KR101329843B1 - Ｃｄ25에 대한 인간 모노클로날 항체 - Google Patents

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폴 파렌
얀 지 제이 반 데 윈켈
데니스 레아 윌리암스
요르겐 페터센
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Abstract

인간 CD25에 결합하고 그를 저해하는 분리된 인간 모노클로날 항체, 및 관련 항체-기초 조성물 및 분자가 개시되어 있다. 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 이소타입 스위칭을 수행함으로써 다양한 이소타입의 인간 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마, 트랜스펙토마, 또는 비인간 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 마우스에 의해 생산될 수 있다. 인간 항체를 포함하는 제약 조성물, 인간 항체를 생산하는 비인간 형질전환 동물, 하이브리도마 및 트랜스펙토마, 및 인간 항체를 사용하는 치료 및 진단방법도 개시되어 있다.

Description

ＣＤ25에 대한 인간 모노클로날 항체{HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST CD25}
관련 출원
본 출원은 2002년 11월 15일 출원된 미국 가출원번호 제60/426,690호의 이익을 주장하며, 이로써 그 전체 내용이 참조로서 도입된다.
고친화도 인터류킨-2 수용체(IL-2R)는 α, β 및 γc -폴리펩티드 쇄로 구성된 헤테로트라이머성 세포 표면 수용체이다(KD 10-11 M). IL-2Rα, CD25, p55, 및 Tac(T 세포 활성화) 항원으로도 알려져 있는 55 kDa α-쇄는 IL-2R에 독특한 것이다. β(CD122; P75) 및 γc(CD132) 쇄는 사이토카인 수용체 슈퍼패밀리(헤마토포이에틴 수용체)의 일부이고, IL-15R과 같은 다른 사이토카인 수용체의 기능적 구성원이다(Waldmann(1993) Immunol . Today 14(6): 264-70; Ellery 등(2002) Cytokine Growth Factor Rev . 13(1): 27-40). 저친화도 수용체가 신호전달 능력이 없는 모노머성 α-서브유닛으로 이루어지는 반면(KD 10-8 M), 중간 친화도 수용체는 β- 및 γc-쇄로 구성된 다이머이다(KD 10-9 M)(Waldmann(1993) Immunol . Today 14(6): 264-70).
휴지 상태의 T 세포, B 세포 및 단핵구는 CD25 분자를 거의 발현하지 않는다. 그러나, 수용체는 활성화 시 신속하게 전사되고 발현된다(Ellery 등(2002) Cytokine Growth Factor Rev . 13(1): 27-40; Morris 등(2000) Ann . Rheum . Dis . 59(Suppl. 1): il09-14). 고친화도 IL-2R을 발현하는 세포는 CD25(CD25-서브유닛)를 과량으로 발현하여 고친화도 및 저친화도 IL-2 결합 프로파일 모두에 이르게 한다(Waldmann 등(1993) Blood 82(6): 1701-12; de Jong 등(1996) J. Immunol . 156(4): 1339-48). CD25는 류마티스성 관절염, 경피증 및 포도막염과 같은 일부 자가면역 질환, 및 피부 질환, 예를 들어 건선과 아토피성 피부염, 및 다양한 림프 신생물, 예를 들어 T 세포 백혈병, 및 호지킨병에서 T 세포에 의해 고도로 발현된다(Waldmann(1993) Immunol . Today 14(6): 264-70; Kuttler 등(1999) J. Mol . Med . 77(1): 226-9). 또한, CD25 발현은 동종이식편 거부 및 이식편-대-숙주 반응과 연관되어 있다(Jones 등(2002) J. Immunol . 168(3): 1123-1130; Anasetti 등(1994) Blood 84(4): 1320-7).
따라서, CD25는 예를 들어 자가면역 질환에서 염증을 감소시키고, 종양을 치료하며, 이식 거부를 예방하기 위한 항체-매개된 요법을 위한 중요한 표적이 된다. 그러나, 지금까지 얻은 결과와 임상 경험이 CD25를 면역요법을 위한 유용한 표적으로 명확히 확립시킨 반면, 이들은 또한 현재 이용가능한 쥐와 키메라 항체가 이상적인 치료제를 구성하지 않음을 보여준다. 따라서, CD25를 발현하는 세포가 관여하는 범위의 질환을 예방하고(하거나) 치료하는데 효과적인 CD25에 대한 추가의 치료 항체에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 특히 동종이식편 및 이종이식편 거부를 포함하는 기관, 조직 및 세포 이식 거부, 이식편-대-숙주 질환, 자가면역 질환, 염증성 및 과증식성 피부 장애, 및 림프 신생물을 포함하는, CD25를 발현하는 세포가 관련된 질환을 치료 및(또는) 예방하기 위한 새로운 항체 치료제를 제공한다. 본 발명에 포함되는 항체는 그들이 완전히 인간성이고, 따라서 환자에서 잠재적으로 면역원성이 낮다는 점에서 향상된 것이다. 본 항체는 또한 그들의 우수한 기능적(예를 들어, 치료적) 성질에 기초하여 우수하다.
여기에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 인간 항체는 ELISA나 플로우 사이토메트리에 의해 시험될 때 CD25에 결합한다.
본 발명의 인간 항체는 리간드로서 재조합 인간 IL-2Rα 및 분석물로서 항체를 사용하여 바이아코어(BIAcore) 3000 장치에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술로 결정할 때 전형적으로 10-9 M 이하, 10-10 M 이하 또는 10-11 M, 또는 심지어 그 미만과 같은 약 10-8 M 이하의 해리 평형 상수(KD)로 CD25에 결합한다. 상기 항체는 전형적으로 관련 세포-표면 항원과 교차-반응하지 않으므로, 그들의 기능을 저해하지 않는다.
더욱이, 본 발명의 인간 항체는 CD25의 그의 리간드인 IL-2와의 상호작용을 저해(예를 들어, 차단)한다. 예를 들어, 결합은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 저해될 수 있다. CD25를 발현하고, 따라서 세포 기능을 본 발명의 인간 항체에 의해 저해할 수 있는 세포의 예들은 특히 T 세포, B 세포 및 단핵구를 포함한다. 예를 들어, 여기에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 인간 항체는 CD25에 대한 IL-2 결합을 저해한다. 상기 CD25에 대한 IL-2 결합의 저해는 동시에 IL-2 결합에 의해 유도되는 다양한 세포 기작을 저해한다. 여기에 또한 나타낸 바와 같이, 본 발명의 인간 항체는 항-CD3 항체-유도된 T 세포 증식을 용량-의존적 방식으로 저해할 수 있다. 여기에 또한 나타낸 바와 같이, 본 발명의 인간 항체는 혼합 림프구 반응(MLR)을 용량-의존적 방식으로 저해할 수 있다. 상기 실험들에서 증식의 저해는 ELISA에서 측정되는 세포괴 축적의 감소나 세포 DNA에서 BrdU 도입의 감소에 의해 모니터링될 수 있다.
본 발명의 인간 항체는 IgGl(예를 들어, IgGl,κ 및 IgGl,λ) 및 IgG4(예를 들어 IgG4,κ 및 IgG4,λ) 항체를 포함한다. 그러나, IgG2, IgG3, IgM, IgA1, IgA2, 분비성 IgA, IgD 및 IgE를 포함하는 다른 항체 이소타입 또한 본 발명에 의해 포함된다. 본 항체는 전체 항체, 또는 예를 들어 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, 단일쇄 Fv(scFv) 단편 또는 이중특이적 항체를 포함하는 항체의 항원-결합 단편일 수 있다. 더욱이, 항원-결합 단편은 (ⅰ) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합된 결합 도메인 폴리펩티드(중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역과 같은), (ⅱ) 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변영역, 및 (ⅲ) CH2 불변영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변영역을 포함하는, 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질을 포함한다. 상기 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질은 추가로 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 개시되어 있다. 본 발명의 특정 인간 항체들은 가변영역에 각각 서열번호 1, 5, 9 또는 13, 및 서열번호 3, 7, 11 또는 15에 기재된 뉴클레오티드 서열, 및 그들의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 중쇄 및 인간 카파 경쇄 핵산에 의해 코딩되는 AB1, AB7, AB11 및 AB12로 언급된 것들을 포함한다. 다른 구체예에서, 인간 항체는 각각 서열번호 2, 6, 10 또는 14, 및 서열번호 4, 8, 12 또는 16에 기재된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 중쇄 및 인간 카파 경쇄 가변영역을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 특정 인간 항체들은 인간 중쇄 및 경쇄 CDR1, 인간 중쇄 및 경쇄 CDR2, 및 인간 중쇄 및 경쇄 CDR3를 갖는 CDR(상보성 결정 부위)을 포함하고, 여기서
(a) 인간 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 도 1-10에 나타낸 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열(서열번호 17-19, 23-25, 29-31, 또는 35-37), 및 그의 보존적 서열 변형물로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고,
(b) 인간 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 도 1-10에 나타낸 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열(서열번호 20-22, 26-28, 32-34, 또는 38-40), 및 그의 보존적 서열 변형물로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 인간 항-CD25 항체는 아래 성질들 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다:
a) 인간 CD25에 대한 특이성;
b) 리간드로서 재조합 IL-2Rα 및 분석물로서 항체를 사용하여 바이아코어 3000 장치에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술로 결정할 때, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 또는 10-11 M 또는 심지어 그 미만과 같은 약 10-8 M 이하의 KD에 상응하는 CD25에 대한 결합 친화도;
c) T 세포를 내성화하는(tolerize) 능력;
d) CD25의 그의 리간드, IL-2와의 상호작용을 차단하는 능력;
e) CD25를 발현하는 T 세포를 제거하는 능력;
f) CD25를 발현하는 T 세포의 증식을 저해하는 능력;
g) 말초혈액 단핵 세포(PBMCs)의 항-CD3 항체-유도된 T 세포 증식을 저해하는 능력;
h) 혼합 림프구 반응(MLR)을 차단하는 능력; 및(또는)
i) T 세포 상에 발현된 CD25의 내재화(internalization).
