JP4441304B2

JP4441304B2 - 水溶性低粘度β−Ｄ−グルカン含有培養液の調製方法

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Publication number: JP4441304B2
Application number: JP2004092330A
Authority: JP
Inventors: 利雄鈴木; 誠司中村; 聡中山; 孝治西川
Original assignee: Daiso Co Ltd
Current assignee: Osaka Soda Co Ltd
Priority date: 2003-04-10
Filing date: 2004-03-26
Publication date: 2010-03-31
Anticipated expiration: 2024-03-26
Also published as: JP2004321177A

Description

本発明は、微生物が菌体外に産生する水溶性β-D-グルカンを主成分とする培養液から、食品用添加物や健康食品素材などとして有用な水溶性低粘度β-D-グルカンの調製方法に関する。

β-グルカン（β-1,3-D-グルカンやβ-1,6-D-グルカンやβ-1,3-1,6-D−グルカン）は自然界に生息するキノコ（担子菌の子実体）に多く含まれる成分（数％から50％程度）で、それらの子実体だけでなく培養菌糸体にも含まれていることが最近明らかになりつつある。またそれらのβ-グルカンには抗腫瘍活性があることが知られている。例えば、スエヒロタケ、カワラタケ、シイタケから抽出されたそれぞれのβ-グルカンは既に抗がん剤などの医薬品として製造販売されている。
一方、不完全菌であるオーレオバシジウム属（Aureobasidium）に属する微生物もβ-グルカンを生産することが知られている。
しかしながら、一般にβ-グルカン水溶液はその構造から１重らせんや３重らせん構造をとるためゲルを形成しやすく、その培養液は高粘度であるため、精製はきわめて困難であった（非特許文献１参照）。例にもれずオーレオバシジウム属に属する微生物の産生するβ-グルカン含有培養液も粘度が高く、その培養液から菌体と水溶性β-グルカンの工業的分離回収精製法は殆ど報告されていなく、菌体と共に用いられているのが現状である。

また、キノコなどの子実体に含有されるβ-グルカンは非常に水に溶け難く、アルカリ溶液でしか可溶化しないため、最近では、キノコなどの不溶性のβ-グルカンを熱水やアルカリ抽出後、乳化剤などの分散化剤存在下で高圧処理（300-800kgf/cm²）し、コロイド状に超微粒子化する方法も特許出願されている（特許文献１）。
その他に、

１）特許文献２によれば、オーレオバシジウム属(Aureobasidium. sp) FERM‐P．No.4257株の培養液を加熱殺菌した後、ろ過または遠心分離して飲食物として利用可能な培養液を得る方法が開示されている。

２）特許文献３によれば、オーレオバシジウム属の微生物の濾過または遠心分離した菌体またはその細胞壁に熱水、希アルカリ水溶液を接触させ水溶性β-1,3-1,6-D-グルカンを溶出させ、採取する方法が開示されている。

３）特許文献４によれば、微生物の産生する不溶性β-グルカンの水分散液あるいは培養液（菌体内に産生したグルカンあるいは細胞壁成分）に親水性有機溶媒存在下でアルカリ熱処理（0.2Ｎ以上、通常0.2-1Ｎ好ましくは0.3-0.5Ｎアルカリ）を行い、不溶性のβ-グルカンが析出した混合液を中和する精製方法が開示されている。

４）特許文献５によれば、キノコや微生物などの不溶性β-グルカンを含む菌体の懸濁液（特に細胞壁成分）に過酸化物と水酸化物を加えpHを10-12.5にせしめ、水不溶性β−グルカンを回収精製する方法が開示されている。

５）特許文献６によれば、オーレオバシジウム属の微生物より産生される水溶性β-1,3-1,6-D-グルカンを含む培養液に苛性アルカリを加えpHを9-10に調節し、生成するアルカリ塩を噴霧乾燥する方法が開示されている。
国際公開第０２／０８７６０３号パンフレット特開昭６１−１４６１９２号公報特公平６−９２４４１号公報特開平５−３０８９８７号公報特開平９−３２２７９５号公報特開平１０−２７６７３９号公報 Fragrance Journal, 5, 71-75 (1995) Agric. Biol. Chem., 47, 1167-1172 (1983) K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978) 今中忠行監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002）濱田ら、科学と工業、64、131-135（1990）

