JP4807941B2 - βグルカン - Google Patents
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Description
以上のように、抗腫瘍活性や免疫増強作用などの生理機能性に優れ、生体に対し、その機能性が充分に発揮されるβグルカンが強く望まれている。
また本発明は、βグルカンが、アウレオバシジウム プルランス(Aureobasidium pulullans) ADK−34(FERM BP−8391)菌株を培養して得られたものである前記βグルカンを提供するものである。
また本発明は、前記βグルカンを、βグルカンの全量に対して、1重量%以上含有することを特徴とするβグルカン組成物を提供するものである。
また本発明は、前記βグルカンと、イネ科植物由来のβグルカンあるいは1,3、1,4−β−D−グルカンとを含有する前記βグルカン組成物を提供するものである
本発明のβグルカンは、β−1,3結合のグルコース残基を主鎖とし、そのグルコース残基の一部に、β−1,6結合のグルコース残基を分岐(側鎖ともいう)として有する、いわゆる、1,3、1,6−β−D−グルカンであり、その分岐を有さないβ−1,3結合のグルコース残基の割合が、主鎖中の全グルコース残基(β−1,3結合している主鎖中の、分岐を有するグルコース残基と分岐を有さないグルコース残基の合計)のうち、12%以上22.5%以下である。
また、微生物類または担子菌類から得られるβグルカンには、本発明のβグルカン以外の構造を有するβグルカンを含有する場合もあり、その場合、本発明のβグルカンを分離精製して使用してもよいが、本発明のβグルカンの含有量がβグルカンの全量に対して1重量%以上である場合はそのままβグルカン組成物として使用してもよい。該βグルカン組成物中の本発明のβグルカンの含有量は、βグルカンの全量に対して好ましくは10重量%以上、より好ましくは30重量%以上である。
上記乳酸菌としては、桿菌のラクトバシラス(Lactobacillus) 属やビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属、球菌のロイコノストック(Leuconostoc) 属、ペディオコッカス(Pediococcus) 属、ストレプトコッカス(Streptococcus) 属、ラクトコッカス(Lactococcus) 属の乳酸菌が通常使用されるが、その他、エンテロコッカス(Enterococcus)属、バゴコッカス(Vagococcus)属、カルノバクテリウム(Carnobacterium)属、アエロコッカス(Aerococcus)属、テトラゲノコッカス(Tetragenococcus) 属の乳酸菌を利用することができる。具体的な乳酸菌株としては、ラクトバシルスブルガリス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバシルスヘルベティカス(L.helveticus)、ラクトバシルスアシドフィルス(L.acidophilus) 、ラクトバシルスラクティス(L.lactis)、ラクトバシルスカゼイ(L.casei) 、ラクトバシルスブレビス(L.brevis)、ラクトバシルスプランタラム(L.plantarum) 、ラクトバシルスサケ(L.sake)、ストレプトコッカスサーモフィルス(Streptococcus thermophilus)、ストレプトコッカスラクティス(S.lactis)、ストレプトコッカスクレモリス(S.cremoris)、ビィフィドバクテリウムロンガム(Bifidobacterium longum)、ビィフィドバクテリウムビィフィダム(B.bifidum) 、ビィフィドバクテリウムブレーベ(B.breve) 、ビィフィドバクテリウムインファンティス(B.infantis)、ロイコノストッククレモリス(Leuconostoc cremoris)、ロイコノストックメセンテロイデス(Ln.mesenteroides)、ロイコノストックオクノス(Ln.ocnos)、ペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)、ペディオコッカスセレビシエ(P.cerevisiae)、ペディオコッカスペントサセウス(P.pentosaceus) などの従来使用されている乳酸菌の1種類または2種類以上を使用できる。