CN106117288B - 二硫键连接的可逆终止子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了对多核苷酸进行测序的方法以及可用于多核苷酸测序的化合物、组合物。所述化学化合物包含：核苷酸及其类似物，其具有包含对3’‑OH基团加帽的可切割化学基团的糖部分，以及通过可切割连接体与可检测标记物附接的碱基，该可切割连接体包含二硫键。另外，所述二硫键和所述可切割化学基团均可被化学试剂切割。此外，在所述二硫键被所述化学试剂切割后，不存在与核苷酸的碱基连接的游离巯基基团。

Description

二硫键连接的可逆终止子
交叉引用
本申请要求于2015年5月8日提交的美国临时专利申请号62/159,017的权益，该申请通过引用全文并入本文。
背景技术
通常被称为新一代测序(NGS)技术的新测序方法已有望通过测序提供快速、廉价且准确的基因组信息。例如，高通量NGS(HT-NGS)法可以使科学家以较快的速度和较低的成本获得所需的基因序列。然而，有时HT-NGS的效率是以牺牲测序结果的准确性为代价获得的。在这种情况下，合成测序(SBS)方法可以允许更准确地确定掺入的碱基的身份，由此在HT-NGS中提供更高的保真度。SBS方法的一个关键步骤是在已经在链中的最后的核苷酸的3’-OH位置放置可去除的帽。因此，在其3’-OH位置具有可去除的帽的标记的核苷酸的合成对于SBS技术是有意义的。
发明内容
本发明提供了包含可逆终止子分子即核苷和核苷酸类似物的化学化合物，该核苷和核苷酸类似物具有与该核苷酸糖部分的3'羟基共价连接的可切割化学基团。此外，所述可逆终止子分子包含通过可切割连接体与核苷酸的碱基附接的可检测标记物。该可切割连接体包含二硫键，该二硫键可在化学试剂切割该核苷酸糖部分的3'羟基上的可切割化学基团的同时被相同的化学试剂切割。与3'羟基连接的共价键是可逆的，这意味着该可切割化学基团可通过化学和/或酶促过程去除。该可检测标记物可任选地是可猝灭的。该核苷酸类似物可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸分子和类似物及其衍生物。共价结合的可切割化学基团的存在被设计用于阻碍在基于酶的多核苷酸合成方法中使用的聚合酶的行进。
本发明的一个方面提供了一种核苷5’-三磷酸类似物，其具有1)糖部分，该糖部分包含对该糖的3’-OH基团加帽的可切割化学基团，以及2)通过可切割连接体与可检测标记物附接的碱基。所述可切割连接体包含二硫键。所述二硫键和对糖的3’-OH基团加帽的可切割化学基团均可被化学试剂切割。此外，在所述二硫键被所述化学试剂切割后，不存在与所述碱基连接的游离巯基基团。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述核苷5’-三磷酸类似物的碱基为嘌呤或嘧啶。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述核苷5’-三磷酸类似物的可检测标记物为荧光团。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述核苷5’-三磷酸类似物的碱基选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述核苷5’-三磷酸类似物的碱基为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)的类似物。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述核苷5’-三磷酸类似物的糖部分为2-脱氧核糖。在本文提供的方面的一些实施方案中，用于切割所述核苷5’-三磷酸类似物的化学试剂为三烷基膦或三芳基膦。在本文提供的方面的一些实施方案中，用于切割所述核苷类似物的化学试剂为三(2-羧乙基)膦。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述核苷5’-三磷酸类似物为式(I)或其盐和/或质子化形式：
Figure BDA0000984681160000021
其中：
X为O、S或BH3；
w为1、2、3、4或5；
B为任选取代的杂环核酸碱基或其类似物；
L1为第一连接基团，且L1的长度为3-25个原子；
L2为第二连接基团，且L2的长度为3-4个原子；
L3为第三连接基团，且L3的长度为4-47个原子；且
D1为所述可检测标记物。
在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)的核苷5’-三磷酸类似物进一步定义为：
L1为
Figure BDA0000984681160000031
n为0或1；
R1为
Figure BDA0000984681160000032
R2为
Figure BDA0000984681160000033
p为0-3，q为0-12，r为1-3；且Z为O或NH。
在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)的核苷5’-三磷酸类似物进一步定义为：
L2为且m为2或3。
在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)的核苷5’-三磷酸类似物进一步定义为：
L3为
Figure BDA0000984681160000035
Q独立地选自不存在、
Figure BDA0000984681160000036
Figure BDA0000984681160000038
且
R3和R4独立地为
Figure BDA0000984681160000039
p为0-3，q为0-12，r为1-3。
在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)的核苷5’-三磷酸类似物进一步定义为：
B选自
Figure BDA00009846811600000310
Y为CH或N。
在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)的核苷5’-三磷酸类似物进一步定义为：
w为1；
X为O；
L1为
Figure BDA0000984681160000041
L2为
Figure BDA0000984681160000042
L3为
Figure BDA0000984681160000043
R4为
Figure BDA0000984681160000044
p为0-3，q为0-12，r为1-3；且
Q选自不存在、
Figure BDA0000984681160000045
在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)的核苷5’-三磷酸类似物进一步定义为：
w为1；
X为O；
L1为
L2为
L3为
Figure BDA0000984681160000049
R4为
Figure BDA00009846811600000410
p为0-3，q为0-12，r为1-3；且
Q选自不存在、
Figure BDA00009846811600000412
在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)中的B选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)中的B为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)的类似物。在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)中的D1为荧光团。
在本文提供的方面的一些实施方案中，用于切割式(I)的化合物的化学试剂为三烷基膦或三芳基膦。在本文提供的方面的一些实施方案中，用于切割式(I)的化合物的化学试剂为三(2-羧乙基)膦。
本发明的另一个方面提供了一种组合物。该组合物包含四种作为可逆终止子的核苷5’-三磷酸，其中所述核苷5’-三磷酸的每个3’位置用可切割化学基团加帽，该可切割化学基团经由醚键与3’碳连接。所述四种核苷5’-三磷酸中的每一种具有不同的碱基，其中每个不同的碱基具有通过可切割连接体与其附接的不同的可检测标记物。此外，所述可切割连接体包含二硫键。所述二硫键和在3’位置的可切割化学基团可被化学试剂切割。由于每个不同的可逆终止子可包含不同的可检测标记物，从而实现了每种不同类型的可逆终止子的检测和区分。另外，在所述二硫键被所述化学试剂切割后，不存在与所述不同的碱基连接的游离巯基基团。
在本文针对所述组合物提供的方面的一些实施方案中，每个不同的可检测标记物为荧光团。在本文针对所述组合物提供的方面的一些实施方案中，所述化学试剂为三烷基膦或三芳基膦。在本文针对所述组合物提供的方面的一些实施方案中，所述化学试剂为三(2-羧乙基)膦。
本发明的另一个方面提供了用于对多核苷酸进行测序的方法，该方法包括：
在包含待测序的靶多核苷酸、与待测序的靶多核苷酸杂交的一种或多种多核苷酸引物、催化量的聚合酶以及一种或多种本发明公开的核苷5’-三磷酸类似物的反应体系中进行聚合反应。
在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，所述一种或多种5’-三磷酸类似物的浓度不大于400μM。在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，所述一种或多种5’-三磷酸类似物的浓度不大于100μM。在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，所述一种或多种5’-三磷酸类似物的浓度不大于50μM。在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，所述一种或多种5’-三磷酸类似物的浓度不大于10μM。在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，所述一种或多种5’-三磷酸类似物的浓度不大于5μM。在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，所述一种或多种5’-三磷酸类似物的浓度不大于3μM。在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，所述一种或多种5’-三磷酸类似物的浓度不大于2μM。
本发明的再一个方面提供了对多核苷酸进行测序的方法。该测序方法包括：在包含待测序的靶多核苷酸、与待测序的靶多核苷酸杂交的一种或多种多核苷酸引物、催化量的聚合酶以及一种或多种本发明公开的核苷5’-三磷酸类似物的反应体系中进行聚合反应；以及采用三烷基膦溶液处理所述聚合反应的产物。
在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，使用的三烷基膦为三(2-羧乙基)膦。在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，在采用所述三烷基膦溶液处理后，所述一种或多种根据权利要求1所述的核苷5’-三磷酸类似物没有与其碱基连接的游离巯基基团。
根据其中仅示出和描述了本发明的说明性实施方案的以下详述，本发明的其他方面和优点将变得对本领域技术人员十分明显。将会认识到，本发明能够实现其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些均不脱离本发明。相应地，附图和描述将被视为在本质上是说明性的，而非限制性的。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文，其程度犹如特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
附图说明
通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：
图1示出了三烷基膦切割本发明公开的可逆终止子的二硫键以及3’-OH上的可切割连接体的可能的机理。
图2示出了本发明的核苷酸终止子，其具有作为糖的脱氧核糖以及作为碱基的胸腺嘧啶/尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶(cytidine)和鸟嘌呤。这些可逆终止子可使用如本文提供的类似的化学法进行制备以得到标记的核苷酸终止子。
图3A和3B描绘了根据本发明用于制备修饰的胸腺嘧啶/尿苷脱氧核糖核苷酸以得到附接有BDP-FL-荧光团的可逆终止子的合成路径。
图4、5和6示出了根据本发明用于制备荧光素作为其荧光团的可逆终止子的合成路径。
图7示出了根据本发明用于制备以Alexa-530作为其荧光团的可逆终止子的合成路径。
图8和9示出了根据本发明用于制备以Alexa-647作为其荧光团的可逆终止子的合成路径。
图10和11描绘了根据本发明用于制备以Alexa-647作为其荧光团的可逆终止子的合成路径。
图12示出了使用本发明的化合物31使引物延伸成生长的DNA链。
图13示出了使用本发明的化合物33使引物延伸成生长的DNA链。
图14示出了使用本发明的化合物34使引物延伸成生长的DNA链。
具体实施方式
随着通过这些新技术所产生的数据迅速呈指数增长，涉及合成测序(SBS)的第二代测序(NGS)方法经历了快速的发展。该循环可逆技术包括可逆终止子的引入、荧光成像和切割。成功使用的可逆终止子可具有3’加帽基团、3’O-烯丙基(Intelligent bio)或3’-O-叠氮基甲基-dNTP(Illumina)，而标记物与碱基连接，该标记物充当报告分子并可被切割。另一种类型是3’-未封端的可逆终止子，在该可逆终止子中终止子基团与碱基以及荧光基团连接，该荧光基团不仅充当报告分子还充当可逆终止基团。
大多数NGS的主要问题为50-150个碱基的短读取长度。循环可逆技术中短读取长度的一个根本原因是迄今为止开发出的可逆终止子在切割携带荧光团的连接体后留下长疤痕(scar)(6-10个原子)。这类疤痕沿DNA复合体的大沟的积累不利地损害了DNA双螺旋结构的稳定性，从而阻碍了底物识别和引物延伸。