本発明の目的は、微生物、特にオーレオバシジウム属に属する微生物が菌体外に産生する水溶性β-D-グルカンを主成分とする培養液の低粘度化および低粘度化水溶性β-D-グルカンに関する。

本発明者らは、微生物を醗酵せしめ、得られる培養液に含有するβ-D-グルカン、特にオーレオバシジウム属に属する微生物の培養液に含有する水溶性β-D-グルカンを高アルカリ水溶液で処理することにより、水溶性でかつ、低粘度のβ-D-グルカン含有培養液が得られることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、水溶性β-D-グルカン、例えばβ-1,3-D-グルカン、β-1,3-1,6-D-グルカンを主成分とする微生物、例えばオーレオバシジウム属プルランスの如きオーレオバシジウム属に属する微生物の培養液にアルカリまたはその水溶液を加え、該培養液を低粘度化するに必要なpH濃度に調整することを特徴とする水溶性低粘度β-D-グルカン含有培養液の調製方法に関する。

本発明は、上記方法で得られる水溶性低粘度β-D-グルカン含有培養液から微生物を含む不純物を分離することによる水溶性低粘度β-D-グルカンの精製方法にも関する。
本発明は、上記方法で得られる水溶性低粘度β-D-グルカン含有培養液または上記方法で得られる水溶性低粘度β-D-グルカン含有水溶液に酸を加えて、弱アルカリ性〜酸性に調整する水溶性低粘度β-D-グルカン含有培養液または水溶性低粘度β-D-グルカン含有水溶液の調整方法に関する。
本発明は、上記の方法により得られる水溶性低粘度β-D-グルカンまたはその水溶液を含む食品に関する。
本発明は、また水溶性β-D-グルカンを主成分とする微生物培養液にアルカリ水溶液を加え、pHを12以上に調整することにより製造される水溶性低粘度β-D-グルカンに関する。
本発明は、また上記方法で得られた水溶性低粘度β-D-グルカン含有水溶液を乾燥して得られる乾燥水溶性低粘度β-D-グルカンに関する。

以上のように、オーレオバシジウム属に属する微生物などにより産生される高粘度の水溶性β-D-グルカンを高アルカリ処理することにより低粘度化することに成功した。その結果、従来の培養液では困難であった菌体の除去やスプレ−ドライなどによる粉末化が可能となった。

本発明に使用される微生物は、水溶性β-D-グルカンを産生し得る限り、特に限定されないが、好ましくはオーレオバシジウム属微生物、特にオーレオバシジウム属プルランスである。
オーレオバシジウム（Aureobasidium） sp. K-1株（非特許文献２参照）から変異処理により得られた変異菌株GM-NH-1A1株またはGM-NH-1A2株は、低分子グルカンも産生するので、特に好ましい菌である。なお、上記オリジナルの菌株であるオーレオバシジウム sp. K-1株は高分子量のβ-グルカンを数種類（200万以上と100万程度のβ-グルカン）を産生し、そのβ‐グルカン含有培養液の粘度は高く、増粘剤として食品添加物として利用されている。また、オーレオバシジウム sp. K-1株の産生するβ‐グルカンは一部スルホ酢酸基により置換されており、その含量は培地組成など培養方法により異なる（非特許文献追加）。

本変異菌株GM-NH-1A1株とGM-NH-1A2株は、実施例で示すようにメインピークが100万程度の高分子量のβ-グルカンとメインピークが10-20万程度の低分子量のβ-グルカンの両方を産生する菌株で、これらにより産生されたβ‐グルカンはオリジナル菌株と同様に一部スルホ酢酸基により置換されており、その含量はいづれも約0.1％であった（非特許文献２参照）。これらの菌株の性質は下記表に示した通りである。それぞれの菌株の形態学的性質および28s rDNAの塩基配列から、これらの菌株はAureobasidium pullulansに属する微生物であることが確認された。これらの菌株は独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターにそれぞれFERM P-19285 とFERM P-19286として寄託されている。