これらは単品で使用してもよく、2種類以上を共生させてもよい。また、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属の乳酸菌の培養とその他の乳酸菌の培養とを別々に行い、これらを混合してもよい。
担子菌類は、子実体や菌糸が塊状に集合した菌核にβグルカンを含有しているので、本発明のβグルカンとして、子実体や菌核を微粉砕したもの、該微粉砕物から抽出された抽出物、あるいは該抽出物からβグルカンを精製したものなどを用いることができる。また、担子菌類の胞子を発芽させ、菌糸体をそれぞれの増殖培地に接種し菌体を増殖させることで得られる培養細胞をそのまま、または該培養細胞を破砕し内容物を除去して得られた培養細胞壁残査を用いることができる。また、上記培養細胞または上記培養細胞壁残査より抽出されたβグルカン、および該抽出βグルカンを精製したもののいずれのβグルカンも用いることができる。また、担子菌類を培養することによって菌体外に分泌生産されたβグルカンを利用することも可能であり、その場合は、培養終了後の培養液をそのまま、あるいは該培養液から分離・精製されたβグルカンを用いることができる。
本発明のβグルカンは、アウレオバシジウム(Aureobasidium) 属に属する微生物から得られたものが特に好ましく、当該微生物を培養することによって菌体内または菌体外に本発明のβグルカンを生産する菌株であるならばいずれでも使用でき、その例として好ましいものはアウレオバシジウム プルランス(Aureobasidium pullulans) の菌株であり、具体的にはIFO4464、IFO4466、IFO6353、IFO7757、ATCC9348、ATCC3092、ATCC42023、ATCC433023などを用いることができ、特に、アウレオバシジウム プルランス(Aureobasidium pullulans) ADK−34菌株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号「FERM BP−8391」として寄託されている菌株)を利用するのが、本発明のβグルカンの収率や単離のしやすさで最も好ましい。その他、環境中(例えば食品、土壌、室内など)により分離された当該微生物を用いることができる。また、単菌分離された保存株あるいは分離株、さらにはそれらを常法に従い変異操作を実施した変異株を用いることができる。変異操作の例としては、例えばUV照射、あるいはニトロソグアニジン、エチジウムブロマイド、メタンスルホン酸エチル、亜硝酸ナトリウムなどによる化学処理などが挙げられる。
上記小麦加工品の例としては、シリアル、うどん、ピザ、パスタ、ほうとう、中華そば、焼きそば、ちゃんぽん、お好み焼き、もんじゃ焼き、ピロキシ、饅頭、カップ麺およびその具などが挙げられる。
上記とうもろこし加工品の例としては、コーンフレーク、コーンスナック、ポップコーンなどが挙げられる。
上記大豆加工品の例としては、豆腐、豆乳、豆乳飲料、湯葉、油揚げ、厚揚げ、がんもどき、あん、みそ、各種豆料理などが挙げられる。
上記穀物(蕎麦、ひえ、あわ、きび)加工品、農産物( ジャガイモ、サツマイモ、サトイモ、トロロイモなど)加工品の例としては、蕎麦、ポテトスナック、ポテトチップ、スイートポテト、ポテトフライ、各種いも料理などが挙げられる。
上記スープ類としては、ポタージュスープ、コンソメスープ、シチュー、味噌汁、お吸い物、雑煮、カレーなどが挙げられ、これらの具材の中に添加してもよい。あるいはクルトンのようにこれらの中に直接添加してもよい。
