JP4756819B2 - 走査型顕微鏡システム - Google Patents

Description

本発明は、走査型顕微鏡に光学顕微鏡を備えた走査型顕微鏡システムに関し、特に、予め、光学顕微鏡によって、走査型顕微鏡を用いて観察する領域を自動的に選定してから走査型顕微鏡による観察を行う走査型顕微鏡システムに関する。

従来、神経細胞を解析する場合、試料中に広範囲に分散する神経細胞を時系列で観察する観察手法が用いられてきた。具体的には、試料上に分散した数百系統の神経細胞の中から観察対象となる神経細胞を抽出して時間の経過に沿って観察や実験を行い、その結果をまとめて統計データを基に解析を行うものである。また、試料上に分散する神経細胞の存在する領域を電動ステージによって移動させながら時系列で観察する多点タイムラプスシステムも行われている。

また、異なる蛍光色素により多重染色された試料を複数の励起波長で励起し、発生した複数の蛍光を複数の光検出器で検出する走査型光学顕微鏡が、特許文献１に開示されている。通常の顕微鏡の光路中にスリットパターン等の透過部分を設けたディスクを挿入し、これを回転させて共焦点効果を生じさせるディスク回転型共焦点顕微鏡が、特許文献２に開示されている。

特許第２８２４４６２号公報 特開２００３−５０７８号公報

しかしながら、従来のように走査型顕微鏡を用いて神経細胞を観察する場合は、神経細胞が試料の中に分散して存在するため、神経細胞の位置を特定して観察目的に合ったレーザ光源を選定し、神経細胞の画像を取得するまでに数日から１週間ほどの時間が必要であった。また、走査型顕微鏡ではレーザ光を用いて神経細胞が存在する領域をスクリーニングするため、神経細胞を観察するまでに蛍光が退色するという問題が存在する。さらに、長時間繰り返し観察を行うため、顕微鏡の光源等の熱により顕微鏡本体がたわみ、電動ステージを繰り返して移動させると、移動による誤差が蓄積され、観察位置がずれてしまうということも問題であった。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、観察対象が存在する領域の正確な位置を速やかに特定し、観察対象の鮮明な走査画像を得ることができる走査型顕微鏡システムを提供することにある。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る走査型顕微鏡システムは、試料をレーザ光で点走査して得られる光を受光器で受光して走査画像を形成する点走査型観察部と、試料からの光を２次元撮像素子で撮像する光学顕微鏡観察部とを備えた走査型顕微鏡システムであって、前記光学顕微鏡観察部の光源から試料に励起光を照射し、前記試料が発する蛍光を受光して光学画像を取得する光学画像取得手段と、前記光学画像取得手段が前記試料中の複数箇所で取得した各光学画像にもとづいて前記試料を複数のブロックに分け、該複数のブロックの各々が前記走査画像の取得対象とすべき走査領域であるか否かを前記光学画像での画素群の輝度値をもとに前記ブロック毎に判断して、前記試料での前記走査領域の分布を示す走査マップを作成する走査マップ作成手段と、前記走査マップ作成手段が作成した走査マップで定められる前記走査領域に対して前記点走査型観察部のレーザ光源から励起光を照射し、前記試料が発する蛍光を受光して走査画像を取得する走査画像取得手段と、を備えることを特徴とする。

本発明に係る走査型顕微鏡システムは、上記の発明において、前記ブロックは、前記光学顕微鏡観察部および前記点走査型観察部が取得できる画像のサイズに対応した領域であることを特徴とする。また、本発明に係る走査型顕微鏡システムは、上記の発明において、前記走査マップ作成手段は、前記輝度値が所定の閾値以上となる画素を所定数以上含むブロックを前記走査領域として選定することを特徴とする。

また、本発明に係る走査型顕微鏡システムは、上記の発明において、前記光学画像取得手段は、前記光学顕微鏡観察部の光源としてハロゲンランプまたはキセノンランプを含む白色光源を用いて前記光学画像を取得することを特徴とする。また、本発明に係る走査型顕微鏡システムは、上記の発明において、前記光学画像取得手段は、前記光学顕微鏡観察部の光路の共焦点位置に複数のピンホールまたは複数のスリットが形成された回転ディスクを挿入し、共焦点方式を用いて前記光学画像を取得することを特徴とする。

また、本発明に係る走査型顕微鏡システムは、上記の発明において、前記光学画像は、焦点位置を前記試料の深さ方向に移動させて撮像した複数枚の共焦点画像を積層して形成した立体画像であることを特徴とする。また、本発明に係る走査型顕微鏡システムは、上記の発明において、前記走査マップ作成手段は、前記立体画像を構成する画素群の輝度値をもとに前記走査領域を選定することを特徴とする。

また、本発明に係る走査型顕微鏡システムは、上記の発明において、前記光学画像は、前記立体画像を構成する前記試料の深さ方向に積層された複数枚の共焦点画像における深さ方向の各画素群から最も高い輝度値を有する画素によって形成された２次元輝度画像であることを特徴とする。

また、本発明に係る走査型顕微鏡システムは、上記の発明において、前記光学画像取得手段は、前記試料に複数の励起光を照射し、前記試料が発する蛍光を受光して前記励起光に対応した前記光学画像を取得し、前記走査マップ作成手段は、前記励起光に対応した前記光学画像から前記走査領域と前記走査領域群に照射する１以上の前記励起光とを関連付けることを特徴とする。

また、本発明に係る走査型顕微鏡システムは、上記の発明において、前記光学画像取得手段が取得する画像サイズは、前記走査領域の大きさとほぼ等しいかまたは複数の走査領域を含む大きさであることを特徴とする。また、本発明に係る走査型顕微鏡システムは、上記の発明において、前記走査マップ作成手段は、走査領域として選定されたブロックの縁部まで前記輝度値が確認された場合、その走査領域の隣のブロックも走査領域として選定することを特徴とする。

また、本発明に係る走査型顕微鏡システムは、上記の発明において、前記走査マップ作成手段は、前記光学画像取得手段により取得された前記深さ方向の異なる複数毎の共焦点画像のそれぞれに対して、画像を構成する画素群の輝度値をもとに前記走査領域を選定することにより、走査領域選定を３次元的におこなうことを特徴とする。また、本発明に係る走査型顕微鏡システムは、上記の発明において、前記光学画像の画像情報またはその取得条件にもとづいて、前記点走査型観察部による走査画像の取得条件を設定することを特徴とする。

また、本発明に係る走査型顕微鏡システムは、上記の発明において、前記光学画像の画像情報またはその取得条件は当該光学画像の輝度値または撮像露光時間であり、前記走査画像の取得条件は前記走査画像取得手段において前記蛍光を受光する光電変換器の感度であることを特徴とする。