因此，存在开发与聚合酶良好协作并且能够在掺入生长链后终止链生长的核苷酸类似物的需要。由可逆终止子核苷酸类似物引起的在链延伸期间聚合酶活性的中止允许准确确定所掺入的核酸的身份。通过可逆终止子核苷酸类似物的随后修饰(其使聚合酶继续行进至生长的DNA链上的下一个位置)，在进行该准确确定后继续链合成的能力将是理想的。阻滞DNA聚合、随后去除所掺入的非天然核苷酸上的封端基团的过程在本文中被称为连续可逆终止(sequential reversible termination)。连续可逆终止的另一个要求是非天然核苷酸类似物必须容易去除，而不破坏生长的DNA链或聚合酶，即在温和的反应条件下终止必须是可逆的。本发明的又一目的在于发现既切割附接在掺入的核苷酸上的可检测标记物又切割在掺入的非天然核苷酸上的封端基团的化学试剂。
合成测序(SBS)和单碱基延伸(SBE)测序
若干种技术可用于实现高通量测序。(参见，Ansorge；Metzker；和Pareek等人,“Sequencing technologies and genome sequencing,”J.Appl.Genet.,52(4):413-435,2011,以及其中引用的参考文献)。SBS方法是用于在短时间内快速并有效地确定多个核苷酸序列片段的序列的、结合PCR改进如乳液PCR(emPCR)的常用方法。在SBS中，核苷酸通过聚合酶掺入，并且由于核苷酸被差异性地标记，所以掺入的核苷酸的信号得以通过灵敏仪器如相机确定，由此确定被掺入生长的合成多核苷酸链中的核苷酸的身份。
SBS方法常采用可逆终止子核酸，即含有共价修饰的碱基，该修饰一旦掺入生长链即阻碍通过聚合酶进行的进一步合成步骤。可随后例如采用化学品或特定的酶去除该共价修饰，以允许通过聚合酶添加下一个互补的核苷酸。其他方法采用连接测序技术，如Applied Biosystems SOLiD平台技术。其他公司如Helicos提供了通过使用非常灵敏的检测技术以及发射足以用于检测的光的特殊标记物，能够在SBS程序中检测单分子合成而无需预先样品扩增的技术。焦磷酸测序是一些可商购的NGS仪器采用的另一种技术。RocheApplied Science 454 GenomeSequencer涉及焦磷酸的检测(焦磷酸测序)。(参见，Nyren等人,“Enzymatic method for continuous monitoring of inorganic pyrophosphatesynthesis,”Anal.Biochem.,151:504-509,1985；还参见,美国专利申请公开号2005/0130173和2006/0134633；美国专利号4,971,903、6,258,568和6,210,891)。
采用本文公开的可逆终止子分子的测序可通过任何可用的手段进行。通常，可用技术的类别包括但不限于合成测序(SBS)、单碱基延伸测序(SBE)、连接测序、单分子测序和焦磷酸测序等。最适于本发明的化合物、组合物、方法和试剂盒的方法是SBS。许多可商购的仪器采用SBS来确定靶多核苷酸的序列。这些中的一些在下文简要概述。
Roche Applied Science 454GenomeSequencer采用的一种方法涉及焦磷酸的检测(焦磷酸测序)。(参见，Nyren等人,“Enzymatic method for continuous monitoring ofinorganic pyrophosphate synthesis,”Anal.Biochem.,151:504-509,1985)。与大多数方法一样，该过程从产生在所采用的***中起作用的、可处理长度(即约400-500bp)的核苷酸片段开始。(参见，Metzker,Michael A.,“Sequencing technologies—the nextgeneration,”Nature Rev.Gen.,11:31-46,2010)。将核苷酸引物与片段的任一端连接，并且通过与珠子结合随后进行乳液PCR来单独地扩增序列。然后使扩增的DNA变性，并随后将每个珠子放置在由玻璃纤维束制成的光纤芯片中的刻蚀的纤维的顶端。该纤维束在相对端具有灵敏的电荷耦合器件(CCD)相机，以检测从载有珠子的纤维的另一端发射的光。每个独特的珠子均位于纤维的末端，其中纤维自身被锚定至空间可寻址的芯片，其中每个芯片含有几十万根这样的附接有珠子的纤维。接着，采用SBS技术，为珠子提供与连接至DNA的相对端的引物互补的引物、聚合酶和仅一种天然核苷酸，即C或T或A或G，并使该反应进行。通过聚合酶掺入下一个碱基释放出光，该光通过在珠子的相对端的CCD相机进行检测。(参见，Ansorge,Wilhelm J.,“Next-generation DNA sequencing techniques,”New Biotech.,25(4):195-203,2009)。该光通过使用ATP硫酸化酶、包含腺苷5'磷酰硫酸、萤光素酶和焦磷酸而产生。(参见，Ronaghi,M.,“Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing,”Genome Res.,11(1):3-11,2001)。
被称为Genome Analyzer的可商购的仪器也采用SBS技术。(参见，Ansorge,第197页)。与Roche仪器相似，样品DNA首先被片段化成可处理的长度并进行扩增。扩增步骤有些独特，因为其包括形成单链DNA片段的约1,000个拷贝，这被称为聚合酶群落(polony)。简言之，将衔接子与DNA片段的两端连接，并随后将片段与共价连接有与该衔接子互补的引物的表面杂交，从而在表面上形成微桥。因此，这些杂交的片段的扩增产生了空间上共定位于表面的一个区域的扩增片段的小群落或簇。通过为表面提供聚合酶和各自采有不同染料进行荧光标记的可逆终止子核苷酸来引发SBS。在通过聚合酶掺入新的生长链后，采用CCD相机检测荧光信号。随后去除与可逆终止子核苷酸的3苷端共价连接的终止子部分以及荧光染料，从而使聚合酶重新开始进行下一轮的合成。(同上，还参见，美国专利号8,399,188；Metzker，第34-36页)。
许多SBS策略依赖于对可检测地标记的核苷酸和核苷酸类似物的掺入的检测。这样的检测可能依赖于荧光或其他光信号，但这并不是必需的。其他可用的技术是针对测量围绕核苷酸掺入事件的热量和pH的变化。(参见，美国专利号7,932,034和8,262,900；美国专利申请公开号20090127589；以及Esfandyarpour等人,“Structural optimization forheat detection of DNA thermosequencing platform using finite elementanalysis,”Biomicrofluidics,2(2):024102(1-11),2008)。一家生命科技公司Ion Torent在其基于离子感应的SBS仪器中采用了这种技术。在Ion Torent仪器中，使用场效应晶体管(FET)检测发生SBS聚合酶反应的微孔中的pH的细微变化。在微孔阵列中的每个孔均为含有聚合酶、靶标/模板链和生长互补链的单独的单分子反应容器。四种核苷酸连续循环进入孔中使得当核苷酸掺入生长DNA链时，对准每个微孔下方的FET检测pH的变化。FET将这种信号转换成电压的变化，该变化在大小上与在该合成步骤中掺入的核苷酸的总数相当。
在基于SBS的NGS方法中，可逆终止子核苷酸是以有效且准确的方式成功获得多核苷酸靶序列的身份的关键。本文的可逆终止子可通过置换在那些方法中先前描述的核苷酸和核苷酸类似物在任意这些情况下使用。即，本发明的可逆终止子的置换可增强和改善所有这些SBS和SBE方法。这些方案中的大多数都采用脱氧核糖核苷酸三磷酸或dNTP。同样地，本发明的可逆终止子可以以dNTP形式被置换。下文描述了在其他测序方法中有用的其他形式的本发明可逆终止子。
可逆终止子核苷酸
在SBS、SBE和类似方法的情况下使用可逆终止子分子的过程通常包括将标记的核苷酸类似物掺入生长的多核苷酸链，随后检测标记物，然后切割该核苷酸类似物以去除阻止继续合成的共价修饰。该切割步骤可采用酶或通过化学切割来完成。核苷酸的修饰可以在5′末端磷酸或3′羟基基团上进行。开发真正可逆的一组核苷酸终止子是多年来的目标。尽管最近取得了进展，但仅提出了少数解决方案，其中大多数均引起其他的问题，包括通过聚合酶的低效或不完全掺入，可去除基团的低效或不完全切割，或者切割步骤需要苛刻的条件，从而引起与该测定的残存部分和/或靶序列的保真度有关的伪(spurious)问题。在采用可逆终止子的标准SBS方案中，聚合酶必须适应核苷酸上的、用于附接荧光信号传导部分的突出基团，以及在3′-OH上的封端基团。天然的聚合酶对这些修饰，特别是3′-封端基团具有低耐受性。聚合酶的诱变对于获得具有可接受的掺入效率的酶是必要的。在从碱基上切割荧光团后，许多目前的方法在剩余的核碱基上留下非天然的“疤痕”。(参见例如，Metzker,Michael A.,“Sequencing technologies—the next generation,”NatureRev.Gen.,11:31-46,2010以及Fuller等人,“The challenges of sequencing bysynthesis,”Nat.Biotech.,27(11):1013-1023,2009)。
因此，已证明有限数目的适合于封闭3′-氧的基团在与某些使得酶能够耐受在3′-位置的修饰的突变聚合酶组合使用时是有用的。这些基团包括叠氮基甲基、烯丙基和烯丙氧基羰基。(参见例如,Metzker等人,“Termination of DNA synthesis by novel 3′-modified deoxyribonucleoside triphosphates,”Nucleic Acids Res.,22:4259-4267,1994；以及美国专利号5,872,244；6,232,465；6,214,987；5,808,045；5,763,594和5,302,509；以及美国专利申请公开号20030215862)。这些基团需要施加化学试剂来实现切割。已证明，在3'-位置的羧酸酯、碳酸酯或硫代碳酸酯基团太不稳定，以至于不能有效作为链终止子，这在表面上是由于与外切核酸酶活性不同的聚合酶固有的编辑活性。(参见,CanardB&Sarfati R.,“DNA polymerase fluorescent substrates with reversible 3′-tags,”Gene,148:1-6,1994)。
我们在此报道了新的一类荧光标记的可逆终止子。
这类新的荧光标记的可逆终止子具有3'-叠氮基甲基封端基团和将荧光团标签与碱基连接的二硫基烷氧基羰基氨基。将终止子暴露于还原剂如三(2-羧乙基)膦(TCEP)将不仅切割3’-叠氮基甲基官能团，而且还原二硫键，从而通过所得硫阴离子的分子内环化触发氨基甲酸酯键的同时切割。更重要的是，荧光团的切割将仅在碱基上留下小(4个原子)的疤痕，并且还将消除通常与碱基上的二硫键切割有关的高反应性巯基末端官能团(图1)。通过切割的荧光团的独特的荧光发射来确定DNA序列，并且叠氮基甲基基团的同时去除使3’-OH官能团再生，以供进一步的聚合酶延伸反应。
应注意，尽管图1示出了本发明的可逆终止子可以与三烷基膦反应的所提出的机理，但当可逆终止子掺入到DNA或RNA链中时，类似的机理也是可能的。在这种情况下，图1中示出的可逆终止子的三磷酸部分将被与DNA或RNA链的末端连接的磷酸二酯键替代。相应地，由于可逆终止子的3’-OH基团被叠氮基甲基基团加帽，所以DNA或RNA链的生长将终止或停止。然而，与上文所阐述的类似，当用三烷基膦如TCEP处理时，与碱基附接的荧光团和糖的3’-OH基团上的加帽部分都将被切割。在DNA或RNA链的末端上掺入的可逆终止子的暴露的3’-OH基团将允许DNA和RNA继续链生长。
此外，尽管图1中示出的可逆终止子是三磷酸，但如本发明其他部分所示，在核苷酸的5’位置处允许其他的三磷酸类似物。
图3A和3B示出了四种示例性3’-O-叠氮基甲基修饰的标记的核苷酸三磷酸的合成，其中BDP-FL-荧光团通过二硫基乙氧基羰基氨基键与嘧啶(C或U)的C-5位置或嘌呤碱基(A和G)的C-7位置附接(如图2所示)。用于制备修饰的尿苷核苷酸的合成路径在图3A和3B中示出。如图3A(流程：新的3’-O-叠氮基甲基-5-二硫-连接的终止子的合成)所示，通过5-碘-2'脱氧尿苷(1)与N-三氟乙酰基炔丙基胺的钯催化偶联制备的5-炔丙基-三氟乙酰氨基尿苷(2)的硅烷化产生5'-O-叔丁基二甲基硅烷基-5-(3-三氟乙酰氨基丙炔基)-2'-脱氧尿苷(3)。然后，采用DMSO、乙酸和乙酸酐通过Pummerer重排将3中的3’-羟基基团转化成3’-O-甲氧基甲基硫化物，以产生中间体4。中间体4首先通过采用硫酰氯原位转化成3’-O-氯甲基，随后接着与叠氮化钠反应，而在一锅反应中进一步转化成相应的3’-叠氮基甲基衍生物5。通过四丁基氟化铵去除5’-硅烷基基团得到3'-叠氮基甲氧基-5-(3-氨基丙炔基)-2'脱氧尿苷(6)。通过活化碳酸酯9合成连接体10。因此，可商购的2,2'-二硫基联吡啶与2-巯基乙醇缩合得到中间体8。中间体8进一步与4-硝基苯基氯碳酸酯反应，以得到吡啶基-二硫基碳酸酯9。由二硫化物9和己-5-炔-1-硫醇获得的活化碳酸酯连接体10最后与6缩合，以得到关键的中间体3'-叠氮基甲基-5-二硫基碳酸酯-2'-脱氧尿苷11。
现在转到图3B。11的三磷酸化得到三磷酸中间体12。随后中间体12与叠氮基BDP-FL-荧光团(可商购自Lumiprobe Corporation,Hallandale Beach,FL,USA)的缩合得到所需的荧光标记的三磷酸核苷酸终止子13。类似于图3A和3B中所示的策略，其他叠氮基荧光团可用于标记不同的染料。
可采用图3A和3B中所示的类似的化学法制备其他具有脱氧腺嘌呤、胞苷和鸟嘌呤的核苷酸终止子，以得到如图2中所示的标记的核苷酸终止子。
本领域技术人员将认识到，存在合成通式(I)的可逆终止子的多种不同的路径：
其中w为1-5；X为O、S或BH3；B为核苷酸碱基或其类似物；L1-3为连接体；D1为可检测标记物。
