JP2009060895A - 可溶性β−D−グルカン粉末の製造方法 - Google Patents
可溶性β−D−グルカン粉末の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009060895A JP2009060895A JP2008204279A JP2008204279A JP2009060895A JP 2009060895 A JP2009060895 A JP 2009060895A JP 2008204279 A JP2008204279 A JP 2008204279A JP 2008204279 A JP2008204279 A JP 2008204279A JP 2009060895 A JP2009060895 A JP 2009060895A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glucan
- adjusted
- solution
- culture
- powder
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
【課題】β-D−グルカンを含む微生物培養液からβ-D−グルカンを分離、精製する可溶性高純度β-D−グルカン粉末の製造方法を提供する。
【解決手段】下記、第1から第5の工程において、脱塩工程を含むことなく、
第1工程において、β-D−グルカン含有水性液をpH12以上に調整し、
第2工程において、微生物又は不溶性夾雑物を除去して上清を得、
第3工程において、上清をpH4未満の酸性に調整し、
第4工程において、酸性に調整した溶液にアルコールを添加してグルカンを析出させ、
第5工程において、析出して得られたグルカンを乾燥、粉末化する、
ことを含む水可溶性β-D−グルカン粉末の製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】下記、第1から第5の工程において、脱塩工程を含むことなく、
第1工程において、β-D−グルカン含有水性液をpH12以上に調整し、
第2工程において、微生物又は不溶性夾雑物を除去して上清を得、
第3工程において、上清をpH4未満の酸性に調整し、
第4工程において、酸性に調整した溶液にアルコールを添加してグルカンを析出させ、
第5工程において、析出して得られたグルカンを乾燥、粉末化する、
ことを含む水可溶性β-D−グルカン粉末の製造方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、微生物、特にオーレオバシジウム属(Aureobasidium sp)に属する微生物の培養液から、清涼飲料水、健康食品素材、又は食品用増粘剤などとして有用な多糖類でβ-D−グルカン、特にβ−1,3−1,6−D−グルカンを効率的、かつ簡便に分離・精製し、可溶性高純度β−D−グルカン粉末を得る製造方法に関する。
従来、オ−レオバシディウム(Aureobasidium sp.)属に代表される微生物がβ-D−グルカンを生産することが知られている(非特許文献1)。β-D−グルカンは、制ガン作用や免疫活性化作用を有することが示唆されており、健康食品素材として有用である。
一般に、β-D−グルカンはその構造から水溶液中で1重らせんや3重らせん構造を取るため、β-D−グルカン水溶液はゲルを形成し易い。このためβ-D−グルカンが菌体外に生産された微生物培養液は高粘度で、その精製は困難である(非特許文献2)。例に漏れず、オーレオバシジウム属微生物の培養液も、菌体外生産されたβ−1,3−1,6−D−グルカンを含むことから粘度が高く、その培養液から菌体を除去し、β−1,3−1,6−D−グルカンを回収、精製することは非常に困難である。このため、オーレオバシジウム属微生物の培養液からβ−1,3−1,6−D−グルカンを分離、精製する工業的方法は殆ど報告されていない。
また、β-D−グルカン溶液は粘度が高いため低濃度にする必要があり、輸送や貯蔵の点から、またサプルメントや化粧品用途では水を含まない原料が求められていることから可溶性高純度β−1,3−1,6−D−グルカン粉末の製法が求められている。
また、β-D−グルカン溶液は粘度が高いため低濃度にする必要があり、輸送や貯蔵の点から、またサプルメントや化粧品用途では水を含まない原料が求められていることから可溶性高純度β−1,3−1,6−D−グルカン粉末の製法が求められている。
オーレオバシジウム属微生物の培養液よりβ-D−グルカン粉末を製造する方法としては、オーレオバシジウム属微生物の培養液をアルカリ処理により低粘度化後、中和処理を行い、微生物を除去し、ついでエタノールを添加し析出したβ−1,3−1,6−D−グルカンを噴霧乾燥し粉末化する製法(特許文献1)が知られている。
経済的観点から、より高純度のβ-D-グルカン粉末を高収率で製造するための、方法の改良が望まれていた。
本発明は、可溶性β−D−グルカン粉末を高純度、高収率で経済的に製造する方法を提供する。
本発明は
下記、第1から第5の工程において脱塩工程を含むことなく、
第1工程において、β-D−グルカン含有水性液をpH12以上に調整し、
第2工程において、上記β-D−グルカン含有水性液から微生物又は不溶性夾雑物を除去して上清を得、
第3工程において、上記上清をpH4.0未満の酸性に調整し、
第4工程において、上記酸性に調整した溶液にアルコールを添加してβ-D−グルカンを析出させ、
第5工程において、上記析出して得られたβ-D−グルカンを乾燥、粉末化する、
ことを含む水可溶性β-D−グルカン粉末の製造方法に関する。
また、本発明は、上記第2工程と第3工程を入れ替えた態様である、
下記、第1から第5の工程において脱塩工程を含むことなく、
第1工程において、β−D−グルカン含有水性液をpH12以上に調整し、
第2工程において、上記β−D−グルカン含有水性液をpH4.0未満の酸性に調整し、
第3工程において、上記酸性に調整した溶液から微生物又は不溶性夾雑物を除去して上清を得、
第4工程において、上記上清にアルコールを添加してβ−D−グルカンを析出させ、
第5工程において、上記析出して得られたβ−D−グルカンを乾燥、粉末化する、
ことを含む水可溶性β−D−グルカン粉末の製造方法に関する。
さらに、本発明は、上記製造方法により製造されたβ−D−グルカンに関する。
下記、第1から第5の工程において脱塩工程を含むことなく、
第1工程において、β-D−グルカン含有水性液をpH12以上に調整し、
第2工程において、上記β-D−グルカン含有水性液から微生物又は不溶性夾雑物を除去して上清を得、
第3工程において、上記上清をpH4.0未満の酸性に調整し、
