JP4359503B2 - インターロイキン15(il−15)に特異的なヒト抗体 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒトIL-15に特異的に結合すると共に、IL-15の誘導する炎症誘発作用を阻害する完全ヒトモノクローナル抗体の初めての作製及び単離や、このような新規な抗体の特徴付け、並びに、多種のIL-15媒介性疾患を治療する上でのそれらの治療上の価値の実証、に基づくものである。例えばここで解説するように、本ヒト抗体は、その両者が炎症性の障害に一体に関与しているTNFα産生及びT細胞増殖の両方を阻害することが示されている。従って、本発明のヒト抗体は、このような疾患(及び他の何らかのIL-15媒介性障害)を治療及び予防する優れた手段となる。これらは、その固有の特異性(例えばエピトープ及び種特異性)、親和性、構造、機能的活性に起因すると共に、これらが完全ヒトであるために、ヒト患者に投与した場合に予め作製された他のIL-15抗体(例えばマウス及びヒト化抗体)よりも、著しく免疫原性が低く、またより治療効果が高く有用であるという事実に起因するものである。さらに本発明は、リウマチ性関節炎、乾癬、移植片拒絶及び癌などの炎症性疾患の治療を含め、ここで解説するヒト抗体などのIL-15阻害性抗体の新しい治療上用途の発見にも基づく。
本発明は、IL-15が媒介する多種の障害(即ち、IL-15の炎症誘発作用が引き起こす障害)を治療及び診断するための新規な抗体ベースの治療薬を提供するものである。ここで用いる用語「IL-15の炎症誘発作用」には、例えばTNFα及び他の炎症媒介物質の産生や、T細胞の動員/増殖など、IL-15により誘導されるあらゆる体液性又は細胞媒介性の免疫応答が含まれる。本発明の治療法では、IL-15上に存在するエピトープに特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体を利用する。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495に解説された標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術など、多様な公知の技術により作製できる。体細胞ハイブリダイゼーション法が基本的には好適であるが、モノクローナル抗体を作製する他の技術、例えばBリンパ球のウィルス又は腫瘍形成性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリを用いたファージ・ディスプレイ技術、も利用できる。
IL-15に対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するためには、ヒト免疫グロブリン遺伝子(例えばHCo12、HCo7又はKMマウス)を含有するトランスジェニック又はトランスクロモゾマル・マウスをLonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 及び WO 98/24884などに解説されたようにIL-15抗原の精製もしくは濃縮製剤及び/又はIL-15発現細胞で免疫することができる。代替的には、ヒトIl-15をコードするDNAでマウスを免疫することもできる。好ましくは、当該マウスは1回目の輸注時に6乃至16週齢であるとよい。例えば、IL-15抗原の精製もしくは濃縮製剤(5乃至50μg)を用いて、HuMAbマウスを腹腔内により免疫することができる。IL-15抗原の精製もしくは濃縮製剤を用いた免疫処置でも抗体が生じない場合、細胞株など、IL-15発現細胞でマウスを免疫して、免疫応答を促進することもできる。
IL-15に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するには、免疫後のマウスから脾細胞及びリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適した不死化細胞株に融合させることができる。こうして出来たハイブリドーマを次に、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングすることができる。例えば免疫後のマウス由来の脾臓リンパ球の単個細胞懸濁液を、50% PEG(w/v)で、SP2/0-Ag8.653非分泌性マウス骨髄腫細胞 (ATCC, CRL 1580)に融合させることができる。細胞を平底の微量定量プレートに約1×105になるようにプレートし、通常の試薬の他に10%胎児クローン血清、5-10%オリゲン・ハイブリドーマ・クローニング・ファクター(アイジェン社)、及び1×HAT (シグマ社)を含有する選択培地で2週間インキュベートすることができる。ほぼ2週間後、HATをHTに取り替えた培地で細胞を培養できる。次に個々のウェルをELISAによりヒト抗IL-15モノクローナルIgM及びIgG抗体についてスクリーニングすることができる。広汎なハイブリドーマ成長が起きたら培地を通常10乃至14日後に観察できる。抗体を分泌しているハイブリドーマを再度プレートし、再度スクリーニングし、ヒトIgGについてまだ尚陽性であれば、限界希釈により少なくとも2回、抗IL-15モノクローナル抗体をサブクローニングすることができる。次に安定なサブクローンをin vitroで培養して、抗体を組織培養培地中に生じさせ、特徴付けに向けることができる。
本発明のヒト抗体は、当業で公知のように、組換えDNA技術及び遺伝子トランスフェクション法の組合せなどを用いて、ホスト細胞トランスフェクトーマで作製することもできる (Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
抗体は、6つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域(CDR)に位置するアミノ酸残基を主に通じて標的抗原と相互作用する。そのため、CDR内のアミノ酸配列は、CDRの外にある配列よりも、個々の抗体間の違いが大きい。CDR配列は大半の抗体−抗原相互作用を担っているため、特定の天然発生型の抗体を由来とするCDR配列を、異なる性質を持つ異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植した状態で含有するような発現ベクタを構築すると、特定の天然発生型抗体の性質を模倣する組換え抗体を発現させることができる(例えばRiechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522-525; and Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033を参照されたい)。このようなフレームワーク配列は生殖細胞抗体遺伝子配列を含む公開DNAデータベースから得ることができる。これらの生殖細胞配列は成熟型の抗体遺伝子配列とは異なるが、それはなぜなら、それらには、B細胞成熟の過程でV(D)J接合により形成される、完全にアセンブルされた可変遺伝子が含まれていないからである。生殖細胞遺伝子配列はまた、可変領域全体にわたって、高親和二次レパートリー抗体の配列とも、個々のレベルで均一に異なる。例えば、体細胞変異は、フレームワーク領域のアミノ末端部分では比較的に頻度が低い。例えば、体細胞変異は、フレームワーク領域1のアミノ末端部分及びフレームワーク領域4のカルボキシ末端部分では比較的に頻度が低い。さらに、数多くの体細胞変異は、抗体の結合特性に大きく影響するものではない。そのために、もとの抗体のものと同様な結合特性を有するインタクト組換え抗体を作り直す際に、特定の抗体のDNA配列全体を得る必要はない(1999年3月12日出願のPCT/US99/05535 を参照されたい)。典型的には、CDR領域にわたる部分的重鎖及び軽鎖配列があれば、この目的にとって充分である。この部分的配列を用いて、どの生殖細胞可変遺伝子及びジョイニング遺伝子セグメントが、組換え後の抗体可変遺伝子に寄与したかを決定する。次にこの生殖細胞配列を用いて、可変領域の欠けている部分を充填する。重鎖及び軽鎖リーダ配列はタンパク質成熟の過程で切断され、最終的な抗体の特性には寄与しない。欠けている配列を追加するためには、クローンされたcDNA配列を、ライゲーション又はPCR増幅法により、合成オリゴヌクレオチドに組み合わせることができる。代替的には、可変領域全体を一組の短い、重複のあるオリゴヌクレオチドとして合成し、PCR増幅法で組み合わせて、完全に人工的な可変領域クローンを作製することもできる。このプロセスは、特定の制限部位を削除又は含有させたり、あるいは特定のコドンを最適化するなどのいくつかの利点を有する。