微生物を培養して水溶性β-D-グルカンを産生するには、公知の水溶性β-D-グルカン産生能を有する菌或いは上記の寄託された菌を使用し、それぞれの微生物に応じて公知の培地、培養方法により行うことができる。
オーレオバシジウム属に属する微生物を培養して、水溶性β-1,3-1,6-D-グルカンを生産する方法もまた種々報告されているが、使用できる炭素源としては、シュ−クロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源を挙げることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源を挙げることができる。場合によってはβ-グルカンの生産量を上昇させるために適宜上、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、さらには鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類を添加するのも有効な方法である。

たとえばオーレオバシジウム属に属する微生物を炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸ナトリウムを添加した培地で培養した場合、高濃度の水溶性β-1,3-1,6-D-グルカンを産生することが報告されている（非特許文献２参照）。しかしながら、培養液はこの組成に限定されるものではなく、さらに必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。
オーレオバシジウム属に属する微生物を上記培地で好気培養するための条件は、温度が10−50℃、好ましくは20−35℃であり、pHが4−7、好ましくは4.5−6.5である。
効果的に培養pHを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のpHを制御するのも得策である。さらに培養液の消泡のために適宜、泡消剤を添加してもよい。培養時間は通常1−10日間が好ましく、1−4日間培養すれば水溶性β‐D‐グルカンを生産することが可能である。なお、β‐D‐グルカンの生産量を測定しながら培養時間を決めてもよい。

上記条件でオーレオバシジウム属に属する微生物を4−6日間通気攪拌培養すると、培養液には水溶性β-1,3-1,6-D−グルカンを主成分とするβ-グルカン多糖が0.1％から数％(w/v)含有されており、その培養液の粘度はBM型回転粘度計（東機産業社製）により30℃では数千cP [mPa・s]）から数百cP ([mPa・s])という非常に高い粘度を有する。
上記のようにして得られる培養液に、通常常温でアルカリまたはその水溶液を加え、該培養液を低粘度化するに必要なpHに調整することにより、急激にその粘度を低下させることができる。

本発明で用いられるアルカリまたはその水溶液としては、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ塩水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液、あるいはアンモニア水溶液など通常用いられる水溶性のアルカリであれば特に制限はない。ただし、食用には食品添加物として認められているアルカリが好ましいことは言うまでもない。
pHの調整は対象の培養液中の多糖類の濃度により異なるが、比較的高濃度の場合、pHが11以上で、好ましくは12以上、更に好ましくは13以上になるようにアルカリまたはその水溶液を添加する。低濃度の場合には、より低いpHで処理することにより低粘度化することができる。

アルカリ処理後の粘度を低下させた水溶性β-D-グルカン培養液から、菌体などの不溶性物質を分離する方法としては、培養液から不溶性物質を分離できる方法であれば特に制限はなく、遠心分離、ろ紙あるいはろ布を利用した全量ろ過、フィルタープレス、更に膜ろ過（MF膜などの限外ろ過）などで行うことができる。ろ紙あるいはろ布による全量ろ過の場合はセライトなどろ過助剤を利用するのも一つの手段である。ろ過により除菌する場合、培養液の粘度は100cp以下、好ましくは60cp以下、更に好ましくは30cp以下に調整されていることが好ましい。
アルカリ処理後、粘度を低下させた水溶性β-D-グルカン含有培養液あるいは、更に除菌などの精製後の水溶性β-D-グルカン含有水溶液に、酸を添加しpHを弱アルカリ性（pH10）から酸性（pH2)に中和処理してもよい。
本発明においては、上記方法で得られる水溶性低粘度β-D-グルカン含有培養液をアルカリ処理で低粘度化した培養液や、更に菌体を取り除たり、中和処理したり、脱塩まで行った水溶性低粘度化β-D-グルカンを乾燥して、乾燥水溶性低粘度β-D-グルカンを製造できる。乾燥方法としては、噴霧乾燥法や、凍結乾燥法等公知の方法を採用できる。また、噴霧乾燥の作業性を改善したり、回収率を上げるため、必要に応じて、乳糖、デキストリン、シクロデキストリン、クラスタ−デキストリン、トレハロ−ス等の糖質化合物を適宜配合することが出来る。