例如，L1与羰基基团之间的键可由两个相应的中间体形成；L2与羰基基团之间的键可由两个相应的中间体形成；二硫键可由两个相应的中间体形成；并且L3可通过将两个中间体通过键形成步骤连接在一起而形成。L1-3中的每一个均可含有另外的键形成位置点以将两个中间体连接在一起，以便形成可逆终止子。虽然本发明仅呈现了较少的产生可逆终止子的合成路径，但当考虑到目标可逆终止子的特定结构时，其他相似或不同的合成路径也是可能的。这类用于连接两个中间体的合成方法是本领域技术人员公知的标准且常用的公开程序。
为了制备根据本发明的可逆终止子，核苷向相应的核苷5’-三磷酸的转化可采用实现该目的的多种公开方案中的任一种。(参见例如，Caton-Williams J等人,“Use of aNovel 5′-Regioselective Phosphitylating Reagent for One-Pot Synthesis ofNucleoside 5′-Triphosphates from Unprotected Nucleosides,”Current Protocolsin Nucleic Acid Chemistry,2013,1.30.1-1.30.21；Nagata S等人,“Improved methodfor the solid-phase synthesis of oligoribonucleotide 5′-triphosphates,”Chem.Pharm.Bull.,2012,60(9):1212-15；Abramova等人,“A facile and effectivesynthesis of dinucleotide 5′triphosphates,”Bioorg.Med.Chem.,15:6549-6555,2007；Abramova等人,“Synthesis of morpholine nucleoside triphosphates,”Tet.Lett.,45:4361,2004；Lebedev等人,“Preparation of oligodeoxyribonucleotide5'-triphosphates using solid support approach,”Nucleos.Nucleot.Nucleic.Acids,20:1403,2001；Hamel等人,“Synthesis of deoxyguanosine polyphosphates and theirinteractions with the guanosine 5′-triphosphate requiring protein syntheticenzymes of Escherichia coli,”Biochemistry,1975,14(23):5055-5060；Vaghefi M.,“Chemical synthesis of nucleoside 5′-triphosphates,”In:NucleosideTriphosphates and their Analogs,pp.1-22,Taylor&Francis,2005；Burgess等人,“Synthesis of nucleoside triphosphates,”Chem.Rev.,100:2047-2059,2000)。
本发明中的可逆终止子在糖部分的3′氧处包含叠氮基甲基基团。这种类型的可逆终止子核苷酸在用于确定多核苷酸序列的方法中是有用的。这些可逆终止子核苷酸在其中有用的方法包括但不限于自动化Sanger测序、包括但不限于合成测序的NGS法，等等。几乎任何已知的分析或检测多核苷酸的方法均可任选地采用本文公开的可逆终止子核苷酸。这类方法可任选地采用与模板共价结合的固体基底。该固体基底可以是颗粒或微粒或在当前用于核酸测序的仪器中使用的该类型的平的固体表面。(参见例如，Ruparel等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,102:5932-5937,2005；EP 1,974,057；WO 93/21340以及美国专利号5,302,509和5,547,839，以及其中引用的参考文献)。任选地，采用本文公开的可逆终止子核苷酸的测序反应可以在溶液中进行，或者该反应在固相如微阵列或微珠上进行，其中DNA模板与固体支持物关联。固体支持物可包括但不限于板、珠子、微珠、须状物(whisker)、纤维、梳状物(comb)、杂交芯片、膜、单晶、陶瓷和自组装单层等。模板多核酸可以通过共价结合(如通过使用偶联剂的缀合)或通过非共价结合(如静电相互作用、氢键或抗体-抗原偶联)或通过其组合而附接至固体支持物。存在许多种将核酸附接至固体支持物的已知方法。
连接体
本文涉及的连接体具有足够的长度和稳定性，以允许通过化学或酶手段有效水解或去除。有用的连接体将是容易获得的，并且可以能够在连接体的一端上或在连接体中间与羟基部分(或碱基或亲核体)反应。连接体的一端可以能够被标记基团如D1或可检测标记物结合或修饰。如果连接体与封端基团附接或者如果连接体与可检测标记物附接，则任选地由其他官能团衍生的连接体中的碳或原子的数目必须具有足够的长度以允许封端基团的化学或酶切割。
尽管为了获得最佳结果，针对不同的反应体系，精确的距离或间距可以不同，但在许多情况下将希望提供保持大体积的标记物部分远离核苷酸一定距离的连接，例如长度为1到20nm的连接体，以减少酶结合位点的空间拥挤。因此，连接体的长度可以是例如1-50个原子长，或1-40个原子长，或2-35个原子长，或3到30个原子长，或5到25个原子长，或10到20个原子长，等等。
连接体可以由任意数目的基础化学起始块组成。例如，连接体可包含在糖基团与可检测标记物例如D1之间提供有用的距离的直链或支链的烷基、烯基或炔基链或其组合。例如，氨基-烷基连接体如氨基-己基连接体已用于提供标记物与核苷酸类似物的附接，并且其通常足够刚性以维持这样的距离。这类连接体中最长的链可包含多达2个原子、3个原子、4个原子、5个原子、6个原子、7个原子、8个原子、9个原子、10个原子，或甚至11-35个原子，或甚至35-50个原子。直链或支链连接体还可含有除碳以外的杂原子，包括但不限于氧、硫、磷和氮。由于与聚氧乙烯相关的亲水性质，聚氧乙烯链(通常也被称为聚乙二醇或PEG)是优选的连接体组分。杂原子如氮和氧向连接体中的***可影响连接体的溶解性和稳定性。
连接体可以在性质上是刚性的或是柔性的。通常，刚性结构包含横向刚性的化学基团，例如，环结构如芳族化合物、相邻基团之间的多个化学键例如双键或三键，以便防止基团相对于彼此旋转，以及由此导致的赋予整个连接体的柔性。因此，期望的刚性程度可以根据连接体的内含物或组成该连接体的单个原子之间的键的数目而改变。此外，沿连接体添加环状结构可以赋予刚性。环状结构可包括芳环或非芳环。环的大小可以是3个碳原子到4个碳原子、到5个碳原子或甚至6个碳原子中的任一个。环还可以任选地包含杂原子如氧或氮，并且也可以是芳族或非芳族的。环可以另外任选地被其他烷基基团和/或取代的烷基基团所取代。
包含环或芳香结构的连接体可包括例如芳基炔和芳基酰胺。本发明的连接体的其他实例包括寡肽连接体，该寡肽连接体还可任选地在其结构内包含环结构。
例如，在一些情况下，可以采用具有螺旋或其他刚性结构的多肽连接体。这类多肽可以由刚性单体组成(该单体从其一级结构以及从其螺旋二级结构两者衍生出刚性)，或者可以由赋予刚性二级或三级结构如螺旋、原纤维、片层等的其他氨基酸或氨基酸组合或序列组成。举例而言，可以采用结构化的刚性蛋白质如纤维蛋白、胶原蛋白、微管蛋白等的多肽片段作为刚性连接体分子。
将可检测标记物与核苷酸的碱基附接的所有连接体均包含本发明的二硫化物部分。此外，第二可切割基团如碳酸酯或氨基甲酸酯被置于二硫键与碱基之间的二硫键附近。二硫键与第二可切割基团之间的间距可以是2或3个原子。在一些实施方案中，该间距可以是任选地具有1或2个取代的亚乙基基团。在其他实施方案中，该间距可以是任选地具有1-3个取代的亚丙基基团。
标记物和染料
本发明的可逆终止子的标记物或可检测标记物如D1可以是包含一种或多种合适的化学物质或酶的任何部分，该化学物质或酶在化学、物理或酶促反应中直接或间接地产生可检测信号。许多种标记物是本领域公知的。(参见例如，PCT/GB2007/001770)。
例如，这类标记物中的一类是荧光标记物。荧光标记物具有以下优点：其以若干个不同的波长(颜色)出现，使得能够可区分地标记各个不同的终止子分子。(参见例如，Welch等人,Chem.Eur.J.,5(3):951-960,1999)。这类标记物的一个实例是丹磺酰基-官能化的荧光部分。另一个实例是基于花青的荧光标记物Cy3和Cy5，其也可以在本发明中使用。(参见，Zhu等人,Cytometry,28:206-211,1997)。适合使用的标记物还公开于以下文献中：Prober等人,Science,238:336-341,1987；Connell等人,BioTechniques,5(4):342-384,1987；Ansorge等人,Nucl.Acids Res.,15(11):4593-4602,1987；以及Smith等人,Nature,321:674,1986。其他可商购的荧光标记物包括但不限于荧光素和相关的衍生物如异硫氰酸酯衍生物，例如FITC和TRITC、罗丹明，包括TMR、德克萨斯红和Rox、氟硼吡咯(bodipy)、吖啶、香豆素、芘、苯并蒽、花青苷、琥珀酰亚胺酯如NHS-荧光素、马来酰亚胺活化的荧光团如荧光素-5-马来酰亚胺、含有受保护的荧光素的亚磷酰胺试剂、硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)染料以及其他荧光团，例如6-FAM亚磷酰胺2。根据需要并根据本申请，所有这些类型的荧光标记物可组合使用、混合使用以及分组使用。
多种可商购的荧光标记物是本领域已知的，如Alexa Fluor染料，例如，Alexa488、555、568、660、532、647和700(Invitrogen-Life Technologies,Inc.,California,USA，以很多种波长可用，参见例如，Panchuk等人,J.Hist.Cyto.,47:1179-1188,1999)。被称为ATTO染料的一大组荧光标记物也是可商购的(可从德国锡根(Siegen)的ATTO-TECGmbH获得)。由于如此之多的不同的吸收和发射谱是可商购的，因此这些荧光标记物可以组合或混合使用，以便为测定中使用的所有终止子分子提供可区分的发射谱。
在各个示例性实施方案中，标记物包含荧光染料，诸如但不限于，罗丹明染料，例如R6G、R1 10、TAMRA和ROX；荧光素染料，例如JOE、VIC、TET、HEX、FAM等；卤代-荧光素染料；花青染料，例如CY3、CY3.5、CY5、CY5.5等；
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染料，例如FL、530/550、TR、TMR等；二氯罗丹明染料；能量转移染料，例如BIGD YETMv 1染料、BIGD YETMv 2染料、BIGD YETMv 3染料等；Lucifer染料，例如Lucifer黄等；CASCADEOregon Green等。其他示例性染料在Haugland,Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and ResearchProducts,第九版.(2003)及其更新文本中提供。非限制性的示例性标记物还包括例如生物素、弱荧光标记物(参见例如，Yin等人,Appl Environ Microbiol.,69(7):3938,2003；Babendure等人,Anal.Biochem.,317(1):1,2003；以及Jankowiak等人,Chem.Res.Toxicol.,16(3):304,2003)、非荧光标记物、比色标记物、化学发光标记物(参见，Wilson等人,Analyst,128(5):480,2003；Roda等人,Luminescence,18(2):72,2003)、拉曼标记物、电化学标记物、生物发光标记物(Kitayama等人,Photochem.Photobiol.,77(3):333,2003；Arakawa等人,Anal.Biochem.,314(2):206,2003；以及Maeda,J.Pharm.Biomed.Anal.,30(6):1725,2003)，等等。
本发明中也可以使用多个标记物。例如，双荧光团FRET盒(Tet.Letts.,46:8867-8871,2000)是本领域公知的，并且可在本文公开的方法中使用。还可以使用多氟(Multi-fluor)树枝状体系(J.Amer.Chem.Soc.,123:8101-8108,2001)。其他形式的可检测标记物也是可用的。例如，包括量子点(Empodocles等人,Nature,399:126-130,1999)、金纳米颗粒(Reichert等人,Anal.Chem.,72:6025-6029,2000)、微珠(Lacoste等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97(17):9461-9466,2000)在内的微粒以及可通过质谱法检测的标签均可以使用。
本发明中也可以使用多组分标记物。多组分标记物是依赖于与另一种化合物的相互作用进行检测的标记物。生物学中最常用的多组分标记物是生物素-链霉亲和素体系。生物素用作与核苷酸碱基附接的标记物。然后单独添加链霉亲和素以使得检测能够发生。其他的多组分体系是可获得的。例如，二硝基酚具有可商购的、可用于检测的荧光抗体。
因此，如本文定义的“标记物”是有利于分子的检测的部分。本发明的背景下的常见标记物包括荧光、发光、光散射和/或比色标记物。合适的标记物还可包括放射性核素、底物、辅因子、抑制剂、化学发光部分、磁性颗粒等。教导这类标记物的使用的专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。作为其他非限制性实例，标记物可以是发光标记物、光散射标记物(例如，胶体金颗粒)或酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP))。