(1)ヒト重鎖フレームワーク領域及びヒト重鎖CDRであって、前記ヒト重鎖CDRのうちの少なくとも一つが、図2に示された(又は配列番号: 2の対応アミノ酸残基)CDRのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト重鎖フレームワーク領域及びヒト重鎖CDRと;(2)ヒト軽鎖フレームワーク領域及びヒト軽鎖CDRであって、前記ヒト重鎖CDRのうちの少なくとも一つが、図3に示された(又は配列番号: 4のアミノ酸残基に相当する)CDRのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト軽鎖フレームワーク領域及びヒト軽鎖CDRと、を含む抗体を調製するステップ
を含み、
但し前記抗体がIL-15への結合能を維持している、抗IL-15抗体を調製する方法を提供するものである。
(1)ヒトIL-15への結合、及び、IL-15誘導性炎症誘発作用の阻害;
(2)IL-15誘導性TNFα産生又はT細胞増殖の阻害;
(3)組換えヒトIL-15を分析物とし、当該抗体をリガンドとして用いたBIACORE 3000装置による表面プラスモン共鳴(SPR)技術で判定した場合、ほぼ10-7M未満の解離平衡定数(KD)でのヒトIL-15への結合;
(4)ヒトIL-15のβ及び/又はγ鎖相互作用ドメイン上に位置するエピトープへの結合;
(5)ヒトIL-15のAsp8の、ヒトIL-15受容体のβユニットへの結合、及び/又は、ヒトIL-15のGln108の、ヒトIL-15受容体のγユニットへの結合、に対する干渉:
(6)受容体に結合したヒトIL-15への結合;
(7)ヒトIL-15への結合、及びヒトIL-15の錯角化症誘導能の阻害;
(8)ヒトIL-15への結合、及びヒトIL-15の表皮肥厚誘導能の阻害;
(9)ヒトIL-15への結合、及びヒトIL-15のケラチノサイト増殖誘導能の阻害;及び/又は
(10)ヒトIL-15への結合、及びヒトIL-15の活性化白血球遊走誘導能の阻害;
などの保持について、選抜してもよい。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、多種の公知の技術を用いてIL-15への結合について特徴付けることができる。一般的には、当該抗体をELISAでまず特徴付ける。簡単に説明すると、微量定量プレートを、PBSに入れた精製IL-15で被覆した後、PBSで希釈したウシ血清アルブミン(BSA)などの無関係のタンパク質で遮断することができる。IL-15免疫マウスから採った血漿の希釈液を各ウェルに加え、37℃で1乃至2時間、インキュベートする。このプレートをPBS/Tween 20で洗浄した後、アルカリホスファターゼに結合させたヤギ抗ヒトIgG Fc特異ポリクローナル試薬と一緒に37℃で1時間、インキュベートする。洗浄後、プレートをABTS基質で展開させ、405のODで分析する。好ましくは、最も高い抗体価を生じるマウスを融合に用いるとよい。
さらに別の局面では、本発明は、IL-15に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を発現できるトランスジェニックもしくはトランスクロモゾマルマウスなどの非ヒトトランスジェニックもしくはトランスクロモゾマル動物を提供するものである。ある具体的な実施態様では、本発明は、IL-15抗原及び/又はIL-15発現細胞で免疫したときにマウスがヒト抗IL-15抗体を産生するように、ヒト重鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックもしくはトランスクロモゾマル・マウスを提供する。前記ヒト重鎖導入遺伝子は、ここで詳細に解説し、例示する通りのHuMAbマウスなど、トランスジェニックの場合と同様に、マウスの染色体DNAに組み込ませることができる。反対に、前記ヒト重鎖導入遺伝子を、WO 02/43478 (2002年6月6日公開)に記載されたようなトランスクロモゾマル(例えばKM)マウスの場合と同様に、染色体外に維持することもできる。このようなトランスジェニック及びトランスクロモゾマル・マウスは、V-D-J組換え及びアイソタイプ・スイッチングを起こすことにより、IL-15に対して複数のアイソタイプ(例えばIgG、IgA 及び/又は IgE)のヒトモノクローナル抗体を産生できる。アイソタイプ・スイッチングは、例えば古典的又は非古典的なアイソタイプ・スイッチングなどで起きるものでもよい。
(1)ヒトVL遺伝子セグメント及びヒトJLセグメントにコードされたポリペプチド配列に実質的に同一なポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、及び(2)ヒトCL遺伝子セグメントにコードされたポリペプチド配列に実質的に同一なポリペプチド配列を有する軽鎖定常領域、から成るヒト配列軽鎖と;
(1)ヒトVH遺伝子セグメント、選択的にD領域、及びヒトJHセグメントにコードされたポリペプチド配列に実質的に同一なポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び(2)ヒトCH遺伝子セグメントにコードされたポリペプチド配列に実質的に同一なポリペプチド配列を有する定常領域、から成るヒト配列重鎖と
を含む。
I.再編成のない重鎖及び再編成される軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含有するトランスジェニック動物;
II.再編成のない重鎖及び再編成のない軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含有するトランスジェニック動物;
III.再編成される重鎖及び再編成のない軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含有するトランスジェニック動物;及び
IV. 再編成される重鎖及び再編成される軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含有するトランスジェニック動物。
別の局面では、本発明は、細胞毒、薬物(例えば免疫抑制剤)又は放射性同位元素などの治療部分に結合させたヒト抗IL-15モノクローナル抗体を特徴とする。細胞毒に結合させた場合、これらの抗体結合体は「イムノトキシン」と呼ばれる。細胞毒又は細胞傷害性薬剤には、細胞にとって有害(例えば致死させる)なあらゆる物質が含まれる。 例にはタキソール、シトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びプロマイシン並びにこれらの類似体又は同族体、がある。治療的薬剤には、限定はしないが、抗代謝産物(例えばメトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えばメクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU) 及びロムスチン (CCNU)、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンC、及びcis-ジクロロジアミンプラチナム(II) (DDP) シスプラチン)、アントラサイクリン (例えばダウノルビシン(以前のダウノマイシン)、及びドキソルビシン)、抗生物質(例えばダクチノマイシン(以前のアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン(AMC))、及び抗有糸***剤(例えばビンクリスチン及びビンブラスチン)、がある。本発明の抗体を、放射性ヨウ素などの放射性同位元素に結合させて、癌などのIL-15関連異常を治療するための細胞傷害性放射性医薬品を作製することもできる。
別の局面では、本発明は、薬学的に許容可能な担体と一緒に調合された、本発明のヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を1つ又は組み合わせで含有する、医薬組成物などの組成物を提供するものである。ある好適な実施態様では、本組成物は、複数(例えば二種以上)の単離された本発明のヒト抗体の組合せを含有する。好ましくは、本組成物の抗体の各々が、IL-15の異なる、予め選択されたエピトープに結合するとよい。