上記飲料の例としては、清涼飲料水、炭酸飲料水、コーラ、ジュース、果汁、野菜ジュース、トマトジュース、シェーク、日本酒、ビール、発泡酒、洋酒、ワイン、果実酒、カクテル、茶、紅茶、コーヒー、カフェオレ、ウーロン茶、青汁、ミネラルウオーター、水などが挙げられる。
上記調味料類の例としては、醤油、魚醤(いかなご醤油、いわし醤油、塩汁、ナンプラーなど)、味噌、ジャム、ソース、ウスターソース、トマトソース、トマトケチャップ、トマトペースト、トマトピューレ、チリソース、たれ、胡椒、トウガラシ、ニンニク、ショウガ、食酢、ラー油、タバスコ、食塩、各種香辛料などが挙げられる。
上記水産加工品の例としては、かまぼこ、さつま揚げ、つみれ、練り製品などが挙げられる。
上記の健康食品または薬用食品の例としては、サプリメント、錠剤、ドリンク剤、スポーツドリンクなどが挙げられる。
また、上記必須ミネラルとしては、例えば亜鉛、カリウム、マグネシウム、マンガン、リン、ナトリウム、セレン、ヨウ素、モリブデンなどが挙げられる。このような必須ミネラルを供給する源として、例えば小麦エキス、小麦胚芽、小麦若葉、クロレラ、カキ肉エキス、海水濃縮物、ナッツ類、魚粉、レバー粉末、玄米粉末、ビール酵母などを用いることができる。
さらに、上記の各成分以外に、通常食品や医薬品などに用いられる甘味剤、着色料、調味料、苦味料、強化剤、界面活性剤、可溶化剤、増粘剤、糊料、賦形剤、防腐剤、香料、抗菌剤、殺菌剤、塩類、溶媒、キレート剤、中和剤、酸味料、pH調整剤、保存剤、緩衝剤、油脂、油脂加工品、澱粉、小麦粉、そば粉、穀粉、卵、乳製品、乳加工品などの成分を使用することができる。
これらの粉体の内、シリコーンエラストマー球状粉体、ポリエチレン末、ポリプロピレン末、テフロン(登録商標)末、シリコーンゴム、ウレタンパウダー、ポリアルキルシルセスキオキサン、ナイロン、シリカビーズ、アルミナビーズ、アパタイト、アリル化アクリルビーズなどの球状粉体(中空樹脂粉末を含む)は、生理活性成分を保持し、徐放する効果に優れることから配合されていることが好ましい。
紫外線防御剤(有機系、無機系を含む。UV−A、Bのいずれに対応していても構わない)としては、無機系では微粒子酸化チタンや微粒子酸化亜鉛などが挙げられる。有機系紫外線防御剤としては、例えば、パラメトキシケイ皮酸2−エチルヘキシル、2−ヒドロキシ−4−メトキシベンゾフェノン、2−ヒドロキシ−4−メトキシベンゾフェノン−5−硫酸、2,2’−ジヒドロキシ−4−メトキシベンゾフェノン、p−メトキシハイドロケイ皮酸ジエタノールアミン塩、パラアミノ安息香酸(以後、PABAと略す)、エチルジヒドロキシプロピルPABA、グリセリルPABA、サリチル酸ホモメンチル、メチル−O−アミノベンゾエート、2−エチルヘキシル−2−シアノ−3,3−ジフェニルアクリレート、オクチルジメチルPABA、メトキシケイ皮酸オクチル、サリチル酸オクチル、2−フェニル−ベンズイミダゾール−5−硫酸、サリチル酸トリエタノールアミン、3−(4−メチルベンジリデン)カンフル、2,4−ジヒドロキシベンゾフェニン、2,2’,4,4’−テトラヒドロキシベンゾフェノン、2,2’−ジヒドロキシ−4,4’−ジメトキシベンゾフェノン、2−ヒドロキシ−4−N−オクトキシベンゾフェノン、4−イソプロピルジベンゾイルメタン、ブチルメトキシジベンゾイルメタン、4−tert−ブチル−4’−メトキシジベンゾイルメタン、4−(3,4−ジメトキシフェニルメチレン)−2,5−ジオキソ−1−イミダゾリジンプロピオン酸2−エチルヘキシル、これらの高分子誘導体、シラン誘導体などが挙げられる。さらに、これらをポリマー中に封止したものでもよい。