本発明にかかる走査型顕微鏡システムは、予め光学顕微鏡観察部の白色光源から出力された励起光を用いて試料をスクリーニングし、観察対象の存在する領域を選定した後に、その選定領域のみを点走査型観察部のレーザ光源からの励起光を用いて蛍光観察するため、速やかに鮮明な走査型顕微鏡による走査画像を取得できるという効果を奏する。

以下に図面を参照して、本発明にかかる走査型顕微鏡システムの実施の形態について説明する。なお、この実施の形態によってこの発明が実施の形態、あるいは生物または医学分野における細胞等の生物標本の観察に限定されるものではなく、工業製品の検査などの他の用途にも使用できるものである。

（実施の形態１）
この実施の形態１は、光学顕微鏡を用いて画像を取得し、取得した画像を構成する画素群の輝度が高い領域を、観察対象が存在する領域として登録し、この登録した領域を走査型顕微鏡で観察するものである。

図１は、本発明にかかる走査型顕微鏡システムの実施の形態１の構成を示すブロック図である。走査型顕微鏡システム１は、顕微鏡本体２の光路が光路切り替え装置３によって光学顕微鏡観察部４と点走査型観察部５とに接続され、顕微鏡本体２、光学顕微鏡観察部４、および点走査型観察部５が、モニタ８を有したコンピュータ６に接続されて制御される。

コンピュータ６は、制御部６１、顕微鏡本体制御部６２、光路切り替え制御部６３、光学顕微鏡観察部制御部６４、走査マップ作成部６６、走査マップ検索部６７、点走査型観察部制御部６８、光学顕微鏡観察部４に接続されたＡ／Ｄ入力ＣＨ７１、点走査型観察部５に接続されたＡ／Ｄ入力ＣＨ７２、メモリ７３、画像処理部７４、および画像形成部８３を備える。制御部６１は、顕微鏡本体制御部６２、光路切り替え制御部６３、光学顕微鏡観察部制御部６４、走査マップ作成部６６、走査マップ検索部６７、点走査型観察部制御部６８、画像処理部７４、および画像形成部８３等を制御する。

顕微鏡本体２は、反射ミラー２１、レボルバ２２、対物レンズ２３、およびＸＹ電動ステージ２４等を備え、コンピュータ６の顕微鏡本体制御部６２によって制御される。ＸＹ電動ステージ２４上には、試料２５が載置される。

図２−１は、試料２５をＸＹ電動ステージ２４の上から見た図である。図２−２は、試料２５を横から見た図である。試料２５は、Ｚ方向にＬの厚みがあり、試料２５のなかには、観察対象となる数百の神経細胞２６が点在し、神経細胞２６は、観察目的に従って蛍光色素によって予め染色されている。

光学顕微鏡観察部４を用いて試料２５の画像を取得する場合、対物レンズ２３の倍率（開口数）に応じた焦点深度があるため、焦点位置の画像だけを鮮明な状態で取得することは難しく、光学顕微鏡観察部４を用いて取得した画像は、焦点以外の部分のぼけた成分が含まれた像となる。

光学顕微鏡観察部４または点走査型観察部５から入射される光は、反射ミラー２１を経由してレボルバ２２に取り付けられた対物レンズ２３を介し、ＸＹ電動ステージ２４上に載置された試料２５に照射される。試料２５に励起光が照射されると、試料２５中の観察対象となる神経細胞２６は蛍光を発する。

試料２５から発せられる蛍光は、入射光路を逆に辿り、対物レンズ２３、および反射ミラー２１を介して光路切り替え装置３によって光学顕微鏡観察部４または、点走査型観察部５へと導かれる。光路切り替え装置３は、光路に挿入可能なミラー３１を備え、コンピュータ６の光路切り替え制御部６３によってミラー３１の出し入れを制御する。光路切り替え装置３の中の光路にミラー３１を挿入すると、顕微鏡本体２の光路は点走査型観察部５に接続され、ミラー３１を抜くと顕微鏡本体２の光路は光学顕微鏡観察部４に接続される。

顕微鏡本体制御部６２は、顕微鏡本体２のレボルバ２２、ＸＹ電動ステージ２４などの準焦部を電動で制御して焦点を合わせる。例えば、レボルバ２２に取り付けられた対物レンズ２３をＺ方向に移動させてＺ方向の焦準を合わせ、ＸＹ電動ステージ２４をＸＹ方向に移動させて観察者が指定した範囲の画像を取得する。光学顕微鏡観察部４のＣＣＤカメラ４４を用いて画像を取得するとき、および点走査型観察部５を用いて画像を取得するときは、同じ倍率の対物レンズ２３を用い、略同じサイズの画像を取得する。

光学顕微鏡観察部４は、ハロゲンランプ光源４１、励起フィルタ４２、ダイクロイックミラー４３、およびＣＣＤカメラ４４等を備え、コンピュータ６の光学顕微鏡観察部制御部６４によって制御される。ハロゲンランプ光源４１は、白色光源である。なお、光学顕微鏡観察部制御部６４の光源は、ハロゲンランプに限らず、キセノンランプ等の白色光源を用いてもよい。励起フィルタ４２は、ハロゲンランプ光源４１から発された白色光の中から試料２５を染色した蛍光を励起する波長の光を抽出する。ダイクロイックミラー４３は、励起フィルタ４２によって抽出された光を光路切り替え装置３に入射させる。

試料２５から発せられた蛍光および反射光は、ダイクロイックミラー４３を透過してＣＣＤカメラ４４に受光される。ＣＣＤカメラ４４は、試料２５から発せられる光量を電荷として蓄積する光電変換器である。

ＣＣＤカメラ４４が蓄積した電荷は、Ａ／Ｄ入力ＣＨ７１によってデジタルの電気信号に変換され、メモリ７３の光学画像情報７６の各ブロックに順に格納される。図３は、光学画像情報７６および光学画像情報７６を構成する１つのブロックを拡大して模式的に示した図である。ＣＣＤカメラ４４を用いて撮像された画像は、光学画像情報７６の１つのブロックに格納される。ＸＹ電動ステージ２４を制御しながら試料２５を端から順に撮像すると、図３に示すような広域の光学画像情報７６が取得できる。

光学画像情報７６の各ブロックのサイズは、光学顕微鏡観察部４または点走査型観察部５によって取得される画像サイズＸ₁Ｙ₁である。図３に示したブロックの拡大図では、輝度の高い画素を○で表し、輝度の低い画素を●で表している。神経細胞２６の存在する部分は輝度が高いので○で表され、神経細胞２６のない部分は、輝度が低くので●で模式的に表している。