20%以上の改善がテンダー・ジョイント・カウント(原語:Tender Joint Count)(TCJ)及びスウォレン・ジョイント・カウント(原語:Swollen Joint Count)(SWJ)にあり、そして、20%以上の改善が以下、5つの評価:ペイシェント・ペイン・アセスメント(原語:Patient Pain Assessment)(VAS)、ペイシェント・グローバル・アセスメント(原語:Patient Global Asessment)(VAS)、フィジシャン・グローバル・アセスメント(原語:Physician Global Assessment)(VAS)、パテント・セルフ−アセッスド・ディスアビリティ(原語:Patent Self-Assessed Disability)(HAQ)、アキュート・フェイズ・リアクタント(原語:Acute Phase Reactant)(CRP又はESR)のうちの3つにあること、と定義されている。
本発明による、IL-15に対するヒト抗IL-15抗体(この抗体の誘導体及び結合体も含む)及び前記抗体を含有する組成物は、多種のin vitro及びin vivoでの診断用途及び治療用途で用いることができる。
実施例1 Cmu標的化マウスの作製
CMDターゲティング・ベクタの構築
プラスミドpICEmuは、mu遺伝子に延びる、Balb/Cゲノム・ラムダ・ファージディスプレイから得られたマウスIg重鎖遺伝子座のEcoRI/XhoI断片を含有する(Marcu et al. Cell 22: 187, 1980)。このゲノム断片をプラスミドpICEMI9HのXhoI/EcoRI部位にサブクローンした (Marsh et al; Gene 32, 481-485, 1984)。pICEmuに含まれたこれら重鎖配列は、muイントロン・エンハンサのちょうど3'側に位置するEcoRI部位の下流から、mu遺伝子の最後の膜貫通エキソンのほぼ1kb下流に位置するXhoI部位まで延びる。しかし、このmuスイッチ反復領域の大半は、E. coliを通過させて欠失させてある。
AB-1 ES 細胞 (McMahon, A. P. and Bradley, A., (1990) Cell 62: 1073-1085) を有糸***不活性期のSNL76/7 細胞支持細胞層(同書)上で、基本的には解説 (Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 71-112のRobertson, E. J. (1987))された通りに成長させた。直線化させたCMDターゲティング・ベクタを、電気穿孔法でAB-1細胞に、Hasty et al. (Hasty, P. R. et al. (1991) Nature 350: 243-246)で解説された方法により注入した。注入後の細胞を100 mm 皿に、1-2×106細胞/皿の密度になるようにプレートした。24時間後、G418 (200マイクログラム/mlの活性成分)及び FIAU (5×10-7M)を培地に加え、薬物耐性クローンを8乃至9日間、展開させた。クローンを摘みだし、トリプシン処理し、2つの部分に分割し、さらに展開させた。その後各クローン由来の細胞の半分を凍結させ、残りの半分を、ベクタと標的配列との間の相同組換えについて分析した。
264番、272番及び408番と指定した3つの標的設定されたESクローンを解凍し、C57BL/6J胚盤胞にBradley (Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 113-151のBradley, A. (1987) )の解説通りに注入した。注入された胚盤胞を偽妊娠メスの子宮に移して、注入されたES細胞及びホストの胚盤胞を由来とする細胞の混合物であるキメラマウスを作製した。このキメラへのES細胞の寄与度は、黒色のC57BL/6Jバックグラウンド上に見える、ES細胞系由来の野鼠色の皮の量により視覚的に判断できる。クローン272及び408では、ごく低いパーセンテージでキメラが生じた(即ち、野鼠色の着色率が低い)が、クローン264では、高率でオスのキメラが生じた。これらのキメラをC57BL/6Jメスと交配し、ES細胞ゲノムの生殖細胞伝播を示す野鼠色の仔を作った。尾の生検で得たDNAをBgII消化し、サザン・ブロット分析して、標的設定されたmu遺伝子のスクリーニングを行った(ES細胞DNAの分析について上述した通り)。野鼠色の仔のほぼ50%が、野生型のバンド15.7kbに加え、ハイブリダイズした7.7kbのBgIIバンドを示し、標的設定されたmu遺伝子の生殖細胞伝播が実証された。
neoカセットをCmu1に挿入したことでIg重鎖遺伝子が不活性化したかどうかを調べるために、クローン264キメラを、JH遺伝子セグメントを欠失させて重鎖発現を不活性化させるJHD変異がホモ接合型となったマウスと交配した(Chen et al, (1993) Immunol. 5: 647-656)。4匹の野鼠色の仔を得た。血清を1月齢のこれら動物から得、ELISAで検定してマウスIgMの存在を調べた。4匹の仔のうち2匹がIgMを完全に欠いていた(表1を参照されたい)。4匹の動物を、尾の生検で得たDNAをBgII消化し、プローブA(図1を参照されたい)にハイブリダイズさせ、さらにStuI消化し、475bpのEcoRI/StuI断片(同書)にハイブリダイズさせる、といったサザン・ブロット分析で遺伝子型決定したところ、血清IgMを発現できない当該動物は、重鎖遺伝子座の一方のアレルがJHD変異を持ち、他方のアレルがCmu1変異を持つものであることが実証された。JHD変異がヘテロ接合型となったマウスは野生型のレベルの血清Igを示す。これらのデータは、Cmu1変異はmu遺伝子の発現を不活性化することを実証するものである。
HCO12ヒト重鎖導入遺伝子
80 kb のpHC2 のインサート(Taylor et al., 1994, Int. Immunol., 6: 579-591)及び25 kbのpVx6のインサートを同時注入することで、HCO12導入遺伝子を作製した。プラスミドpVx6 を以下に解説するように構築した。
上述の通りに作製され、米国カリフォルニア州サンホセのメダレックス社より提供されたHCo12 及び HCo7 トランスジェニックマウスを、完全フロイント・アジュバント(CFA、米国ミシガン州デトロイト、ディフコ・ラボラトリーズ社、ロット番号121024LA)又は不完全フロイント・アジュバント(ICFA、ディフコ社、ロット番号121195LA)を添加したヒト組換えIL-15 (hIL-15、米国、シアトル、イムネックス社)で皮下的 (SC)腹腔内 (IP)又は静脈内 (IV)により免疫した。いくつかの場合では、KLHに結合させたhIL-15を免疫処置に用いた。完全もしくは不完全フロイント・アジュバントを添加したhIL-15で数回、追加し激した後、マウスの血清を、IL-15に対するヒト抗体の存在について検査した。
マウス番号 146 (HCo12)、ID 995-146、メス
170699 SC 12μg hIL-15 のCFA (ディフコ社、ロット番号121024LA)溶液
010799 SC 12μg hIL-15 のICFA (ディフコ社、ロット番号121195LA)溶液
150799 SC 12μg hIL-15 のICFA溶液
020899 SC 12μg hIL-15-KLH のICFA溶液
070999 SC 12μg hIL-15-KLH のICFA溶液
280999 SC 12μg hIL-15-KLH のCFA溶液
111099 IV 30μg hIL-15 のPBS溶液
121099 IV 30μg hIL-15 のPBS溶液
151099 このマウスのリンパ節及び脾細胞のSP2/0との融合
201099 IP 25μg hIL-15-KLHのCFA (ディフコ社、ロット番号121024LA)
031199 IP 12.5μg hIL-15、12.5μg hIL-15-KLH、25μgのICFA溶液 (ディフコ 社、ロット番号121195LA)
101199 IV 12.5μg hIL-15、12.5μg hIL-15-KLH
121199 IV 12.5μg hIL-15、 12.5μg hIL-15-KLH
191199 このマウスのリンパ節及び脾細胞のSP2/0との融合
融合相手の培地(FPM):
イスコーブの改変ダルベッコ培地に、100 IU/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、0.5 mM β-メルカプトエタノール(スコットランド、ペーズリー、ライフ・テクノロジーズ社)及び10% 熱不活化ウシ胎児血清(米国ユタ州、ハイクローン社)を添加した。
30 ml オリゲン・ハイブリドーマ・クローニング・ファクター(米国メリーランド州、ガイザーズバーグ、アイジェン社)、HAT (1バイアル、メーカの推奨濃度、米国ミズーリ州セントルイス、シグマ・ケミカル社)及び0.5 mg/ml カナマイシン(スコットランド、ペーズリー、ライフ・テクノロジーズ社)を添加したFPM。