第4工程において、上記酸性に調整した溶液にアルコールを添加してβ-D−グルカンを析出させ、
第5工程において、上記析出して得られたβ-D−グルカンを乾燥、粉末化する、
ことを含む水可溶性β-D−グルカン粉末の製造方法に関する。
また、本発明は、上記第2工程と第3工程を入れ替えた態様である、
下記、第1から第5の工程において脱塩工程を含むことなく、
第1工程において、β−D−グルカン含有水性液をpH12以上に調整し、
第2工程において、上記β−D−グルカン含有水性液をpH4.0未満の酸性に調整し、
第3工程において、上記酸性に調整した溶液から微生物又は不溶性夾雑物を除去して上清を得、
第4工程において、上記上清にアルコールを添加してβ−D−グルカンを析出させ、
第5工程において、上記析出して得られたβ−D−グルカンを乾燥、粉末化する、
ことを含む水可溶性β−D−グルカン粉末の製造方法に関する。
さらに、本発明は、上記製造方法により製造されたβ−D−グルカンに関する。
本発明の方法は、粗β−D−グルカン水溶液を特定酸性条件下でアルコールを加え析出させることを特徴としており、本方法によれば可溶性β−D−グルカン粉末を高純度、高収率に製造することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
精製β-D−グルカンの製造方法
一実施態様において、本発明は、β-D−グルカン含有水性液をpH12以上に調整する第1工程、微生物又は不溶性夾雑物を除去して上清を得る第2工程、上清をpH=4.0未満の酸性に調整する第3工程、酸性に調整した溶液にエタノールを添加してβ-D−グルカンを沈殿させる第4工程と、得られたβ-D−グルカンを乾燥、粉末化する第5工程を含む水可溶性β-D−グルカン粉末の製造方法を提供する。
ここで、β-D-グルカン含有水性液は、β-D-グルカンを含む水溶液であり、β-D-グルカンの由来には限定されない。β-D-グルカン含有水性液は、例えば、β-D-グルカンを産生する微生物の培養液又は該微生物の破砕液である。
β−D−グルカン含有水性液の提供
<微生物・β−D−グルカン>
微生物はβ−D−グルカンを生産できる微生物であればよく特に限定されない。β−D−グルカンとしては、β−1,3−D−グルカン、β−1,6−D−グルカン、β−1,3−1,6−D−グルカン等が挙げられる。これらのβ-D−グルカンは、有用な生理活性を示すことが知られている。
精製β-D−グルカンの製造方法
一実施態様において、本発明は、β-D−グルカン含有水性液をpH12以上に調整する第1工程、微生物又は不溶性夾雑物を除去して上清を得る第2工程、上清をpH=4.0未満の酸性に調整する第3工程、酸性に調整した溶液にエタノールを添加してβ-D−グルカンを沈殿させる第4工程と、得られたβ-D−グルカンを乾燥、粉末化する第5工程を含む水可溶性β-D−グルカン粉末の製造方法を提供する。
ここで、β-D-グルカン含有水性液は、β-D-グルカンを含む水溶液であり、β-D-グルカンの由来には限定されない。β-D-グルカン含有水性液は、例えば、β-D-グルカンを産生する微生物の培養液又は該微生物の破砕液である。
β−D−グルカン含有水性液の提供
<微生物・β−D−グルカン>
微生物はβ−D−グルカンを生産できる微生物であればよく特に限定されない。β−D−グルカンとしては、β−1,3−D−グルカン、β−1,6−D−グルカン、β−1,3−1,6−D−グルカン等が挙げられる。これらのβ-D−グルカンは、有用な生理活性を示すことが知られている。
これらのβ-D−グルカンを生産する微生物としては、オーレオバシジウム属(Aurebasidium sp.)微生物、パン酵母(S.cerevisiae)、担子菌(Lentinus edodes,Schizophyllum commune,Coriolus versicolor)などが挙げられる。中でも、制ガン作用や免疫活性化作用を有することが報告されているβ−1,3−1,6−D−グルカンを主に生産する点で、オーレオバシジウム属微生物が好ましい。オーレオバシジウム属微生物としては、オーレオバシジウム・プルランス(Aurebasidium pullulans)などの微生物が挙げられる。
特に、培養液が比較的低粘度であること、及びβ−1,3−1,6−D−グルカンを高生産する点で、オーレオバシジウム・プルランスが好ましく、Aureobasidium sp. K−1株(以下、「K−1株」ということがある)の変異菌株であるAureobasidium pullulans GM-NH-1A1株(以下、「GM1A1株」ということがある)、及びAureobasidium pullulans GM-NH-1A2株(以下、「GM1A2株」ということがある)がより好ましい。これらの菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにそれぞれFERM BP-10294及びFERM BP-10295として寄託済みである。オーレオバシジウム属K−1株は、分子量200万以上と100万程度の2種類のβ-1,3-1,6-D-グルカンを生産することが知られている。また、K−1株の生産するβ-D−グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている(Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)),科学と工業,64,131-135(1990))。
なお、本発明は、担子菌やパン酵母等が生産する水不溶性のβ-D−グルカンを精製する場合にも、アルカリ処理により可溶化できるβ-D−グルカンであれば適用できる。この場合、例えばキノコ細胞を緩衝液中で破砕してグルカンを含む破砕液を調製して、第1工程に供すればよい。また、パン酵母などの培養液をそのまま、又は一旦集菌して緩衝液などに懸濁した懸濁液を、超音波などを用いて破砕して、菌体外にβ-D-グルカンを放出させ、この微生物破砕液を第1工程に供すれば良い。更に本発明は別の方法で作成された不純物の多い可溶性β−D−グルカンの精製にも適用できる。
<微生物の培養>
β-D−グルカンを培養液中に分泌させる微生物培養方法は公知である。例えば、オーレオバシジウム属微生物を培養して、β−1,3−1,6−D−グルカンを生産させる方法が、Biosci. Biotech. Biochem., 57(8), 1348-1349, 1993;特開平6−340701号公報;特願平9−56391号公報;特開平7−51081号公報などに報告されている。
<微生物の培養>