βグルカンの分析は、アルコールによって沈殿する全多糖量をフェノール硫酸法にて測定し、引き続き沈殿させた多糖中のβグルカンの確認・定量を生化学工業(株)の(1−3)−β−D−結合を含むβグルカンの検出・測定用キットを用いて行った。まず、測定サンプル中の全多糖量をフェノール硫酸法にて測定した。すなわち、サンプル溶液30μlに蒸留水30μlを加え、ここに300mMのNaClを含むリン酸緩衝液(pH6.9)を120μl加え、さらにエタノール640μl(3倍量)を添加し、−15℃に10分間放置して多糖を沈殿させた。上清を除去後、100μlの蒸留水を添加して溶解させた。ここに5重量%フェノール水溶液100μlおよび硫酸500μlを加え、反応させた。サンプルを加えず蒸留水100μlにフェノール液および硫酸を加えたものをブランクとして、490nmの吸光度を測定した。なお、プルランの10mg/mlから2倍希釈系列を作成したものを標準サンプルとして使用して検量線を作成し、多糖量の定量を実施した。次に、全多糖量が1〜0.1mg/ml前後の溶液をまず、0.5MのNaOHにて10倍希釈し、引き続きβグルカンフリーの蒸留水にて希釈し、10-10 まで希釈液を調製した。βグルカン希釈液の50μlをチューブにとり、主反応試薬50μlを添加して、37℃にて30分間インキュベートした。続いて亜硝酸ナトリウム溶液50μl、スルファミン酸アンモニウム50μl、Nメチル2ピロリドン溶液50μlを加え、反応させた後、溶液の吸光度545nm(対象波長630nm)を測定した。なお、添付のβグルカン標準品で7.5〜60pg/mlのβグルカン溶液にて検量線を得て、各βグルカン溶液の濃度を算出した。
βグルカンの分子量測定は、以下の通りとした。すなわち、βグルカン溶液に3倍量のアルコールを加え、−20℃に冷却して10分間放置し、沈殿を得た。沈殿させたβグルカン沈殿物の5mgをチューブに取り、1mlの蒸留水を加えて溶解させ、3倍量のエタノールを加え溶解させた。この操作を3回繰り返して得た溶液を水で透析して、凍結乾燥させて精製βグルカンを得た。βグルカンを蒸留水に溶解し、濃度はフェノール硫酸法で測定した。フェノール硫酸法の検量線はプルランとした。分離にはHPLCゲル濾過カラムであるShodexのパックドカラムKS−804とKS−802(昭和電工社製)を用い、流速0.5ml/min.、温度80℃、検出にはビスコテック社製の分子量測定装置TriSEC Model302を用い、差圧粘度、示差屈折、光散乱の3点を測定し、3つの情報から分子量を算出した。まず、βグルカン濃度を正確に求めた溶液(1.5mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml)を調製し、サンプル濃度と示差屈折面積値から、サンプル固有の屈折率を計算した。差圧粘度の測定では、固有粘度の標準物質としてプルランを用いた。精製βグルカン溶液(1.5mg/ml)について測定した示差屈折検出面積値、光散乱検出面積値から大凡の分子量を算出し、さらに算出されたβグルカン固有粘度から分子量を補正し、精製βグルカンの分子量とした。
βグルカンの構成糖の解析は、アルジトールアセテート法で実施した。アルコール沈殿によって精製した多糖を水に溶解し、透析して単糖・オリゴ糖を完全に除去した。なお、低分子糖の有無はHPLCにより確認した。精製βグルカンの酸加水分解は、精製βグルカン1mgに72重量%硫酸0.1mlを添加し、氷冷での反応後、100℃で4時間加熱した。中和し、遠心分離して上清を回収して、脱塩、減圧エバポレーターで濃縮した。次にアルジトール化を行った。すなわち、濃縮サンプルに蒸留水1mlを加え2Nのアンモニア水を1滴加えた後、水素化ホウ素ナトリウムを3mg添加して室温で2時間反応させた。イオン交換樹脂で中和、減圧エバポレーターで濃縮した。さらにメタノールを1ml添加して減圧エバポレーターで濃縮した。次いで、濃縮サンプルに無水酢酸0.1mlとピリジン0.1mlを加え、100℃で2時間反応させた。蒸留水を1ml加え減圧エバポレーターで濃縮した。この濃縮操作を3回繰り返し、乾燥後のサンプルにアセトンを20μl添加してガスクロマトグラフィーで測定した。ガスクロマトグラフィーはキャピラリーカラムTC−WAX(GL Sciences社製)を用い、キャリアガスHe