20 ml オリゲン・ハイブリドーマ・クローニング・ファクター(米国メリーランド州、ガイザーズバーグ、アイジェン社)、HAT (1バイアル、メーカの推奨濃度、米国ミズーリ州セントルイス、シグマ・ケミカル社)及び0.5 mg/ml カナマイシン(スコットランド、ペーズリー、ライフ・テクノロジーズ社)を添加した培地。
ハイブリドーマを得るために、脾臓、鼠径及び大動脈周囲リンパ節をマウスから摘出した。脾臓及びリンパ節細胞の単個細胞懸濁液をSP2/0骨髄腫細胞に細胞比1:2で混合した。細胞を遠心分離で沈降させ、そのペレットを37℃の 1 ml ポリエチレングリコール (PBSによる50% w/v溶液、英国アーヴィン、シグマ−アルドリッチ社)中に静かに再懸濁させた。細胞を60秒間、渦流させた後、25 ml FPM-2 を加え、細胞を37℃で30乃至60分間、インキュベートした。インキュベート後、細胞を96ウェル・プレートでFSMに入れて1ウェル当たり(100μl中)0,75×105細胞 の細胞密度で培養した。3日後、100μl FSM を各ウェルに加えた。
融合後7日目乃至11日目の間にウェルをヒト抗体の存在について以下のELISAを用いてスクリーニングした:
ヒトIgG抗体の存在を検出するELISAを行うために、100μl/ウェルの0.9μg/ml ウサギ-α-k-軽鎖抗体 (デンマーク、グロストラップ、ダコ社)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れてNunc Maxisorp ELISA-プレートに加えた(インキュベーションは室温で一晩)。 ニワトリ血清(2%;スコットランド、ペーズリー、ライフ・テクノロジーズ社)及びTween-20 (0.05 %;PBSTC)を添加したPBSでこのプレートを遮断後、培養上清を加えた。1.5時間のインキュベート後、プレートを洗浄し、PBSTCで希釈した0.5μg/mlの西洋わさびペルオキシダーゼ(デンマーク、グロストラップ、ダコ社)に結合させたウサギ-α-ヒトIgG (Fab2-フラグメント) を加えた。1時間のインキュベート後、ウェルを洗浄し、基質であるABTS (2,2'-アジノビス-3-エチルベンズチアゾリン-スルホン酸、ドイツ、マンハイム、ロシュ・ダイアグノスティックス社)をメーカのプロトコル通りに加え、抗体結合を405nmで、EL808 ELISAリーダ(米国ヴァーモント州、ウィヌースキ、バイオ−テック・インスツルメンツ社)で評価した。
ヒトIgG/k抗体を含有するウェルを、さらにヒト抗IL-15抗体の存在について、IL-15特異的ELISAで検査した。このELISAを行うために、100μl/ウェルの1μg/ml IL-15 をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れてNunc Maxisorp ELISAプレート(室温で一晩、インキュベート)に加えた。ニワトリ血清(2%;スコットランド、ペーズリー、ライフ・テクノロジーズ社)及びTween-20 (0.05 %;PBSTC)を添加したPBSでこのプレートを遮断後、培養上清を加えた。1.5時間のインキュベート後、プレートを洗浄し、PBSTCで1/5000に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ(米国ペンシルヴァニア州、ウェスト・グローブ、ジャクソン・イムノ・リサーチ社)に結合させたα-ヒトIgG Fc を加えた。1時間のインキュベート後、ウェルを洗浄し、基質であるABTS (2,2'-アジノビス-3-エチルベンズチアゾリン−スルホン酸、ドイツ、マンハイム、ロシュ・ダイアグノスティックス社)をメーカのプロトコル通りに加え、抗体結合を405nmで、EL808 ELISAリーダ(米国ヴァーモント州、ウィヌースキ、バイオ−テック・インスツルメンツ社)で評価した。
安定な抗IL-15細胞株を得るために、前記ハイブリドーマを細胞の(0.5細胞/ウェルまでの)限界希釈により、96ウェル・プレートでサブクローンした。
アイソタイプELISAを行うために、100μl/ウェルの1μg/ml 抗ヒトFc(ジャクソン・イムノ・リサーチ社)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れてNunc Maxisorp ELISAプレート(室温で一晩、インキュベート)に加えた。ニワトリ血清(2%;スコットランド、ペーズリー、ライフ・テクノロジーズ社)及びTween-20 (0.05 %;PBSTC)を添加したPBSでこのプレートを遮断後、培養上清を加えた。1.5時間のインキュベート後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ(ランド、プラーツ、ザイメッド社)に結合させたマウス-α-HuIgG1又は、西洋わさびペルオキシダーゼ(ザイメッド社)に結合させたマウス-α-HuIgG3を加えた。1時間のインキュベート後、ウェルを洗浄し、基質であるABTS (2,2'-アジノビス-3-エチルベンズチアゾリン−スルホン酸、ドイツ、マンハイム、ロシュ・ダイアグノスティックス社)をメーカのプロトコル通りに加えた。抗体結合を405nmで、EL808 ELISAリーダ(米国ヴァーモント州、ウィヌースキ、バイオ−テック・インスツルメンツ社)で評価した。
治療的に機能し、そしてIL-15誘導性炎症誘発作用を阻害するためには、IL-15特異抗体は、IL-15受容体のIL-2Rβ鎖及び/又はγ鎖との相互作用に関与するIL-15エピトープを認識する必要がある。
このELISAを行うために、100μlの1μg/ml IL-15 又はhIL-15 変異型タンパク質のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をNunc Maxisorp ELISAプレートに加えて被覆した。ニワトリ血清(2%;スコットランド、ペーズリー、ライフ・テクノロジーズ社)及びTween-20 (0.05 %;PBSTC)を添加したPBSでこのプレートを遮断後、hIL-15特異抗体の連続希釈液をインキュベートした。洗浄後、PBSTCで1/5000に希釈したペルオキシダーゼ(米国ペンシルヴァニア州、ウェスト・グローブ、ジャクソン・イムノ・リサーチ社)に結合させたα-ヒトIgG Fcを加えた。洗浄後、基質であるABTS (2,2'-アジノビス-3-エチルベンズチアゾリン−スルホン酸、ドイツ、マンハイム、ロシュ・ダイアグノスティックス社)をメーカのプロトコルに従って加え、抗体結合を405 nmでEL808 ELISAリーダ(米国ヴァーモント州、ウィヌースキ、バイオ−テック・インスツルメンツ社)で評価した。
146B7の再編成のあるVH及びVLドメインのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を以下の手法を用いて決定した。これらの配列は、用いるVH及びVL生殖細胞系ファミリーに関する情報を提供する; これらの生殖細胞配列中の点変異は、動物の免疫処置の際のB細胞の親和性成熟が原因である。
総RNAを5×106個の146B7ハイブリドーマ細胞から、RNAzol (英国プール、バイオジェネシス社)を用いてメーカのプロトコルに従って調製した。
146B7由来のRNAのcDNAを、3μgの総RNAから、緩衝剤(ドイツ、マンハイム、ロシュ・ダイアグノスティックス社)、オリゴd(T)15(米国ウィスコンシン州、マジソン、プロメガ社)、dNTP (米国、ベーリンガー・マンハイム社)及びRNAsin (プロメガ社)を加えたAMVリバース・トランスクリプターゼを用いてメーカのプロトコルに従って調製した。
用いたプライマ対:
VH:
FR1 5' プライマ
(1) AB62 CAg gTK CAg CTg gTg CAg TC
(2) AB63 SAg gTg CAg CTg KTg gAg TC
(3) AB65 gAg gTg CAg CTg gTg CAg TC
VHリーダ5'プライマ
(4) AB85 ATg gAC Tgg ACC Tgg AgC ATC
(5) AB86 ATg gAA TTg ggg CTg AgC Tg
(6) AB87 ATg gAg TTT ggR CTg AgC Tg
(7) AB88 ATg AAA CAC CTg Tgg TTC TTC
(8) AB89 ATg ggg TCA ACC gCC ATC CT
VH3'プライマ
(9) AB90 TgC CAg ggg gAA gAC CgA Tgg
VK:
FR1 5'プライマ
(1) AB8 RAC ATC CAg ATg AYC CAg TC
(2) AB9 gYC ATC YRg ATg ACC CAg TC
(3) AB10 gAT ATT gTg ATg ACC CAg AC