여기에 사용된 용어 "내성화된"은, 이 항원으로 재공격 후 T 세포가 항원에 반응할 수 없음을 의미한다.
본 발명의 인간 항-CD25 항체는 유도체화되거나, 다른 결합 특이체와 결합되거나 공동-발현될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 이펙터 세포 상의 항원과 같은 다른 표적 항원에 대한 하나 이상의 결합 특이체에 결합된다.
따라서, 본 발명은 또한 인간 CD25, 및 CD3, CD4, IL-15R, 막 결합 또는 수용체 결합 및 TNF-α, 또는 막 결합 또는 수용체 결합된 IL-15와 같은 하나 이상의 상이한 표적 항원 모두에 결합하는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 인간 항-CD25 항체는 유도체화되거나, 다른 기능적 분자, 예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질(예를 들어, Fab 단편)에 결합되거나 공동-발현된다. 예를 들어, 항체는 다른 항체(예를 들어, 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 생산하도록), 세포독소, 세포성 리간드 또는 항원(예를 들어, 면역독소와 같은 면역콘쥬게이트를 생산하도록)과 같은 하나 이상의 다른 분자적 단위에 기능적으로 결합될 수 있다(예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 결합 또는 그 이외의 방법으로). 항체는 또한 다른 치료적 잔기, 예를 들어 방사성동위원소, 소분자 항암제, 항염증제 또는 면역억제제에 결합될 수 있다. 따라서, 본 발명은 모두 CD25-발현 세포에 결합하고 그 세포로 다른 분자를 표적화하는데 사용될 수 있는 매우 다양한 항체 콘쥬게이트, 이중특이적 및 다중특이적 분자, 및 융합 단백질을 포함한다.
본 발명의 인간 항체, 면역콘쥬게이트, 이중특이적 및 다중특이적 분자, 및 조성물은 CD25를 발현하는 세포를 저해, 살해 및(또는) 그의 활성 및(또는) 성장(예를 들어, 증식)을 조절하는 다양한 방법에 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 방법은 CD25를 발현하는 T 세포의 증식 저해를 포함한다. 다른 구체예에서, 방법은 이식편-대-숙주 반응, 예를 들어 MLR 저해를 포함한다. 또다른 구체예에서, 방법은 CD25를 발현하는 세포의 살해를 포함한다(예를 들어, 보체-매개된 용균에 의하거나 항체를 세포독소에 결합시켜). 세포는 바람직하게는, CD25를 발현하지 않지만 예를 들어 구조적으로 관련된 세포-표면 항원을 발현할 수 있는 세포를 살해하거나 그의 활성을 저해하지 않으면서(즉, 관련되어 있으나 기능적으로 구별되는 세포 표면 항원에 대한 교차-반응성 없이) 살해되거나 저해된다. 본 발명의 인간 항체를 사용하여 저해되거나 살해될 수 있는 CD25 발현 세포는 예를 들어, 활성화된 T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 간의 쿠퍼(Kuppfer) 세포, 및 CD25를 발현하는 피부의 랑게르한스 세포를 포함한다.
따라서, 본 발명의 인간 항체는 CD25를 발현하는 활성화된 세포가 병인에 능동적인 역할을 담당하는 다양한 질환 및 증상을 앓고 있는 환자에게 투여됨으로써, 상기 질환 및 증상의 치료 및(또는) 예방에 사용될 수 있다. 치료(예를 들어 경감) 또는 예방될 수 있는 예시적 질환은 심장, 폐, 결합된 심장-폐, 기관지, 신장, 간, 췌장, 식도, 장, 피부, 사지, 탯줄, 줄기세포, 섬 세포 이식 등과 같은 기관 또는 조직 이식을 받고 있거나 받은 환자의 동종이식편 및 이종 이식편 거부를 포함하는 이식 거부를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 따라서 본 발명의 항체는 동종이식편 및 이종이식편 거부에서 예방제로서 사용되거나, 급성 동종이식편 또는 이종이식편 거부 현상을 반전, 치료 또는 다르게는 경감하는데 사용될 수 있다.
치료될 수 있는 추가 질환은 이식편-대-숙주 질환, 예를 들어 혈액 수혈 이식편-대-숙주 질환 및 골수 이식편-대-숙주 질환; 염증성, 면역 또는 자가면역 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 1형 당뇨병, 인슐린-요구성 2형 당뇨병, 다중 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 중증근무력증, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 장염, 피부-다발성 근염, 스조그렌 (Sjoegren) 증후군, 거대세포 동맥염을 포함한 동맥염, 재생불량성 빈혈, 천식, 경피증 및 포도막염; 염증성 또는 과증식성 피부 장애, 예를 들어 플라크 건선을 포함하는 건선, 수장족저농포증(PPP), 침식성 편평 태선, 천포창 수포증, 표피 수포증, 접촉성 피부염 및 아토피성 피부염; 및 다양한 림프 신생물, 예를 들어 T 세포 백혈병, 호지킨병, 모세포(hairy cell) 백혈병, 또는 균상식육종을 포함하는 피부 T 세포 림프종, 및 세자리(Sezary's) 증후군을 포함한다.
치료될 수 있는 추가 질환은 위암, 식도암, 악성 흑색종, 결장직장암, 췌장암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 자궁경부암, 난소암, 및 신세포암과 같은, 침윤성 CD25+ 조절 T 세포의 저해가 이로운 악성종양;
성인 T 세포 백혈병/림프종, 역형성대세포림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), 말초 T 세포 림프종, 및 이차성 유전분증과 같은 혈액학적 장애;
괴저성 농피증, 환상 육아종, 알러지성 접촉피부염, 반흔성 유천포창 및 임신성 포진과 같은 피부 장애;
콜라겐성 결장염, 경화성 담관염, 만성 활동성 간염, 루포이드 간염, 자가면역 간염, 알콜성 간염, 만성 췌장염, 및 급성 췌장염과 같은 간-위장관 장애;
심근염 및 심낭염과 같은 심장 장애;
동맥경화증, 거대세포 동맥염/류마티스성 다발성 근육통, 다카야스(Takayasu) 동맥염, 결절성 다발동맥염, 가와사키(Kawasaki) 증후군, 베게너 육아종증, 현미경적 다발혈관염, 척-스트라우스(Churg-Strauss) 증후군, 백혈구파괴 맥관염 및 이차성 백혈구파괴 혈관염과 같은 혈관 장애;
급성 사구체신염, 만성 사구체신염, 미세변화 신염 및 굳패스쳐(Goodpasture's) 증후군과 같은 신장 장애;
폐포염, 폐쇄성 세기관지염, 규폐증 및 베릴륨증과 같은 폐 장애;
다중 경화증, 알츠하이머병, 증증근무력증, 만성 탈수초성 다발성 신경병증 및 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군을 포함한 다발성 신경근염과 같은 신경 장애;
재발성 다발연골염, 사르코이드증, 전신성 홍반성 낭창, CNS 루푸스, 원판상 루푸스, 루푸스 신염, 만성 피로 증후군 및 섬유근통과 같은 결합조직 장애;
그레이브스병, 하시모토(Hashimoto's) 갑상선염 및 아급성 갑상선염과 같은 내분비 장애; 및
열대 연축성 대칭부전마비와 같은 바이러스 감염이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 항체가 투여되는 대상은 면역억제제, 항-염증제, 화학요법제, 세포독성제, 또는 항체의 치료 효과를 증진시키는데 기여하는 다른 약제와 같은 하나 이상의 추가적인 치료제로 부가적으로 치료된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 샘플 또는 개체에서 CD25의 존재를 시험관내 또는 생체내에서 검출하기 위한, 예를 들어 CD25-관련 질환을 바람직하게는 초기에 진단하기 위한 방법을 제공한다. 이것은 또한 질환과 항-CD25 항체 치료의 효과를 모니터링하고, 투여되는 항체의 용량을 결정하고 조절하기 위해서도 유용할 수 있다. 일 구체예에서, 샘플 중 CD25 존재의 검출은, 항체와 CD25 간의 복합체 형성을 허용하는 조건 하에서 시험하고자 하는 샘플을(임의로 대조 샘플과 함께) 본 발명의 인간 모노클로날 항체와 접촉시킴으로써 달성된다. 그 후, 복합체 형성을 검출한다(예를 들어, ELISA, 플로우 사이토메트리 또는 웨스턴 블랏팅을 이용하여). 시험 샘플과 함께 대조 샘플을 사용할 때 복합체는 두 샘플 모두에서 검출되고, 복합체 형성에서 임의의 통계학적으로 유의한 차이가 시험 샘플에서 CD25의 존재의 지표가 된다. 생체내 방법은 PET(positron emission tomography) 또는 SPECT(single photon emission computed tomography)와 같은 영상화 기술을 이용하여 수행할 수 있다.