本発明によれば、アルカリ処理後の水溶性β-D-グルカン含有培養液または精製β-D-グルカン含有水溶液のpHを中性付近から酸性付近に調整しなおしてもグルカンなどの多糖がゲル化するようなことは無く、粘度は低粘度のままである。
このように本発明は、高粘度の水溶性β-D-グルカン含有培養液をアルカリ処理により低粘度化させ、必要に応じ精製処理後、引き続きpHを酸性（pH２）に調整しなおしても粘度の上昇が無く、健康食品素材、特に健康食品飲料素材として有用である。特にそのままでホットパック滅菌（pHが4以下、90℃以下で数分）に供することができることから、本発明に係る方法は実際的な方法である。
この場合のpHの調整は目的に応じて適当に調整すればよい。
本発明の方法において用いられる酸としては、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸など通常アルカリを中和させることができるものであれば特に制限がない。ただし、食用には、食品添加物として認められている酸、例えばクエン酸やリンゴ酸が使用される。

下記に実施例１及び２に示す２種類の培養液を用いて行った粘度低下実験の結果を示す。なお、粘度の測定はアルカリ処理した培養液を50%(w/v)クエン酸水溶液でpH4.9に調整してから行った。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

実施例１ Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1株の使用
１）β-グルカンの培養産生−１
下記の組成からなる60mlの液体培地をバッフル付きの300 ml三角フラスコに入れ、121℃、15分間、加圧蒸気滅菌を行った後、GM-NH-1A1株を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、24時間、30℃で130rpmの通気攪拌培養を行い種培養液を調製した。ついで、同組成の培地3Lを5L容ジャーファーメンター（ミツワ理科学社製）に入れ、121℃、15分間、加圧蒸気滅菌を行い、先ほど得られた種培養液を無菌的に植菌し、400rpm、 30℃、 600ml/minの通気攪拌培養を行った。なお、pHは水酸化ナトリウムと塩酸を用いてpH4.6〜5.0に制御した。約96時間後の菌体濁度は24 OD(660nm）で、多糖濃度は0.6%(w/v)であった。多糖濃度は、培養液から菌体を遠心除去した後、66%(v/v)となるようにエタノールを加えて沈殿させ、イオン交換水に溶解後、フェノール硫酸法で定量した。

ついでコンゴ―レッド法によって、480nmから525nm付近への波長シフトを確認することができたのでβ-グルカンを含有していることが証明された（非特許文献３、４参照）。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μg多糖であった。また、本多糖の２次元NMR（¹³C-¹H COSY NMR ）スペクトルより、構成糖であるD-グルコースのC1炭素に由来する¹³C NMR 104ppmと相関関係を有する¹H NMRスペクトル 4.7ppmと4.4ppm付近の２つのシグナルを得た。この結果、β-グルカンがβ-1,3-1,6-D-グルカンであることが証明された（非特許文献４参照）。それぞれの¹H NMRシグナルの積分比から、β−1,3-結合/β1,6-結合の比は1.17であることが判明した。
また、この菌体除去した培養上清にエタノールを最終濃度が６６％となるように添加し、β‐グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、不溶各分をろ紙でろ過除去した。その上清に最終濃度が0.9％になるように食塩を加えた後、再度６６％エタノールでβ‐グルカンを回収した。このβ‐グルカン回収精製操作をさらに２回繰り返し、得られたβ‐グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ‐グルカン粉末を得た。本β‐グルカンの組成分析結果からS含量は239mg/kgであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は0.09％であった。これは非特許文献２記載の方法で測定したスルホ酢酸含量からも確認できた。

２）アルカリ処理
上記１）で得られた培養液3LをBM型回転粘度計により測定したところ、粘度は30℃で1400cP ([mPa・s])であった。この培養液に最終濃度が2.4 %(w/v)となるように25％(w/w)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ、瞬時に粘度が低下した。そのときのpHは13.6であった。引き続いて50％(w/v)クエン酸水溶液でpH4.9にしてから粘度を測定したところ、そのときの粘度は18cP ([mPa・s])であった。次いで、この培養液にろ過助剤としてKCフロック（日本製紙社製）を添加し、ろ紙（アドバンテック社製 No.2）を用いて吸引ろ過により菌体を除去し、最終的に培養ろ液を約3.5L得た。その多糖濃度は0.6％(w/v)で、ほぼ100％の回収率であった。