(4) AB11 gAA ATT gTg TTg ACR CAg TC
(5) AB12 gAA ATW gTR ATg ACA CAg TC
(6) AB13 gAT gTT gTg ATg ACA CAG TC
(7) AB14 gAA ATT gTg CTg ACT CAg TC
VKリーダ5'プライマ:
(8) AB123 CCC gCT Cag CTC CTg ggg CTC CTg
(9) AB124 CCC TgC TCA gCT CCT ggg gCT gC
(10) AB125 CCC AgC gCA gCT TCT CTT CCT CCT gC
(11) AB126 ATg gAA CCA Tgg AAg CCC CAg CAC AgC
VK3'プライマ
(12) AB16 Cgg gAA gAT gAA gAC AgA Tg
PCR反応を、AmpliTaq ポリメラーゼ(パーキン・エルマー社)をGeneAmp PCRシステム9700 (米国カリフォルニア州、フォスター・シティ、パーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ社)で用いて行った。
94° 2'
11サイクル94° 30"
1サイクル毎 65° 30"にマイナス 1°
72° 30"
30 サイクル94° 30"
55° 30"
72° 30"
72° 10"
4°まで冷却
アガロース・ゲルでPCR産物を解析後、この産物を S-400 もしくは S300マイクロスピン・カラム (米国ニュージャージー州ピスカタウェイ、アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社)か、又はQIAEX II ゲル・エクストラクション・キット(ドイツ、ヒルデン、キアゲン社)で精製した。各実験につき、各VH及びVL領域のうちで、FR1又はリーダ・プライマを用いて2つの個別に増幅されたPCR産物を、メーカのプロトコルに従ってpGEMT-ベクタ系(プロメガ社)でクローンした。
V領域は、pGEMTベクタ系Iでクローニングした後に配列決定された。T7及びSp6プライマ(ベルギー、リュイック、ユーロジェンテック社)を、配列決定キット:ABIプリズムBigDyeターミネータ・サイクル・シーケンシング・レディ・リアクション・キット(英国ウォリントン、アプライド・バイオシステムズ社)とプロトコルに従って組み合わせて用いた。反応をABI PRISM 377 シーケンサ(PEアプライド・バイオシステムズ社)で行わせ、配列をプログラムDNAStar, SeqmanIIで解析した。次にこの配列を生殖細胞V遺伝子配列にVBASE (www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/intro.htm)でアライメントした。
ハイブリドーマ146B7由来のVH及びVL領域をPCRで増幅し、pGEMTベクタ系Iでクローンして、そのcDNA配列を決定した。当該ヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を、それぞれ図2 (配列番号: 1 及び2) 及び図3(配列番号: 3 及び4)に示す。フレームワーク(FR)及び相補性決定領域(CDR)も示す。Vbaseでのアライメントに基づく146B7のVH領域の生殖細胞ファミリー:VH5-51 (VH5-サブグループ)、D2-15/D2 (DH-セグメント)、JH4b (JH-セグメント)。Vbaseでのアライメントに基づく146B7のVL領域の生殖細胞ファミリー: A27 (VKIII-サブグループ) 及びJK2 (JK-セグメント)。VH及びVLドメインに関する更なる情報は、Kabatデータベース http://immuno.bme.nwu.edu/ 又はhttp://www.Vbase.comに見られる。
146B7の親和性を表面プラスモン共鳴(SPR)技術により、BIACORE 3000 装置を用いて解析して、以下の手法に従って生体分子タンパク質間相互作用を調べた。生体分子結合により起きる表面層上でのSPRシグナルの変化を検出し、表面層での質量密度の変化とする。親和性は以下の定義を用いて表現されている:ka=結合速度定数 (M-1sec-1);kd=解離速度定数(sec-1);KA=結合平衡定数=ka/kd(M-1);及びKD=解離平衡定数=kd/ka (M)。
結合速度定数ka: 1.07(±0.17)×105M-1 sec-1
解離速度定数kd: 6.56 (±0.09) ×10-3 sec-1
結合平衡定数KA: 1.55 (±0.21)×107 M-1
解離平衡定数KD: 6.59 (±0.88) ×10-8 M
結合速度定数ka: 7.30 (±0.81)×105M-1 sec-1
解離速度定数kd: 1.45 (±2.05) ×10-3 sec-1
結合平衡定数KA: 5.03 (±3.40) × 108 M-1
解離平衡定数KD: 1.55 (±1.24) ×10-9 M
完全ヒト抗IL-15抗体146B7、146H5、404E4及び404A8がIL-15誘導性TNF-α産生に及ぼす作用を、以下の手法を用い、健康なボランティアから採った末梢血由来単核細胞(PBMC)を用いて研究した。IL-15に対する特異性を評価するために、これらの抗体がIL-2媒介性TNF-α産生に及ぼす作用も調べた。
培養株は、2 mM L-グルタミン、100 IU/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン(すべてスコットランド、ペーズリー、ライフ・テクノロジーズ社から得た)及び10% 熱不活化ウシ胎児血清(米国ユタ州ハイクローン社)を加えたRPMI-1640中に維持された。
新鮮なヒト血液を健康なボランティアからインフォームド・コンセント後に採血し、ヘパリンを加えて凝固を防いだ。PBMCの精製をフィッコール(スウェーデン、ウプサラ、ファルマシア社)を用いた密度勾配遠心分離により行った。
HIL-15、ロット番号:6870-011、米国ワシントン州、シアトル、イムネックス社。 hIL-2、オランダ、アムステルダム、チロン・ベネルクス社。
用いた完全ヒト抗体:146B7 (バッチ:070101) 及び146B7RDJW07、404A8 (バッチ:030101) 及び404E4 (バッチ:080101) 、そしてアイソタイプ・コントロールとして抗体T1 (97-2B11-2B12、バッチ:190900)。
PBMCを三重又は四重にして96ウェルの平底プレートで、1ウェル当たり1.5×105個の細胞にして、hIL-2又はhIL-15の存在下もしくは非存在下、そして抗IL-15抗体を加えて、又は加えずに、培養した。 アイソタイプ・コントロール抗体(T1)を陰性コントロールとして含めた。コンカナバリンA(2.5μg/ml、カルビオケム社)を増殖に関する陽性コントロールとして加えた。細胞を72時間、37℃で5% のCO2下でインキュベートした。上清を採集して、ヒトTNF-αの量をELISA (オランダ、ユトレヒト、U-サイテック社)で定量した。
抗体146B7、146H5、404E4及び404A8を、それらのT細胞増殖阻害能について、CTLL-2細胞 (Gillis et al., 1978)及び末梢血単核細胞(PBMC) を用い、以下の手法を用いて検査した。
培養株は、2 mM L-グルタミン、100 IU/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン(スコットランド、ペーズリー、ライフ・テクノロジーズ社から得たもの)及び10% 熱不活化ウシ胎児血清(米国ユタ州、ハイクローン社)を加えたRPMI-1640中に維持された。CTLL-2細胞(Gillis et al., 1978) は、36 単位 hIL-2/ml (オランダ、アムステルダム、チロン・ベネルクス社)を添加した上述の培地中に維持し、3乃至4日間、hIL-2を枯渇させてから、実験を開始した。CTLL-2細胞は使用前に三回、洗浄した。
新鮮なヒト血液を健康なボランティアからインフォームド・コンセント後に採血し、ヘパリンを加えて凝固を防いだ。PBMCの精製をフィッコール(スウェーデン、ウプサラ、ファルマシア社)を用いた密度勾配遠心分離により行った。
HIL-15、ロット番号:6870-011、米国ワシントン州、シアトル、イムネックス社。 hIL-2、オランダ、アムステルダム、チロン・ベネルクス社。
図8に示すこの報告でCTLL-2検定に用いた抗IL-15抗体:146B7、146H5、404A8、404E4。
PBMC検定に用いた抗IL-15抗体:146B7 (バッチ:070101)、404A8 (バッチ:030101) 及び 404E4 (バッチ:080101)。