110kPa、カラム温度230℃、注入口温度250℃、検出法は水素炎イオン化検出を行い、5890A GasChromatograph(HEWLETT PACKARD社製)を用いた。測定データのピーク面積比から構成糖組成を算出した。なお、本分析では、内部標準としてイノシトールを使用し、グルコース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、フコース、キシロース、アラビノース、リボースの混合物において各単糖のアセチル化誘導体を完全分離し、定量できることを確認した。
βグルカンの結合様式の解析は、メチル化法によって実施した。分析例3と同様に精製したβグルカン3mgにDMSO2mlを加えて溶解させ、カルバニオン試薬(DMSOと水素化ナトリウムで調整)0.5mlを加え、室温で4時間反応させた。冷却しながらヨウ化メチル1.5mlを加えて1.5時間反応させ、反応液を流水で3時間、200倍の蒸留水で一晩透析した後、減圧エバポレーターで濃縮、乾固させた。このメチル化操作を3回繰り返した後、分析例3と同様に酸加水分解、アルジトールアセテート化を行った。得られたサンプルにアセトン20μlを添加してガスクロマトグラフィーで検出した。測定データのピーク面積比から各糖の誘導体を定量した。本分析では、内部標準としてイノシトールを使用し、2,3,4,6メチル1アセチルグルコース、2,4,6メチル1,3アセチルグルコース、2,3,6メチル1,4アセチルグルコース、2,3,4メチル1,6アセチルグルコース、2,4メチル1,3,6アセチルグルコース、2,3メチル1,4,6アセチルグルコースの混合物において各誘導体を完全分離し、定量できることを確認した。
1,3、1,4−β−D−グルカンの定量は、メガザイム社製のβグルカン測定キットを用いて、McCleary法(酵素法)にて行った。まず、測定サンプルの水分含量を測定し、その10mgを17mlチューブに取り、50%エタノール溶液を200μl加え、分散させた。次に4mlの20mMリン酸緩衝液(pH6.5)を加え、よく混合した後、煮沸した湯浴中にて1分間加温した。よく混合し、更に2分間、湯浴中で加熱した。50℃に冷却後、5分間放置してから、各チューブにリケナーゼ酵素溶液(キットに付属するバイアルを20mlの20mMリン酸緩衝液で希釈、残量は凍結保存)の200μl(10U)を加え、1時間、50℃にて反応させた。チューブに200mM酢酸緩衝液(pH4.0)を5ml加えて、静かに混合した。室温に5分間放置し、遠心分離にて上清を得た。100μlを3本のチューブに取り、1本には100μlの50mM酢酸緩衝液(pH4.0)を、他の2本には100μl(0.2U)のβグルコシターゼ溶液(キットに付属するバイアルを20mlの50mM酢酸緩衝液で希釈、残量は凍結保存)を加え、50℃にて10分間、反応させた。3mlのグルコースオキシターゼ/ベルオキシターゼ溶液を加えて、50℃にて20分間反応させ、各サンプルの510nmにおける吸光度(EA)を測定した。βグルカン含有量は、次式により求めた。
βグルカン含有量(重量%)=(EA)×(F/W)×8.46
F=(100)/(グルコース100μgの吸光度)
W=算出された無水物重量(mg)
FERM BP−8391株をYM培地(ディフコ社製)120mlに植菌して前培養液(26℃、180rpm、3日間培養)を得た。シュークロース90g、酵母エキス15g、K2 HPO4 1.0g、KCl 0.5g、MgSO4 ・7H2 O 0.5g、FeSO4 ・7H2 O 0.01gおよび蒸留水3Lを入れた5Lジャーファーメンターに、前培養液100mlを植菌して、26℃、72時間の培養を実施し、培養液3L(pH4.5)を得た。培養液を80℃にて30分間加熱殺菌し、等量の蒸留水を添加し、よく混合してから、8000rpmで30分間遠心分離して、培養上清液(A)を得た。培養上清液(A)200mlに等量のエタノールを添加し、得られた多糖の沈殿を分離し、エタノールで洗浄し、100mlの蒸留水に溶解させた。不溶性物を除去してから、200mlのエタノールを加え、沈殿を得た。この操作を再度繰り返して、水に溶解した多糖溶液を透析膜(分子量3000カット)に入れ100倍量の蒸留水で透析後、凍結乾燥して培養上清粉末(B)16gを得た。