メモリ７３には、光学画像情報７６、光学画像情報７６から作成した走査マップ７７、走査画像情報７９、輝度値／電圧変換テーブル８１、および露光時間／電圧変換テーブル８２等が格納される。

画像処理部７４は、制御部６１を介してメモリ７３の光学画像情報７６または走査画像情報７９から画像を構築してモニタ８に表示する。光学画像情報７６は、光学顕微鏡観察部４からＡ／Ｄ入力ＣＨ７１を介して取得したブロック単位の画像データおよびブロック単位の画像データを合わせたものであり、走査画像情報７９は、点走査型観察部５のフォトマルチプライヤ５６からＡ／Ｄ入力ＣＨ７２を介して出力される出力信号と走査ユニット５３からの走査位置情報とをもとに画像形成部８３が形成した画像データである。

輝度値／電圧変換テーブル８１は、光学顕微鏡観察部４によって取得した光学画像情報７６から、点走査型観察部５のフォトマルチプライヤ５６の電圧を設定するために設けた変換テーブルである。露光時間／電圧変換テーブル８２は、ＣＣＤカメラ４２の自動露光設定機能を使用して画像を取得したとき、ＣＣＤカメラ４２の露光時間から点走査型観察部５のフォトマルチプライヤ５６の電圧を設定するために設けた変換テーブルである。

走査マップ作成部６６は、制御部６１を介し、メモリ７３にある光学画像情報７６のブロック内の画素の中のうち、閾値以上の輝度値を有する画素数、たとえば○で示される画素数をカウントし、閾値以上の輝度値を有する画素がブロック内に所定数以上あれば、そのブロックを、神経細胞２６が存在するブロックとして設定する。すなわち、走査マップ作成部６６は、神経細胞２６の存在するブロックをスクリーニングし、ブロックの位置情報が記憶された走査マップ７７を作成する。

図４−１は、走査マップ作成部６６によるスクリーニングを示す図である。図４−２は、観察対象となる神経細胞２６の存在するブロックを斜線で示した図である。図４−３は、走査マップ７７の一例を示す図である。

走査マップ作成部６６は、図４−１に示すように、光学顕微鏡観察部４のＣＣＤカメラ４４を用いてブロック単位で光学画像情報７６のＸ方向に右から左へと順に光学画像情報７６を取得し、取得した光学画像情報７６のブロックが閾値以上の輝度値を有する画素を所定数以上含むかどうかをスクリーニングし、Ｙ方向の１列が終了するとＸ方向に１つ下がって同様のスクリーニングを繰り返す。図４−２に示すように、例えば、斜線を施したブロックは、閾値以上の輝度値を有する画素を所定数以上含み、観察対象となる神経細胞２６が存在すると考えられるので、走査マップ作成部６６は、そのブロックの位置に「１」を書き込み、閾値以上の輝度値を有する画素を所定数未満しか含まないブロックの位置に「０」を書き込んで図４−３に示すような走査マップ７７を作成する。

このようにして、走査マップ７７で「１」が書き込まれたブロックは、点走査型観察部５を用いてさらに詳細な画像を取得するように登録される。また、神経細胞２６の軸策は点走査型観察部５で取得できる１ブロック内に神経細胞が納まらない場合があるため、ブロックの縁まで輝度が確認された場合、画素の連結情報によって隣のブロックも点走査型観察部５によって画像を取得するように走査マップ７７のブロックの位置に「１」を代入して登録する。

走査マップ検索部６７は、光路切り替え制御部６３によって光路切り替え装置３の光路にミラー３１を挿入し、顕微鏡本体２の光路を点走査型観察部５に接続させ、走査マップ７７において「１」が書き込まれたブロックを自動的に探し出し、点走査型観察部５によって「１」が書き込まれたブロックの詳細画像を取得する。

点走査型観察部５は、レーザ光源５１、励起波長切り替え用ダイクロイックミラー５２、走査ユニット５３、複数の測定用ダイクロイックミラー５４、およびダイクロイックミラー５４に個々に接続される複数のバリアフィルタ５５およびフォトマルチプライヤ５６等を備え、コンピュータ６の点走査型観察部制御部６８によって制御される。

レーザ光源５１は、光学顕微鏡観察部４の励起フィルタ４２によって抽出された励起光と同じ波長のレーザ光を発するように点走査型観察部制御部６８によって制御される。

ダイクロイックミラー５２は、レーザ光源５１からのレーザ光を反射させて走査ユニット５３に入射させる。走査ユニット５３は、図示しないＸ方向走査用のガルバノメータミラーとＹ方向のガルバノメータミラーを備え、レーザ光源５１からの光をコンピュータ６からの走査制御信号によってＸ方向およびＹ方向に走査し、Ｘ方向の１ラインを走査するたびに走査終了信号をコンピュータ６に出力する。

走査ユニット５３によってＸ方向およびＹ方向に走査された光は、光路切り替え装置３を介して、スポット光として顕微鏡本体２の試料２５に照射される。スポット光の照射によって試料２５から発せられる蛍光または反射光は、光路切り替え装置３を介して点走査型観察部５に戻される。

点走査型観察部５に戻された光は、ダイクロイックミラー５２を通過し、測定用ダイクロイックミラー５４、およびバリアフィルタ５５等の測定波長切り替え装置によって観察者が所望する波長の光だけがフォトマルチプライヤ５６などの光電変換器に受光される。

フォトマルチプライヤ５６等の光電変換器が光量に応じて蓄積した電荷は、Ａ／Ｄ入力ＣＨ７２によってデジタルの電気信号に変換され、画像形成部８３によって、フォトマルチプライヤ５６の出力信号と走査ユニット５３からの走査位置情報とをもとに２次元画像を形成し、メモリ７３に走査画像情報７９として格納される。画像処理部７４は、必要に応じて制御部６１を介して走査画像情報７９から画像を構築してモニタ８に表示する。

次に、走査マップ７７を作成する処理について説明する。図５は、走査マップ７７を作成する処理のフローチャートである。走査マップ７７を作成する処理は、例えば、神経細胞２６の観察を始めるとき、観察者が入力したコマンド等によって制御部６１から起動される。走査マップ７７を作成する処理が起動されると、始めに、光路切り替え制御部６３によって光路切り替え装置３のミラー３１を抜き、顕微鏡本体２の光路を光学顕微鏡観察部４に接続する（ステップＳ５０１）。