추가적 측면에서, 본 발명은 본 발명의 인간 모노클로날 항체에 결합하는 항-이디오타입 항체에 관한 것이다. 이들 항-이디오타입 항체는 실험실이나 환자 샘플에서 CD25에 대한 인간 모노클로날 항체를 검출하거나 그의 수준을 정량하기 위한 면역진단적 도구로 사용될 수 있다. 이것은 항-CD25 항체의 약동력학을 조사하거나, 항-CD25 항체의 용량을 결정하고 조절하고, 환자에서 질환과 치료 효과를 모니터링하는데 유용할 수 있다.
마우스 항-이디오타입 항체는 예를 들어 Balb/C 마우스를 본 발명에 따른 인간 모노클로날 항체로 면역화시키고, 표준 기술을 이용하여 NS1과 같은 골수종 세포와의 융합에 의해 이들 마우스의 지라로부터 하이브리도마를 생성함으로써 제조될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 CD25에 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 형질전환(transgenic) 마우스와 같은 형질전환 비인간 동물을 제공한다. 특정 구체예에서, 형질전환 비인간 동물은 본 발명의 항체의 모두 또는 일부를 코딩하는 인간 중쇄 형질전환유전자(transgene) 또는 도입염색체(transchromosome)와 인간 경쇄 형질전환유전자 또는 도입염색체를 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 마우스이다. 형질전환 비인간 동물은 CD25 항원의 정제 또는 농축된 제제 및(또는) CD25 발현 세포로 면역화될 수 있다. 바람직하게는, 형질전환 비인간 동물, 예를 들어 형질전환 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소타입 스위칭을 거침으로써 CD25에 대한 다중 이소타입(예를 들어, IgG, IgA 및(또는) IgM)의 인간 모노클로날 항체를 생산할 수 있다. 이소타입 스위칭은 예를 들어 고전적 또는 비고전적 이소타입 스위칭에 의해 일어날 수 있다.
따라서 또다른 측면에서, 본 발명은 상기한 바와 같은 형질전환 비인간 동물, 예를 들어 형질전환 마우스로부터 단리된, 인간 항-CD25 항체를 발현하는 B 세포를 제공한다. 그 후, 단리된 B 세포는 불멸화된 세포와의 융합에 의해 불멸화되어 인간 항-CD25 항체원(예를 들어, 하이브리도마)를 제공한다. 상기 하이브리도마(즉, 인간 항-CD25 항체를 생산하는) 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
여기에 예시된 바와 같이, 본 발명의 인간 항체는 항체를 발현하는 하이브리도마로부터 직접 수득되거나, 클로닝되고(예를 들어, 항체의 항원-결합 부분을 디스플레이하는 하이브리도마 또는 파지로부터) 숙주 세포(예를 들어, CHO(중국 햄스터 난소) 세포 또는 NS/0 세포)에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 숙주 세포의 추가 예들은 대장균과 같은 미생물과 효모와 같은 진균이다. 다르게는, 그들은 형질전환 비인간 동물이나 식물에서 재조합적으로 생산될 수 있다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 인간 CD25에 결합하는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 방법은 상기한 바와 같은 형질전환 비인간 동물, 예를 들어 형질전환 마우스(예를 들어, 항-CD25 항체의 모두 또는 일부를 코딩하는 인간 중쇄 형질전환유전자와 인간 경쇄 형질전환유전자를 포함하는 게놈을 갖는)를 인간 CD25 항원의 정제 또는 농축된 제제 및(또는) 인간 CD25를 발현하는 세포로 면역화시키는 것을 포함한다. 그 후 동물의 B 세포(예를 들어, 지라 B 세포)를 수득하여 골수종 세포와 융합시켜, CD25에 대한 인간 모노클로날 항체를 분비하는 불멸화된 하이브리도마 세포를 형성한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 인간 항-CD25 항체(예를 들어, 그의 가변영역)를 코딩하는 핵산 분자, 및 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 이 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 이들 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 방법 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명에 의해 제공되는 특정 핵산은 각각 인간 항-CD25 항체 AB1, AB7, AB11 및 AB12의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 서열번호 1, 5, 9 또는 13, 및 서열번호 3, 7, 11 또는 15에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 특징들과 장점들은 하기 상세한 설명과 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 CDRs가 표시된, 인간 모노클로날 항체 AB1, AB7, AB11 및 AB12의 경(카파)쇄 VJ 부위의 아미노산 서열(각각 서열번호 4, 8, 12 및 16)을 나타낸다.
도 2는 CDRs가 표시된, 인간 모노클로날 항체 AB1, AB7, AB11 및 AB12의 중쇄 VDJ 부위의 아미노산 서열(각각 서열번호 2, 6, 10 및 14)을 나타낸다.
도 3은 CDRs가 표시된, 인간 모노클로날 항체 AB1의 중쇄 VDJ 부위의 아미노산 서열(서열번호 2)과 상응하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)을 나타낸다.
도 4는 CDRs가 표시된, 인간 모노클로날 항체 AB1의 경(카파)쇄 VJ 부위의 아미노산 서열(서열번호 4)과 상응하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 3)을 나타낸다.
도 5는 CDRs가 표시된, 인간 모노클로날 항체 AB7의 중쇄 VDJ 부위의 아미노산 서열(서열번호 6)과 상응하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 5)을 나타낸다.
도 6은 CDRs가 표시된, 인간 모노클로날 항체 AB7의 경(카파)쇄 VJ 부위의 아미노산 서열(서열번호 8)과 상응하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 7)을 나타낸다.
도 7은 CDRs가 표시된, 인간 모노클로날 항체 AB11의 중쇄 VDJ 부위의 아미노산 서열(서열번호 10)과 상응하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 9)을 나타낸다.
도 8은 CDRs가 표시된, 인간 모노클로날 항체 AB11의 경(카파)쇄 VJ 부위의 아미노산 서열(서열번호 12)과 상응하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 11)을 나타낸다.
도 9는 CDRs가 표시된, 인간 모노클로날 항체 AB12의 중쇄 VDJ 부위의 아미노산 서열(서열번호 14)과 상응하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 13)을 나타낸다.
도 10은 CDRs가 표시된, 인간 모노클로날 항체 AB12의 경(카파)쇄 VJ 부위의 아미노산 서열(서열번호 16)과 상응하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 15)을 나타낸다.
도 11은 인간 모노클로날 항체 AB1, AB7, AB11 및 AB12의 상등액에 의한 IL-2의 그의 수용체, CD25에 대한 결합의 저해를 Zenapax®(daclizumab, 재조합 인간화 IgGl 항-CD25 항체, 로슈)에 의한 IL-2 결합의 저해와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 인간 모노클로날 항체 AB1, AB7, AB11 및 AB12에 의한 CD25에 대한 Zenapax® 결합의 저해를 나타낸 그래프이다.
도 13은 인간 모노클로날 항체 AB1, AB7 및 AB12에 의한 항-CD3 항체-유도된 T 세포 증식(PBMCs 이용)의 저해를 대조 항체(hIgG1/κ)와 Zenapax®에 의한 저해와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 인간 모노클로날 항체 AB1, AB7 및 AB12에 의한 MLR의 저해를 대조 항체(hIgG1/κ)와 Zenapax®에 의한 저해와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 15는 FITC-표지된 AB12에 의한 CD25의 내재화를 가시화한 FITC 필터를 이용한 사진을 나타낸다. 도 15A는 FITC-표지된 AB12로 예비-인큐베이션된 T 세포 블라스트의 37 ℃에서 18 시간 인큐베이션 후의 결과를 나타내고, 도 15B는 FITC-표지된 AB12의 존재 하에 37 ℃에서 18 시간 배양한 T 세포 블라스트의 결과를 나타낸다. 비교를 위해, 도 15C는 FITC-표지된 이소타입 대조 항체(항-KHL)의 존재 하에 37 ℃에서 18 시간 배양한 T 세포 블라스트의 결과를 나타낸다.
