミノ酸位６１がＲであり、アミノ酸位１７１がＲであり、アミノ酸位２０５がＬであり、アミノ酸位３２７がＡであり、かつアミノ酸位３３０がＮであり；
配列番号６については、アミノ酸位４８がＲであり、アミノ酸位１５８がＲであり、アミノ酸位１９２がＬであり、アミノ酸位３１４がＰであり、かつアミノ酸位３１７がＮであり；
配列番号９については、アミノ酸位６１がＲであり、アミノ酸位１７１がＲであり、アミノ酸位２０５がＬであり、アミノ酸位３２７がＡであり、かつアミノ酸位３３０がＮであり；
配列番号１２については、アミノ酸位６１がＲであり、アミノ酸位１７１がＡであり、アミノ酸位２０５がＬであり、アミノ酸位３２４がＰであり、かつアミノ酸位３２７がＮであり；
配列番号１５については、アミノ酸位６１がＲであり、アミノ酸位１７１がＲであり、アミノ酸位２０５がＬであり、アミノ酸位３２８がＰであり、かつアミノ酸位３３１がＮであり；
配列番号１８については、アミノ酸位４８がＲであり、アミノ酸位１５８がＲであり、アミノ酸位１９２がＬであり、アミノ酸位３１１がＰであり、かつアミノ酸位３１４がＮであり；
配列番号２１については、アミノ酸位６１がＲであり、アミノ酸位１７１がＰであり、アミノ酸位２０５がＬであり、アミノ酸位３２１がＡであり、かつアミノ酸位３２４がＮであり；
配列番号２４については、アミノ酸位６１がＲであり、アミノ酸位１７１がＡであり、アミノ酸位２０５がＬであり、アミノ酸位３２２がＡであり、かつアミノ酸位３２５がＮであり；
配列番号２７については、アミノ酸位６１がＲであり、アミノ酸位１７１がＲであり、アミノ酸位２０５がＬであり、アミノ酸位３２７がＡであり、かつアミノ酸位３３０がＮであり；
配列番号３０については、アミノ酸位４８がＲであり、アミノ酸位１５８がＲであり、アミノ酸位１９２がＬであり、アミノ酸位３１０がＰであり、かつアミノ酸位３１３がＮであり；
配列番号３３については、アミノ酸位６１がＲであり、アミノ酸位１７１がＲであり、アミノ酸位２０５がＬであり、アミノ酸位３２３がＰであり、かつアミノ酸位３２６がＮであり；
配列番号３６については、アミノ酸位６１がＲであり、アミノ酸位１７１がＲであり、アミノ酸位２０５がＬであり、アミノ酸位３２３がＡであり、かつアミノ酸位３２６がＮであり；
配列番号３９については、アミノ酸位６１がＲであり、アミノ酸位１７１がＲであり、アミノ酸位２０５がＬであり、アミノ酸位３２３がＰであり、かつアミノ酸位３２６がＮであり；
配列番号４２については、アミノ酸位６１がＲであり、アミノ酸位１７１がＲであり、アミノ酸位２０５がＬであり、アミノ酸位３２３がＡであり、かつアミノ酸位３２６がＮであり；
配列番号４５については、アミノ酸位４８がＲであり、アミノ酸位１５８がＲであり、アミノ酸位１９２がＬであり、アミノ酸位３１０がＡであり、かつアミノ酸位３１３がＮであり；
配列番号４８については、アミノ酸位６１がＲであり、アミノ酸位１７１がＲであり、アミノ酸位２０５がＬであり、アミノ酸位３２３がＰであり、かつアミノ酸位３２６がＮであり；
（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、かつ（ｉｉ）核酸断片の遊離３’－ヒドロキシルに３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを組み込むことができる、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体。 - 配列番号３については、アミノ酸位３２８がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号６については、アミノ酸位３１５がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号９については、アミノ酸位３２８がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号１２については、アミノ酸位３２５がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号１５については、アミノ酸位３２９がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号１８については、アミノ酸位３１２がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号２１については、アミノ酸位３２２がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号２４については、アミノ酸位３２３がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号２７については、アミノ酸位３２８がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号３０については、アミノ酸位３１１がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号３３については、アミノ酸位３２４がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号３６については、アミノ酸位３２４がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号３９については、アミノ酸位３２４がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号４２については、アミノ酸位３２４がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；
配列番号４５については、アミノ酸位３１１がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択され；かつ
配列番号４８については、アミノ酸位３２４がＱであるか、またはＴ、Ｆ、ＬもしくはＭからなる群から選択される、
請求項６に記載のＴｄＴ変異体。 - 前記３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドが、３’－Ｏ－アミノ－２’－デオキシヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－２’－デオキシヌクレオシド三リン酸および３’－Ｏ－アリル－２’－デオキシヌクレオシド三リン酸からなる群から選択される、請求項６または７のいずれかに記載のＴｄＴ変異体。
- 配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５または４８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体であって、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、かつ（ｉｉ）ポリヌクレオチドの遊離３’－ヒドロキシルに３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを組み込むことができる、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体。
- 所定の配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法であって、
（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有する３’－末端ヌクレオチドを有するイニシエーターを提供する工程；
ｂ）（ｉ）伸長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有するイニシエーターまたは伸長された断片と、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸および請求項１～９のいずれか一項に記載のＴｄＴ変異体とを、イニシエーターまたは伸長された断片が、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の組み込みによって伸長されて、３’－Ｏ－ブロック伸長断片が形成されるように接触させること、および（ｉｉ）伸長された断片を脱ブロックして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長された断片を形成することをポリヌクレオチドが形成されるまで繰り返す工程、
を含む方法。 - 前記３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸が、３’－Ｏ－ＮＨ２－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－ヌクレオシド三リン酸、または３’－Ｏ－アリル－ヌクレオシド三リン酸である、請求項１０に記載の方法。
- ヌクレオチド組み込み反応を実施するためのキットであって、
ａ）請求項１～９のいずれか一項に記載のＴｄＴ変異体、ｂ）１または複数の３’－Ｏ－保護ヌクレオシド三リン酸、およびｃ）任意選択的に少なくとも１つのイニシエーター、
を含むキット。
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