光学顕微鏡観察部制御部６４によって、光学顕微鏡観察部４のハロゲンランプ光源４４から発された白色光の中から励起フィルタ４２によって励起光を抽出し、ダイクロイックミラー４１を介して光路切り替え装置３から顕微鏡本体２に入射させる。顕微鏡本体制御部６２は、顕微鏡本体２に入射した励起光を制御して、顕微鏡本体２の反射ミラー２１を経由させてレボルバ２２に取り付けられた対物レンズ２３を介してＸＹ電動ステージ２４上に載置された試料２５に照射する（ステップＳ５０２）。

試料２５に励起光が照射されると、試料２５の中の観察対象となる神経細胞２６は蛍光を発する。試料２５から発せられた光は、ダイクロイックミラー４３を透過してＣＣＤカメラ４４に受光される（ステップＳ５０３）。ＣＣＤカメラ４４が光量に応じて蓄積した電荷は、Ａ／Ｄ入力ＣＨ７１によってデジタルの電気信号に変換され、光学画像情報７６の１つのブロックに格納される（ステップＳ５０４）。全ブロックの処理が終了していない場合（ステップＳ５０５，ＮＯ）、ステップＳ５０２に戻って光学画像情報７６の次のブロックの画像を取得する。

全ブロックの画像取得処理が終了すると（ステップＳ５０５，ＹＥＳ）、走査マップ作成部６６は、ブロック内の画像の画素群のうち閾値以上の輝度値を有する画素数をカウントし（ステップＳ５０６）、カウントの結果、そのブロックに閾値以上の輝度を有する画素数が所定数以上含まれている場合（ステップＳ５０７，ＹＥＳ）、走査マップ７７の該当するブロックの位置に「１」を代入して、点走査型観察部５による観察を行うように登録する（ステップＳ５０８）。閾値以上の輝度を有する画素数が所定数未満である場合（ステップＳ５０７，ＮＯ）、走査マップ７７の該当するブロックの位置に「０」を代入する（ステップＳ５０９）。

ここで、観察対象が神経細胞２６であり、ブロックの縁まで輝度が確認された場合、画素の連結情報によって隣のブロックも点走査型観察部５による観察対象として走査マップ７７の該当するブロックの位置に「１」を代入して、点走査型観察部５による観察を行うように登録してもよい。

全ブロックの処理が終了している場合（ステップＳ５１０，ＮＯ）、次のブロックについて（ステップＳ５１１）、ステップＳ５０６に戻って同様の処理を繰り返す。全ブロックの処理が終了すると（ステップＳ５１０，ＹＥＳ）、走査マップ７７を作成する処理は終了する。

図６は、走査マップ７７の作成処理の変形例を示すフローチャートである。ステップＳ６０１からステップＳ６０４までの処理は、光学画像情報７６の１つのブロックの画像を取得するステップＳ５０１からステップＳ５０４と同じ処理であり、ステップＳ６０５からステップＳ６１０までの処理は、画像を取得した光学画像情報７６の１つのブロックを走査マップ７７へ登録するか否かを決定するステップＳ５０６からステップＳ５１１と同じ処理である。走査マップ７７を作成する第２の処理では、光学画像情報７６の１つのブロックの画像を取得した後、連続して画像を取得したブロックを走査マップ７７へ登録するか否かの決定を行うものである。走査マップ７７は、図５または図６のいずれの処理を用いて作成してもよい。

点走査型観察部５によって時系列で神経細胞２６を観察する場合、走査マップ７７の作成が終了すると、タイマ等によって設定された時間が経過する度に走査マップ７７を検索する処理が起動される。

続いて、走査マップ７７を検索する処理について説明する。図７は、走査マップ７７を検索する処理のフローチャートである。走査マップ７７を検索する処理は、例えば、時系列で神経細胞２６を観察する場合、タイマ等によって設定された時間が経過する度に制御部６１によって起動される。始めに、光路切り替え制御部６３によって光路切り替え装置３のミラー３１を挿入し、顕微鏡本体２の光路を点走査型観察部５に接続する（ステップＳ７０１）。

次に、走査マップ７７検索部６７によって、走査マップ７７を順に検索する。走査マップ７７の該当するブロックの位置が「１」であれば（ステップＳ７０２，ＹＥＳ）、走査光学顕微鏡観察部制御部６４によって点走査型観察部５のレーザ光源５１から発射された光学顕微鏡観察部４の励起フィルタ４２によって抽出された励起波長と同じ波長のレーザ光を走査ユニット５３によってＸ方向およびＹ方向に走査し、光路切り替え装置３を介してスポット光として顕微鏡本体２の試料２５に照射する（ステップＳ７０３）。

スポット光の照射によって試料２５から発せられる蛍光または反射光は、光路切り替え装置３を介して点走査型観察部５へ戻される。点走査型観察部５へ戻った光は、ダイクロイックミラー５２を通過し、測定用ダイクロイックミラー５４、およびバリアフィルタ５５等の測定波長切り替え装置によって観察者が所望する波長の光に限定されてフォトマルチプライヤ５６などの光電変換器に受光される（ステップＳ７０４）。

フォトマルチプライヤ５６が光量に応じて蓄積した電荷は、Ａ／Ｄ入力ＣＨ７２によってデジタルの電気信号に変換され、画像形成部８３によって、フォトマルチプライヤ５６の出力信号と走査ユニット５３からの走査位置情報とをもとに２次元画像を形成してメモリ７３に走査画像情報７９として格納される（ステップＳ７０５）。

画像処理部７４は、制御部６１を介して走査画像情報７９から画像を構築し、モニタ８に表示する（ステップＳ７０６）。全ブロックの処理が終了していなければ（ステップＳ７０７，ＮＯ）、走査マップ７７の次のブロックを取り出し（ステップＳ７０８）、ステップＳ７０２に戻って同様の処理を繰り返す。全ブロックの処理が終了すれば（ステップＳ７０７，ＹＥＳ）、走査マップ７７を検索する処理は終了し、タイマ等によって設定された時間が経過すると再び起動される。

なお、実施の形態１では、ステップＳ５０４およびステップＳ６０４にあるようにＣＣＤカメラ４４が光量に応じて蓄積した電荷を、光学画像情報７６の１つのブロックに格納するようにしているが、ＣＣＤカメラ４４によって撮像される画像サイズは、光学画像情報７６の１つのブロックに限定されない。複数のブロック、例えば３または４個くらいのブロックをまとめて撮像し、光学画像情報７６にまとめて格納して各ブロックをスクーリングしてもよい。