도 16은 플로우 사이토메트리에 의해 측정된 FITC-표지된 AB12에 의한 CD25의 내재화를 나타내고, 여기서 1을 초과하는 평균 형광 강도(MFI) 비율이 내재화가 일어났음을 가리킨다. 도 16A는 각각 4 ℃와 37 ℃에서 FITC-표지된 AB12로 예비-인큐베이션된 T 세포 블라스트의 결과를 나타내고, 도 16B는 각각 4 ℃와 37 ℃에서 FITC-표지된 AB12의 존재 하에 배양한 T 세포 블라스트의 결과를 나타낸다.
본 발명은 CD25를 발현하는 세포가 관여하는 다양한 장애를 치료하고 진단하기 위한 항체-기초 요법을 제공한다. 본 발명의 요법은 CD25 상에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체를 사용한다. 상기 항체는 모든 알려진 이소타입, 예를 들어 IgA, IgG1-4, IgE, IgM 및 IgD 항체를 포함한다.
일 구체예에서, 항체는 IgG1 항체, 보다 특히 IgG1,κ 또는 IgG1,λ 이소타입이다. 다른 예에서, 항체는 IgG3 항체, 보다 특히 IgG3,κ 또는 IgG3,λ 이소타입이다. 또다른 구체예에서, 항체는 IgG4 항체, 보다 특히 IgG4,κ 또는 IgG4,λ 이소타입이다. 또다른 구체예에서, 항체는 IgA1 또는 IgA2 항체이다. 추가 구체예에서, 항체는 IgM 항체이다.
일 구체예에서, 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 이소타입 스위칭을 수행하여 CD25에 대한 다중 이소타입의 인간 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 비인간 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 마우스에서 생산된다. 상기 형질전환 동물은 또한 US 2003/0017534에 개시된 바와 같은 폴리클로날 항체를 생산하기 위한 형질전환 토끼일 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 CD25에 특이적으로 결합하는 인간 폴리클로날 항체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 측면들은 항체, 항체 단편, 및 그의 제약 조성물뿐 아니라, 모노클로날 항체를 생산하는 비인간 형질전환 동물, B 세포, 숙주 세포 트랜스펙토마(transfectomas) 및 하이브리도마를 포함한다. 본 발명의 항체를 사용하여 CD25 발현 세포를 차단하거나 저해하는 방법도 제공되며, 이는 CD25와 연관된 장애의 치료에 유용하다. 본 발명의 항체를 사용하여 CD25 발현 세포를 검출하는 방법은 본 발명에 포함된다.
본 발명이 보다 쉽게 이해되도록 하기 위하여, 특정 용어들을 먼저 정의한다. 부가적인 정의는 상세한 설명을 통해 기재된다.
용어 "CD25" 및 "CD25 항원"은 여기에서 상호교환적으로 사용되며, 세포에 의해 자연적으로 발현되거나 CD25 유전자로 형질감염된 세포 상에서 발현되는 인간 CD25의 임의의 변이체, 이소폼 및 종 동족체를 포함한다. 당업계에 인식되어 있는 바와 같이, CD25의 동의어는 CD25, p55 및 Tac(T 세포 활성화(cell activation)) 항원을 포함한다. CD25 항원에 대한 본 발명의 항체의 결합은 CD25의 리간드, IL-2에 대한 결합을 저해하고(하거나) 차단하여, 동시에 그에 의해 세포 기능을 저해하고(하거나) 차단한다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명의 인간 항체는 항-CD3 항체-유도된 T 세포 증식을 저해한다. 다른 구체예에서, 인간 모노클로날 항체는 MLR을 저해한다.
여기에 사용된, 용어 "성장을 저해한다"(예를 들어, 세포를 언급함)는 세포 성장에 있어서 항-CD25 항체와 접촉하였을 때, 항-CD25 항체와 접촉하지 않은 동일한 세포의 성장과 비교하여 어떠한 측정가능한 감소, 예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 또는 100%의 세포 배양물의 성장 저해를 포함하고자 하는 것이다.
여기에 사용된 용어 "결합을 저해한다"와 "결합을 차단한다"(예를 들어, IL-2의 CD25에 대한 결합의 저해/차단을 가리킴)는 상호교환적으로 사용되며, 부분적 및 완전한 저해/차단 모두를 포함한다. IL-2의 CD25에 대한 결합의 저해/차단은 바람직하게는 IL-2가 저해나 차단 없이 CD25에 결합할 때 발생하는 정상적인 수준 또는 유형의 세포 신호를 감소시키거나 변화시킨다. 저해와 차단은 또한 IL-2의 CD25에 대한 결합 친화도에 있어서 항-CD25 항체와의 접촉시 항-CD25 항체와 접촉하지 않은 리간드와 비교하여 어떠한 측정가능한 감소, 예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 또는 100%의 IL-2의 CD25에 대한 결합 차단을 포함하고자 하는 것이다.
여기에 언급된 용어 "항체"는 완전한 항체와 그의 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합 부분")이나 단일쇄를 포함한다. "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 두 개의 중쇄(H)와 두 개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질, 또는 그의 항원 결합 부분을 가리킨다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변영역(여기서 VH라 약칭함)과 중쇄 불변영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변영역(여기서 VL이라 약칭함)과 경쇄 불변영역으로 구성된다. VH와 VL 영역은 프레임워크 부위(FR)로 명명된 보다 보존된 부위가 산재하는, 상보성 결정 부위(CDR)로 명명된 과가변(hypervariable) 부위로 더욱 세분된다. 각각의 VH와 VL은 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지 아래 순서로 배열되는 세 개의 CDRs과 네 개의 FRs로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 경쇄와 중쇄의 가변영역은 항원과 상호작용하는 결합 영역을 함유한다. 항체의 불변영역은 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포)와 고전적 보체 시스템의 제1 구성원(Clq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
여기에 사용된 용어인 항체의 "항원-결합 부분"(또는 간단하게는 항체 부분")은 항원(예를 들어, CD25)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 가리킨다. 항체의 항원-결합 기능은 완전 내지 전장 항체의 단편에 의해서 수행될 수 있음이 입증되어 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예들은 (ⅰ) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 일가 단편; (ⅱ) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편; (ⅲ) VH와 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (ⅳ) VL과 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (ⅴ) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward 등(1989) Nature 341: 544-546); (ⅵ) 단리된 상보성 결정 부위(CDR), 및 (ⅶ) 임의로 합성 링커에 의해 연결될 수 있는 두 개 이상의 단리된 CDRs의 배합물이다. 더욱이, 비록 Fv 단편의 두 도메인, VL과 VH가 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, VL과 VH 부위가 쌍을 이루어 일가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄(단일쇄 Fv(scFv)로 알려져 있음; 예를 들어 Bird 등(1988) Science 242: 423-426; 및 Huston 등(1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85: 5879-5883) 참조)로 제조되도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법으로 연결될 수 있다. 상기 단일쇄 항체 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되도록 하고자 한다. 추가 예는 (ⅰ) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합된 결합 도메인 폴리펩티드, (ⅱ) 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변영역 및(ⅲ) CH2 불변영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변영역을 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질이다. 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역일 수 있다. 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질은 추가로 US 2003/0118592와 US 2003/0133939에 개시되어 있다. 이들 항체 단편은 당업자에게 알려져 있는 통상적인 기술을 이용하여 수득되며, 단편들은 완전 항체와 같은 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
용어 "에피토프"는 항체에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 보통 아미노산이나 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹들로 구성되며, 보통 특이적인 삼차원적 구조 특성과 특이적인 전하 특성을 갖는다. 입체적 및 비입체적 에피토프는 변성 용매 처리에 의해 전자에 대한 결합은 상실되나 후자에 대한 결합은 상실되지 않는다는 점에서 구별된다.
용어 "이중특이적 분자"는 두 상이한 결합 특이성을 갖는 어떠한 물질, 예를 들어 단백질, 펩티드, 또는 단백질이나 펩티드 복합체도 포함하고자 하는 것이다. 예를 들어, 분자는 (a) 세포 표면 항원 및 (b) 이펙터 세포 표면 상의 Fc 수용체와 결합하거나, 이와 상호작용할 수 있다.