各実験において、細胞を三重にして96ウェルプレートに、hIL-2 又はhIL-15のいずれかの存在下又は非存在下で1ウェル当たり5×103個の細胞になるように接種した。増殖に対する作用を評価するために4種類の抗IL-15抗体のそれぞれを加えた。細胞を16時間、37℃で5% CO2下でインキュベートした。[3H]チミジン (1μCi/ウェル、英国バッキンガムシャイア、リトル・チャルフォント、アマーシャム・ライフ・サイエンセズ社)を加えてから4時間後に回収した(米国コネチカット州オレンジ、トムテック社、ハーベスター 96 Mach II M)。
PBMCを三重にして96ウェルのU型底プレート(Nunc、デンマーク、ナルジ・ナンク・インターナショナル社)で、1ウェル当たり5×104個の細胞にして、hIL-2もしくはhIL-15及び抗IL-15抗体の存在下又は非存在下で培養した。コンカナバリンA(2.5μg/ml、カルビオケム社)を増殖の陽性コントロールのために加えた。細胞を72時間、37℃で5% CO2下でインキュベートした。[3H]チミジン (1μCi/ウェル、英国バッキンガムシャイア、リトル・チャルフォント、アマーシャム・ライフ・サイエンセズ社)を加えてから16時間後に回収した(米国コネチカット州オレンジ、トムテック社、ハーベスター 96)。
テスト化合物
ヒトPBMCを、インフォームド・コンセント後に健康なボランティアから得た。
抗体 146B7 (バッチ番号 MDX015)、米国カリフォルニア州ミルピタス、メダレックス社。
N-ヒドロキシスクシンイミド-ビオチン(シグマ社)をまずDMSO (最終希釈液:100 mg/ml) で希釈し、次に0.1 M NaHCO3(最終希釈液:1 mg/ml、シグマ社)で希釈した。 抗体1mg当たり(1mlに希釈したもの)、600μlのビオチン溶液を加えた(暗、2時間、RT)。抗体−ビオチン溶液をスライド-a-ライザーTM透析カセット(オランダ、ペルビオ・サイエンス、ピアース社、10,000 MWCO)(4℃で一晩)で透析して未標識のビオチンを取り除いた。翌日、ビオチン化抗体の濃度を分光光度法(Ultrospec 2100pro)で280nmのODで判定した。
IL-15を誘導するために、健康なボランティアから静脈穿刺で血液を得た。PBMCを、ペニシリン(5 U/ml)、ストレプトマイシン(50μg/ml)、L-グルタミン (2mM) (バイオホイッテカー・ヨーロッパ社)及び10% ウシ胎児血清(オプティマム C241、マルチセル、ウィセント社)を添加したRPMI 1640 (バイオホイッテカー・ヨーロッパ社)で、最長2日間(37℃)で培養し、500 U/ml IFNγ(ベーリンガー・インゲルハイム社)で刺激した。
細胞を、ペニシリン(5 U/ml)、ストレプトマイシン(50μg/ml)、L-グルタミン(2mM) (バイオホイッテカー・ヨーロッパ社)及び10% ウシ胎児血清(オプチマム C241、マルチセル、ウィセント社)を添加したRPMI 1640 (バイオホイッテカー・ヨーロッパ社)中で、10%ヒトAB血清(オランダ、アムステルダム、CLB社)と一緒にプレインキュベートした。透過化(カリフォルニア州サンディエゴ、ベクトン・ディッキンソン社、Cytofix/CytopermTMキット中で20分間、4℃)及びPerm/WashTM(Cytofix/CytopermTMキット)緩衝液で洗浄した後、フローサイトメトリにより、PBMCにIL-15の染色を施した。この染色処置全般に渡って Perm/WashTM緩衝液 (Cytofix/CytopermTMキット) を用いることにより、継続的な透過性を保つことに成功した。これら細胞をビオチン化146B7又はビオチン化hIgG1 (20μg/ml、30分間、4℃) と一緒にインキュベートし、Perm/WashTM緩衝液で洗浄した後、細胞をストレプトアビジン-フィコエリトリン (ダコ社)と一緒に30分間(4℃)でインキュベートした。分析後に1試料当たり少なくとも5000個の細胞の蛍光強度をフローサイトメトリ (FACS Calibur、ベクトン・ディッキンソン社)で調べ、CellQuest Pro ソフトウェアを用いて単球の通門を調べた。データは以下:S.I.=(平均蛍光陽性染色)/(平均蛍光バックグラウンド染色)の通りに計算された刺激指数(S.I.)を示す。
ヒト単球に存在するIL-15を検出するために、サイトスピン・プレパラートを全血試料から作製した。 5×104個の細胞(200μl)を遠心してSuperfrost(R)-プラス顕微鏡用スライド(メンゼル社)上に沈降させた後、スライドを空気乾燥(<60分間)し、2%パラホルムアルデヒド/PBS(8分間、4℃)で固定し、PBSで洗浄し、再び空気乾燥した。染色前にサイトスピン・プレパラートをPBS (+0.1% サポニン;PBSS)で透過化し、これをその後染色処置全般に用いた。内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害するために、サイトスピン・プレパラートを、クエン酸/リン酸緩衝液(pH5.8、20分間、RT)で希釈した0.05% (v/v) 過酸化水素(H2O2)と一緒にインキュベートした。PBSSで洗浄後、内因性ビオチン活性をメーカの指示 (ビオチン・ブロッキング・キット、ダコ社、ベクタ・ラブズ)に従って阻害した。PBSSで洗浄後、このサイトスピン・プレパラートを、PBSSに溶かした10% (v/v)ヒトプールAB血清(オランダ、アムステルダム、CLB社)と一緒にインキュベートする(30分間)ことで非特異的結合部位を遮断した。その後、サイトスピン・プレパラートをビオチン化一次抗体(60分間、RT)と一緒にインキュベートし、PBSSで洗浄した後に、ビオチン化西洋わさびペルオキシダーゼ(streptABComplex/HRP、ダコ社;2% ヒトAB血清を含有するPBSSによる1:100溶液;30分間、RT)と複合体形成させたストレプトアビジンと一緒にインキュベートした。PBSSで洗浄した後、サイトスピン・プレパラートを、3-アミノ-9-エチルカルバゾール (0.5 mg/ml)及びH2O2(0.01%)の酢酸ナトリウム緩衝液 (50 mM、pH 4.9)溶液と一緒に10分間(RT)、インキュベートして、HRP活性の検出に向けた。サイトスピンを水道水で5分間、洗浄し、ヘマトキシリン(ダコ社)で1分間、対比染色し、水道水でさらに5分間、洗浄し、ファラマウント又はグリセルゲル(ダコ社)中に包埋した。
IFNγで刺激したヒト単球への146B7の結合を図12に示す。ビオチン化146B7は未刺激の単球に結合することから、未刺激の細胞にIL-15が存在することが分かる。単球をIFNγで刺激すると、146B7のこれら細胞への結合が増し、培養一日目で最大に達する。コントロール抗体であるhIgG1は未刺激の単球への結合をほとんど示さない。IFNγで刺激すると、単球上の Fcγ受容体の発現が増加することで、hIgG1の結合が増す。
図13は、146B7又はコントロール抗体hIgG1によるヒト単球の染色を示す。細胞質の明確な赤い染色が、細胞を146B7と一緒にインキュベートした後では観察されるが、コントロール抗体とインキュベートした後では観察されない。従って、146B7は単球中のhIL-15に結合し、この結合はIFNγでの刺激後に上方調節される。図13ではさらに、IL-15の染色が主に細胞内で起きていることも示す。
テスト化合物
ヒト乾癬皮膚 − 組織試料をインフォームド・コンセント後に得た。デンマーク、コペンハーゲン、ゲントフテ大学病院皮膚科、ルイース・ヴィラーゼン。
抗体146B7 (バッチ番号.MDX015)、米国カリフォルニア州、ミルピタス、メダレックス社。
N-ヒドロキシスクシンイミド-ビオチン(シグマ社)をまずDMSO (最終希釈液:100 mg/ml) で希釈し、次に0.1 M NaHCO3(最終希釈液:1 mg/ml、シグマ社)で希釈した。 抗体1mg当たり(1mlに希釈したもの)、600μlのビオチン溶液を加えた(暗、2時間、RT)。抗体−ビオチン溶液をスライド-a-ライザーTM透析カセット(オランダ、ペルビオ・サイエンス、ピアース社、10,000 MWCO)(4℃で一晩)で透析して未標識のビオチンを取り除いた。翌日、ビオチン化抗体の濃度を分光光度法(Ultrospec 2100pro)で280nmのODで判定した。