β-D−グルカンを培養液中に分泌させる微生物培養方法は公知である。例えば、オーレオバシジウム属微生物を培養して、β−1,3−1,6−D−グルカンを生産させる方法が、Biosci. Biotech. Biochem., 57(8), 1348-1349, 1993;特開平6−340701号公報;特願平9−56391号公報;特開平7−51081号公報などに報告されている。
オーレオバシジウム属微生物の培養に使用できる炭素源としては、シュ−クロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトン、酵母エキスなどを挙げることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源を挙げることができる。場合によってはβ-D−グルカンの生産量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、さらには鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類、グルコン酸を添加するのも有効な方法である。
また、例えばオーレオバシジウム属(Aureobasidium. sp)に属する微生物を炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ−1,3−1,6−D−グルカンを生産することが報告されている(Agric. Biol.Chem., 47, 1167-1172 (1983);科学と工業, 64, 131-135 (1990);特願平5−22229号公報)。シュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加し、さらに必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加したものも好適に使用できる。
オーレオバシジウム属(Aureobasidium. sp)微生物は、通常、通気攪拌により好気培養すればよい。培養温度は10〜45℃程度が好ましく、20〜35℃程度がより好ましい。また、培養液のpHは3〜7程度が好ましく、3.5〜5程度がより好ましい。培養中、アルカリ、又は酸を用いて培養液pHを上記範囲に制御することも好ましい。さらに、培養液の泡立ちを抑えるために消泡剤を添加しても良い。培養時間は1〜10日間程度もあれば十分量のβ−D−グルカンを生産することができるが、通常は1〜4日間程度でよい。β−D−グルカンの生産量を測定しながら培養時間を決めても良い。
上記のようにしてオーレオバシジウム属微生物を培養した培養液にはβ−1,3−1,6−D−グルカンを主成分とするβ−D−グルカン多糖が0.1%から数%(w/v)含有されており、その培養液の粘度は、BM型回転粘度計(東機産業社製)を用いて30℃で測定する場合に、数百〜数千cP ([mPa・s] )という非常に高い粘度を示す。微生物破砕液も同様である。
第1工程
上記のようにしてオーレオバシジウム属微生物を培養した培養液にはβ−1,3−1,6−D−グルカンを主成分とするβ−D−グルカン多糖が0.1%から数%(w/v)含有されており、その培養液の粘度は、BM型回転粘度計(東機産業社製)を用いて30℃で測定する場合に、数百〜数千cP ([mPa・s] )という非常に高い粘度を示す。微生物破砕液も同様である。
第1工程
第1工程では、上記微生物の培養液又は破砕液のpHを12以上、好ましくは13以上に調整する。培養液又は破砕液を攪拌しつつアルカリを添加すればpHを高くすることができる。アルカリの種類は水に溶解するものであればよく特に制限されない。例えば、水酸化ナトリウムを用いる場合、培養液中の水酸化ナトリウムの最終濃度が0.2〜4%(w/v)、好ましくは0.4〜2.4%(w/v)、更に好ましくは0.5〜2.0%(w/v)になるように添加する。アルカリの添加量が多すぎると得られるβ-D−グルカン粉末の純度が低下する傾向がある。
pHを12以上にすると、培養液の粘度が通常数cP([mPa・s])程度まで、急激ないしは瞬時に低下する。アルカリは公知のものを制限なく使用できる。公知のアルカリとしては、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液のような炭酸アルカリ塩水溶液;水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液のような水酸化アルカリ水溶液;アンモニア水溶液などが挙げられる。食用には、食品添加物として認められている水酸化ナトリウム水溶液が好ましい。
第2工程
第2工程では、アルカリ性培養液又は破砕液から菌体や、菌体破砕物のような不溶性夾雑物を除去する。
第2工程
第2工程では、アルカリ性培養液又は破砕液から菌体や、菌体破砕物のような不溶性夾雑物を除去する。
従来、粘度の高い培養液から菌体を除去するのは困難であった。そのため、例えば現在市販されているアウレオバシジウム属微生物の培養液は菌体を含む。これに対して、アルカリ処理により粘度を低下させた培養液又は微生物破砕液は菌体や不溶性物質が沈降し易いため、これらを容易に除去することができる。
不溶性夾雑物を除去前のβ−D−グルカン液は必要に応じて水で希釈しても良い。濃度が高すぎると不溶性夾雑物除去が困難であり、低すぎても効率的でない。β−D−グルカン濃度は、0.1mg/ml〜20mg/ml、好ましくは0.5mg/ml〜10mg/ml、さらに好ましくは1mg/ml〜5mg/mlが良い。
不溶性夾雑物を除去前のβ−D−グルカン液は必要に応じて水で希釈しても良い。濃度が高すぎると不溶性夾雑物除去が困難であり、低すぎても効率的でない。β−D−グルカン濃度は、0.1mg/ml〜20mg/ml、好ましくは0.5mg/ml〜10mg/ml、さらに好ましくは1mg/ml〜5mg/mlが良い。
培養液又は破砕液から菌体や不溶性夾雑物を分離、除去する方法は周知である。本発明方法ではどのような除去方法を採用してもよいが、工業的にはフィルタープレス、連続遠心分離装置による菌体除去が好ましい。これにより、通常、菌体以外の不溶性夾雑物の一部又は全部も除去される。菌体とともに不溶性夾雑物を完全に除去することが好ましい。
第3工程
第3工程では、アルコールを加えβ−D−グルカン析出させるための前段階として、培養液のpHを4.0未満、好ましくは3.8以下、更に好ましく2.0〜3.7、特に3.0〜3.7の酸性に調整する。これにより、β−D-グルカン析出時にβ−D−グルカン以外の低分子物質や塩類の沈降を防ぐことができる。
pHが4.0以上ではβ−D−グルカン純度が悪くなる。
第3工程
第3工程では、アルコールを加えβ−D−グルカン析出させるための前段階として、培養液のpHを4.0未満、好ましくは3.8以下、更に好ましく2.0〜3.7、特に3.0〜3.7の酸性に調整する。これにより、β−D-グルカン析出時にβ−D−グルカン以外の低分子物質や塩類の沈降を防ぐことができる。