也可以采用荧光能量转移(FRET)染料，如来自德国的Dyomics GmbH的DY-630/DY-675，Dyomics GmbH还在商业上供应许多不同类型的染料，包括基于酶的标记物、荧光标记物等(参见例如，Dohm等人,“Substantial biases in ultra-short read data sets fromhigh-throughput DNA sequencing,”Nucleic Acids Res.,36:e105,2008)。其他供体/接受体FRET标记物包括但不限于：
Figure BDA0000984681160000201
(还参见，Johansen,M.K.,“Choosing Reporter-Quencher Pairs for EfficientQuenching Through Formation of Intramolecular Dimers,”Methods in MolecularBiology,vol.335:Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes:Designs andProtocols,由V.V.Didenko编著,Humana Press Inc.,Totowa,N.J.)。其他染料猝灭剂是可商购的，包括dabcyl、QSY猝灭剂等。(还参见，Black Hole Quencher Dyes，来自BiosearchTechnologies,Inc.,Novato,Calif.；Iowa Black Dark Quenchers，来自Integrated DNATechnologies,Inc.,Coralville,Iowa；以及由Santa Cruz Biotechnology,Inc,Dallas,Tex.出售的其他染料猝灭剂)。
标记物和连接体构建体可以具有足以阻止另外的核苷酸掺入到本发明的核苷酸上的大小或结构。这允许进行受控的聚合。该阻止可以是由于空间位阻，或者可以是由于大小、电荷和结构的组合而产生的。
SBS/SBE测序中使用的聚合酶
如上文已经评论的，SBS或SBE技术面临的一个关键挑战是寻找能够被聚合酶有效掺入并且提供可以在掺入后容易去除的封端基团的可逆终止子分子。因此，为了实现本发明请求保护的方法，必须选择对核苷类似物分子的糖部分的3′和5′端处的修饰耐受的聚合酶。这样的耐受的聚合酶是已知并且可商购的。
优选的聚合酶缺乏3′-外切核酸酶或其他编辑活性。如别处报道的，9°N-7(exo-)DNA聚合酶的突变形式可进一步改善对这类修饰的耐受性(WO 2005024010；WO2006120433)，同时保持高活性和特异性。合适的聚合酶的一个实例是来源于热球菌属(Thermococcus)种9°N-7的THERMINATORTMDNA聚合酶(New England Biolabs,Inc.,Ipswich,MA)——一种B家族DNA聚合酶。9°N-7(exo-)DNA聚合酶含有导致3′-5′外切核酸酶缺乏的D141A和E143A变异。(参见，Southworth等人,“Cloning of thermostable DNApolymerase from hyperthermophilic marine Archaea with emphasis onThermococcus species 9°N-7and mutations affecting 3′-5′exonuclease activity,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93(11):5281-5285,1996)。THERMINATORTMI DNA聚合酶是还含有A485L变异的9°N-7(exo-)。(参见，Gardner等人,“Acyclic and dideoxy terminatorpreferences denote divergent sugar recognition by archaeon and Taq DNApolymerases,”Nucl.Acids Res.,30:605-613,2002)。THERMINATORTMIII DNA聚合酶是还拥有L408S、Y409A和P410V突变的9°N-7(exo-)酶。后面这些变异表现出对碱基和3′位置上被修饰的核苷酸的耐受性改善。在本发明方法和试剂盒中有用的另一种聚合酶是KOD DNA聚合酶的exo-突变体——古生热球菌(Thermococcus kodakaraensis)KOD1DNA聚合酶的重组形式。(参见，Nishioka等人,“Long and accurate PCR with a mixture of KOD DNApolymerase and its exonuclease deficient mutant enzyme,”J.Biotech.,88:141-149,2001)。热稳定的KOD聚合酶能够以高准确度和高产率将靶DNA扩增到最多6kbp。(参见，Takagi等人,“Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp.strainKOD1and its application to PCR,”App.Env.Microbiol.,63(11):4504-4510,1997)。其他的聚合酶有Vent(exo-)、Tth聚合酶(exo-)和Pyrophage(exo-)(可获自Lucigen Corp.,Middletown,WI,US)。另一种非限制性的示例性DNA聚合酶为增强的DNA聚合酶或EDP。(参见WO 2005/024010)。
当采用SBE测序时，合适的DNA聚合酶包括但不限于DNA聚合酶I的Klenow片段、SEQUENASETM1.0和SEQUENASETM2.0(U.S.Biochemical)、T5DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、THERMOSEQUENASETM(具有Tabor-Richardson突变的Taq聚合酶(参见Tabor等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6339-6343,1995)以及本领域已知或本文描述的其他聚合酶。还可以使用具有改善的掺入本发明核苷酸类似物的能力的这些聚合酶的修饰形式。
此外，已经报道，改变聚合酶的反应条件可以影响其随意性(promiscuity)，从而允许掺入修饰的碱基和可逆终止子分子。例如，已经报道，向聚合酶反应缓冲液添加特定的金属离子例如Mn2+导致对修饰的核苷酸的耐受性改善，但以牺牲特异性为代价(错误率)。反应的其他改变可包括以更高或更低的温度、更高或更低的pH、更高或更低的离子强度进行反应，在反应中包含共溶剂或聚合物，等等。
随机或定向诱变也可用于产生衍生自天然物种的突变聚合酶的文库；并且可以筛查该文库以选择具有最佳特性如改善的效率、特异性和稳定性、pH以及最佳温度等的突变体。在测序方法中有用的聚合酶通常是衍生自天然来源的聚合酶。可对聚合酶进行修饰以改变其对修饰的核苷酸的特异性，如在例如WO 01/23411、美国专利号5,939,292和WO 05/024010中所描述的。而且，聚合酶不必衍生自生物***。
去封闭：3'封端基团和可检测标记物的去除
在掺入后，3'封端基团(叠氮基甲基基团)和经由二硫键与核苷酸的碱基附接的可检测标记物都可以通过包括但不限于化学手段的各种手段从可逆终止子分子中去除。封端基团的去除将生长的多核苷酸链再活化或释放，从而使其游离以可用于随后通过聚合酶进行的延伸。这使得引物能够以顺序方式受控地延伸单个核苷酸。本文公开的可逆终止子特别地被设计用于允许通过化学手段进行这样的去除，相比于酶手段，化学手段有时是优选的。
在一个实施方案中，用于进行去封闭反应的化学试剂是三烷基膦和三芳基膦。在另一个实施方案中，用于进行去封闭反应的化学试剂是三烷基膦。在又一个实施方案中，用于进行去封闭反应的化学试剂是三(2-羧乙基)膦。
三烷基膦可以在水的存在下将叠氮化物还原成相应的胺，该过程被称为施陶丁格(Staudinger)反应。膦充当来自于水的氧接受体，而来自于水的氢原子添加至叠氮化物以形成胺产物并消除氮气作为副产物。通常，对于将叠氮化物还原成胺，三烷基膦比三芳基膦更有效。
类似地，三烷基膦在水中将有机二硫化物还原成硫醇。此外，磷-氧键的强度使得还原不可逆。由于三烷基膦在水溶液中是动力学稳定的、对于二硫键还原是选择性的并且对许多其他官能团(除二硫化物或叠氮化物外)是非反应性的，因此它们在包括与核苷酸如DNA和RNA分子的反应在内的生物化学应用中是有吸引力的还原剂。
三烷基膦相对于三芳基膦(例如，Ph3P)的一个优点是前者更有可能是液体，这可以更容易地防止暴露于空气。使用三烷基膦的另一个优点是，所得三烷基膦氧化物可以是水溶性的，因此容易通过用水溶液简单洗涤而从水不溶性产物中去除。
定义
所有术语旨在按照其将被本领域技术人员所理解的含义来理解。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。下列定义对本领域中的那些定义进行补充并且是针对本申请的，并且不转用到任何相关或不相关的情形，例如任何共同拥有的专利或申请。本文描述了优选的材料和方法，尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料均可用于实施本发明的测试。因此，本文所用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，并非意在限制。
如在本说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提及“一个分子”包括多个这样的分子，等等。
如本文所用的，术语“约”表示给定量的值在该值的+/-10％内变化，或任选地在该值的+/-5％内变化，或者在一些实施方案中，在如此描述的值的+/-1％内变化。
术语“羟基保护基团”意在包括任何这样的基团：其形成对于预期反应稳定的羟基基团的衍生物，其中所述羟基保护基团随后可任选地被选择性地去除。所述羟基衍生物可以通过羟基保护剂与羟基基团的选择性反应来获得。
术语“互补的”是指例如在相关的测定条件下与其“互补序列”形成稳定双链体的多核苷酸。通常，彼此互补的两个多核苷酸序列具有少于约20％碱基、少于约10％碱基、优选少于约5％碱基的错配，并且更优选没有错配。
根据上下文，“多核苷酸序列”或“核苷酸序列”是核苷酸的聚合物(寡核苷酸、DNA、核酸等)或是代表核苷酸聚合物的字符串。根据任何指定的多核苷酸序列，可以确定给定的核酸或互补多核苷酸序列(例如，互补核酸)。
“连接基团”可以是如本发明中描述的可裂解连接体，或者是选自亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂芳基烷基、亚杂环基烷基、亚芳基、亚杂芳基或[R2-K-R2]n的基团，并且每个连接基团均可以被0-6个R5取代；每个R2独立地为亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂芳基烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基烷基；K不存在或为–O–、–S–、–S(O)–、–S(O2)–、–C(O)–、–C(O)O–、–C(O)N(R3)–或
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R3为氢、被0-6个R5取代的烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基；R5为卤素、烷基、–OR6、–N(R6)2、–SR6、–S(O)R6、–SO2R6或–C(O)OR6；每个R6独立地为-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基或杂环烷基；且n为1-4的整数。
“糖部分”包括核糖和脱氧核糖及其衍生物/类似物。
两个多核苷酸当例如在相关的测定条件下缔合形成稳定双链体时“杂交”。核酸杂交是由于多种良好表征的物理化学力，如氢键结合、溶剂排斥、碱基堆积等。核酸杂交的广泛指导见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,第I部分第2章,“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”(Elsevier,New York)以及下文的Ausubel。
术语“多核苷酸”(和等价术语“核酸”)包括可以与核苷酸串对应的单体单元的任何物理串，包括核苷酸的聚合物，例如，典型的DNA或RNA聚合物、肽核酸(PNA)、修饰的寡核苷酸，例如，包含对于生物学RNA或DNA不典型的核苷酸的寡核苷酸，如2′-O-甲基化的寡核苷酸，等。多核苷酸的核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸类似物，可以是天然的或非天然的，并且可以是未置换的、未修饰的、置换的或修饰的。核苷酸可以通过磷酸二酯键或通过硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、硼烷磷酸酯键等连接。多核苷酸可另外包含非核苷酸元件，如标记物、猝灭剂、封端基团等。多核苷酸可以是例如单链的或双链的。
在核酸类似物的语境中，术语“类似物”意在表示多种已知核酸类似物中的任一种，诸如但不限于LNA、PNA等。此外，“核苷三磷酸类似物”可含有3-7个磷酸基团，其中磷酸上的一个氧(-O-)可以被硫(-S-)或硼烷(-BH3 -)替代。另外，“核苷三磷酸类似物”可含有碱基，该碱基为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的类似物。例如，包括以下的碱基：
其中Y为CH或N。
在本申请中使用的术语“芳族”意指根据休克尔规则(Huckel's rule)，具有至少一个具有共轭π电子体系的环(即，具有4n+2个离域电子的芳族碳分子)的芳族基团，并且包括碳环芳基(例如，苯基)和杂环芳基(例如，吡啶)。该术语包括单环或稠环多环(即，共享相邻的碳原子对的环)基团。
本文中使用的术语“杂环核酸碱基”意指DNA或RNA的含氮碱基。这些碱基可分为两类：嘌呤和嘧啶。前者包括鸟嘌呤和腺嘌呤，而后者包括胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。