以上詳細に説明したように、実施の形態１によれば、光学顕微鏡観察部４を用いて取得した光学画像情報７６のブロックのうち、閾値以上の輝度を有する画素が所定数以上あるブロックを走査マップ７７に登録し、走査マップ７７に登録されたブロックの走査画像情報７９をタイマ等によって自動的に取得しているので、観察試料上に点在する数百もの神経細胞２６の中から観察目的に合致する神経細胞２６を自動的に点走査型観察部５によって詳細に観察することができる。そのため、観察者の負担は軽減され、観察時間を短縮することができる。また、光学顕微鏡観察部４によるスクリーニング時にハロゲン光等の白色光を使用しているので、スクーリングによる蛍光の退色が少なく鮮明な走査画像情報７９を得ることができる。

なお、実施の形態１では、予め光学顕微鏡観察部４のＣＣＤカメラ４４を用いて光学画像情報７６を取得しているので、その後、点走査型観察部５を用いて走査画像情報７９を取得するときの条件設定に、光学顕微鏡観察部４によって取得した光学画像情報７６を利用することができる。

つまり、予め光学顕微鏡観察部４により取得した光学画像情報７６またはその撮像条件に基づいて、点走査型観察部５のフォトマルチプライヤ５６などの光電変換器の電圧を設定すれば、フォトマルチプライヤ５６を最適な電圧に設定することができる。図８−１は、輝度値／電圧変換テーブル８１の例である。輝度値／電圧変換テーブル８１によって横軸の光学顕微鏡観察部４により取得した光学画像情報７６の輝度値から縦軸のフォトマルチプライヤ５６の電圧を求めれば、点走査型観察部５で画像を取得する際、フォトマルチプライヤ５６を駆動するのに最適な電圧を自動的に設定することができる。このとき、光学画像情報７６の画像取得条件を揃えるため、ＣＣＤカメラ４４の電荷蓄積時間を一定にして光学画像情報７６を取得する。

同様に、ＣＣＤカメラ４４の有する自動露光時間設定機能によって設定された各ブロックの露光時間より点走査型観察部５のフォトマルチプライヤ５６の電圧を設定する。図８−２は、露光時間／電圧変換テーブル８２の例である。露光時間／電圧変換テーブル８２によって、横軸のＣＣＤカメラ４４の自動露光時間から縦軸のフォトマルチプライヤ５６の電圧を求めれば、点走査型観察部５で画像を取得する際、フォトマルチプライヤ５６を駆動するのに最適な電圧を自動的に設定することができる。このようにして求めたフォトマルチプライヤ５６の電圧を各ブロックの位置情報と共にメモリに記憶する。

また、光学顕微鏡観察部４で取得した光学画像情報７６のブロック内の閾値以上の輝度値を有する画素数が、所定の小さい数以下の場合、これをノイズとして除去するようにＡ／Ｄ入力ＣＨ７２等のゲインおよびオフセット値等を自動的に調整すれば、ノイズの少ない鮮明な走査画像情報７９を取得することができる。所定の小さい数とは、ステップＳ５０７で観察対象となる神経細胞２６が存在すると判断する所定数未満の値である。

（実施の形態２）
実施の形態２は、光学顕微鏡観察部４の光路の共焦点位置に複数のピンホールまたは複数のスリットが形成されたディスクを挿入し、これを回転させてＺ方向の焦点を移動させながら共焦点画像を複数枚取得し、取得した複数枚の共焦点画像をＺ方向に積層させて立体画像を作成し、立体画像に基づいて観察対象が存在する領域をスクリーニングして点走査型観察部５で観察する領域を特定するものである。

図９は、本発明にかかる走査型顕微鏡システム１００の実施の形態２の構成を示すブロック図である。図９に示した走査型顕微鏡システム１００において、図１に示した実施の形態１の走査型顕微鏡システム１と同一構成部分には同一符号を付している。

図９において、光学顕微鏡観察部４０は、実施の形態１の光学顕微鏡観察部４の光路の共焦点位置にスピニングディスク装置４５を配置したものである。スピニングディスク装置４５は、スリット状の透光部と遮光部とが交互に形成されたスピニングディスク４６と、スピニングディスク４６を略一定の速度で回転させるモータ４７とを備え、光学顕微鏡観察部制御部６４によって制御される。スピニングディスク４６の代わりに、複数のピンホールが形成されたニポウディスクを用いても同じように共焦点効果が得られる。

光学顕微鏡観察部４０のハロゲンランプ光源４１から出た光は、励起フィルタ４２を通ってスピニングディスク４６上に投影される。スピニングディスク４６のスリットを通過した光は反射ミラー２１によって反射されて対物レンズ２３を通過し、試料２５上に収束する。

試料２５に励起光が照射されると、試料２５の中の観察対象となる神経細胞２６は蛍光を発する。試料２５から発せられる蛍光は、入射光路を逆に辿り、再び、スピニングディスク４６のスリットを通過した光のみが、ダイクロイックミラー４３を通って、ＣＣＤカメラ４４上に共焦点画像を形成する。スピニングディスク装置４５を使用すると、厚さのある試料２５においても共焦点画像情報９２を取得することができる。

ＣＣＤカメラ４４が蓄積した電荷は、Ａ／Ｄ入力ＣＨ７１によってデジタルの電気信号に変換され、メモリ７３の共焦点画像情報９２の各ブロックに順に格納される。メモリ７３には、光学顕微鏡観察部４０を用いてＺ方向に焦点を少しずつ移動させて取得した複数枚の共焦点画像情報９２、この複数枚の共焦点画像情報９２から作成した輝度画像情報９３、およびこの輝度画像情報９３から作成した走査マップ７７等が格納される。

画像処理部７４は、制御部６１を介してメモリ７３に格納された共焦点画像情報９２から２次元の画像を構築してモニタ８に表示する。また、共焦点画像情報９２をＺ方向に複数枚積層させて立体画像９５を構築してモニタ８に表示する。

図１０は、メモリ７３に格納された複数枚の共焦点画像情報９２をＺ方向に積層して作成した立体画像９５である。１枚の共焦点画像９２では点として認識される神経細胞２６が、立体画像９５では神経細胞２６としてのつながりを認識できる。図１０の斜線部分は、観察対象となる神経細胞２６が存在するブロックである。

コンピュータ６０は、実施の形態１のコンピュータ６にさらに輝度画像情報作成部６５を備える。輝度画像情報作成部６５は、立体画像９５のＺ方向の画素の中で最も高い輝度値を有する画素情報をＸＹ方向の全ての画素について集めた輝度画像情報９３を作成し、走査マップ作成部６６は、作成した輝度画像情報９３をもとに走査マップ７７を作成する。