pHが4.0以上ではβ−D−グルカン純度が悪くなる。
pH調整用の酸の種類は特に限定されず、公知の酸を用いることができる。公知の酸として、塩酸、燐酸、硫酸などの無機酸、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸、アミノ酸、アスコルビン酸などの有機酸が挙げられる。好ましくは、食品添加物として認められているクエン酸、リンゴ酸、グルコン酸、アスコルビン酸、特にクエン酸である。
なお、上記第2工程と第3工程の順を入れ替えることもできる。
すなわち、菌体除去工程の前に、アルカリ性の培養液に酸を添加して、pHを4.0未満、好ましくは3.8以下、更に好ましく2.0〜3.7、特に3.0〜3.7の酸性に調整し、その後菌体を除去してもよい。pHを中性付近から酸性付近に調整しても多糖がゲル化することは無く、低粘度が維持される。
この場合も、pH調整用の酸の種類は特に限定されず、公知の酸を用いることができる。公知の酸として、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸、アミノ酸、アスコルビン酸などが挙げられる。食用には、食品添加物として認められているクエン酸、リンゴ酸、グルコン酸が好ましい。
すなわち、菌体除去工程の前に、アルカリ性の培養液に酸を添加して、pHを4.0未満、好ましくは3.8以下、更に好ましく2.0〜3.7、特に3.0〜3.7の酸性に調整し、その後菌体を除去してもよい。pHを中性付近から酸性付近に調整しても多糖がゲル化することは無く、低粘度が維持される。
この場合も、pH調整用の酸の種類は特に限定されず、公知の酸を用いることができる。公知の酸として、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸、アミノ酸、アスコルビン酸などが挙げられる。食用には、食品添加物として認められているクエン酸、リンゴ酸、グルコン酸が好ましい。
第4工程
第4工程では、pHを酸性に調整した培養液にアルコールを添加することにより、培養液中の高分子物質、すなわちβ−D−グルカンのみを沈殿させることができる。アルコールとしては炭素数2〜6のアルコールを使用できるが、好ましくは炭素数2〜4のアルコールであり、特にエタノールが好ましい。
また、アルコールを加える前の工程では透析などの脱塩処理は必要ない。脱塩工程を行わないことにより得られる精製β-D−グルカン粉末の回収率が向上する。
明細書および特許請求の範囲において、「脱塩工程」は、透析により試料中の塩濃度を1/10以下に、好ましくは1/5以下に、より好ましくは1/2以下に、低下させる工程である。
本発明においては、アルコール添加前に、透析膜を用いてβ−D−グルカン溶液を濃縮してもよいが、この場合は、β−D−グルカン溶液中の塩濃度が低下しないので、勿論本発明における「脱塩工程」には該当しない。
第4工程では、pHを酸性に調整した培養液にアルコールを添加することにより、培養液中の高分子物質、すなわちβ−D−グルカンのみを沈殿させることができる。アルコールとしては炭素数2〜6のアルコールを使用できるが、好ましくは炭素数2〜4のアルコールであり、特にエタノールが好ましい。
また、アルコールを加える前の工程では透析などの脱塩処理は必要ない。脱塩工程を行わないことにより得られる精製β-D−グルカン粉末の回収率が向上する。
明細書および特許請求の範囲において、「脱塩工程」は、透析により試料中の塩濃度を1/10以下に、好ましくは1/5以下に、より好ましくは1/2以下に、低下させる工程である。
本発明においては、アルコール添加前に、透析膜を用いてβ−D−グルカン溶液を濃縮してもよいが、この場合は、β−D−グルカン溶液中の塩濃度が低下しないので、勿論本発明における「脱塩工程」には該当しない。
酸性にpH調整した培養液上清に、エタノールを培養上清の4倍容量(80%)以下、好ましくは3倍容量(77%)以下、さらに好ましくは2〜2.5(66−71%)倍容量程度することでβ−D−グルカンを沈殿させることができる。このときエタノールの最終濃度は40〜80%、好ましくは50〜75%、さらに好ましくは60〜70%にすることが好ましい。
また培養液上清とエタノールの混合については、培養上清にエタノールを添加してもよいし、エタノールに培養上清を添加してもよい。このとき培養上清をスターラーなどで混合し、エタノールを少しずつ添加することがより好ましい。また、添加するエタノールの濃度は、最終濃度が適正範囲であればいずれでもよいが、好ましくは85%以上、より好ましくは95%以上がよい。
第5工程
第4工程でアルコールを添加することによりβ−D−グルカンが析出する。第5工程では、この析出したβ-Dグルカンを回収し、乾燥させ、粉末化する。
第5工程
第4工程でアルコールを添加することによりβ−D−グルカンが析出する。第5工程では、この析出したβ-Dグルカンを回収し、乾燥させ、粉末化する。
析出した沈殿物のみを回収し、上清を除去する方法としては、どのような除去方法を採用してもよいが、吸引ろ過法、遠心分離法が好ましい。工業的にはメッシュを用いた遠心分離法、連続遠心分離装置、シャープレスを用いた回収が好ましい。さらには第4工程において用いたアルコールと同一、同濃度のアルコール水溶液を用いて沈殿物を洗浄することができる。
得られたβ−D−グルカンの乾燥方法は特に限定されず公知の方法を用いることができる。公知の方法として、棚乾燥、加温乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥、スプレードライ法などが挙げられる。得られたβ−D−グルカン乾燥物を粉砕し、粉末をそのまま、または溶解させて水溶液にして使用することができる。
また、粉末化後のβ−D−グルカンの一次構造は、培養後の天然型のβ−D−グルカンと同じであると考えられる。即ち、1N水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とするβ−D−グルカン溶液の1H NMRスペクトルが約4.7ppm及び約4.5ppmの2つのシグナルを有するものである。NMRの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約4.7ppm」「約4.5ppm」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅(例えば±0.2)を含む数値を意味する。