如在本发明中使用的，在“芳族溶剂”的语境中使用的术语“芳族”意指任何已知的和/或可商购的芳族溶剂，诸如但不限于甲苯、苯、二甲苯、任何的Kesol和/或GaroSOL，及其衍生物和混合物。
除非另有说明，术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分意指直链或支链或环状烃基或它们的组合，其可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并且可包括二价和多价基团，具有指定的碳原子数，即，C1-C10意指在链中有一至十个碳原子。饱和烃基的非限制性实例包括诸如以下的基团：甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，异丁基，仲丁基，环己基，(环己基)甲基，环丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基基团是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基基团的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和更高级的同系物和异构体。除非另有说明，术语“烷基”还意在包括以下更详细定义的那些烷基衍生物，诸如“杂烷基”。
术语“亚烷基”本身或作为另一个取代基的一部分意指衍生自烷烃的二价基团，例如但不限于—CH2CH2CH2CH2—，并进一步包括以下描述为“亚杂烷基”的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)基团具有1至24个碳原子，在本发明中优选具有10个或更少的碳原子的那些基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基基团，一般具有八个或更少的碳原子。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫基”(或硫代烷氧基)以它们的常规意义使用，并分别指经由氧原子、氨基基团或硫原子与分子的其余部分附接的那些烷基基团。
除非另有说明，术语“杂烷基”本身或与另一术语组合起来意指稳定的直链或支链或环状烃基，或它们的组合，其由规定数目的碳原子和至少一个选自O、N、Si和S的杂原子组成，并且其中氮和硫原子可任选地被氧化并且氮杂原子可任选地被季铵化。杂原子O、N和S和Si可以置于杂烷基基团的任何内部位置或烷基基团附接至分子的其余部分的位置。实例包括但不限于—CH2—CH2—O—CH3、—CH2—CH2—NH—CH3、—CH2—CH2—N(CH3)—CH3、—CH2—S—CH2—CH3、—CH2—CH2、—S(O)—CH2、—CH2—CH2—S(O)2—CH3、—CHCH—O—CH3、—Si(CH3)3、—CH2—CHN—OCH3和—CHCH—N(CH3)—CH3。最多两个杂原子可以是连续的，诸如—CH2—NH—OCH3和—CH2—O—Si(CH3)3。类似地，术语“亚杂烷基”本身或作为另一个取代基的一部分意指衍生自杂烷基的二价基团，例如但不限于—CH2—CH2—S—CH2—CH2—和—CH2—S—CH2—CH2—NH—CH2—。对于亚杂烷基基团，杂原子还可以占据链的任一端或两端，例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等。此外，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团，书写连接基团的通式的方向并不暗示该连接基团的方位。例如，式—C(O)2R′—表示—C(O)2R′—和—R′C(O)2—。
除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其他术语组合起来分别表示环状形式的“烷基”和“杂烷基”。此外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环与分子的其余部分附接的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另有说明，术语“卤代”或“卤素”本身或作为另一个取代基的一部分意指氟、氯、溴或碘原子。此外，诸如“卤代烷基”的术语意在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”意在包括但不限于三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另有说明，术语“芳基”意指多不饱和的芳族取代基，该取代基可以是单环，诸如遵循休克尔规则(4n+2，其中n为任意整数)的那些，或稠合在一起或共价连接并且包括遵守Clar规则的那些的多环(优选1至5个环)。术语“杂芳基”指含有一至四个选自N、O和S的杂原子的芳基基团(或环)，其中氮和硫原子任选地被氧化，并且氮原子任选地被季铵化。杂芳基基团可通过杂原子与分子的其余部分附接。芳基和杂芳基基团的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、四唑基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、2,3-二氢苯并[1,4]二氧杂环己-6-基、苯并[1,3]二氧戊环-5-基和6-喹啉基。每一个以上所述芳基和杂芳基环系的取代基选自以下所述的可接受的取代基。
为简便起见，术语“芳基”当与其他术语组合使用时(例如芳氧基、芳基硫氧基(arylthioxy)、芳基烷基)，包括如上定义的芳基和杂芳基环两者。因此，术语“芳基烷基”意在包括其中芳基基团与烷基基团附接的那些基团，例如，苄基、苯乙基、吡啶基甲基等，包括其中碳原子(例如，亚甲基基团)已经被例如氧原子替代的那些烷基基团，例如，苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等。
以上每一个术语，例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”，意在包括所指示基团的取代和未取代形式。以下提供了每种类型的基团的优选取代基。
包括通常被称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团在内的烷基和杂烷基基团的取代基通称为“烷基基团取代基”，并且它们可以是数目在零至(2M′+1)范围内的选自但不限于以下基团的多种基团中的一种或多种：—OR′、═O、═NR′、═N—OR′、—NR′R″、—SR′、-卤素、—SiR′R″R′″、—OC(O)R′、—C(O)R′、—CO2R′、—CONR′R″、—OC(O)NR′R″、—NR″C(O)R′、—NR′—C(O)NR″R′″、—NR″C(O)2R′、—NR—C(NR′R″R′″)═NR″″、—NR—C(NR′R″)═NR′″、—S(O)R′、—S(O)2R′、—S(O)2NR′R″、—NRSO2R′、—CN和—NO2，其中M’为该基团中的碳原子的总数。R′、R″、R′″和R″″各自优选独立地指氢、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基例如被1-3个卤素取代的芳基、取代的或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基基团，或芳基烷基基团。当本发明的化合物包含多于一个R基团时，例如，每一个R基团独立地选择；当存在这些基团中的多于一个基团时，每一个R′、R″、R′″和R″″个基团也独立地选择。当R′和R″附接至同一氮原子时，它们可与该氮原子组合以形成5、6或7元环。例如，—环。例如，意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据以上对取代基的讨论，本领域技术人员将会理解术语“烷基”意在包括包含与除了氢基团之外的基团结合的碳原子的基团，诸如卤代烷基(例如，—CF3和—CH2CF3))和酰基(例如，—C(O)CH3、—C(O)CF3、—C(O)CH2OCH3等)。
类似于针对烷基基团所述的取代基，芳基和杂芳基基团的取代基通称为“芳基基团取代基”。该取代基选自例如：数目在零至芳族环系上开放化合价总数范围内的卤素、—OR′、═O、═NR′、═N—OR′、—NR′R″、—SR′、-卤素、—SiR′R″R′″、—OC(O)R′、—C(O)R′、—CO2R′、—CONR′R″、—OC(O)NR′R″、—NR″C(O)R′、—NR′—C(O)NR″R′″、—NR″C(O)2R′、—NR—C(NR′R″R′″)═NR′″、—NR—C(NR′R″)═NR′″、—S(O)R′、—S(O)2R′、—S(O)2NR′R″、—NRSO2R′、—CN和—NO2、—R′、—N3、—CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烷基；并且其中R′、R″、R′″和R″″优选独立地选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基。当本发明的化合物包含多于一个R基团时，例如，每一个R基团独立地选择；当存在这些基团中的多于一个基团时，每一个R′、R″、R′″和R″″基团也独立地选择。在下述流程中，符号X表示如上所述的“R”。
除非另有说明，如本文所用的术语“催化量”包括足以使本发明方法的反应发生的反应物的量。因此，组成催化量的量是用来允许或提高反应速率的任意量，越大的量通常提供越大的提高。在任何特定应用中使用的量将在很大程度上由制造设施的单独需求来决定。纳入这样的决定的因素包括催化剂成本、回收成本、所需的反应时间以及***容量。使用如下量的反应物将是最方便的：在约0.001至约0.5当量、约0.001至约0.25当量、约0.01至约0.25当量、约0.001至约0.1、约0.01至约0.1当量的范围内，包括约0.005、约0.05或约0.08当量的反应物/底物，或在约0.001至约1当量、约0.001至约0.5当量、约0.001至约0.25当量、约0.001至约0.1当量、约0.01至约0.5当量或约0.05至约0.1当量的范围内，包括约0.005、约0.02或约0.04当量。
除非另有说明，如本文所用的术语“可切割化学基团”包括对在核苷酸类似物中的核糖或脱氧核糖的3′-位置处的-OH基团加帽的化学基团，其为可以使用的任何化学基团，只要该基团1)在聚合酶反应期间是稳定的，2)不干扰核苷酸类似物作为底物被聚合酶的识别，3)是可切割的，以及4)可被切割可检测标记物与碱基之间的二硫键的同一化学试剂切割。
申请人意识到，存在许多可以命名和以其他方式描述有机化合物的约定和体系，包括通用命名以及体系，如IUPAC体系。
缩写
在整个本申请中使用的缩写具有以下提供的含义。以下提供的含义并非意在限制，而是意在同时涵盖本领域技术人员所理解的任何等价的通用或***名称。以下未列出的任何其他缩写名称应具有本领域技术人员通常所理解的含义。
I2＝碘
TBDMS＝叔丁基二甲基硅烷基
TBDPS＝叔丁基二苯基硅烷基
BOC＝叔丁氧羰基
Pyr＝吡啶碱
THF＝四氢呋喃
TsOH＝对甲苯磺酸
DCA＝二氯乙酸
Bu3N＝三丁胺
DMF＝二甲基甲酰胺
Py＝吡啶
TEAB＝三乙基碳酸氢铵
DMTO＝4,4’-二甲氧基三苯基甲氧基
CEO＝2-氰基乙氧基
TIPSCl＝三异丙基硅烷醚氯化物
Et＝乙基
Ph＝苯基
(PhO)2P(O)Cl＝二苯基磷酰氯
CEO-P(NiPr2)2＝O-(2-氰基乙基)-N,N,N,N-四异丙基二氨基磷酸酯
iPr2NH＝二异丙基胺
DBU＝1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯
FMOC＝芴基甲氧羰基
TCEP＝(三(2-羧乙基)膦)
CDI＝1,1′-羰基二咪唑
MeOH＝甲醇
TBA＝叔丁醇或2-甲基-2-丙醇
TEA＝三乙醇胺
TFP＝四氟丙醇或2,2,3,3-四氟-1-丙醇
BSA＝牛血清白蛋白
DTT＝二硫苏糖醇
ACN＝乙腈
NaOH＝氢氧化钠
IE HPLC＝离子交换高效液相色谱法
TLC＝薄层色谱法
TCEP＝三(2-羧乙基)膦
合成方法
合成方法的大小和规模将根据所需的终产物量而变化。应理解，尽管实施例中提供了具体的反应物和量，但本领域技术人员知晓同样将产生相同化合物的其他替代的和同样可行的成组反应物。因此，当使用一般的氧化剂、还原剂、不同性质(非质子性、非极性、极性等)的溶剂时，其等价物将是本领域已知的并且在此考虑用于本发明的方法。
例如，在所有情况下，当使用干燥剂时，所考虑的干燥剂包括在文献中报道以及技术人员已知的所有干燥剂，诸如但不限于硫酸镁、硫酸钠、硫酸钙、氯化钙、氯化钾、氢氧化钾、硫酸、生石灰、五氧化二磷、碳酸钾、钠、硅胶、氧化铝、氢化钙、氢化铝锂(LAH)、氢氧化钾等。(参见，Burfield等人,“Dessicant Efficiency in Solvent Drying.A Reappraisalby Application of a Novel Method for Solvent Water Assay,”J.Org.Chem.,42(18):3060-3065,1977)。在每个后处理(work up)中添加的干燥剂的量可以由本领域技术人员优化，并且没有特别地限制。此外，尽管针对每一步中的中间体的后处理提供了一般性指导，但技术人员通常理解，其他任选的溶剂和试剂可以在后处理步骤中等价地被替换。然而，在一些例外的情况下，发现需要非常特殊的后处理条件来保持不稳定的中间体。这些情况在下文中其出现的步骤中进行说明。