検定まで組織を−80℃で保存した。解凍後、組織切片をアセトン中に固定し(10分間、RT)、空気乾燥した。内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害するために、クエン酸/リン酸緩衝液(pH5.8、20分間、RT)で希釈した0.05%(v/v)過酸化水素(H2O2)と一緒に切片をインキュベートした。PBS-Tween 20 (PBST、0.05% v/v)で洗浄後、内因性ビオチン活性をメーカの指示 (ビオチン・ブロッキング・キット、ダコ社、ベクター・ラブ)に従って阻害した。PBSTで洗浄後、PBSTに溶かした10%(v/v)ヒトプールAB血清(オランダ、アムステルダム、CLB社)と一緒に組織切片をインキュベート(30分間)することで、非特異的結合部位を遮断した。血清を吸い取り、次に切片を、2%ヒトAB血清を含有するPBSで希釈したビオチン化一次抗体(146B7又はhIgG1)と一緒に60分間(RT)、インキュベートした。切片をPBSTで洗浄した。PBSTで洗浄した後、すべての組織切片を、streptABComplex/HRP (ダコ社;2%ヒトAB血清を含有するPBSで 1:100に希釈したもの;30分間、RT)と一緒にインキュベートした。PBSTで洗浄した後、酢酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH4.9)に溶かした3-アミノ-9-エチルカルバゾール (0.5 mg/ml) 及びH2O2(0.01%)と一緒に切片を10分間(RT)、インキュベートして、HRP活性の検出に向けた。切片を水道水で5分間、洗浄し、ヘマトキシリン(ダコ社)で1分間、対比染色し、水道水でさらに5分間、洗浄し、最後にファラマウント又はグリセルゲル(ダコ社)中に包埋した。
明確な細胞質の染色が、乾癬皮膚のケラチノサイトに、146B7による組織切片染色後に観察されたが、コントロール抗体による染色では観察されなかった(図14;146B7は、乾癬プラークから得られたIL-15陽性ケラチノサイトを染色する)。
テスト化合物
滑膜組織 − 若年性リウマチ性関節炎患者から、インフォームド・コンセント後に得た;米国オハイオ州、シンシナティ、チルドレンズ・ホスピタル・メディカル・センター、小児リウマチ科アレクセイ・グロム。
角膜切開刀生検 − 組織試料をインフォームド・コンセント後に得た。デンマーク、コペンハーゲン、ゲントフテ大学病院皮膚科、ルイース・ヴィラーゼン。
抗体146B7 (バッチ番号。MDX015)、乾癬実験用に米国カリフォルニア州ミルピタス、メダレックス社から。
抗体146B7 (バッチ番号。15-00RDJW07)、リウマチ性関節炎実験用に米国カリフォルニア州ミルピタス、メダレックス社から。
新鮮な滑膜組織試料を、若年性リウマチ性関節炎患者から関節置換手術後に得た。試料を無菌状態で採集した。全滑膜組織試料から採った刻んだ組織断片を完全に混合して各プレパラートが確実に均質になるようにした。刻んだ試料(動物1匹当たり2乃至4移植片;一箇所当たり100mg)をSCID/NODマウス(ジャクソン・ラボラトリーズ)の背面に皮下的に植え付けた。移植片の移植日、及び移植後7日目、14日目、及び21日目に各動物に146B7 (500μg、i.p.) 又はPBS を投与した。移植後28日目に動物をと殺した。滑膜移植片を切除し、H&E染色に向けてホルマリン上に配置した。
SCIDマウス−ヒト滑膜組織キメラから得た切片のデジタル画像(2600×2060、jpg)を10倍対物レンズ(ツァイス顕微鏡;アキシオビジョン・ソフトウェア)を用いて得た後、Photoshop バージョン6.0 (カリフォルニア州マウンテンビュー、Adobe システムズ社)を用いてデータをコンピュータ解析し、1300×1300ピクセルに縮小した。各切片内で6つの10倍野を選び出し、スライド全体の上の組織の染色全体が最良に反映されるようにした。着色した核を全部選抜した後(許容差10で暗色の核を魔法の杖で)、所定の面積の光学密度表を作製し、平均染色強度を記録した(同様な/画像ヒストグラムコマンドの選択の後)。次にバックグラウンドを選択し、染色を定量した(許容差10でバックグランド上に魔法の杖)。核染色及びバックグラウンド染色間の差として、染色強度を計算した。これを任意の単位を持つ細胞化学的指数として指定した。データは平均及びs.e.m.として示されている。データをスチューデントのt検定で解析した。
角膜切開刀生検を二人の患者の乾癬プラークから得、分割し、C.B-17 SCID (ジャクソン・ラボラトリーズ) マウスに移植した。移植後3週間目にマウスにPBS (プラセボ)、CsA (シクロスポリンA)(サンドス社)を15日間の間1日置きに10mg/kgの用量、又は、146B7を1日目に20mg/kg、そして8日目及び15日目に10 mg/kgの用量、投与した。最後の注射から1週間後にマウスをと殺し、4mmの穿孔生検を各異種移植片から採取した。パラフィン包埋用に生検をホルマリンに固定し、H&EでKi-67 核内抗原について染色した。
H&E染色切片を表皮の厚さ(μm)、 錯角化症の等級(0から3までの等級)、及び上側真皮の炎症性単核細胞の数、について評価した。Ki-67について染色した切片を、1mm2切片当たりのサイクリング(原語:cycling)ケラチノサイト数について評価した。各処理群中の4匹のマウスの平均値を計算し、各患者から採ったデータを平均及びs.e.m.として要約した。
切片の顕微鏡観察から、最も濃く染色された核は浸潤細胞のものであることが分かった。従って、(相対的表面積で測定したときの)核の数を、浸潤の測定値とみなしている。146B7を注射すると、炎症性滑膜組織への浸潤細胞の数が、賦形剤処理に比較して減少する(図15a、p<0.05)。図15bは、異種移植された滑膜組織への細胞浸潤に対する146B7の作用を示し、賦形剤処理に比較したときの、暗色の核を持つ細胞数の減少を示す。
図16は、146B7又はコントロール処理で処理したSCID/乾癬マウスを示す。賦形剤PBSに比較して、146B7を注射すると、角質層からリート・ペグ(原語:rete pegs)の始まりにかけて測定された表皮厚さで評価したときの乾癬の重篤度が低下した(図16A)): PBS (177.8±42.2μm)、CsA (91.0±15.2μm)、146B7 (62.5±9.1μm)。厚さの減少はさらに、角質層からリート・ペグの最深部までを測定した場合にも観察された(図16B):PBS (433.8±32.1μm)、CsA (303.8±62.9μm)及び146B7 (208.0±33.8μm)。さらに、錯角化症の等級が146B7処理により低下した(図16C):PBS (1.6±0.4)、CsA (1.3±0.3)、146B7 (0.5±0.3)。その上、146B7は上側真皮中の炎症性単核細胞の数を減少させる(図16D):PBS (33.3±1.9 単核細胞)、CsA (19.4±8.5)、146B7 (16.4±0.1)。ヒトKi-67タンパク質の発現は細胞増殖と深い関係がある。***間期においてこの抗原を核内でのみ、検出することができるが、他方、有糸***時にはこのタンパク質の大半が染色体表面上に移動する。Ki-67タンパク質は細胞周期のすべての活動期 (G(1)、S、G(2)、及び有糸***)で存在するが、休止期 (G(0))では存在しないという事実から、これを、ある任意の細胞集団のうちのいわゆる成長群を判定する優れたマーカとすることができる。146B7はKi-67+サイクリング(原語:cycling)ケラチノサイトの数を減少させる(図16E):PBS (247.9±77.0)、CsA (116.0±24.1)、146B7 (73.8±9.9)。
テスト化合物
hIgG1 - ヒトコントロール抗体(シグマ社)。
抗体146B7 メダレックス社、MDX015。
IL-15Rαを構成的に発現するRaji細胞(英国サザンプトン、サザンプトン・ゼネラル病院、テノバス・リサーチ・ラボラトリー、マーティン・グレニー)。
N-ヒドロキシスクシンイミド-ビオチン(シグマ社)をまずDMSO (最終希釈液:100 mg/ml) で希釈し、次に0.1 M NaHCO3(最終希釈液:1 mg/ml、シグマ社)で希釈した。 抗体1mg当たり(1mlに希釈したもの)、600μlのビオチン溶液を加えた(暗、2時間、RT)。抗体−ビオチン溶液をスライド-a-ライザーTM透析カセット(オランダ、ペルビオ・サイエンス、ピアース社、10,000 MWCO)(4℃で一晩)で透析して未標識のビオチンを取り除いた。翌日、ビオチン化抗体の濃度を分光光度法(Ultrospec 2100pro)で280nmのODで判定した。