本発明において、微生物としてオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株(FERM BP-10294)、又はオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A2株(FERM BP-10295)を用いる場合、得られる多糖は、β−1,3−1,6−D−グルカンであることが、2次元NMR(13C-1H COSY NMR)分析を用いて常法により確認された。
本発明において、微生物としてオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株(FERM BP-10294)、又はオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A2株(FERM BP-10295)を用いる場合、得られる多糖は、β−1,3−1,6−D−グルカンであることが、2次元NMR(13C-1H COSY NMR)分析を用いて常法により確認された。
β−D−グルカン粉末を水に溶かしβ−D−グルカン水溶液として食品用途に供する場合、溶解後に加熱滅菌、ろ過殺菌、又は紫外線滅菌などの方法で滅菌することが好ましい。食品用途に供する場合の加熱滅菌は、通常pH3.5〜10程度の下、65〜90℃程度で行うべきことが定められている。
上記pH調整を行う場合、滅菌は、その前後のいずれに行ってもよい。
本発明方法における殺菌を除く各工程は、5〜50℃程度の温度下で行うことができ、通常は、常温ないしは室温下で行えばよい。
また、本発明の製造方法により製造されるβ−D−グルカン粉末は、化粧品としても提供される。
上記pH調整を行う場合、滅菌は、その前後のいずれに行ってもよい。
本発明方法における殺菌を除く各工程は、5〜50℃程度の温度下で行うことができ、通常は、常温ないしは室温下で行えばよい。
また、本発明の製造方法により製造されるβ−D−グルカン粉末は、化粧品としても提供される。
実施例1
以下、本発明を実施例、及び試験例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
(1)β-D−グルカンの培養生産
後掲の表1の組成からなる100mlの液体培地を500ml肩付きフラスコに入れ、121℃、15分間、加圧蒸気滅菌を行った後、GM1A1株を同培地組成のスラントより無菌的に1白金耳植菌し、24時間、30℃で130rpmの通気攪拌培養を行い種培養液を調製した。
以下、本発明を実施例、及び試験例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
(1)β-D−グルカンの培養生産
後掲の表1の組成からなる100mlの液体培地を500ml肩付きフラスコに入れ、121℃、15分間、加圧蒸気滅菌を行った後、GM1A1株を同培地組成のスラントより無菌的に1白金耳植菌し、24時間、30℃で130rpmの通気攪拌培養を行い種培養液を調製した。
次いで、同組成の培地200Lを300L容培養装置(丸菱バイオエンジ製)に入れ、121℃、15分間、加圧蒸気滅菌を行ったものに、上記種培養液を無菌的に植菌し、200rpm、28℃、40L/分の通気攪拌培養を行った。
培養開始時のpHは3.5であった。また、120時間培養後のpHは4.30、菌体濁度はOD 660nmで30 ODで、β−D−グルカン濃度は0.9%(w/v)であった。β−D−グルカン濃度は、培養液を数mLサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が66%(v/v)となるようにエタノールを加えてβ−D−グルカンを沈殿させ、回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。
(2)アルカリ処理
(1)で得られた培養液をBM型回転粘度計により測定したところ、粘度は30℃で1200 [mPa・s]であった。この培養液に最終濃度が2.4%(w/v)となるように25%(w/w)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところpH13.2となり、瞬時に粘度が低下した。
(1)で得られた培養液をBM型回転粘度計により測定したところ、粘度は30℃で1200 [mPa・s]であった。この培養液に最終濃度が2.4%(w/v)となるように25%(w/w)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところpH13.2となり、瞬時に粘度が低下した。
引き続いて1000L容タンクに培養液を移し、飲料水で3倍量に希釈し、同様にして粘度を測定したところ、粘度は10 [mPa・s ]であった。
水溶液の粘度は、TOKIMEC製BM型粘度計を用いて測定した。
(3)除菌
次いで、この培養液に珪藻土を1wt%添加し、薮田式ろ過圧搾機(薮田機械製)を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液約600Lを得た。そのβ−D−グルカン濃度をフェノール硫酸法で定量したところ、0.2%(w/v)で、ほぼ100%のβ−D−グルカン回収率であった。
(4)β-D−グルカン水溶液のpH調整
上記のβ-D−グルカン水溶液(培養除菌液、β-D−グルカン濃度2g/L)1Lに50%クエン酸水溶液を加えて、pH3.0に調整したものを実施例1−1、pH3.5に調整したものを実施例1−2、pH3.7に調整したものを実施例1−3、pH4.0に調整したものを比較例1−1、pH4.5に調整したものを比較例1−2、pH5.0に調整したものを比較例1−3、pH7.0に調整したものを比較例1−4、pH13.2のままのものを比較例1−5とした。
(5)β-D−グルカン水溶液のエタノール沈殿
それぞれのβ-D−グルカン水溶液(実施例1−1〜3、比較例1−1〜5)をスターラーで撹拌、混合し、2倍容量の99.5%エタノールを少量ずつ添加した。その後、25℃で静置し沈殿させた。
(6)β-D−グルカンの回収、乾燥、粉末化
沈殿物はろ紙(桐山製作所 NO.5B 95φ)を用いて吸引ろ過法により回収し、回収物は凍結乾燥させ、乾燥後に乳鉢を用いて粉末化した。
水溶液の粘度は、TOKIMEC製BM型粘度計を用いて測定した。
(3)除菌
次いで、この培養液に珪藻土を1wt%添加し、薮田式ろ過圧搾機(薮田機械製)を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液約600Lを得た。そのβ−D−グルカン濃度をフェノール硫酸法で定量したところ、0.2%(w/v)で、ほぼ100%のβ−D−グルカン回収率であった。
(4)β-D−グルカン水溶液のpH調整