以下的多个步骤说明了反应终止后的各种后处理。后处理通常包括将反应猝灭以终止任何残留的催化活性和起始试剂。这之后通常为有机溶剂的添加，以及水层与有机层的分离。产物通常从有机层中获得，而未使用的反应物和其他假的副产物以及不想要的化学品通常留在水层中并丢弃。在整个文献中发现的标准有机合成程序中的后处理之后通常为以下操作：通过暴露于干燥剂来干燥产物以去除任何过量的水或剩余的、部分溶解在有机层中的水性副产物，并浓缩剩余的有机层。溶解在溶剂中的产物的浓缩可以通过任何已知的手段实现，如在压力下蒸发、在升高的温度和压力下蒸发等等。这样的浓缩可通过使用标准的实验室设备如旋转蒸发器蒸馏等来实现。这之后任选地为一个或多个纯化步骤，其可包括但不限于快速柱色谱法、通过各种介质过滤和/或本领域已知的其他制备性方法，和/或结晶/重结晶。(参见例如，Addison Ault,“Techniques and Experiments forOrganic Chemistry,”第6版.,University Science Books,Sausalito,Calif.,1998,AnnB.McGuire编著.,pp.45-59)。尽管可能在下文所述的步骤中指出了某些有机共溶剂和猝灭剂，但技术人员已知的其他等价的有机溶剂和猝灭剂也同样可被采用，并且是在本文中充分考虑到的。此外，大多数步骤中的大多数后处理可根据偏好和期望的最终用途或终产物而进一步改变。不必使用有机合成化学实验员所做的常规步骤干燥和蒸发，但认为其在所有步骤中都是可任选的。根据期望的结果和反应规模，采用有机溶剂萃取的次数可以多达一次、两次、三次、四次、五次或十次或更多次。除非特别指出，在后处理中使用的猝灭剂的体积、量以及有机溶剂的体积可以根据具体的反应条件而变化，并进行优化，以产生最佳的结果。
另外，当指出惰性气体或稀有气体时，在本领域中常用的任何惰性气体均可替代所指出的惰性气体，如氩、氮、氦、氖等。
本文引用了多个专利和出版物，以便更全面地描述和公开本发明的方法、化合物、组合物和试剂盒，以及其所属领域的情况。为了说明背景、已知方法，以及特别地为了提供关于本发明方法、组合物和/或试剂盒的实施的额外细节而在本文中引用的参考文献、出版物、专利、书籍、手册和其他材料全部为了所有目的通过引用而全文并入本文，其引用程度如同特别地且单独地指明每个单独的参考文献通过引用而并入。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。目的在于以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。
实施例
应当理解，本文所述的实施例和实施方案用于说明性目的，并且基于此的各种修改或变化将为本领域技术人员提供建议且包含在本申请的精神和范围以及权利要求书的范围内。相应地，提供以下实施例是为了说明而非限制所请求保护的发明。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是这些实施方案仅以示例的方式提供。目的并不在于通过说明书内提供的具体实例来限制本发明。尽管已经参考上述说明书对本发明进行了描述，但本文中对实施方案的描述和说明并非意在以限制意义进行理解。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。此外，应当理解，本发明的所有方面并不限于本文阐述的依赖于多个条件和变量的具体描绘、配置或相对比例。应当理解，本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。因此考虑本发明也应涵盖任何这样的替代、修改、变化或等同项。目的在于以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。
以下实施例描述了图4-11中所示的详细的合成步骤。
实施例1
3'-O-叠氮基甲基-5-(荧光素-二硫连接体-氨基甲酸酯)-2'-脱氧尿苷三磷酸(33)的合成
根据图4-6中所示的方法制备标题化合物。具体地，图4中使用的试剂和条件为：(i)三氟-N-丙-2-炔基-乙酰胺、Pd(PPh3)4、CuI、三乙胺、DMF，室温(RT)，12h；(ii)叔丁基二苯基硅烷基氯化物、吡啶，室温，6h；(iii)DMSO、AcOH、Ac2O，室温，12h；(iv)a)SOCl2，0℃，1h；b)NaN3、DMF，4h；(v)NH4OH、MeOH，55℃，3h；图5中使用的试剂和条件为：(i)2-巯基乙醇、吡啶、无水MeOH，室温，12h，(ii)BOC-半胱胺、吡啶、MeOH，室温，12h，(iii)4-硝基苯基氯甲酸酯、Et3N、MeCN；图6中使用的试剂和条件为：(i)28、NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH 9.2)、乙腈，(ii)Et3N·3HF、THF，55℃，4h，(iii)(a)2-氯-1H-1,3,2-苯并二氧杂磷杂环己烷-4-酮、吡啶、THF，1.5h，(b)三丁胺、三丁基焦磷酸铵，4h；(c)叔丁基过氧化氢，1h，(iv)水性TFA，(v)5-荧光素-NHS酯、NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH 9.2)。
5-[3-(2,2,2-三氟乙酰氨基)-丙-1-炔基]-2’脱氧尿苷(21)的合成。在氮气下向5-碘尿苷A(5.0g，14.1mmol)在无水DMF(40mL)的溶液中添加CuI(0.20g，1.05mmol)和Pd(PPh3)4(0.41g，0.035mmol)。搅拌10min后，添加三乙胺(4.0mL，28.6mmol)和三氟-N-丙-2-炔基-乙酰胺(5.4g，35.7mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。真空去除所有的挥发物，并将残余物通过硅胶快速色谱法[EtOAc/MeOH(0-15％)]进行纯化，以得到呈黄色固体的所需产物4.1g(76％)。1H-NMR(DMSO-d6)δ11.68,(br s,1H,NH),10.02(s,1H,NH),7.94(s,7.94(s,1H,H6),6.11(t,J＝7.2Hz,H-1’),5.29(d,J＝0.4Hz,1H,OH),4.21(m,3H,H-3’,NCH2),3.71-3.83(m,2H,CH2-5’),2.15-2.19(m,1H,H-2’),2.03-2.08(m,1H,H-2’)，C14H14F3N3O6(M+Na)的分子量计算值为400，实测值为400。
5’-O-叔丁基二苯基硅烷基-5-[3(2,2,2,-三氟乙酰氨基-丙-1-炔基]-2’脱氧尿苷(22)的合成。在N2下，向21(2.5g，6.61mmol)在无水吡啶(50mL)中的冷却(0℃)溶液中缓慢地添加叔丁基二苯基硅烷基氯化物(2.1g，7.63mmol)，并将反应混合物在室温下进一步搅拌过夜。真空去除挥发物，并将残余物通过硅胶快速色谱法(在己烷中的EA，75％至100％)进行纯化，以得到呈白色固体的所需产物(2.82g，71％)。1H-NMR(DMSO-d6)δ11.71(br S,1H,NH),9.98(s,1H,NH),8.60(s,1H,NH),8.14(s,1H,H-6),7.62-7.65(m,4H,Ar-H),6.12(t,J＝6.9Hz,HC-1’),5.32(d＝4.4Hz,OH),4.23-4.27(m,1H,HC-3’),4.09(d,J＝4.8Hz,NCH2),3.83-3.88(m,1H,CH2-5’),3.68-3.74(m,1H,H-5’),2.18(m,2H,H-5’),1.00(s,9H,CH3x3)；C30H32F3N3O6Si(M+Na)的分子量计算值为638.6实测值为638。
5’-O-叔丁基二苯基硅烷基-3’-O-甲硫基甲基-5-[3(2,2,2,-三氟乙酰氨基-丙-1-炔基]-2’脱氧尿苷(23)的合成。随后在N2下，向22(2.0g，3.24mmol)在DMSO(5.2mL)中的溶液中添加乙酸(1.1mL)和乙酸酐(3.5mL)，并将反应在室温下搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩，并将残余物用EA稀释并倒入饱和NaHCO3溶液(150mL)中搅拌1h。用EA萃取水层。将合并的有机层干燥(MgSO4)，过滤并浓缩，以得到油。将残余物通过硅胶快速柱色谱法进行纯化，并用在己烷中的40-80％EA洗脱出呈白色固体的所需产物(1.22g，55％)。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.60(br s,1H,NH),8.17(s,1H,H-6),7.68-7.71(m,4H,Ar-H),7.41-7.50(m,6H,Ar-H),6.30(dd,J＝5.6Hz和2.8Hz,1H,H-1’),4.6-4.64(m,2H,OCH2S),4.13-4.15(m-H-3’),4.06-4.08(m,3H,H-3’和NCH2),3.98-4.02(m,1H,H-5’),3.79-3.82(m,1H-H-5’),2.54-2.59(m,1H,H-2’),2.44-2.48(M,1H,H-2’)，C32H36F3N3O6SSi的分子量计算值为675.8，实测值(M+H)为676。
5’-O-叔丁基二苯基硅烷基-3’-O-叠氮基甲基-5-[3(2,2,2,-三氟乙酰氨基-丙-1-炔基]-2’脱氧尿苷(24)的合成。将23(2.5g，3.70mmol)和环己烯(3.8mL，37.5mmol)在无水二氯甲烷中的溶液冷却至0℃，并在N2下向该溶液中逐滴添加硫酰氯(在DCM中的1M溶液，18.5mL，18.5mmol)。搅拌1h后，TLC显示没有任何起始物质。真空去除挥发物，并将残余物溶解于无水DMF中，并向其中添加叠氮化钠(1.45g，37.5mmol)并进一步搅拌3h。将反应用二氯甲烷猝灭，并将有机层用饱和的盐水水溶液洗涤。将有机层经无水MgSO4干燥并真空浓缩。将残余物在硅胶上层析，并用在己烷中的40-60％EA洗脱出呈白色固体的所需产物(1.05g，42％)。1H-NMR(CDCl3)δ8.93(br s,1H,NH),8.14(s,1H,H-6),7.67-7.709m,4H-Ar-H),7.41-7.50(m,6H-Ar-H),6.28(dd,J＝5.6Hz和2.4Hz,1H,H-1’),4.68(d,J＝8.8Hz,OCH2N),4.61(d,J＝8.8Hz,1H,OCH2N),4.38-4.39(m,1H,H-3’),4.08-4.09(m,1H,H-4’),4.00-4.04(m,1H,H-5’),3.79-3.82(m,1H,H-5’),2.57-2.62(m,1H,H-2’)2.13-2.20 9m,1H,H-5’)1.10,(s,9H,CH3x3)；C31H33F3N6O6Si的分子量计算值为670，实测值(M+H)为671。
5’-O-叔丁基二苯基硅烷基-3’-O-叠氮基甲基-5-[3-氨基-丙-1-炔基]-2’脱氧尿苷(25)的合成。将24(0.25g)在甲醇氨(7N，50mL)中的溶液在密闭管中在55℃下加热3h。将反应冷却至室温并浓缩，以得到白色泡沫(0.21g，98％)。1H-NMR(CDCl3)δ8.13(s,H-6),7.67-7.69(m,4H,Ar-H),7.42-7.62(m,6H,Ar-H),6.28-6.35(m,1H-H-1’),4.59-4.69(m,2h,OCH2-N),4.38 9m,1h,H3’),4.15-4.17(m,1H,H-4’),3.99-4.01(m,1H,H-5’),3.78-3.81(m,1H,5-H),3.40 9s,CH2N),2.54-2.64(m,1H,H-2’),2.11-2.18(m,1H,H-2’),1.10(s,9H,C(CH3)3)，C29H34N6O5Si的分子量计算值为574.2，实测值(M+H)为575。
2-(吡啶-2-基-二硫基)-乙醇(26)。将2-巯基乙醇(3.9g，49.9mmol)添加至2-2’-二吡啶基-二硫化物B(10g，45.4mmol)在吡啶/甲醇(3:200mL)中的溶液中，并将混合物搅拌过夜。将混合物蒸发至干，并将残余物通过硅胶快速色谱法进行纯化。用在己烷中的30-50％乙酸乙酯洗脱出呈无色油的所需产物(4.5g，53％)。1H-NMR(CDCl3)δ8.51(d,J＝4.0Hz,1H,Ar-H),7.57-7.62(m,1H-Ar-H),7.40-7.62(m,1H,Ar-H),7.15-7.28(m,1H,Ar-H),5.84(br s,1h,OH),3.81(t,J＝5.2Hz,2H,OCH2),2.96(t,J＝5.2Hz,SCH2)，C7H9NOS2的分子量计算值为187，实测值(M+H)为188。
2-(N-叔丁氧基酰氨基-乙基)2-基-二硫基)乙醇(27)。向26(0.9g，4.8mmol)在甲醇/吡啶(40/1mL)中的溶液中添加BOC-半胱胺(2.1g，11.8mmol)，并将混合物搅拌过夜。将反应浓缩，并将残余物通过硅胶快速色谱法进行纯化。采用在己烷中的40-60％乙醇梯度获得呈无色油的所需产物(1.04g，86％)。1H-NMR(CDCl3)δ4.89(br s,1H,OH),3.88-3.91(t,J＝5.6Hz,2H,OCH2),3.46-3.48(m,2H,NCH2),2.88-2.91(t,J＝6.0HZ,2H,SCH2),2.80-2.2.83(t,J＝6.8Hz,2H,SCH2),1.45(s,9H,C(CH3)3)。C9H19NO3S2的分子量计算值为253.0，实测值(M+Na)为276。
2-(N-叔丁氧基酰氨基-乙基)2-基-二硫基)乙基-4-硝基苯基碳酸酯(28)。在氮气下，在10分钟内向27(0.80g，3.16mmol)在无水乙腈中的冷却(4℃)溶液中缓慢地添加三乙胺(540uL，3.82mol)和4-硝基苯基碳酸酯(0.75g，3.72mmol)的乙腈溶液。将反应在室温下进一步搅拌过夜。在去除挥发物后，将粗残余物通过硅胶快速色谱法进行纯化。洗脱出呈白色结晶固体的所需产物(1.05g，75％)。1H-NMR(CDCl3)δ8.30(d,J＝9.2Hz,2H,Ar-H),7.41(d,J＝9.2Hz,2H,Ar-H),4.55-4.58(t,J＝6.8Hz,2H,OCH2),3.48-3.49(m,2H,(NCH2),3.02-3.06(t,J＝6.8Hz,2H,SCH2),2.84-2.87(t,J＝6.0Hz,2H,SCH2),1.46s,9H,C(CH3)3)，C16H22N2O7S2(M+Na)的分子量计算值为441，实测值为441。