３）β-D-グルカン水溶液の脱塩
上記のβ-グルカン水溶液（培養ろ液）をＵＦ膜（分子量カット５万、スペクトラム社製）によって脱塩を行い、最終的に塩濃度を30-40分の1程度に脱塩した。最後に、50％(w/v)クエン酸水溶液によりpHを3.5にした後、95℃、3分間殺菌処理を行い、最終製品として3.5Lのβ-D-グルカン水溶液を得た。この時のβ-D-グルカンの濃度はフェノール硫酸法により測定したところ0.43%(w/v)で、培養液からの収率は約70％であった。
また、得られたβ‐グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ‐グルカン粉末を得た。本β‐グルカンの組成分析結果からS含量は330mg/kgであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は0.12％であった。これは非特許文献２記載の方法で測定したスルホ酢酸含量からも確認できた。
また、東ソー社製のトーヨーパールHW65（カラムサイズ 75cm x φ1cm、排除分子量250万（デキストラン））により0.1Mの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行ったところ、得られた多糖の分子量は平均分子量で5万から30万のピークの低分子画分と50万から250万以上の高分子画分の二種類からなることが判明した。なお、分子量マーカーとしてShodex社製のプルランを用いた。

実施例２ Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1株の使用
１）β-D-グルカンの培養産生−２
前記、表４の組成からなる60mlの液体培地をバッフル付きの300 ml三角フラスコに入れ、121℃、15分間、加圧蒸気滅菌を行った後、GM-NH-1A1株を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、96時間、30℃で130ｒｐｍの通気攪拌培養を多糖生産実験を行った。96時間後の菌体濁度は35 OD（660nm）で、多糖濃度は0.3%(w/v)であった。多糖濃度は、培養液から菌体を遠心除去した後、66%(v/v)となるようにエタノールを加えて沈殿させ、イオン交換水に溶解後、フェノール硫酸法で定量した。

２）以下、実施例１と同様にして、この多糖の性質を調べた。
コンゴ―レッドでのシフト効果を調べたところ、極大吸収が480nmから525nm付近へのシフトが観察されβ-D-グルカンを含有していることが証明された。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.45/500μg多糖であった。また２次元NMR（¹³C-¹H COSY NMR）分析を行った。その結果より、得られた多糖はβ-1,3-1,6-D-グルカンであることが証明された。それぞれの¹H シグナルの積分比より、β-1,3-結合/β1,6-結合の比は1.11であった。
引き続いて、得られた培養液60mlをBM型回転粘度計により測定したところ、粘度は30℃で140cP ([mPa・s])であった。この培養液に最終濃度が2.4 %(w/v)となるように25％(w/w)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ、瞬時に粘度が低下しpHは13.4であった。続いてpHを50％(w/v)クエン酸水溶液でpH4.9に調整した。そのときの粘度は8.5cP ([mPa・s])であった。

実施例３ Aureobasidium pullulans GM-NH-1A2株の使用
菌株をGM-NH-1A1株からGM-NH-1A2株に変更した以外はすべて実施例１の方法で行った。その結果、生成した多糖濃度は0.5％(w/v)、そのときの粘度は1300cP（[mPa・s]）であった。得られた培養液に実施例２と同様にして水酸化ナトリウムを最終濃度が2.4％(w/w)になる様に添加したところpHは13.6となり著しく粘度が低下した。引き続いて50％(w/v)クエン酸水溶液でpH4.9に調整してから粘度を測定したところ、粘度は7cP ([mPa・s])であった。そのときの多糖濃度は0.5％(w/v)であった。

以下、実施例１と同様にして、この多糖の性質を調べた。
コンゴ―レッドでのシフト効果を調べたところ、極大吸収が480nmから525nm付近へのシフトが観察された。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.45/500μg多糖であった。また２次元NMR（¹³C-¹H COSY NMR）分析を行った。その結果より、得られた多糖はβ-1,3-1,6−D-グルカンであることが証明された。それぞれの¹H シグナルの積分比より、β−1,3−結合/β1,6−結合の比は1.23であった。
更に分子量を測定したところ、その分子量は平均分子量で5万から30万のピークの低分子画分と50万から250万以上の高分子画分の二種類からなることが判明した。
また、本β‐グルカンの組成分析結果からS含量は229mg/kgであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は0.09％であった。これは非特許文献２記載の方法で測定したスルホ酢酸含量からも確認できた。