図１１は、走査マップ７７を作成する処理手順を示すフローチャートであり、図５のステップＳ５０１〜Ｓ５０６間に挿入される処理を示している。まず、実施の形態１のステップＳ５０１によって顕微鏡本体２の光路を光学顕微鏡観察部４０に切り替える。次に、光学顕微鏡観察部制御部６４は、光学顕微鏡観察部４０のハロゲンランプ光源４４から発された白色光の中から励起フィルタ４２によって励起光を抽出し、この励起光を、ダイクロイックミラー４１を介してスピニングディスク４６のスリットを通して光路切り替え装置３から顕微鏡本体２に入射させる。

顕微鏡本体制御部６２は、顕微鏡本体２に入射した励起光を制御して、顕微鏡本体２の反射ミラー２１を経由させてレボルバ２２に取り付けられた対物レンズ２３を介してＸＹ電動ステージ２４上に載置した試料２５に照射する（ステップＳ１１１）。

試料２５に励起光が照射されると、試料２５の中の観察対象となる神経細胞２６は蛍光を発する。試料２５から発せられた蛍光は、入射光路を逆に辿り、再び、スピニングディスク４６のスリットを通過した光のみが、ダイクロイックミラー４３を透過してＣＣＤカメラ４４に受光される（ステップＳ１１２）。

ＣＣＤカメラ４４が光量に応じて蓄積した電荷は、Ａ／Ｄ入力ＣＨ７１によってデジタルの電気信号に変換され、共焦点画像情報９２の１つのブロックに格納される（ステップＳ１１３）。全ブロックの処理が終了していなければ（ステップＳ１１４，ＮＯ）、ステップＳ１１２に戻って次のブロックの画像を取得する。

全ブロックの画像取得処理が終了すれば（ステップＳ１１４，ＹＥＳ）、顕微鏡本体２の焦点をＺ方向に少し移動させ（ステップＳ１１５）、共焦点画像情報９２をｎ枚取得していなければ（ステップＳ１１６，ＮＯ）、ステップＳ１１２に戻って次の共焦点画像情報９２を取得する。一方、共焦点画像情報９２をｎ枚取得していれば（ステップＳ１１６，ＹＥＳ）、取得した共焦点画像情報９２をＺ方向にｎ枚重ねて積層させ、立体画像９５を形成させる（ステップＳ１１７）。

輝度画像情報作成部６５は、立体画像９５の各画素の輝度をＺ方向に探索して（ステップＳ１１８）、最も高い輝度値をその画素の輝度値とする処理を共焦点画像情報９２の各画素について行い、輝度画像情報９３を作成し（ステップＳ１１９）、実施の形態１のステップＳ５０６に戻って走査マップ７７の作成を続ける。

図１２は、走査マップ７７を作成する他の処理手順を示すフローチャートであり、図６のステップＳ６０１〜Ｓ６０５間に挿入される処理を示している。ここで、ステップＳ１２１からステップＳ１２３までの処理は、共焦点画像情報９２の１ブロックの画像を取得するステップＳ１１１からステップＳ１１３と同じ処理であり、ステップＳ１２４からステップＳ１２８までの処理は、取得した共焦点画像情報９２の１つのブロックをＺ方向に積層させて立体画像９５および輝度画像情報９３を得るステップＳ５０６からステップＳ５１１と同じ処理である。ここで、図１２に示す処理では、共焦点画像情報９２の１ブロックの画像を取得した後、画像を取得したブロックをＺ方向に積層させ、連続して１ブロックの立体画像９５および１ブロックの輝度画像情報９３を得る処理を行うものである。なお、走査マップ７７は、図１１または図１２のいずれの処理を用いて作成してもよい。

走査マップ７７の作成が終了すると、実施の形態１と同様に走査マップ７７を検索する図７に示す処理が起動され、点走査型観察部５によって走査マップ７７に登録されたブロックの走査画像情報７９を取得することができる。

なお、実施の形態２では共焦点画像情報９２を得るためにスピニングディスク装置４５を用いたが、スピニングディスク装置４５を用いる代わりに、実施の形態１で取得した光学画像情報７６にデコンボリューションなどの画像処理を行い、光学画像情報７６に含まれる焦点以外の部分のぼけた成分を除去してもよい。この場合、デコンボリューションなどの画像処理を行うことによって神経細胞２６のスクリーニング精度を上げることができる。

以上詳細に説明したように、実施の形態２によれば、実施の形態１の効果に加えて、ＣＣＤカメラ４４にスピニングディスク装置４５を配置したので、デコンボリューションなどの画像処理を行うことなく試料２５の光学的な断層像を取得し、焦点位置にあたる平面の鮮明な共焦点画像情報９２を得ることができる。共焦点画像情報９２をＺ方向に積層させて試料２５の立体画像９５を得ることができる。また、立体画像９５のＺ方向の画素群の中で最も高い輝度値を有する画素情報をＸＹ方向の全ての画素について集めた輝度画像情報９３を作成し、輝度画像情報９３を基に走査マップ７７を作成するため、試料２５のＺ方向の厚さのために埋もれた神経細胞２６を見逃すことなく精度の高いスクリーニングを行うことができる。

（実施の形態３）
実施の形態３は、実施の形態１と実施の形態２を組みあわせたものであり、実施の形態２の光学顕微鏡観察部４０を用いて、Ｚ方向の焦点を少しずつ移動させて取得した複数枚の共焦点画像情報９２を各々スクリーニングして３次元走査マップを作成して点走査型観察部５で観察する領域を３次元の領域として特定するものである。

図１３は、本発明にかかる走査型顕微鏡システム２００の実施の形態３の構成を示すブロック図である。図１３に示した走査型顕微鏡システム２００において、図１および図９に示す実施の形態１の走査型顕微鏡システム１および実施の形態２の走査型顕微鏡システム１００と同一構成部分については同一符号を付している。

光学顕微鏡観察部４０は、光路の共焦点位置にスピニングディスク装置４５を配置して共焦点画像を取得できるようにしたものである。光学顕微鏡観察部制御部６４は、光学顕微鏡観察部４０のＺ方向の焦点を少しずつ移動した共焦点画像情報９２を複数枚取得する。走査マップ作成部６６は、取得した共焦点画像情報９２ごとに図５または図６のフローチャートに従って走査マップ９７を作成し、さらに走査マップ９７をＺ方向に積層させ、３次元走査マップ９７を作成する。

図１４−１は、３次元走査マップ９７の例であり、領域Ａは、走査マップ作成部６６のステップＳ５０８またはステップＳ６０７の処理によって点走査型観察部５による画像取得を登録されたブロック位置を表す。このようにして、３次元走査マップ９７によって、点走査型観察部５で観察する領域を３次元領域として特定することができる。