FERM BP−8391株を1%酵母エキス(ディフコ社製)および1重量%グルコースを含む培地120mlに植菌して前培養液(26℃、180rpm、3日間培養)を得た。シュークロース90g、酵母エキス2g、K2 HPO4 1.0g、KCl 0.5g、MgSO4 ・7H2 O 0.5g、FeSO4 ・7H2 O 0.01gおよび蒸留水3Lを入れた5Lジャーファーメンターに、前培養液100mlを植菌して、26℃、72時間の培養を実施し、培養液3L(pH4.5)を得た。培養液を80℃にて30分間加熱殺菌し、等量の蒸留水を添加し、よく混合してから、8000rpmで30分間遠心分離して、培養上清液(C)を得た。培養上清液(C)200mlに等量のエタノールを添加し、得られた多糖の沈殿を分離し、エタノールで洗浄し、100mlの蒸留水に溶解させた。不溶性物を除去してから、200mlのエタノールを加え、沈殿を得た。この操作を再度繰り返して、水に溶解した多糖溶液を透析膜(分子量3000カット)に入れ100倍量の蒸留水で透析後、凍結乾燥して培養上清粉末(D)10gを得た。
実施例1で得られた培養液に0.05重量%となるようツニカーゼ(大和化成社製)を添加、40℃にて2時間、撹拌反応させた後、80℃にて30分間加熱殺菌した。これに2倍量の蒸留水を添加し、よく混合してから、8000rpmで30分間遠心分離して、培養上清液(E)を得た。培養上清液(E)300mlに等量のエタノールを添加し、得られた多糖の沈殿を分離し、エタノールで洗浄し、100mlの蒸留水に溶解させた。不溶性物を除去してから、200mlのエタノールを加え、沈殿を得た。この操作を再度繰り返して、水に溶解した多糖溶液を透析膜(分子量3000カット)に入れ100倍量の蒸留水で透析後、凍結乾燥して培養上清粉末(F)18gを得た。
実施例1で得られた培養上清粉末(B)100mgに10mlの蒸留水を加え、よく溶解させた。1,3、1,4−β−DグルカンのβグルカンMW標準物(分子量4万、Megazyme社製)100mgに10mlの蒸留水を加え、よく溶解させた。調製した両溶液をよく混合してから凍結乾燥し、βグルカン組成物の粉末(G)、(H)および(I)をそれぞれ得た。培養上清粉末(B)とβグルカンMW標準物の混合比は、重量比で以下の通りとした。4:1(G)、1:1(H)、1:4(I)。
FERM BP−8391株の代わりにIFO4466株を用いる以外は、実施例1と同様に実施し、培養上清液(J)および培養上清粉末(K)1.5gを得た。
実施例で得られたサンプル〔培養上清粉末(B)、(D)および(F)、βグルカン組成物の粉末(G)、(H)および(I)〕ならびに比較例で得られたサンプル〔培養上清粉末(K)〕について、溶解性試験を実施した。なお、コントロールとしてシゾフィラン(医薬品名ソニフィラン:科研製薬社製)、カードラン(和光純薬社製)を合わせて評価した。それぞれの粉末サンプル10mgを1.5mlチューブに取り、蒸留水1mlを加えた。該チューブを回転式撹拌装置であるローテーターRT−50(タイテック社製)にセットし、室温にて30rpmで回転しながら溶解の度合いを肉眼で観察した。観察は5分後、10分後、30分後、60分後、120分後、180分後、240分後、360分後、720分後、1440分後とし、その結果を表1に示した。
評価は、均一に完全溶解したもの(◎)、水和・膨潤して透明な液になっているが不均一な部分が認められるもの(○)、溶解しない部分が認められるもの(△)、沈殿が認められ溶解していない状態のもの(×)、の4点に区分けした。