平底マイクロタイタ・プレート(グライナー社)をIL-15Rα(米国ミネソタ州、ミネアポリス、R&Dシステムズ社)で被覆(室温で一晩)した後、プレートをPBS及びニワトリ血清(2%、RT、60分間)と一緒にインキュベートした。PBS (+0.05% Tween 20:PBST)で洗浄後、プレートを、未標識のIL-15 (50μl、RT、米国シアトル、イムネックス社)のいくつかの希釈液と一緒にインキュベートした。10分後、ビオチン化抗体を様々な濃度になるようにウェル(50μl)に加えた(室温で90分間)。PBSTで洗浄した後、プレートを、PBST-C (PBST 及び2% ニワトリ血清)に1:10,000になるように希釈したストレプトアビジン-ポリ-西洋わさびペルオキシダーゼ (オランダ、アムステルダム、CLB社)と一緒にインキュベート(室温で60分間)した。最後に、プレートを洗浄し、次に、メーカのプロトコルに従って、ABTS緩衝液にしたABTS (アジノビス-3-エチルベンズチアゾリン−スルホン酸、ドイツ、マンハイム、ロシュ・ダイアグノスティックス社)と一緒にインキュベートした。呈色反応を2% シュウ酸(50μl)で停止させた。結合を 405 nmでEL808 ELISA-リーダ (米国ヴァーモント州、ウィヌースキ、バイオ-テック・インスツルメンツ社)で評価した。
Raji細胞を、10% ヒトプールAB血清(オランダ、アムステルダム、CLB社)のFACS 緩衝液 (PBS、0.05%BSA、0.02% NaNO3)溶液と一緒にプレインキュベートした(4℃で20分間)。Raji 細胞(1-2*105細胞/ml)をウェル内に入れ、50μlの未標識のIL-15 を数種類の濃度で加えた (10% ヒトAB血清を加えたFACS緩衝液に希釈して)。この細胞を30分間(4℃)インキュベートし、FACS緩衝液で2回、洗浄した後、50μlのビオチン化抗体 (146B7 又は hIgG1)をウェルに加えた(4℃で30分間)。FACS緩衝液で2回、洗浄した後、50μlのストレプトアビジン-フィコエリトリンを各ウェルに加えた(4℃で30分間)。 FACS 緩衝液で2回、洗浄した後、細胞を200μlのFACS緩衝液中に取り出し、1試料当たり少なくとも5000個の細胞の蛍光強度を、CellQuestソフトウェアを用いたフローサイトメトリ(FACS Calibur、ベクトン・ディッキンソン社)による分析後に判定した。データは、以下の通り:
S.I. = (平均蛍光陽性染色)/(平均蛍光バックグラウンド染色)
に計算された刺激指数(S.I.)を示す。
ELISAにおける146B7のIL-15/IL-15R 複合体への結合を図19に示す。146B7の結合は、その受容体に結合しているIL-15の濃度が増すにつれ、高まる。コントロール抗体のIL-15又はIL-15Rへの結合の作用は何ら、観察されなかった。
Raji細胞上のIL-15/IL-15R複合体への146B7結合を図20に示す。146B7はIL-15/IL-15R 複合体に用量依存的に結合する。Raji細胞上のIL-15/IL-15R複合体へのhIgG1の結合は何ら、観察されなかった(図20)。
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当業者であれば、日常的な実験によって、ここに解説した本発明の具体的な実施態様の均等物を数多く、認識し、又は確認できることであろう。このような均等物は以下の請求の範囲の包含するところと、意図されている。従属請求項に開示した実施例のいかなる組合せも、本発明の範囲内にあると考えられる。
ここで引用する全公開文献、特許及び係属中の特許出願の全文を、引用をもってここに援用することとする。
Claims (28)
- それぞれSEQ ID NO.2及びSEQ ID NO.4に示すアミノ酸配列を含むヒト重鎖及びヒト軽鎖可変領域を含む、IL−15に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
- それぞれSEQ ID NO.1及びSEQ ID NO.3に示すヌクレオチド配列をそれらの可変領域に含む核酸にコードされた、IL−15に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
- IL−15誘導性炎症誘発効果を阻害する、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- IL−15誘導性TNFα産生又はT細胞増殖を阻害する、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- 組換えヒトIL−15を分析物とし、そして前記抗体をリガンドとして用いた表面プラズモン共鳴(SPR)技術により判定したときに10−7未満の解離平衡定数(KD)でヒトIL−15に結合する、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- ヒトIL−15のβ鎖又はγ鎖相互作用ドメイン上に位置するエピトープに結合する、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- 受容体結合型ヒトIL−15に結合する、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- 前記抗体がIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、及びIgE抗体から成る群より選択される、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- 前記抗体がIgG1抗体である、請求項8に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- IgG1重鎖由来の可変領域と、カッパ軽鎖由来の可変領域とを含む、請求項7に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- Fabフラグメント又は一本鎖抗体である、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物から得られたB細胞を不死化細胞に融合させて含むハイブリドーマにより産生される、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物から得られたB細胞を不死化細胞に融合させて含むハイブリドーマであって、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合部分を産生する、ハイブリドーマ。
- ヒト重鎖及びヒト軽鎖をコードする核酸を含むトランスフェクトーマにより産生される、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- 請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
- 治療薬を更に含む、請求項15に記載の組成物。
- 免疫抑制剤を更に含む、請求項16に記載の組成物。
- 前記免疫抑制剤がシクロスポリンである、請求項17に記載の組成物。
- 前記治療薬がステロイド系抗炎症剤及び非ステロイド系抗炎症剤からなる群より選択される抗炎症剤である、請求項16に記載の組成物。
- 前記治療薬がメトトレキセート、エタネルセプト及びインフリキシマブから成る群より選択される疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)である、請求項16に記載の組成物。
- 前記薬剤がドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、カルムスチン、シクロホスファミド、及びクロラムブシルから成る群より選択される化学療法薬である、請求項16に記載の組成物。
- 前記治療薬が、乾癬を治療するための薬剤である、請求項16に記載の組成物。
- 前記治療薬が抗体又は腫瘍壊死因子−α(TNF−α)阻害剤である、請求項16に記載の組成物。
- 前記抗体がCD4特異抗体及びIL−2特異抗体から成る群より選択される、請求項23に記載の組成物。
- 前記治療薬が抗体である、請求項16に記載の組成物。
- 請求項1又は2に記載のIL−15に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を有効成分とするIL−15媒介性障害治療剤。
- 前記IL−15媒介性障害が、乾癬、関節炎、炎症性腸疾患、癌、移植片拒絶及び感染性疾患から成る群より選択される、請求項26に記載のIL−15媒介性障害治療剤。
- 請求項1又は2に記載のIL−15に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を有効成分とするIL−15媒介性障害の診断薬。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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