용어 "다중특이적 분자" 또는 "이종특이적 분자"는 두 개 초과의 결합 특이성을 갖는 임의의 물질, 예를 들어 단백질, 펩티드, 또는 단백질이나 펩티드 복합체도 포함하고자 하는 것이다. 예를 들어, 분자는 (a) 세포 표면 항원, (b) 이펙터 세포 표면 상의 Fc 수용체, 및 (c) 하나 이상의 다른 구성원과 결합하거나, 이와 상호작용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 CD25 및 이펙터 세포 상의 Fc 수용체와 같은 다른 표적에 대한 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 및 기타 다중특이적 분자를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
용어 "이중특이적 항체"는 또한 디아바디(diabodies)를 포함한다. 디아바디는 VH과 VL 영역이 단일 폴리펩티드 쇄 상에 발현되지만, 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 두 도메인이 쌍을 이루지 못하여 그 도메인들이 다른 쇄의 상보적 영역과 쌍을 이루게 되고 두 개의 항원 결합 위치를 생성하는 링커를 사용하는, 이가의 이중특이적 항체이다(예를 들어, Holliger, P. 등(1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J. 등(1994) Structure 2: 1121-1123 참조).
용어 "인간 항체 유도체"는 임의의 변형된 형태의 항체, 예를 들어 항체와 다른 물질 또는 항체의 콘쥬게이트를 가리킨다.
여기에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 배아계 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변영역을 갖는 항체를 포함하고자 하는 것이다. 본 발명의 인간 항체는 또한 인간 배아계 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위특이적 돌연변이유발, 또는 생체내 체돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 여기에 사용된 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 배아계로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 이식된 항체를 포함하고자 하는 것은 아니다.
여기에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자 제제를 가리킨다. 모노클로날 항체 조성물은 단일의 결합 특이성과 특정 에피토프에 대한 친화성을 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 배아계 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변영역을 갖는 단일의 결합 특이성을 나타내는 항체를 가리키는 것이다. 일 구체예에서, 인간 모노클로날 항체는 인간 중쇄 형질전환유전자와 경쇄 형질전환유전자를 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 또는 염색체도입된(transchrosomal) 비인간 동물, 예를 들어 형질전환 마우스로부터 수득된, 불멸화된 세포에 융합된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
여기에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대해 형질전환되거나 염색체도입된 동물(예를 들어, 마우스), 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체(하기 Ⅰ란에 추가로 기재됨), (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 분자조합(combinatorial) 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열로의 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 창제 또는 단리된 항체와 같은, 재조합적 수단에 의해 제조, 발현, 창제 또는 단리된 모든 인간 항체를 포함한다. 상기 재조합 인간 항체는 인간 배아계 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변영역을 갖는다. 그러나 특정 구체예에서, 상기 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 생체내 체돌연변이유발시 인간 Ig 서열에 대해 형질전환된 동물을 사용할 때)될 수 있으므로, 재조합 항체의 VH 및 VL 부위의 아미노산 서열은 인간 배아계 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 그와 관련되지만, 생체내에서 인간 항체 배아계 레파토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
여기에 사용된 용어 "트랜스펙토마"는 항체를 발현하는 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293 세포, 식물세포, 또는 효모세포를 포함하는 진균과 같은 진핵 숙주 세포를 포함한다.
여기에 사용된 "이종 항체"는 이 항체를 생산하는 형질전환 비인간 유기체와 관련하여 정의된다. 이 용어는 형질전환 비인간 동물을 구성하지 않는 유기체에서 발견되고 일반적으로 형질전환 비인간 동물 이외의 종으로부터 발견되는 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 코딩 핵산 서열을 갖는 항체를 가리킨다.
여기에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체를 실질적으로 갖지 않는 항체를 가리키고자 하는 것이다(예를 들어, CD25에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 CD25 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 갖지 않는다). 그러나 인간 CD25의 에피토프, 이소폼 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 예를 들어, 다른 종으로부터의 다른 관련된 항원(예를 들어, CD25 종 동족체)에 교차-반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포성 물질 및(또는) 화학물질을 실질적으로 갖지 않을 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상이한 특이성을 갖는 "단리된" 모노클로날 항체의 배합물은 잘 규명된 조성물에서 배합된다.
여기에 사용된 "특이적 결합"은 예정된 항원에 대한 항체 결합을 가리킨다. 전형적으로, 항체는 리간드로서 재조합 IL-2Rα와 분석물로서 항체를 사용하여 바이아코어 3000 장치에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술로 결정할 때 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 또는 약 10-11 M 또는 심지어 그 미만과 같은 약 10-8 M 이하의 KD에 상응하는 친화도로 결합하고, 예정된 항원 이외의 비특이적 항원(예를 들어 BSA, 카제인)이나 밀접하게 관련된 항원에 대한 그의 친화도 보다 적어도 10배 낮은, 바람직하게는 적어도 100배 낮은 KD에 상응하는 친화도로 예정된 항원에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체"와 "항원에 특이적인 항체"는 여기서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.
여기에 사용된 용어 "kd"(sec-1)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 속도 상수를 가리키고자 하는 것이다. 상기 값은 koff 값이라고도 한다.
여기에 사용된 용어 "ka"(M-1×sec-1)는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 평형 속도 상수를 가리키고자 하는 것이다.
여기에 사용된 용어 "KD"(M)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 가리키고자 하는 것이다.
여기에 사용된 용어 "KA"(M-1)는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 평형 상수를 가리키고자 하는 것이고, ka를 kd로 나누어 얻어진다.
여기에 사용된 "이소타입"은 중쇄 불변영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 가리킨다.
여기에 사용된 "이소타입 스위칭"은 항체의 클래스 또는 이소타입이 하나의 Ig 클래스에서 다른 Ig 클래스의 하나로 바뀌는 현상을 가리킨다.
여기에 사용된 "비스위치된 이소타입"은 이소타입 스위칭이 일어나지 않았을 때 생산된 중쇄의 이소타입 클래스를 가리키고, 비스위치된 이소타입을 코딩하는 CH 유전자는 전형적으로 기능적으로 재배열된 VDJ 유전자 바로 하류에 있는 제1 CH 유전자이다. 이소타입 스위칭은 고전적 또는 비고전적 이소타입 스위칭으로 분류되어 왔다. 고전적 이소타입 스위칭은 형질전환유전자에서 하나 이상의 스위치 서열이 관여하는 재조합 현상에 의해 일어난다. 비고전적 이소타입 스위칭은 예를 들어, 인간 σμ와 인간 Σμ(δ-연관된 결실) 사이의 상동적 재조합에 의해 일어날 수 있다. 특히 형질전환유전자 간 및(또는) 염색체 간의 재조합과 같은 비고전적 스위칭 기작이 일어나 이소타입 스위칭을 일으킬 수 있다.
여기에 사용된 용어 "스위치 서열"은 스위치 재조합을 담당하는 DNA 서열을 가리킨다. "스위치 공여체" 서열, 전형적으로 μ 스위치 부위는 스위치 재조합 동안 결실되는 구조체(construct) 부위의 5'(즉, 상류)에 있다. "스위치 수용체"는 결실되는 구조체 부위와 대체 불변영역(예를 들어, γ, ε 등)의 사이에 있다.
여기에 사용된 "글리코실화 양상"은 단백질, 보다 구체적으로 면역글로불린(항체) 단백질에 공유적으로 결합되는 탄수화물 단위의 양상으로 정의된다. 당업자가 이종 항체의 글리코실화 양상을 형질전환유전자의 CH 유전자가 유래된 종 보다 비인간 형질전환 동물 종의 글리코실화 양상에 더 유사한 것으로 인식할 때, 이종 항체의 글리코실화 양상은 비인간 형질전환 동물 종에 의해 생산된 항체에서 자연적으로 발생하는 글리코실화 양상에 실질적으로 유사한 것으로 특징지워질 수 있다.
대상에 적용되는 여기에 사용된 용어 "자연-발생"은 대상이 자연에서 발견될 수 있는 사실을 가리킨다. 예를 들어 유기체(바이러스 포함)에 존재하고 자연에서 출처로부터 단리될 수 있으며 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연-발생인 것이다.
여기에 사용된 용어 "재배열된"은 각각 본질적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 형태에서 V 조각(segment)이 D-J 또는 J 조각에 바로 인접하여 위치하는 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 좌위(locus)의 배열을 가리킨다. 재배열된 면역글로불린(항체) 유전자 좌위는 배아계 DNA와의 비교에 의해 확인될 수 있고; 재배열된 위치는 하나 이상의 재조합된 헵타머/노나머 상동성 요소를 갖는다.
V 조각을 언급하는 여기에 사용된 용어 "비재배열된" 또는 "배아계 배열"은 V 조각이 D나 J 조각에 바로 인접하도록 재조합되지 않은 배열을 가리킨다.