次に、実施の形態３で試料２５が多重染色されているとき、それぞれの蛍光によって励起される走査画像情報７９の取得処理について説明する。試料２５が多重染色されているときは、光学顕微鏡観察部４０の励起フィルタ４３を、試料２５を染色した蛍光に合わせて変更し、試料２５に照射する励起光の波長を切り替え、それぞれの共焦点画像９２を取得する。取得した共焦点画像情報９２ごとに走査マップ７７を作成してＺ方向に積層させ、図１４−１のような３次元走査マップ９７を、それぞれ試料２５を染色した蛍光ごとに作成する。

例えば、試料２５が３５１ｎｍ、４８８ｎｍ、５４３ｎｍの３つの波長で励起される３重の蛍光で染色されている場合、初めに、光学顕微鏡観察部４０の励起フィルタ４３を３５１ｎｍに切り替えて励起光を照射し、例えば、図１４−１の３次元走査マップ９７を作成する。領域Ａは、３５１ｎｍの波長で励起される領域であり、領域Ａには３５１ｎｍの波長で励起されたとき蛍光を発する細胞が存在する。

同様に、光学顕微鏡観察部４０の励起フィルタ４３を変えて４８８ｎｍの励起光を照射し、図１４−２の３次元走査マップ９８を作成し、励起フィルタ４３を変えて５４３ｎｍの励起光を照射し、図１４−３の３次元走査マップ９９を作成すると、領域Ｂには４８８ｎｍの波長で励起されたとき蛍光を発する細胞が存在し、領域Ｃには５４３ｎｍの波長で励起されたとき蛍光を発する細胞が存在することがわかる。

次に、３次元走査マップ９７、３次元走査マップ９８、および３次元走査マップ９９を合成して図１４−４の３次元走査マップ１００を作成する。３次元走査マップ１００によれば、領域Ａと領域Ｂの重なった領域Ｄには３５１ｎｍの励起光に反応する細胞と、４８８ｎｍの励起光に反応する２種類の細胞が存在し、領域Ａと領域Ｃの重なった領域Ｅには３５１ｎｍの励起光に反応する細胞と、５４３ｎｍの励起光に反応する２種類の細胞が存在し、重ならない領域には１種類の細胞だけが存在することがわかる。

ここで、画像処理部７４によって、３次元走査マップ９７の領域Ａを青色に、３次元走査マップ９８の領域Ｂを緑色に、３次元走査マップ９９の領域Ｃを赤色に表示するよう画像処理し、画像処理した３次元走査マップ９７、３次元走査マップ９８、３次元走査マップ９９とそれを合成した次元走査マップ１００をモニタ８に表示する。観察者は、モニタ８に表示された３次元走査マップ１００によって、領域Ａの青色と領域Ｂの緑色の重なった領域Ｄには３５１ｎｍの励起光に反応する細胞と、４８８ｎｍの励起光に反応する２種類の細胞が存在し、領域Ａと領域Ｃの重なった領域Ｅには３５１ｎｍの励起光に反応する細胞と、５４３ｎｍの励起光に反応する２種類の細胞が存在し、重ならない領域には１種類の細胞だけが存在することが３次元走査マップ１００等をモニタ８に表示すれば目で見て理解できる。

また、３次元走査マップ１００によれば、レーザ波長を照射するべきブロックのＸＹＺ位置情報に加えて、ブロックごとのレーザ光源５１の種類、およびレーザ波長を知ることができる。３次元走査マップ１００から得られる走査画像情報７９取得のための画像取得条件を、画像取得条件テーブル１１０としてコンピュータ６００のメモリ７３に記憶する。

図１５は、画像取得条件テーブル１１０の例を示す図である。画像取得条件テーブル１１０には、レーザ光源の種類１１１、レーザ波長１１２、およびブロックのＸＹＺ位置１１３等の画像取得条件が記憶される。点走査型観察部制御部６８は、画像取得条件テーブル１１０に記憶された画像取得条件に従って、レーザ光源の種類１１１、およびレーザ波長１１２を自動的に選択し、記憶されたブロックのＸＹＺ位置１１３の走査画像情報７９を自動的に取得する。

このように実施例３では、登録されたブロックのＸＹＺ位置を正確に捉えることができる。しかし、試料２５の登録されたブロックを電動ＸＹステージ２４等の電動焦点準部を制御しながら長時間繰り返し観察すると、ハロゲンランプ光源４１やレーザ光源５１などの熱によって顕微鏡周辺の温度が上昇して顕微鏡本体２がたわむことがある。また、ＸＹ電動ステージ２４を繰り返し移動させることでずれが生じ、観察領域として登録したブロックのＸＹＺ位置がずれることがある。

このような場合、定期的に、または点走査型観察部５による観察を行う前に、顕微鏡本体２を光学顕微鏡観察部４０と接続してＣＣＤカメラ４４の画像データを用いてオートフォーカス処理を行い、Ｚ方向の位置ずれを補正する。また、前回オートフォーカスにより取得した画像と今回オートフォーカスにより取得した画像とを比較して画素ずれが生じている場合、自動的にずれ量を計算し、ＸＹ位置の位置ずれを補正する。ＸＹＺ位置の補正が終了した後、点走査型観察部５を顕微鏡本体２に接続すれば、常に同じ位置で画像情報を取得することができる。また、光学顕微鏡観察部４内に、公知のパッシブＡＦユニットやアクティブＡＦユニットを設けて、Ｚ方向の位置ずれ補正をしてもよい。

以上詳細に説明したように、実施の形態３によれば、実施の形態１および実施の形態２の効果に加えて、各ブロックで観察目的に合った細胞をＺ方向に探すような無駄な画像取得時間を短縮することができる。また、多重染色の場合も、登録されたブロックに必要外のレーザを照射することがないので、蛍光の退色を防止できるし、登録されたブロックに必要なレーザ光だけを照射するので、レーザのクロストークによるノイズが走査画像情報７９に取得されることが少ない。さらに、観察者がブロックごとに画像取得条件にあるレーザ光源５１の設定をする必要がなく、観察者の負担を軽減することができる。