5’-O-叔丁基二苯基硅烷基-3’-O-叠氮基甲基-5-[3(2-(N-叔丁氧基酰氨基-乙基)-2-基-二硫基)乙氧基-甲酰氨基)-丙-1-炔基]-2’脱氧尿苷(29)的合成。向25(0.35g，0.61mmol)在NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH 9.2，2.0mL)中的溶液中添加28(0.34g，0.77mmol)在乙腈(5mL)中的溶液，并将反应搅拌过夜。将反应用乙酸乙酯稀释并用盐水洗涤。将有机层分离，经无水MgSO4干燥并浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法进行纯化。用在己烷中的EA(50％至75％梯度)洗脱出呈白色固体的所需产物(0.36g，71％)。1H-NMR(CDCl3)δ8.03(s,1H,H-6),7.67-7.70(m,4H,Ar-H),7.42-7.51(m,Ar-H-6H),6.25-6.29(t,J＝6.0Hz,1H,H-1’),4.66-4.69(d,J＝9.2Hz,1H,NCH2),59-4.61(d,J＝9.2Hz,1H,NCH2),4.36-4.38(m,1H,H-3’),4.29-4.32(t,J＝6.0Hz 1H,OCH2),4.37-4.0(m,3H,NCH2和H-5’),3.79-3.82(m,1H,H-5’),3.45-3.37,(m,2H,NCH2),2.87-2.91(t,J＝6.0HZ,2H,SCH2),2.79-2.82(t,J＝6.4Hz,2H,SCH2),2.54-2.59(m,1H,H-2’),2.11-2.18(m,1H,H-2’),1.46(s,9H,O(CH3)3),1.01(s,9H,C(CH3)3)；C23H36N7O18P3S2(M+Na)的分子量计算值为876，实测值为876。
3’-O-叠氮基甲基-5’-羟基-5-[3(2-(N-叔丁氧基酰氨基-乙基)-2-基-二硫基)乙氧基-羧基酰氨基)-丙-1-炔基]-2’脱氧尿苷(30)的合成。向29(0.30g，0.35mmol)在无水THF(10mL)中的溶液中添加三乙胺三氢氟酸盐(0.29g，0.29mmol)的溶液，并将混合物在55℃下加热3h。去除挥发物并将油性残余物通过硅胶快速色谱法进行纯化。用在乙酸乙酯中的0-55％甲醇洗脱出呈白色固体的所需产物(0.22g，76％)。1H-NMR(CDCl3)δ8.22(s,1H,H-6),6.21-6.24(t,J＝6.4Hz,1H,H-1’),5.50(br s,1H,OH),4,76-4.78(d,J＝8.8Hz,1H,N3CH2),4.69-4.71(d,J＝9.6Hz,1H,N3CH2),4.49-4.51(m,1H,H-3’),4.34-4.36,m(1H,2H,OCH2),4.17-4.19(m,3H,NCH2和H-4’),4.01-4.01(d,J＝11.2Hz,1H,NCH2),3.87-3.89(d,J＝10.0Hz,1H,NCH2),3.45-3.47(m,2H,H-5’),3.09-3.10(m,2H,SCH2),2.81-2.83(m,2H,SCH2),2.50-2.52(m,1H,H-2’),2.31-2.34(m,1H,H-2’),1.47(s,9H,O(CH3)3)，C23H33N7O9S2(M+Na)的分子量计算值为638，实测值为638。
3’-O-叠氮基甲基-5-[3(2-(N-叔丁氧基酰氨基-乙基)-2-基-二硫基)乙氧基-羧基酰氨基)-丙-1-炔基]-2’脱氧尿苷-三磷酸(31)的合成。在氮气下向30在无水THF和无水吡啶(各5mL)中的溶液中添加溶解于1mL THF中的2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧杂磷杂环己烷-4-酮(0.090g，0.45mmol)的溶液，并搅拌1.5h(TLC显示没有任何起始物质)。随后添加三丁胺(0.35g，1.95mmol)和三丁基焦磷酸铵(在DMF中的0.05mmol溶液，1.3mL，0.65mmol)并进一步搅拌3h。将叔丁基过氧化氢溶液(在癸烷中的5.5M溶液，350ul，1.92mmol)添加到反应中并进一步搅拌1h。随后将反应用水猝灭并放置过夜。粗反应的LCMS显示27％的所需产物。使用Dionex DNA Pac柱(9x 250mm)以及作为缓冲液A的50mM TRIS和作为缓冲液B的50mMtris和800mM氯化铵，通过离子交换HPLC(在30min内0-40％B的梯度)将产物进行纯化。C23H36N7O18P3S2的分子量计算值为855.08，实测值LCMS 855.1。
3’-O-叠氮基甲基-5-[3-(2-氨基乙基)-2-基-二硫基)-乙氧基-羧基酰氨基)-丙-1-炔基]-2’脱氧尿苷-三磷酸(32)的合成。将三氟乙酸水溶液(在52uL水中58uL)添加到31的溶液(7.56uM)中并搅拌4h。使用Hamilton PRP-柱(21.2x 250mm)以及作为缓冲液A的50mM三乙基碳酸氢铵和作为缓冲液B的乙腈，并使用在30分钟内0-40％B的梯度，通过反相HPLC分离出所需产物。C18H28N7O16P3S2的分子量计算值为755.02，实测值LCMS 754.9。
荧光素标记的终止子(33)的合成：向32(3.16uM)在碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH9.2，600uL)中的溶液中添加5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(15mg，31.6uM)在DMSO(50uL)中的溶液。将反应搅拌过夜。使用作为缓冲液A的50mM三乙基碳酸氢铵和作为缓冲液B的乙腈，并使用在30min内0-40％B的梯度，通过反相HPLC将粗产物进行纯化。通过LCMS表征微红色粉末，C39H38N7O22P3S2的分子量计算值为1113.07，实测值LCMS 1112.9。
实施例2
3'-O-叠氮基甲基-5-(Alexa530-二硫连接体-氨基甲酸酯)-dUTP(34)的合成
根据图7中所示的方法制备标题化合物。具体地，图7中使用的试剂和条件为：(i)Alexa530-NHS酯、硼酸盐缓冲液(pH 9.0)。
Alexa-530标记的终止子(34)的合成。向32(1.18uM)在硼酸盐缓冲液(pH 9.0，200uL)中的溶液中添加Alexa-530琥珀酰亚胺酯(2.2mg，3.0uMol)并搅拌过夜。使用作为缓冲液A的50mM三乙基碳酸氢铵和作为缓冲液B的乙腈，并使用在30min内0-40％B的梯度，通过反相HPLC对粗产物进行纯化。通过LCMS表征对微红色粉末，C48H56N9O24P3S4的分子量计算值为1163.15，实测值LCMS 1162.9。
实施例3
3'-O-叠氮基甲基-5-(Alexa647-二硫连接体-氨基甲酸酯)-脱氧胞苷三磷酸(45)的合成
根据图8-9中所示的方法制备标题化合物。具体地，图8中使用的试剂和条件为：试剂和条件：(i)三氟-正丙-2-炔基-乙酰胺、Pd(PPh3)4、CuI、三乙胺、DMF，室温，12h，(ii)叔丁基-二苯基硅烷基氯化物、吡啶，室温，6h，(iii)(a)三甲基氯硅烷、吡啶，(b)苯甲酰氯；(iv)DMSO、AcOH、Ac2O，室温，12h，(v)a)SOCl2，0℃，1h；b)NaN3、DMF，4h，(vi)甲醇氨，55℃，3h；图9中使用的试剂和条件为：28、NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH 9.2)、乙腈，(ii)Et3N·3HF、THF，55℃，4h，(iii)(a)2-氯-1H-1,3,2-苯并二氧杂磷杂环己烷-4-酮、吡啶、THF，1.5h，(b)三丁胺、三丁基焦磷酸铵，4h；(c)叔丁基过氧化氢，1h，(iv)Aq TFA，(v).Alexa-647-NHS酯、硼酸盐缓冲液。
5-[-(2,2,2-三氟乙酰氨基-丙-1-炔基]-2’-脱氧胞苷(35)的合成。向5-碘胞苷C(7.5g，21.2mmol)在无水DMF(75mL)中的溶液中添加CuI(0.30g，1.57mmol)和Pd(PPh3)4(0.62g，0.053mmol)。在搅拌10min后，添加三乙胺(6.0mL，42.9mmol)和三氟-N-丙-2-炔基-乙酰胺(9.6g，63.5mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。真空去除所有的挥发物，并将残余物通过硅胶快速色谱法(EtOAc/MeOH(0-15％)]进行纯化，以得到7.8g呈黄色固体的所需产物35(79％)。1H-NMR(DMSo-d6)δ9.97(brs,1H,NH),8.15(s,1H,H-6),6.08-6.12(t,J＝6.4Hz,1H,H-1’),5.20-5.21(d,J＝4Hz,1H,OH0,5.05-5.07(t,J＝4.8Hz,1H,OH),4.28-4.29(d,J＝5.2Hz,2H,NCH2),4.15-4.19(m,1H,H-3’),3.77-3.79(m,1H,H-4’),2.11-2.16(m,1H,(H-2’),1.92-1.96(m,1H,H-2’)。
5’-(O-叔丁基二苯基硅烷基)-5-[3-(2,2,2-三氟乙酰氨基-丙-1-炔基]-2’脱氧胞苷(36)的合成。在0℃下，在N2下，将叔丁基二苯基硅烷基氯化物(6.97mL，26.65mmol)逐滴添加到化合物35(9.11g，24.23mmol)在无水吡啶(100mL)中的搅拌溶液中。10分钟后，使溶液升温至室温并搅拌过夜。真空去除挥发物，并使用在己烷中的乙酸乙酯(75-100％)通过二氧化硅快速色谱法将残余物行纯化，以得到所需产物36(8.42g，57％)。1H-NMR(DMSO-d6)δ7.95(s,1H,H-6),7.61-7.65(m,4H,Ar-H),7.43-7.47(m,6H,Ar-H),6.11-6.15(t,J＝6.8Hz,H-1’),5.26-5.28(m,1H,OH),4.20-4.27(m,1H,H-3’),4.13-4.15(d,J＝4.8Hz,NCH2),3.84-3.90(m,3H,H-4和CH2-5’),3.70-3.74(m,1H,CH2-5’),1.00(s,(H,C(CH3)3)。
4-N-苯甲酰基-5’O-叔丁基二苯基硅烷基)-5-[3-(2,2,2-三氟-乙酰氨基-丙-1-炔基]-2’脱氧胞苷(37)的合成。使化合物36(4.06g，6.6mmol)在无水吡啶中共沸，随后在N2气氛下溶解于无水吡啶(40mL)中。将三甲基氯硅烷(2.3mL，26.4mmol)逐滴添加到该溶液中并在室温下搅拌2小时。将反应混合物冷却至0℃，并将苯甲酰氯(0.81mL，6.94mmol)逐滴添加到反应混合物中。将反应混合物在0℃下保持1小时。随后将水(20mL)缓慢地添加到反应混合物中并保持在室温下搅拌过夜。真空去除所有的挥发物，并使残余物在饱和NaHCO3水溶液与EtOAc之间分配。分离有机相，并用另外的EtOAc萃取水相。将有机层合并，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。使用在己烷中的20-60％EA通过二氧化硅快速色谱法将残余物进行纯化以得到所需产物37(2.74g，58％)。1H-NMR(CDCl3)δ8.34(s,1H,H-6),8.22-8.25(m,2H,Ar-H),7.80-7.7.83(m,4H,Ar-H),7.43-7.50(m,9H,Ar-H),6.33-6.36(t,J＝6.0Hz,1H,H-1’),4.52-4.54(m,1H,H-3’),4.03-4.17(m,4H,NCH2,H-4’,H-5’),3.77-3.83(m,1H,H-5’),2.56-2.60(m,1H,H-2’),2.25-2.30(m,1H,H-2’),1.10(s,9H,C(CH3)3)。
4-N-苯甲酰基-3-(甲硫基甲基)-5’-O-叔丁基二苯基硅烷基)-5-[3-(2,2,2-三氟乙酰氨基-丙-1-炔基]-2’脱氧胞苷(38)的合成。在N2气氛下将化合物37(5.25g，7.31mmol)溶解于无水DMSO(28mL)中。将乙酸(5.7mL，0.10mol)和乙酸酐(18.0mL，0.19mol)依次并缓慢地添加到该溶液中。将反应混合物在室温下搅拌过夜。真空去除挥发物，并将残余物溶解于EtOAc(200mL)中，随后倒入饱和NaHCO3溶液(250mL)中并搅拌一小时。用EtOAc(100mL)萃取水层。将有机层合并，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。将粗产物通过快速色谱法(EtOAc：己烷，0至30％)进行纯化以得到标题化合物38(2.55g，45％)。1H-NMR(CDCl3)δ8.30(s,1H,H-6),8.22-8.25(m,2H,Ar-H),7.64-7.73(m,4H,Ar-H),7.39-7.50(m,,9H,Ar-H),4.51-4.65(m,3H,SCH2和H-3’),4.16-4.18(m,1H,H-3’),4.02-4.09(m,2H,NCH2),4.02-4.05(m,1H,H-5’),3.80-3.83(m,1H,H-5’),2.64-2.67(m,1H,H-2’),2.06-2.20(m,4H,SCH3和H-2’),1.10(s,9H,C(CH3)3)。
4-N-苯甲酰基-3’-O-叠氮基甲基-5’-O-叔丁基二苯基硅烷基)-5-[3-(2,2,2-三氟乙酰胺)-丙-1-炔基]-2’脱氧胞苷(39)的合成。将起始物质38(2.55g，3.28mmol)溶解于无水DCM(20mL)中并冷却至-78℃。添加环己烯(1.66mL，16.39mmol)和SO2Cl2(9.8mL，9.83mmol)。将反应混合物搅拌一小时。真空去除挥发物。向残余物中添加NaN3(1.06g，16.39mmol)和无水DMF(20mL)，随后在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完全。使反应通过硅胶垫并用EtOAc洗涤。真空去除溶剂。将残余物通过快速色谱法(EtOAc：己烷，0至30％)进行纯化以得到标题化合物39(1.37g，54％)。1H-NMR(CDCl3)δ8.26 9s,H-6’),8.21-8.23 9m,2h,Ar-H),7.45-7.70(m,4H,Ar-H),7.40-7.48(m,9H,Ar-H),6.25-6.28(q,J＝5.6,2.4Hz,1H,H-1’),4.66-4.69(d,J＝9.2Hz,1H,NCH2),4.55-4.58(d,J＝9.2Hz,1H,NCH2),4.35-4.37(m,1H,H3’),4.16-4.18(m,H-4’),4.10-4.13(t,J＝4.0Hz,2H,NCH2),4.00-4.04(m,1H,H-5’),3.80-3.84(m,1H,H-5’),2.62-2.67(m,1H,H-2’)2.03-2.18(m,1H,H-2’),1.10(s,9H,C(CH3)3)。