여기에 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자와 RNA 분자를 포함하고자 하는 것이다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
CD25에 결합하는 전체 항체나 항체 부분(예를 들어, VH, VL, CDR3)을 코딩하는 핵산을 언급하는 여기에 사용된 용어 "단리된 핵산 분자"는, 완전한 항체나 항체 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 CD25 이외의 항원과 결합하는 전체 항체나 항체 부분을 코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열을 갖지 않고, 이 다른 서열은 인간 게놈 DNA의 핵산을 자연적으로 플랭킹(flanking)할 수 있는 핵산 분자를 가리키고자 하는 것이다. 일 구체예에서, 인간 항-CD25 항체는 각각 서열번호 1, 5, 9 또는 13, 및 서열번호 3, 7, 11 또는 15에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 AB1, AB7, AB11 또는 AB12의 중쇄(VH)와 경쇄(VL) 가변 아미노산 부위를 포함한다.
여기에 개시되고 청구된, 서열번호 1-40에 기재된 서열들은 "보존적 서열 변형물", 즉 그 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나 그 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 현저히 영향을 미치거나 변화를 주지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형물을 포함한다. 상기 보존적 서열 변형물은 뉴클레오티드 및 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 부위-특이적 돌연변이유발과 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은 당업계에 알려진 표준 기술에 의해 서열번호 1-40에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알리닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 인간 항-CD25 항체에서 예상되는 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는, 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체된다.
본 발명은 또한 CD25에 대한 항체의 결합 특성에 현저하게 영향을 미치거나 변화시키지 않으면서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 예를 들어, 아실화 또는 글리코실화에 의해 유도체화된 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 17-40에 나타낸 아미노산 서열, 및 그의 보존적 서열 변형물의 "유도체"를 포함한다.
더욱이, 본 발명은 항체의 기능적 또는 약동력학적 성질을 변화시키기 위하여 Fc 부위에 하나 이상의 변형이 가해진 항체를 포함한다. 상기 변형은 Clq 결합과 CDC, 또는 FcγR 결합과 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)의 감소나 증가를 일으킬 수 있다. 치환은 예를 들어, 중쇄 불변영역의 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322 중 하나 이상에서 일어나, 비변형된 항체와 비교하여 항원에 대한 결합은 보유하면서 이펙터 기능에서의 변형을 유발할 수 있다(US 5,624,821 및 US 5,648,260 참조). 추가의 참조문헌은 ADCC를 증가시키는 Fc 부위가 변형된 항체를 개시한 WO 00/42072, 및 FcRⅠ에 결합하는 항체의 능력을 변화시켜 Clq에 결합하는 항체의 능력을 감소시키고, 이어서 보체를 고정하는 항체의 능력을 감소시키는 CH2 도메인의 N-말단 부위에 돌연변이를 갖는 항체를 개시한 WO 94/29351이 될 수 있을 것이다. 더욱이, Shields 등, J. Biol . Chem .(2001) 276: 6591-6604는 FcγRⅢ 결합을 개선시킨 조합 변이체들, 예를 들어 T256A/S298A, S298A/E333A 및 S298A/E333A/K334A를 교시하고 있다.
항체의 생체내 반감기는 또한, Ig 불변영역이나 Ig-양 불변영역의 재이용(salvage) 수용체 에피토프를 분자가 완전한 CH2 도메인 또는 완전한 Ig Fc 부위를 포함하지 않도록 변형시킴으로써 향상될 수 있다(US 6,121,022 및 US 6,194,551 참조). 더욱이 생체내 반감기는 Fc 부위에 돌연변이를 만들어, 예를 들어 252번 위치에서 류신을 트레오닌으로, 254번 위치에서 세린을 트레오닌으로, 256번 위치에서 페닐알라닌을 트레오닌으로 치환함으로써 증가될 수 있다(US 6,277,375 참조).
더욱이, 항체의 이펙터 기능을 변화시키기 위하여 항체의 글리코실화 양상을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, FcγRⅢ에 대한 Fc의 친화도를 증진시키고 이어서 NK 세포 존재 하에 항체의 ADCC를 증가시키기 위하여, Fc의 297번 위치의 Asn에 결합된 탄수화물에 정상적으로 결합되는 퓨코스 단위를 첨가하지 않는 트랜스펙토마에서 항체를 발현시킬 수 있다(Shield 등(2002) J. Biol . Chem ., 277: 26733 참조). 더욱이, 글리코실화의 변형은 CDC를 변형시키기 위하여 가해질 수 있다. 추가 참조문헌은 글리코폼이 변형되고 ADCC 활성이 향상된 모노클로날 항체를 발현하는 GntⅢ를 발현하도록 조작된 CHO 세포주를 개시한 WO 99/54342 및 Umana 등, Nat. Biotechnol .(1999) 17: 176이다.
더욱이, 본 발명의 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편을 PEG화하여 반감기를 증가시킬 수 있다. 이것은 예를 들어 Focus on Growth Factors(1992) 3: 4-10; EP 154 316 및 EP 401 384에 기재된 바와 같은, 당업계에 알려져 있는 PEG화 반응에 의해 수행될 수 있다.
다르게는, 다른 구체예에서, 포화 돌연변이유발에 의해서와 같이 돌연변이를 항-CD25 항체 코딩 서열의 모두 또는 부분을 따라 무작위로 도입하고, 생성된 변형 항-CD25 서열을 결합 활성에 대해 스크리닝할 수 있다.
따라서, 여기에 개시된(중쇄 및 경쇄 가변영역) 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고(되거나) 여기에 개시된(중쇄 및 경쇄 가변영역) 아미노산 서열(서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 17-40)을 함유하는 항체는, 보존적으로 변형된 유사한 서열에 의해 코딩되거나 그를 함유하는 실질적으로 유사한 항체를 포함한다. 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 17-40으로 여기에 개시된 일부(즉, 경쇄 및 중쇄 가변영역) 서열에 기초하여 그러한 실질적으로 유사한 항체를 생성할 수 있는 방법에 관한 추가 논의는 이하에 제공된다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대하여, 용어 "상동성"은 최적으로 정렬하고 적절한 삽입이나 결실과 비교할 때 두 핵산이나 아미노산 서열 간의 동일성 정도를 가리킨다. 다르게는, 실질적 상동성은 DNA 조각들이 선택적인 혼성화 조건 하에서 그 가닥의 상보물에 혼성화할 때 존재한다. 두 서열 간의 퍼센트 동일성은 두 서열의 최적 배열을 위해 도입될 필요가 있는 갭(gap)의 수와 각 갭의 길이를 고려하여, 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 #×100). 서열의 비교와 두 서열 간의 퍼센트 동일성은 아래 비제한적 예에 기재되어 있는 바와 같이 수학적 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있다.
두 뉴클레오티드 서열 간의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스와 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 GCG 소프트웨어 팩키지(http://www.gcg.com에서 이용가능)의 GAP 프로그램을 이용하여 결정할 수 있다. 두 뉴클레오티드나 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티를 이용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함된 E. Meyers 및 W. Miller(Comput . Appl . Biosci., 4: 11-17(1988))의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은 Blossum 62 매트릭스나 PAM250 매트릭스, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 팩키지(http://www.gcg.com에서 입수가능)의 GAP 프로그램에 포함된 Needleman 및 Wunsch(J. Mol . Biol . 48: 444-453(1970)) 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 또한 예를 들어, 관련 서열을 동정하기 위하여 공중 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질문(query) 서열"로 사용될 수 있다. 상기 검색은 Altschul 등(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자에 상동적인 뉴클레오티드 서열을 얻기 위한 BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어길이 = 12로 수행될 수 있다. 본 발명의 단백질 분자에 상동적인 아미노산 서열을 얻기 위한 BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 허용(gapped) 정렬을 얻기 위하여, Gapped BLAST를 Altschul 등(1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402에 기재되어 있는 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST와 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조.
핵산은 전체 세포, 세포 용균물 내에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 알칼라인/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동, 및 당업계에 잘 알려진 기타 방법을 포함하는 표준 기술에 의해, 다른 세포 성분이나 다른 오염물질, 예를 들어 다른 세포성 핵산이나 단백질로부터 정제될 때 "단리" 또는 "실질적으로 순수하게" 된다. F. Ausubel 등, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)을 참조.
본 발명의 핵산 조성물은 흔히 cDNA, 게놈으로부터의 본래의 서열, 또는 그의 혼합물(변형된 제한위치 등을 제외한)인 반면, 유전자 서열을 제공하기 위하여 표준 기술에 따라 돌연변이될 수 있다. 코딩 서열에 대하여, 이들 돌연변이는 원하는대로 아미노산 서열에 영향을 미칠 수 있다. 특히, 여기에 기재된 본래의 V, D, J, 불변, 스위치 및 상기 기타 서열에 실질적으로 상동적이거나 그로부터 유래된 DNA 서열이 고려된다(여기서 "유래된"은 서열이 다른 서열과 동일하거나 그로부터 변형된 것을 가리킨다).