上記のβ-D−グルカン水溶液(培養除菌液、β-D−グルカン濃度2g/L)1Lに50%クエン酸水溶液を加えて、pH3.0に調整したものを実施例1−1、pH3.5に調整したものを実施例1−2、pH3.7に調整したものを実施例1−3、pH4.0に調整したものを比較例1−1、pH4.5に調整したものを比較例1−2、pH5.0に調整したものを比較例1−3、pH7.0に調整したものを比較例1−4、pH13.2のままのものを比較例1−5とした。
(5)β-D−グルカン水溶液のエタノール沈殿
それぞれのβ-D−グルカン水溶液(実施例1−1〜3、比較例1−1〜5)をスターラーで撹拌、混合し、2倍容量の99.5%エタノールを少量ずつ添加した。その後、25℃で静置し沈殿させた。
(6)β-D−グルカンの回収、乾燥、粉末化
沈殿物はろ紙(桐山製作所 NO.5B 95φ)を用いて吸引ろ過法により回収し、回収物は凍結乾燥させ、乾燥後に乳鉢を用いて粉末化した。
β-D−グルカン粉末の純度測定
実施例1−1〜3、比較例1−1〜5で得られたβ-D−グルカン乾燥粉末の純度を測定した。それぞれのβ-D−グルカン乾燥粉末を10mg/ml(1.0重量%)になるように溶解し、β-D−グルカン水溶液を作成し、少量をサンプリングし、以下のフェノール硫酸法で定量した。
実施例1−1〜3、比較例1−1〜5で得られたβ-D−グルカン乾燥粉末の純度を測定した。それぞれのβ-D−グルカン乾燥粉末を10mg/ml(1.0重量%)になるように溶解し、β-D−グルカン水溶液を作成し、少量をサンプリングし、以下のフェノール硫酸法で定量した。
具体的には、精製β-D−グルカン溶液0.1(ml)をサンプリングし、そこにイオン交換水0.9(ml)加えて撹拌した。この溶液50(μl)とイオン交換水450(μl)、5(%(w/v))フェノール溶液500(μl)を攪拌混合し、そこに濃硫酸2.5(ml)を加え、攪拌した。室温で30分放置冷却した溶液の吸光度(Abs490nm)を測定し、グルコースを用いて作成した検量線より定量した。(「糖質の化学」(朝倉書店)新家龍、南浦能至、北畑寿美雄、大西正健 編参照)。
上記方法により、実施例1−1〜3、比較例1−1〜5で得たβ−D−グルカン粉末中のβ-D-グルカンの純度(重量%)(下表ではパウダー純度と記載する)を求めたところ、pH3.0に調整したもので87.0重量%(実施例1−1)、pH3.5に調整したもので97.0重量%(実施例1−2)、pH3.7に調整したもので97.0重量%(実施例1−3)、pH4.0に調整したもので7.9重量%(比較例1−1)、pH4.5のもので7.3重量%(比較例1−2)、pH5.0に調整したもので5.9重量%(比較例1−3)、pH7.0に調整したもので16.0重量%(比較例1−4)、pH13.2に調整したもので61.0重量%(比較例1−5)となった。
実施例2
実施例1の(3)に記載の除菌工程で得られた除菌後の低粘度培養ろ液2Lを実施例1に従い、50%クエン酸水溶液でpH3.5に調整した後、2倍容のエタノールで該培養液中のβグルカンを沈澱させた。その後、実施例1の(6)記載の方法に従って得られた該βグルカンの回収、乾燥、そして粉末化を行った。その結果、パウダー純度(βグルカン純度)97%のβグルカン乾燥粉末3.0gを得た。除菌低粘度培養ろ液からの回収率は81%であった。
比較例2
実施例1の(3)に記載の除菌工程で得られた除菌後の低粘度化培養ろ液2Lを、スペクトラム社製の限外ろ過膜(分子量カット50K、膜面積8000cm2)を用いて該培養液の塩濃度が1/64になるまで透析により脱塩を行った。次いで、得られた脱塩培養液を50%クエン酸水溶液を添加してpHを3.5に調整した後、2倍容の99.5%エタノールを添加して、培養液中のβグルカンを沈澱させた。その後、実施例1の(6)記載の方法に従って得られた該βグルカンの回収、乾燥、そして粉末化を行った。その結果、パウダー純度(βグルカン純度)95%のβグルカン粉末2.3gを得た。脱塩前の除菌低粘度培養ろ液からの回収率は61%であった。
実施例3
実施例1−(3)に記載の除菌工程で得られた除菌後の低粘度化培養ろ過液を、各種有機酸を添加してpHを3.5に調整した。pH調整用の有機酸として、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸を使用した。その後、実施例1−(5)に記載の方法に従ってエタノール沈殿を実施し、実施例1−(6)に記載の方法に従ってβグルカンの回収、乾燥、そして粉末化を行った。
実施例1と同様にして、実施例3−1〜3で得たβ-D-グルカン粉末中のβ-D-グルカンの純度(重量%)(下表ではパウダー純度と記載する)を求めたところ、クエン酸で調整したもので96.6重量%(実施例3−1)、リンゴ酸で調整したもので98.0重量%(実施例3−2)、グルコン酸で調整したもので90.4重量%(実施例3−3)となった。
Claims (12)
- 下記、第1から第5の工程において脱塩工程を含むことなく、
第1工程において、β−D−グルカン含有水性液をpH12以上に調整し、
第2工程において、上記β−D−グルカン含有水性液から微生物又は不溶性夾雑物を除去して上清を得、
第3工程において、上記上清をpH4.0未満の酸性に調整し、
第4工程において、上記酸性に調整した溶液にアルコールを添加してβ−D−グルカンを析出させ、
第5工程において、上記析出して得られたβ−D−グルカンを乾燥、粉末化する、
ことを含む水可溶性β−D−グルカン粉末の製造方法。 - 下記、第1から第5の工程において脱塩工程を含むことなく、
第1工程において、β−D−グルカン含有水性液をpH12以上に調整し、
第2工程において、上記β−D−グルカン含有水性液をpH4.0未満の酸性に調整し、
第3工程において、上記酸性に調整した溶液から微生物又は不溶性夾雑物を除去して上清を得、
第4工程において、上記上清にアルコールを添加してβ−D−グルカンを析出させ、
第5工程において、上記析出して得られたβ−D−グルカンを乾燥、粉末化する、
ことを含む水可溶性β−D−グルカン粉末の製造方法。 - 第3工程において有機酸によりpHを酸性に調整し、第4工程においてアルコールとしてエタノールを使用する、請求項1に記載の方法。
- 第2工程において有機酸によりpHを酸性に調整し、第4工程においてアルコールとしてエタノールを使用する、請求項2に記載の方法。
- 有機酸としてクエン酸を用いる、請求項3または請求項4に記載の方法。
- β−D−グルカン含有水性液がβ−D−グルカンを産生する微生物の培養液、または該微生物の破砕液である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 微生物が、オーレオバシジウム属微生物である請求項6に記載の方法。