本発明の実施の形態１である走査型顕微鏡システムの構成を示すブロック図である。 試料２５をＸＹ電動ステージ２４の上から見た図である。 試料２５を横から見た図である。 光学画像情報７６および光学画像情報７６を構成する１つのブロックを拡大して模式的に示した図である。 光学画像情報７６のブロックの画像を順に取得して神経細胞２６の存在するブロックをスクリーニングする様子を示す図である。 観察対象となる神経細胞２６の存在するブロックを斜線で示した図である。 走査マップ７７の一例を示す図である。 走査マップ７７の作成処理手順を示すフローチャートである。 走査マップ７７の他の作成処理手順を示すフローチャートである。 走査マップ７７を検索する処理手順を示すフローチャートである。 輝度値／電圧変換テーブル８１の一例を示す図である。 露光時間／電圧変換テーブル８２の一例を示す図である。 本発明の実施の形態２である走査型顕微鏡システムの構成を示すブロック図である。 共焦点画像情報９２をＺ方向に積層して作成した立体画像９５を示す図である。 走査マップ７７の作成処理手順を示すフローチャートである。 走査マップ７７の他の作成処理手順を示すフローチャートである。 本発明の実施の形態３である走査型顕微鏡システムの構成を示すブロック図である。 ３次元走査マップ９７の一例を示す図である。 ３次元走査マップ９８の一例を示す図である。 ３次元走査マップ９９の一例を示す図である。 ３次元走査マップ１００の一例を示す図である。 画像取得条件テーブル１１０の一例を示す図である。

符号の説明

１，１００，２００ 走査型顕微鏡システム
２ 顕微鏡本体
３ 光路切り替え装置
４ 光学顕微鏡観察部
５ 点走査型観察部
６，６０，６００ コンピュータ
８ モニタ
２１ 反射ミラー
２２ レボルバ
２３ 対物レンズ
２４ 電動ＸＹステージ
２５ 試料
２６ 神経細胞
３１ ミラー
４１ ハロゲンランプ光源
４２ 励起フィルタ
４３，５２，５４ ダイクロイックミラー
４４ ＣＣＤカメラ
５１ レーザ光源
５３ 走査ユニット
５５ バリアフィルタ
５６ フォトマルチプライヤ
６１ 制御部
６２ 顕微鏡本体制御部
６３ 光路切り替え制御部
６４ 光学顕微鏡観察部制御部
６５ 輝度画像情報作成部
６６ 走査マップ作成部
６７ 走査マップ検索部
６８ 点走査型観察部制御部
７１，７２ Ａ／Ｄ入力ＣＨ
７３ メモリ
７４ 画像処理部
７６ 光学画像情報
７７ 走査マップ
８１ 輝度値／電圧変換テーブル
８２ 露光時間／電圧変換テーブル
８３ 画像形成部
９２ 共焦点画像情報
９３ 輝度画像情報
９５ 立体画像
９７，９８，９９，１００ ３次元走査マップ
１１０ 画像取得条件テーブル
１１１ レーザ光源の種類
１１２ レーザ波長
１１３ ブロックのＸＹＺ位置

Claims (14)

1. 試料をレーザ光で点走査して得られる光を受光器で受光して走査画像を形成する点走査型観察部と、試料からの光を２次元撮像素子で撮像する光学顕微鏡観察部とを備えた走査型顕微鏡システムであって、
   前記光学顕微鏡観察部の光源から試料に励起光を照射し、前記試料が発する蛍光を受光して光学画像を取得する光学画像取得手段と、
   前記光学画像取得手段が前記試料中の複数箇所で取得した各光学画像にもとづいて前記試料を複数のブロックに分け、該複数のブロックの各々が前記走査画像の取得対象とすべき走査領域であるか否かを前記光学画像での画素群の輝度値をもとに前記ブロック毎に判断して、前記試料での前記走査領域の分布を示す走査マップを作成する走査マップ作成手段と、
   前記走査マップ作成手段が作成した走査マップで定められる前記走査領域に対して前記点走査型観察部のレーザ光源から励起光を照射し、前記試料が発する蛍光を受光して走査画像を取得する走査画像取得手段と、
   を備えることを特徴とする走査型顕微鏡システム。
2. 前記ブロックは、前記光学顕微鏡観察部および前記点走査型観察部が取得できる画像のサイズに対応した領域であることを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡システム。
3. 前記走査マップ作成手段は、前記輝度値が所定の閾値以上となる画素を所定数以上含むブロックを前記走査領域として選定することを特徴とする請求項１または２に記載の走査型顕微鏡システム。
4. 前記光学画像取得手段は、前記光学顕微鏡観察部の光源としてハロゲンランプまたはキセノンランプを含む白色光源を用いて前記光学画像を取得することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の走査型顕微鏡システム。
5. 前記光学画像取得手段は、前記光学顕微鏡観察部の光路の共焦点位置に複数のピンホールまたは複数のスリットが形成された回転ディスクを挿入し、共焦点方式を用いて前記光学画像を取得することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の走査型顕微鏡システム。
6. 前記光学画像は、焦点位置を前記試料の深さ方向に移動させて撮像した複数枚の共焦点画像を積層して形成した立体画像であることを特徴とする請求項５に記載の走査型顕微鏡システム。
7. 前記走査マップ作成手段は、前記立体画像を構成する画素群の輝度値をもとに前記走査領域を選定することを特徴とする請求項６に記載の走査型顕微鏡システム。
8. 前記光学画像は、前記立体画像を構成する前記試料の深さ方向に積層された複数枚の共焦点画像における深さ方向の各画素群から最も高い輝度値を有する画素によって形成された２次元輝度画像であることを特徴とする請求項７に記載の走査型顕微鏡システム。
9. 前記光学画像取得手段は、前記試料に複数の励起光を照射し、前記試料が発する蛍光を受光して前記励起光に対応した前記光学画像を取得し、
   前記走査マップ作成手段は、前記励起光に対応した前記光学画像から前記走査領域と前記走査領域群に照射する１以上の前記励起光とを関連付けることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一つに記載の走査型顕微鏡システム。
10. 前記光学画像取得手段が取得する画像サイズは、前記走査領域の大きさとほぼ等しいかまたは複数の走査領域を含む大きさであることを特徴とする請求項２に記載の走査型顕微鏡システム。
11. 前記走査マップ作成手段は、走査領域として選定されたブロックの縁部まで前記輝度値が確認された場合、その走査領域の隣のブロックも走査領域として選定することを特徴とする請求項３に記載の走査型顕微鏡システム。
12. 前記走査マップ作成手段は、前記光学画像取得手段により取得された前記深さ方向の異なる複数毎の共焦点画像のそれぞれに対して、画像を構成する画素群の輝度値をもとに前記走査領域を選定することにより、走査領域選定を３次元的におこなうことを特徴とする請求項７に記載の走査型顕微鏡システム。
13. 前記光学画像の画像情報またはその取得条件にもとづいて、前記点走査型観察部による走査画像の取得条件を設定することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一つに記載の走査型顕微鏡システム。
14. 前記光学画像の画像情報またはその取得条件は当該光学画像の輝度値または撮像露光時間であり、前記走査画像の取得条件は前記走査画像取得手段において前記蛍光を受光する光電変換器の感度であることを特徴とする請求項１３に記載の走査型顕微鏡システム。

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