実施例で得られたサンプル〔培養上清粉末(B)、(D)および(F)〕ならびに比較例で得られたサンプル〔培養上清粉末(K)〕の分子量測定を分析例2に従って行い、その結果を表2に示した。その結果、シゾフィランは分子量44万と文献値にほぼ一致する値が得られ、FERM BP−8391株から得られたβグルカン〔培養上清粉末(B)、(D)および(F)〕は、いずれも分子量50万未満と測定された。
分析例3に従い、構成糖解析を実施し、その結果を表3にまとめて示した。FERM
BP−8391株から得られたβグルカン〔培養上清粉末(B)、(D)および(F)〕は、グルコース80%以上のβグルカンであり、培養上清粉末(B)および(F)は、マンノースを含む多糖であることを確認した。
分析例4に従い、結合様式を解析し、そのピーク面積値、および、1,3結合のみを有するグルコース残基の、グルコース同士の結合にあずかる主鎖中の全グルコース残基に対する比率を表4に示した。FERM BP−8391株から得られたβグルカン〔培養上清粉末(B)、(D)および(F)〕は、いずれも高分岐な多糖であることが確認された。
実施例で得られたサンプル〔βグルカン組成物の粉末(G)、(H)および(I)〕について、1,3、1,4−β−D−グルカンを定量した。分析例5に従い測定したところ、サンプル中の1,3、1,4−β−D−グルカン量は、(G)20%、(H)46%、(I)80%と算出され、理論値(25%、50%、75%)に近似した値が得られた。
実施例1で得られたβグルカンの培養上清粉末(B)を用いて免疫賦活活性を測定した。培養上清粉末(B)の0.04mg、0.2mg、1mg、および5mgを生理食塩水0.25mlにそれぞれ溶解し、ICRマウス (雌、4週令) に腹腔内投与した。投与6時間後に腹腔細胞を採取し、細胞遠心後、染色して腹腔内細胞数および好中球数を測定した。培養上清粉末(B)を0.04mg投与した場合の腹腔内細胞数および好中球数を1として、測定結果を図1および表5に示した。
以上から本発明のβグルカンは、白血球を活性化することで免疫増強効果を示すことが明らかとなった。
各サンプル〔培養上清粉末(B)、(D)および(F)、βグルカン組成物の粉末(G)、シゾフィラン〕の1mgを生理食塩水にそれぞれ溶解し、ICRマウス (雌、4週令) に腹腔内投与した。投与6時間後に腹腔細胞を採取し、腹腔内細胞数および好中球数を測定した。シゾフィランを投与した場合の腹腔内細胞数および好中球数を1として各サンプルを投与した場合の値を比較し、その結果を表7に示した。試験した本発明のβグルカンは、いずれも好中球の増加が認められ、免疫増強の基本的な性質(BRM活性)が備わっていることがわかった。
実施例1で得られた培養上清液(A)および培養上清粉末(B)を蒸留水でそれぞれ希釈して、βグルカン濃度2.5mg/mlに調製し、溶液を滅菌後、マウスの飲料水として自由摂取させた。対照はサンプルの希釈に用いた蒸留水を飲料水とした。固形飼料で1週間飼育後、腹腔細胞を採取し、2時間培養後にTNF−αを、24時間培養後にIL−12をELISA法で測定した。その結果、蒸留水のみ投与のコントロール群に比較して培養上清液(A)および培養上清粉末(B)の経口投与群は、TNF−αにおいて3倍以上、IL−12は2倍以上の産生が認められた。以上から、本発明のβグルカンは、溶解性がよく、かつ免疫増強に優れた機能性を発揮するβグルカンであることが明らかとなった。
Claims (3)
- 重量平均分子量が5000以上50万未満の1,3、1,6−β−D−グルカンであり、分岐を有さないβ−1,3結合のグルコース残基の割合が、主鎖中の全グルコース残基中12%以上22.5%以下であり、βグルカンの構成糖が、グルコースとマンノースであることを特徴とするβグルカン。
- 請求項1記載のβグルカンを、βグルカンの全量に対して、1重量%以上含有することを特徴とするβグルカン組成物。
- 請求項1記載のβグルカンと、イネ科植物由来のβグルカンあるいは1,3、1,4−β−D−グルカンとを含有する請求項2記載のβグルカン組成物。
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