- オーレオバシジウム属微生物が、オーレオバシジウム・プルランスである請求項7に記載の方法。
- オーレオバシジウム・プルランスが、オーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株(FERM BP-10294)、又はオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A2株(FERM BP-10295)である請求項8に記載の方法。
- β−D−グルカンが、β−1,3−1,6−D−グルカンである請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の方法により得られたβ−D−グルカン粉末。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の方法により得られたβ−D−グルカン粉末を含有する化粧品、または食品。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008204279A JP2009060895A (ja) | 2007-08-16 | 2008-08-07 | 可溶性β−D−グルカン粉末の製造方法 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007212309 | 2007-08-16 | ||
JP2008204279A JP2009060895A (ja) | 2007-08-16 | 2008-08-07 | 可溶性β−D−グルカン粉末の製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009060895A true JP2009060895A (ja) | 2009-03-26 |
Family
ID=40556084
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008204279A Pending JP2009060895A (ja) | 2007-08-16 | 2008-08-07 | 可溶性β−D−グルカン粉末の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2009060895A (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010285421A (ja) * | 2009-05-15 | 2010-12-24 | Daiso Co Ltd | 腸管免疫賦活能を有する乳酸菌に対する効果促進剤 |
JP2011103877A (ja) * | 2009-10-20 | 2011-06-02 | Saga Univ | 高粘性培養液の粘性低下方法、及び、その方法で製造された多糖含有培養液 |
JP2018088909A (ja) * | 2016-11-30 | 2018-06-14 | 財團法人食品工業發展研究所 | アウレオバシジウム・プルランス、β−グルカン生産用培地及び方法、アウレオバシジウム・プルランス培養物及びそれを含む組成物 |
US10260080B2 (en) | 2016-11-30 | 2019-04-16 | Food Industry Research And Development Institute | Aureobasidium pullulans, culturing medium and method for producing B-glucan, a culture of aureobasidium pullulans and a composition comprising the same |
WO2019073989A1 (ja) * | 2017-10-12 | 2019-04-18 | 三菱瓦斯化学株式会社 | β-1,3-1,6-グルカン粉末、グルカン含有組成物、β-1,3-1,6-グルカン粉末の製造方法、包接複合体、包接複合体の製造方法およびゲスト分子の回収方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62205008A (ja) * | 1986-03-05 | 1987-09-09 | Bio Bai Daimaru:Kk | 化粧品等の添加剤 |
JP2002204687A (ja) * | 2000-11-09 | 2002-07-23 | Onaka Yasushi | β−1.3−1.6グルカン(アウレオバシジウム培養液)の医療、保健、福祉、食品および各種産業分野での応用 |
JP2003159011A (ja) * | 2001-09-14 | 2003-06-03 | Onaka Yasushi | アウレオバシジウム培養液を含有する食品 |
JP2004321177A (ja) * | 2003-04-10 | 2004-11-18 | Daiso Co Ltd | 水溶性低粘度β−D−グルカン含有培養液の調製方法 |
JP2006104439A (ja) * | 2004-03-29 | 2006-04-20 | Daiso Co Ltd | β−1,3−1,6−D−グルカンおよびその用途 |
-
2008
- 2008-08-07 JP JP2008204279A patent/JP2009060895A/ja active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62205008A (ja) * | 1986-03-05 | 1987-09-09 | Bio Bai Daimaru:Kk | 化粧品等の添加剤 |
JP2002204687A (ja) * | 2000-11-09 | 2002-07-23 | Onaka Yasushi | β−1.3−1.6グルカン(アウレオバシジウム培養液)の医療、保健、福祉、食品および各種産業分野での応用 |
JP2003159011A (ja) * | 2001-09-14 | 2003-06-03 | Onaka Yasushi | アウレオバシジウム培養液を含有する食品 |
JP2004321177A (ja) * | 2003-04-10 | 2004-11-18 | Daiso Co Ltd | 水溶性低粘度β−D−グルカン含有培養液の調製方法 |
JP2006104439A (ja) * | 2004-03-29 | 2006-04-20 | Daiso Co Ltd | β−1,3−1,6−D−グルカンおよびその用途 |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010285421A (ja) * | 2009-05-15 | 2010-12-24 | Daiso Co Ltd | 腸管免疫賦活能を有する乳酸菌に対する効果促進剤 |