実施例４ Aureobasidium sp. Ｋ-１株の使用
菌株をGM-NH-1A1株からＫ−１株に変更した以外はすべて実施例１の方法で行った。その結果、生成した多糖濃度は0.5％(w/v)、そのときの粘度は1800cP ([mPa・s])であった。得られた培養液に実施例２と同様にして水酸化ナトリウムを最終濃度が2.4％(w/w)になる様に添加したところpHは13.5となり、著しく粘度が低下した。引き続いて50％(w/v)クエン酸水溶液でpH4.9に調整してから粘度を測定したところ、粘度は30cP ([mPa・s])であった。そのときの多糖濃度は0.5％(w/v)であった。

以下、実施例１と同様にして、この多糖の性質を調べた。
コンゴ―レッドでのシフト効果を調べたところ、極大吸収が480nmから525nm付近へのシフトが観察された。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.52/500μg多糖であった。また２次元NMR（¹³C-¹H COSY NMR）分析を行った。その結果より、得られた多糖はβ-1,3-1,6−D-グルカンであることが証明された。それぞれの¹H シグナルの積分比より、β−1,3−結合/β1,6−結合の比は1.42であった。更に分子量を測定したところ、その分子量は10万から300万であることが判明した。
また、本β‐グルカンの組成分析結果からS含量は6,800mg/kgであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は2.7％であった。これは非特許文献２記載の方法で測定したスルホ酢酸含量からも確認できた。

実施例５培地組成の変更
菌株をGM-NH-1A2株に変更し、表４の培地のアスコルビン酸ナトリウムを無添加とした以外はすべて実施例１の方法で行った。その結果、生成した多糖濃度は0.6%、そのときの粘度は1500cP ([mPa・s])であった。得られた培養液に実施例２と同様にして水酸化ナトリウムを最終濃度が2.4％(w/w)になる様に添加したところpHは13.6となり、著しく粘度が低下した。引き続いて50％(w/v)クエン酸水溶液でpH4.9にしてから粘度を測定したところ、その粘度は7cP ([mPa・s])であった。コンゴ―レッド法で、極大吸収が480nmから525nm付近へのシフトが観察された。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.45/500μg多糖であった。
また実施例１と同様に２次元NMR（¹³C-¹H COSY NMR）分析を行った。その結果、得られた多糖はβ-1,3-1,6-D-グルカンであることが証明され、それぞれの¹H シグナルの積分比より、β-1,3-結合/β1,6-結合の比は1.21であった。
次いで分子量を実施例３と同様の方法で測定したところ、その分子量は平均分子量で5万から30万のピークの低分子画分と50万から250万以上の高分子画分の二種類からなることが判明した。

実施例６水溶性高分子β-グルカンの粘度低下テスト
市販されているAureobasidium sp.の水溶性β−１，３−１，６−Ｄグルカン含有培養液Ａ（商品名 “天慈のしずく”、発売元フジカＩｎｃＦＳ宮崎県宮崎市清水２−７−３９）及びＢ（商品名 “アクファ−ジマックス”、発売元一光化学株式会社岡山県浅口郡里庄町浜中９３−５９）を用いてアルカリ処理による粘度低下実験を行った。
製品の多糖濃度を測定したところ培養液Ａは0.45%(w/v)、そのときの粘度は250cP ([mPa・s])であった。その培養液に実施例１−２）と同様、水酸化ナトリウムを最終濃度が2.4%(w/w)になる様に添加し(pH13.4)、引き続いて50%(w/v)クエン酸水溶液でｐＨ４．９にしてから粘度を測定したところ、その粘度は10cP ([mPa・s])に低下した。そのときの多糖濃度は0.46% (w/v)であった。
培養液Ｂは多糖濃度0.07%(w/v)、そのときの粘度は115cP ([mPa・s])であった。その培養液に実施例１−２）と同様、水酸化ナトリウムを最終濃度が2.4%(w/w)になる様に添加し(pH13.4)、引き続いて50%(w/v)クエン酸水溶液でpH4.9にしてから粘度を測定したところ、その粘度は20cP ([mPa・s ])に低下した。
よって、市販されているAureobasidium sp.の水溶性β−１，３−１，６−Ｄグルカン含有培養液についても低粘度化が確認された。