5’-O-叔丁基二苯基硅烷基-3’-O-叠氮基甲基-5-[3-(氨基)-丙-1-炔基]-2’脱氧胞苷(40)的合成。将39(0.60g，0.77mmol)在甲醇氨(40mL)中的溶液在密闭管中在55℃下加热1h(TLC显示没有起始物质)。将溶液冷却至室温并浓缩。将残余物通过快速色谱法进行纯化，并用在乙酸乙酯中的甲醇(0-15％)洗脱出所需产物，以得到所需产物20(0.28g，54％)。1H-NMR(CDCl3)δ8.12(s,1H,H-6),7.66-7.77(m,4H,Ar-H),4.40-4.49(m,6H,Ar-H),4.69-4.71(d,J＝8.8Hz,1H,CH2N3),4.54-4.56(d,J＝8.8Hz,1H,CH2N3),4.36-4.39(m,1H,H-3’),4.13-4.16,m,1H,H-4’),3.96-4.00(m,1H,H-5’),3.77-3.80(m,1H,H-5’),3.45-3.50(m,2H,NCH2),4.67-4.72(m,1H,H-2’),2.06-2.19(m,1H,H-2’),1.10(s,9H,C(CH3)3)。
5’-O-叔丁基二苯基硅烷基-3’-O-叠氮基甲基-5-[3-(2-(N-叔丁氧基酰氨基-乙基)-2-基-二硫基)乙氧基-羧基酰氨基)-丙-1-炔基]-2’脱氧胞苷(41)的合成。向40(0.31g，0.54mmol)在NaHCO3/NaCO3缓冲液(pH 9.2，5.0mL)中的溶液中添加28(0.30g，0.68mmol)在乙腈(5mL)中的溶液，并将反应搅拌过夜。将反应用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤。将有机层分离，经无水MgSO4干燥并浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法进行纯化。用在MeOH中的EA(0-10％)洗脱出呈白色固体的所需产物(0.30g，65％)。1H-NMR(CDCl3)δ8.13(s,1H,H-6),7.66-7.71(m,4H,Ar-H),7.41-7.52(m,6H,Ar-H),6.25-6.28(t,J＝7.2Hz,1H,H-1’),4.68-4.71(d,J＝8.8Hz,1H,N3CH2),4.57-4.55(d,J＝8.8Hz,1H,N3CH2),4.32-4.37(m,3H,NCH2和H-3’),4.15-4.17(m,1H,H-4’),3.97-4.01(m,2H,NCH2),3.79-3.83(m,1H,H-5’),3.44-3.49(m,1H,H-5’),3.44-3.49(m,2H,NCH2),2.92-2.95(t,J＝6.4Hz,2H,SCH2),2.79-2.83(t,J＝6.4Hz,2H,SCH2),2.68-2.72(m,1H,H-2’),2.06-2.12(m,1H,H-2’),1.10(s,9H,C(CH3)3)。
根据图9中描述的步骤由化合物41合成化合物45，其类似于制备化合物33时使用的那些步骤。
实施例4
3’-O-叠氮基甲基-7-脱氮-5-(alexa568-二硫连接体-氨基甲酸酯)-7-脱氮-2’脱氧腺苷三磷酸终止子(59)的合成
根据图10-11中所示的方法制备标题化合物。具体地，图10中使用的试剂和条件为：试剂和条件：(i)4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2.3-d]嘧啶、NaH、ACN；(ii)NH4OH、MeOH，(iii)N-三氟-丙-2-炔基-乙酰胺、Pd(PPh3)4、CuI、三乙胺、DMF，室温；(iv)叔丁基-二苯基硅烷基氯化物、吡啶；(v)(a)三甲基氯硅烷、吡啶，(b)苯甲酰氯，(vi)DMSO、AcOH、Ac2O；(vii)a)SOCl2，0℃，b)NaN3、DMF，(viii)MeOH、氨；图11中使用的试剂和条件为：28、NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH 9.2)、乙腈，(ii)Et3N·3HF、THF，55℃，4h，(iii)(a)2-氯-1H-1,3,2-苯并二氧杂磷杂环己烷-4-酮、吡啶、THF，1.5h，(b)三丁胺、三丁基焦磷酸铵，4h；(c)叔丁基过氧化氢，1h，(iv)Aq TFA，(v)Alexa568-NHS酯、NaHCO3/NaHCO3缓冲液(pH 9.2)。
根据上述步骤合成化合物59，其类似于制备化合物33时使用的步骤。
引物延伸试验的程序
寡聚物制备：寡聚物购自IDT并以500uM储存在无核酸酶的水中：生物素化的靶序列(Biot_Primer1_Capt,5’-/5Biosg/CTGAACGGTAGCATCTTGACGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTTTCAG-3’)和测序引物(SP_T,5’-ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCG-3’)。在室温下，将8nmol生物素化的模板序列与涂覆有链霉亲和素的磁珠(T1Dynabeads,Invitrogen)在含有1M NaCl、10mM Tris-HCl pH7.5、1mM EDTA的溶液中缀合一小时。用60℃的洗涤缓冲液(0.64X SSC，0.016％SDS)将珠子洗涤三次以去除未结合的引物，并且在4℃下储存在800μL反应结合缓冲液RB(1M NaCl，25mM Tris-HCl pH7.5，0.01％吐温20)中。为使测序引物与模板杂交，将100uL缀合的珠子与在200μL RB中的饱和量的SP_T(2.5nmol)在70℃温育五分钟，55℃温育15分钟，然后25℃温育5分钟。将杂交的珠子在室温下储存在360uL RB中。
引物延伸：对于与CENT1酶反应，该酶在使用前在95℃煮沸5分钟。将40uL的杂交的珠子重悬在22.5uL的反应混合物(40mM Tris-HCl pH8.8，20mM硫酸铵，20mM KCl，0.2％Triton X-100，2mM MgSO4，1.5ug CENT1)中。在添加2.5uL的20uM核苷酸(最终浓度2uM)之前，将反应预热至45℃持续一分钟。在一分钟的掺入后，用40μL RB猝灭反应。将珠子用40μLRB洗涤，并且或者重悬在新的反应混合物中以供进一步的掺入事件，或者在室温下将SP_T用0.1N NaOH洗脱10分钟，然后用1.5uL Tris-HCl pH8.0中和。对于与Bst大片段(NEB)反应，将40uL的杂交的珠子重悬在22.5uL的反应混合物(40mM Tris-HCl pH8.8，20mM硫酸铵，20mM KCl，0.2％Triton X-100，2mM MgSO4，1.5ug Bst)中。在添加2.5uL的1mM dNTP(NEB)(最终浓度100uM)之前，将反应预热至37℃持续一分钟。在37℃下五分钟后，用40μL RB猝灭反应。将珠子用40μL RB洗涤，并在室温下将SP_T用0.1N NaOH洗脱10分钟，然后用1.5uLTris-HCl pH8.0中和。
可逆终止子的切割：在可逆终止子掺入后，将珠子重悬在100mM TCEP pH9.0(GoldBio)中，并在用100μL RB猝灭之前在65℃下温育30分钟。将珠子用40μL RB洗涤，并且或者重悬在新的反应混合物中以供进一步的掺入事件，或者在室温下将SP_T用0.1N NaOH洗脱10分钟，然后用1.5uL Tris-HCl pH8.0中和。
变性PAGE：将等体积的2x TBE-尿素样品缓冲液(Novex,Thermo Fisher)添加至样品，之后在85℃下热变性五分钟。在160V下，在1X TBE中的15％TBE-尿素PAGE凝胶(Novex,Thermo Fisher)上运行10μL样品和10bp分子量标记(TrackIt,Invitrogen)两小时。在染色前和用SYBR金(Thermo)染色后将凝胶在AlphaImager 3400上荧光成像。
以下的实施例5-7是采用上述程序的引物延伸实验。
实施例5
使用本发明的化合物31的引物延伸。
采用本发明的化合物31进行引物延伸。该延伸由增强的DNA聚合酶(“EDP”)和另一种DNA聚合酶(“CENT1”)催化。(参见图12)。化合物31没有荧光团。通过与TCEP一起温育实现了解除阻断。
实施例6
使用本发明的化合物33的引物延伸。
Figure BDA0000984681160000462
采用本发明的化合物33进行引物延伸。该延伸由DNA聚合酶(“CENT1”)催化。(参见图13)。在与Bst聚合酶的“失控(runaway)”反应中观察到在终止子掺入后阻断了进一步的延伸(参见泳道4)。通过与TCEP、Bst聚合酶以及全部四种未修饰的dNTP一起温育实现了解除阻断(参见泳道7)。
实施例7
使用本发明的化合物34的引物延伸。
采用本发明的化合物34进行引物延伸。该延伸由增强的DNA聚合酶(“CENT1”)催化。(参见图14)。在与Bst聚合酶的“失控”反应中观察到在终止子掺入后阻断了进一步的延伸(参见泳道4)。通过与TCEP、Bst聚合酶以及全部四种未修饰的dNTP一起温育实现了解除阻断(参见泳道7)。
如以上实施例5-7所示，本发明的可逆终止子可以掺入由DNA聚合酶CENT1催化的引物延伸反应中。例如，采用2μM本发明的可逆终止子和DNA聚合酶CENT1，在45℃下1分钟内，本发明的可逆终止子可以大约100％地掺入生长的引物的3’末端。此外，实施例5-7显示，掺入的可逆终止子可以使多核苷酸延伸停止(在TECP处理之前)；并且在去除可逆终止子的3’-OH上的叠氮基甲基加帽基团的TCEP处理后，多核苷酸延伸恢复。

Claims (13)

1.式(I)的核苷5’-三磷酸类似物或其盐：
Figure FDA0002094962420000011
其中：
X为O；
w为1、2、3、4或5；
B选自
Figure FDA0002094962420000012
且Y为CH或N；
L1为第一连接基团，且L1为
Figure FDA0002094962420000013
n为0或1；
R1为
Figure FDA0002094962420000014
R2为CH2；且
Z为NH；
L2为第二连接基团，且L2为
Figure FDA0002094962420000015
且m为2或3；
L3为第三连接基团，且L3为
Figure FDA0002094962420000016
Q1和Q2独立地选自不存在、
Figure FDA0002094962420000017
以及
Figure FDA0002094962420000019
且
R3和R4独立地为
Figure FDA00020949624200000110
p为0-3，q为0-12，且r为1-3；
D1为所述可检测标记物。
2.根据权利要求1所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中：
w为1；
L1为
Figure FDA0002094962420000021
并且
L2为
3.根据权利要求1所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中D1为荧光团。
4.根据权利要求1所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中所述二硫键配置为被化学试剂切割，并且其中在所述二硫键被所述化学试剂切割后，所述核苷5’-三磷酸类似物的碱基配置为不包含游离巯基基团。
5.根据权利要求4所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中所述化学试剂是三烷基膦、三芳基膦或者三(2-羧乙基)膦。
6.一种组合物，其包含：
第一、第二、第三和第四核苷5’-三磷酸类似物，其中所述类似物如权利要求1中所定义，其中：
所述第一、第二、第三和第四核苷5’-三磷酸类似物的碱基各不相同；
每个不同的碱基对应的所述可检测标记物不同。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述可检测标记物为荧光团。
8.一种对多核苷酸进行测序的方法，该方法包括：
在包含待测序的靶多核苷酸、与待测序的靶多核苷酸杂交的一种或多种多核苷酸引物、催化量的聚合酶以及一种或多种根据权利要求1所述的核苷5’-三磷酸类似物的反应体系中进行聚合反应，从而生成与所述靶多核苷酸互补的一种或多种测序产物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述一种或多种根据权利要求1所述的5’-三磷酸类似物的浓度不大于2μM、不大于3μM、不大于5μM、不大于10μM、不大于50μM、不大于100μM、或者不大于400μM。
10.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括：
采用三烷基膦溶液处理所述一种或多种测序产物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述三烷基膦为三(2-羧乙基)膦。
12.根据权利要求10所述的方法，其中在采用所述三烷基膦溶液处理后，所述一种或多种测序产物没有与其碱基连接的游离巯基基团。
13.根据权利要求10所述的方法，其中在采用所述三烷基膦溶液处理后，所述一种或多种测序产物允许继续链生长。
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