JP2011103877A (ja) * | 2009-10-20 | 2011-06-02 | Saga Univ | 高粘性培養液の粘性低下方法、及び、その方法で製造された多糖含有培養液 |
JP2018088909A (ja) * | 2016-11-30 | 2018-06-14 | 財團法人食品工業發展研究所 | アウレオバシジウム・プルランス、β−グルカン生産用培地及び方法、アウレオバシジウム・プルランス培養物及びそれを含む組成物 |
US10260080B2 (en) | 2016-11-30 | 2019-04-16 | Food Industry Research And Development Institute | Aureobasidium pullulans, culturing medium and method for producing B-glucan, a culture of aureobasidium pullulans and a composition comprising the same |
WO2019073989A1 (ja) * | 2017-10-12 | 2019-04-18 | 三菱瓦斯化学株式会社 | β-1,3-1,6-グルカン粉末、グルカン含有組成物、β-1,3-1,6-グルカン粉末の製造方法、包接複合体、包接複合体の製造方法およびゲスト分子の回収方法 |
JPWO2019073989A1 (ja) * | 2017-10-12 | 2021-01-07 | 三菱瓦斯化学株式会社 | β−1,3−1,6−グルカン粉末、グルカン含有組成物、β−1,3−1,6−グルカン粉末の製造方法、包接複合体、包接複合体の製造方法およびゲスト分子の回収方法 |
US11384159B2 (en) | 2017-10-12 | 2022-07-12 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | B-1,3-1,6-glucan powder, glucan-containing composition, method for producing B-1,3-1,6-glucan powder, inclusion complex, method for producing inclusion complex, and method for recovering guest molecule |
JP7298846B2 (ja) | 2017-10-12 | 2023-06-27 | 三菱瓦斯化学株式会社 | β-1,3-1,6-グルカン粉末、グルカン含有組成物、β-1,3-1,6-グルカン粉末の製造方法、包接複合体、包接複合体の製造方法およびゲスト分子の回収方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI110324B (fi) | Uudet polysakkaridit ja niiden valmistus | |
EP2209816B1 (en) | Process for the preparation of purified beta-(1,3)-d-glucans | |
JP4802821B2 (ja) | 精製β−D−グルカンの製造方法 | |
US20170349672A1 (en) | Fucose-containing bacterial biopolymer | |
US8614070B2 (en) | Process for the co-production of chitin, its derivatives and polymers containing glucose, mannose and/or galactose, by the fermentation of the yeast Pichia pastoris | |
JP5080029B2 (ja) | β―グルカン産生微生物、培養方法、産生物及び食品 | |
JP2009060895A (ja) | 可溶性β−D−グルカン粉末の製造方法 | |
JP5585769B2 (ja) | 腸管免疫賦活能を有する乳酸菌に対する効果促進剤 | |
JP5969390B2 (ja) | フコース含有細菌バイオポリマー | |
US10273514B2 (en) | Method for preparing an aqueous solution of beta-glucan | |
JP4441304B2 (ja) | 水溶性低粘度β−D−グルカン含有培養液の調製方法 | |
JP4736908B2 (ja) | β−1,3−1,6−D−グルカンの製造方法 | |
JP4974453B2 (ja) | β−1,3−1,6−D−グルカンを用いた腸管免疫活性化剤 | |
JP4431766B2 (ja) | 多糖類の生産方法 | |
JP4944412B2 (ja) | 前駆脂肪細胞分化抑制剤及びその製造方法 | |
KR20090099939A (ko) | 체내흡수율이 높은 키토올리고당을 이용한 간장 또는된장의 제조 방법 | |
JPH10276740A (ja) | β−1,3−1,6グルカンを含む飲食物の製法 | |
JP2008072916A (ja) | 高分散性植物性キトサンおよびその製造方法 | |
US20090221806A1 (en) | Method for Producing a Beta-1,3-Glucan With Improved Characteristics | |
JP4713860B2 (ja) | Il−12産生誘導活性を有するマクロファージ活性化剤 | |
JPH1156384A (ja) | 多糖類の精製方法 | |
JP2021036841A (ja) | 改良されたヒアルロン酸の製造方法 | |
JP2014223027A (ja) | 糸状菌の産する新規アミノ多糖 | |
CN110922504A (zh) | 一种从鱿鱼眼中提取透明质酸的方法 | |
WO2011114472A1 (ja) | ヒアルロン酸の精製方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110310 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130514 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20131015 |