一方、培養液Ａについて実施例１と同様にコンゴ―レッド法で、極大吸収波長を測定したところ、４８０ｎｍから５２５ｎｍ付近へのシフトが観察された。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.41/500μg 多糖であった。また２次元ＮＭＲ(13C-1H COSY NMR)分析を行ったところ、得られた多糖はβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンであることが証明され、それぞれの１Ｈシグナルの積分比より、β−１，３結合/β−１，６結合の比は１．３３であった。
また、培養液Ａについて分子量を実施例１−３）と同様の方法で測定したところ、その分子量は平均分子量で50万から250万以上の高分子画分の一種類からなることが判明した。

実施例７粉体化（スプレ−ドライ法）
実施例１−２）でアルカリで低粘度化処理を行ったのち、クエン酸にてpH6に調整したβ-グルカン（菌体を含む）を、坂本技研製の噴霧乾燥装置Ｒ−３（直径1200mm、高さ800mm）用いて、熱風入口温度145℃、熱風出口温度65℃、アトマイザ−回転数15000rpm、送液速度1000ml/hで噴霧乾燥を行い、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン粉体約50gを得た。この粉体はやや赤褐色をしており、β-グルカン純度は約８％であった。

実施例８粉体化（エタノ−ル沈澱−凍結乾燥法）
実施例１−２）でアルカリ処理、脱塩、pH3.5 調整まで行った最終製品（菌体除去品）200mlをエタノ−ル800mlに混合し、一晩放置した後、沈殿物を遠心分離で回収した。この沈殿物をEYERA製の凍結乾燥装置を用いて乾燥させた。乾燥物は乳鉢で粉砕し、粉体約0.6gを得た。この粉体はわずかに褐色を示したが、β-グルカン純度はほぼ100%であることを確認した。このようにして、得られる乾燥粉末は、水、温水、アルカリ水に容易に再分散し、飲食物の添加剤として有用である。

Claims

水溶性β-1,3-1,6-D-グルカンを主成分とするオーレオバシジウム属（Aureobasidium）に属する微生物の培養液に常温でアルカリ溶液を加え、pH13以上に調整することを特徴とする水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有培養液の調製方法。
オーレオバシジウム属に属する微生物がオーレオバシジウム属プルランス（Aureobasidium pullulans）またはオーレオバシジウム属スピシーズ（Aureobasidium sp.）である請求項１に記載の方法。
オーレオバシジウム属プルランスがオーレオバシジウム属プルランス（Aureobasidium pullulans）GM-NH-1A1株（国内寄託番号 FERM P-19285）またはオーレオバシジウム属プルランス（Aureobasidium pullulans）GM-NH-1A2株（国内寄託番号FERM P-19286）である請求項1または２に記載の方法。
請求項１〜３の何れかに記載の方法で得られる水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有培養液から微生物を含む不溶物を分離することによる水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有水溶液の精製方法。
請求項１〜３の何れかに記載の方法で得られる水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有培養液に酸を加えて、該培養液をpH2〜10に調整する水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有培養液の調製方法。
請求項４に記載の方法で得られる水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有水溶液に酸を加えて、該水溶液をpH2〜10に調整する水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有水溶液の精製方法。
請求項１〜３に記載の方法で水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有培養液を調製し、該培養液を食品に添加することを特徴とする水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有培養液配合食品の製造法。
請求項４又は６に記載の方法で水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有水溶液を精製し、該水溶液を食品に添加することを特徴とする水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有水溶液配合食品の製造法。
水溶性β-1,3-1,6-D-グルカンを主成分とするオーレオバシジウム属に属する微生物の培養液に常温でアルカリ溶液を加え、pH13以上に調整し、水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有培養液を得、該培養液を食品に添加することを特徴とする水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有培養液配合食品の製造法。
水溶性β-1,3-1,6-D-グルカンを主成分とするオーレオバシジウム属に属する微生物の培養液に常温でアルカリ溶液を加え、pH13以上に調整し、水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有培養液を得、該培養液から微生物を含む不溶物を除去し、更にpH2〜10に調整し、水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有水溶液を得、ついで該水溶液を食品に添加することを特徴とする水溶性低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン含有水溶液配合食品の製造法。