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터나 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 조절 서열의 전사에 관하여, 작동가능하게 연결된 이란 연결된 DNA 서열이 연속적이고, 필요한 경우 두 단백질 코딩 부위를 결합시키기 위하여 연속적이고 리딩 프레임 내에 있음을 의미한다. 스위치 서열에 대하여, 작동가능하게 연결된 이란 서열이 스위치 재조합을 수행할 수 있음을 가리킨다.
여기에 사용된 용어 "벡터"는 그에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 가리키고자 하는 것이다. 한 유형의 벡터는 부가적인 DNA 조각이 라이게이션될 수 있는 환상 이중 가닥 DNA 루프를 가리키는 "플라스미드"이다. 다른 유형의 벡터는 부가적인 DNA 조각이 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 어떤 벡터들은 그들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제를 할 수 있다(예를 들어, 세균 복제 기원을 갖는 세균 벡터와 에피좀성 포유류 벡터). 다른 벡터들(예를 들어, 비-에피좀성 포유류 벡터)은 숙주 세포로 도입 시 숙주 세포의 게놈에 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 어떤 벡터들은 그에 기능적으로 연결된 유전자를 발현시킬 수 있다. 상기 벡터들은 여기에 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")라고 언급되어 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용되는 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태이다. 플라스미드가 벡터의 가장 보편적으로 사용되는 형태이므로, 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 균등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스와 아데노-관련 바이러스)와 같은 기타 상기 형태의 발현 벡터를 포함하고자 한다.
여기에 사용된 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 가리키고자 하는 것이다. 상기 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 상기 세포의 자손을 가리키고자 하는 것이다. 돌연변이나 환경적 영향으로 인해 특정 변형이 후손 세대에 일어날 수 있으므로 사실상 상기 자손은 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여기에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다. 재조합 숙주 세포는 예를 들어, CHO 세포 및 NS/0 세포와 같은 트랜스펙토마를 포함한다.
여기에 사용된 용어 "대상"은 어떠한 인간 또는 비인간 동물도 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 포유류와 비포유류를 포함한다.
용어 "형질전환(transgenic) 비인간 동물"은 하나 이상의 인간 중쇄 및(또는) 경쇄 형질전환유전자(transgene) 또는 도입염색체(transchromosome)(동물의 자연적 게놈 DNA에 통합되거나 비통합된)를 포함하는 게놈을 갖고, 완전 인간 항체를 발현할 수 있는 비인간 동물을 가리킨다. 예를 들어, 형질전환 마우스는 그 마우스가 CD25 항원 및(또는) CD25 발현 세포로 면역화될 때 인간 항-CD25 항체를 생산하도록, 인간 경쇄 형질전환유전자와 인간 중쇄 형질전환유전자 또는 인간 중쇄 도입염색체를 가질 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 형질전환유전자 및(또는) 도입염색체는 마우스의 염색체 DNA에 통합될 수 있거나 염색체 외적으로 유지될 수 있다. 상기 형질전환 및 염색체도입 마우스(여기서는 합쳐서 "형질전환 마우스"라고 함)는 V-D-J 재조합 및 이소타입 스위칭을 수행함으로써 CD25에 대한 다중 이소타입(예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgD 및(또는) IgE)의 인간 모노클로날 항체를 생산할 수 있다. 형질전환 비인간 동물은 또한 예를 들어, 특정 항-CD25 항체를 코딩하는 유전자를 동물 젖에서 발현되는 유전자에 작동가능하게 연결, 도입함으로써, 특정 항-CD25 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 다양한 측면들은 하기 세부항목에서 더욱 상세하게 기재된다.
Ⅰ. CD25 에 대한 인간 항체의 생산
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어, Kohler 및 Milstein, Nature 256: 495(1975)의 표준 체세포 잡종화 기술을 포함하는 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 원칙적으로 체세포 잡종화 과정이 바람직하지만 다른 모노클로날 항체 생산 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스 또는 발암유전자 형질전환이나 인간 항체 유전자 라이브러리를 이용하는 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있다.
인간 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하는데 바람직한 동물 시스템은 쥐 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립된 과정이다. 면역화 프로토콜과 융합을 위해 면역화된 지라세포의 단리기술은 당업계에 알려져 있다. 융합 상대(예를 들어, 쥐 골수종 세포) 및 융합과정 또한 알려져 있다.
바람직한 구체예에서, CD25에 대한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템 보다 인간 면역 시스템의 일부를 갖는 형질전환 또는 염색체도입된 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이들 형질전환 및 염색체도입 마우스는 여기에 HuMAb 마우스, 예를 들어 각각 HCo7 및 HCo12 마우스, 및 KM 마우스로 언급된 마우스를 포함하고, 여기에서 모두 "형질전환 마우스"라 언급된다.
HuMAb 마우스는 재배열되지 않은 인간 중쇄(μ와 γ)와 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니좌위(miniloci)를 내생적 μ와 κ쇄 좌위를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께 포함한다(Lonberg, N. 등(1994) Nature 368(6474): 856-859). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ 경쇄의 발현 감소를 나타내고, 면역화에 반응하여 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 형질전환유전자는 클래스 스위칭과 체돌연변이를 통하여 고친화도 인간 IgG,κ 모노클로날 항체를 생성한다(상기 Lonberg, N. 등(1994); Lonberg, N.(1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101f에서 검토됨; Lonberg, N. 및 Huszar, D.(1995) Intern . Rev . Immunol . Vol. 13: 65-93, 및 Harding, F. 및 Lonberg, N.(1995) Ann . N. Y. Acad . Sci 764: 536-546). HuMAb 마우스의 제조는 Taylor, L. 등(1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. 등(1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon 등(1994) J. Immunol . 152: 2912-2920; Lonberg N. 등(1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N.(1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Taylor, L. 등(1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. and Huszar, D.(1995) Intern . Rev. Immunol . Vol. 13: 65-93; Harding, F. 및 Lonberg, N.(1995) Ann . N. Y. Acad. Sci 764: 536-546; Fishwild, D. 등(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851에 상세히 기술되어 있다. 추가로 모두 Lonberg와 Kay의 US 5,545,806; US 5,569,825; US 5,625,126; US 5,633,425; US 5,789,650; US 5,877,397; US 5,661,016; US 5,814,318; US 5,874,299; 및 US 5,770,429; 및 Surani 등의 US 5,545,807; WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 및 WO 01/09187을 참조.
HCo7 마우스는 그들의 내생적 경쇄(카파) 유전자에 JKD 파괴(Chen 등(1993) EMBO J. 12: 821-830에 기재된 바와 같이), 그들의 내성적 중쇄 유전자에 CMD 파괴(WO 01/14424의 실시예 1에 기재된 바와 같이), KCo5 인간 카파 경쇄 형질전환유전자(Fishwild 등(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851에 기재된 바와 같이), 및 HCo7 인간 중쇄 형질전환유전자(US 5,770, 429에 기재된 바와 같이)를 갖는다.
HCo12 마우스는 그들의 내생적 경쇄(카파) 유전자에 JKD 파괴(Chen 등(1993) EMBO J. 12: 821-830에 기재된 바와 같이), 그들의 내생적 중쇄 유전자에 CMD 파괴(Korman 등에 의한 WO 01/14424의 실시예 1에 기재된 바와 같이), KCo5 인간 카파 경쇄 형질전환유전자(Fishwild 등(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851에 기재된 바와 같이), 및 HCo12 인간 중쇄 형질전환유전자(Korman 등에 의한 WO 01/14424의 실시예 2에 기재된 바와 같이)를 갖는다. KM 마우스 주에서, 내생적 마우스 카파 경쇄 유전자는 Chen 등(1993) EMBO J. 12: 811-820에 기재된 바와 같이 동형접합적으로 파괴되고, 내생적 마우스 중쇄 유전자는 WO 01/09187의 실시예 1에 기재된 바와 같이 동형접합적으로 파괴된다. 이 마우스 주는 Fishwild 등(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851에 기재된 바와 같이 인간 카파 경쇄 형질전환유전자, KCo5를 갖는다. 이 마우스 주는 또한, WO 02/43478에 기재되어 있는 바와 같이 염색체 14 단편 hCF(SC20)로 구성된 인간 중쇄 도입염색체를 갖는다.
면역화
CD25에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위하여, 인간 면역글로불린 유전자를 함유하는 형질전환 또는 염색체도입 마우스(예를 들어, HCo12, HCo7 또는 KM 마우스)를 예를 들어 상기 Lonberg 등(1994); 상기 Fishwild 등(1996) 및 WO 98/24884에 기재된 바와 같이 CD25 항원의 농축된 제제, 재조합 CD25 및(또는) CD25를 발현하는 세포로 면역화시킬 수 있다. 다르게는, 마우스를 인간 CD25를 코딩하는 DNA로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 제1 주입 시 6-16 주령이다. 예를 들어, CD25 항원의 농축된 제제나 재조합 CD25를 사용하여 HuMAb 마우스를 복강 내로 면역화시킬 수 있다. CD25 항원의 정제 또는 농축된 제제를 이용한 면역화가 항체를 생성하지 않는 경우, 마우스는 면역 반응을 촉진하기 위하여 CD25를 발현하는 세포, 예를 들어 세포주로 면역화될 수도 있다.
다양한 항원에 대한 누적된 경험이 HuMAb 형질전환 마우스가 완전 또는 불완전 프로인트 애쥬번트 중의 CD25 발현 세포로 복강 내(IP) 또는 피하(SC)로 최초 면역화된 후, 예를 들어 인산완충식염수(PBS) 중의 CD25 발현 세포로 IP 면역화(총 10회까지)될 때 가장 잘 반응하는 것으로 나타났다. 면역 반응은 안와 후 출혈에 의해 얻어진 혈청 샘플을 이용하여 면역화 프로토콜 과정에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 혈청을 FACS 분석(하기하는 바와 같이)에 의해 스크리닝할 수 있고, 충분한 역가의 항-CD25 인간 면역글로불린을 갖는 마우스를 융합에 사용할 수 있다. 마우스를 희생시키고 지라와 림프절을 제거하기 전에, 예를 들어 3 일 및 2 일 전에, 마우스를 CD25 발현 세포로 정맥 내로 추가접종할 수 있다.
CD25 에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
인간 CD25에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위하여, 면역화된 마우스로부터 지라세포와 림프절 세포를 단리하고 마우스 골수종 세포주와 같은 적절한 불멸화 세포주와 융합할 수 있다. 그 후 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체 생산에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 지라 림프구의 단일 세포 현탁액은 50% PEG(w/v)로 SP2/0-Ag14 골수종 세포(ATCC, CRL 1581)에 융합될 수 있다. 세포를 평저 마이크로타이터 플레이트에 웰 당 약 1×105으로 플레이팅한 후, 보통의 시약 외에 10% 태아 클론 혈청, 5 오리젠 하이브리도마 클로닝 인자(IGEN) 및 1×HAT(시그마)를 함유하는 선택 배지에서 2 주 인큐베이션할 수 있다. 약 2 주 후, HAT가 HT(시그마)로 대체된 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 그 후 개개의 웰을 인간 카파-경쇄 함유 항체에 대해 ELISA로, 그리고 CD25 특이성에 대해 CD25 발현 세포를 사용하는 FACS 분석으로 스크리닝할 수 있다. 일단 강력한 하이브리도마 성장이 일어나면, 보통 7-10 일 후 클론을 IgG 생산에 대해 스크리닝할 수 있다. 항체-분비 하이브리도마를 다시 플레이팅하고 다시 스크리닝할 수 있으며, 인간 IgG에 대해 여전히 양성이면 항-CD25 모노클로날 항체를 제한 희석법으로 두 번 이상 서브클로닝할 수 있다. 그 후 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여 특성규명을 위해 조직 배양 배지에서 항체를 생성할 수 있다.
CD25 에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
본 발명의 인간 항체는 또한 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 재조합 DNA 기술과 유전자 형질감염 방법의 결합을 사용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다(Morrison, S.(1985) Science 229: 1202).
예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현하기 위하여, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자생물학적 기술(예를 들어, PCR 증폭, 부위특이적 돌연변이유발)에 의해 얻을 수 있으며, 유전자가 전사 및 해독 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터로 삽입될 수 있다. 이 문맥에서. 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 해독 조절 서열이 항체 유전자의 전사와 해독을 조절하는 그들의 의도된 기능을 제공하도록 벡터로 라이게이션되는 것을 의미하고자 하는 것이다. 발현 벡터와 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용되도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자와 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터로 삽입될 수 있거나, 보다 전형적으로는 두 유전자 모두가 동일한 발현 벡터로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들어, 항체 유전자 단편과 벡터 상의 상보적 제한 위치의 라이게이션, 또는 제한 위치가 존재하지 않으면 평활 말단(blunt end) 라이게이션)에 의해 발현 벡터로 삽입된다. 여기에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역은 VH 조각이 벡터 내의 CH 조각(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 조각이 벡터 내의 CL 조각에 작동가능하게 연결되도록, 원하는 이소타입의 중쇄 불변 및 경쇄 불변영역을 이미 코딩하는 발현 벡터로 그들을 삽입함으로써 임의의 항체 이소타입의 전장 항체 유전자를 창제하는데 사용될 수 있다. 부가적으로나 다르게는, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 신호 펩티드가 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 프레임에 맞게(in-frame) 연결되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 쇄 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 갖는다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사나 해독을 조절하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하고자 하는 것이다. 상기 조절 서열은 예를 들어, Goeddel; 유전자 Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)에 기재되어 있다. 조절 서열의 선택을 포함한 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의해 좌우될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 포유류 숙주 세포 발현을 위해 바람직한 조절 서열은 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미언 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및(또는) 인핸서와 같은 포유류 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소를 포함한다. 다르게는, 유비퀴틴 프로모터나 β-글로빈 프로모터와 같은 비바이러스성 조절 서열을 사용할 수 있다.
항체 쇄 유전자와 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 원점)과 선별 마커 유전자와 같은 부가적인 서열을 가질 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(예를 들어, 모두 Axel 등에 의한 U.S. 특허번호 4,399,216,4, 634,665 및 5,179,017을 참조). 예를 들어, 전형적으로 선별 마터 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 하이그로마이신 또는 메쏘트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메쏘트렉세이트 선별/증폭된 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위해)와 neo 유전자(G418 선별을 위해)를 포함한다.
경쇄와 중쇄 발현을 위해, 중쇄와 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)는 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질감염된다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 도입하기 위해 보편적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하고자 하는 것이다. 본 발명의 항체를 원핵이나 진핵 숙주 세포에서 발현하는 것이 이론적으로는 가능하지만, 진핵 숙주 세포, 특히 포유류 세포에서 원핵 세포보다 더욱 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비할 수 있을 것 같으므로, 진핵 세포, 가장 바람직하게는 포유류 숙주 세포에서의 항체 발현이 가장 바람직하다.
본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위해 바람직한 포유류 숙주 세포는 CHO 세포(예를 들어, R. J. Kaufman 및 P. A. Sharp(1982) Mol. Biol. 159: 601-621에 기재되어 있는 바와 같은, DHFR 선별 마커와 사용되는, Urlaub 및 Chasin(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함), NS/0 골수종 세포, COS 세포, HEK293 세포와 SP2 세포를 포함한다. 특히 NS/0 골수종 세포와 사용하기 위한 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 개시된 GS(글루타민 합성효소) 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포로 도입될 때, 숙주 세포에서 항체의 발현, 또는 보다 바람직하게는, 숙주 세포를 성장시킨 배양 배지로의 항체의 분비를 허용하는 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 생산한다. 항체는 표준 단백질 정제방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
CD25 에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 추가의 재조합 수단
다르게는 클로닝된 항체 유전자를 미생물, 예를 들어 scFv 항체 생산을 위한 대장균과 같은 원핵세포, 조류 및 곤충 세포를 포함하는 다른 발현 시스템에서 발현할 수 있다. 더욱이, 항체는 양과 토끼의 젖이나 암탉의 알과 같은 형질전환 비인간 동물이나, 형질전환 식물에서 생산될 수 있다. 예를 들어, Verma, R. 등(1998), Antibody engineering: Comparison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression systems. J. Immunol . Meth . 216: 165-181; Pollock 등(1999), Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies, J. Immunol . Meth . 231: 147-157; 및 Fischer, R. 등(1999). Molecular farming of recombinant antibodies in plants, Biol. Chem. 380: 825-839를 참조.
완전한 항체를 발현하기 위한 부분 항체 서열의 용도
항체는 주로 6 개의 중쇄와 경쇄 CDRs에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이 이유로, CDRs 내의 아미노산 서열은 CDRs 밖의 서열에 비해 개개 항체 간에 더욱 다양하다. CDR 서열이 대부분 항체-항원 상호작용을 담당하므로, 상이한 성질을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열로 이식된 특정 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 제작함으로써 특정 자연 발생 항체의 성질을 모방한 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다(예를 들어, Riechmann, L. 등(1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. 등(1986) Nature 321: 522- 525; 및 Queen, C. 등(1989) Proc . Natl . Acad . Sci .. U.S.A. 86: 10029-10033)을 참조. 상기 프레임워크 서열은 배아계 항체 유전자 서열을 포함하는 공중 DNA 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 이들 배아계 서열은 B 세포 성숙 중 V(D)J 결합에 의해 형성되는 완전히 조립된 가변 유전자를 포함하지 않으므로 성숙한 항체 유전자 서열과 상이할 것이다. 배아계 유전자 서열은 가변 유전자 전체에 걸쳐 돌연변이를 함유하지만 전형적으로는 CDRs에 모여 있는 고친화도 이차 레파토리 항체의 서열과도 상이할 것이다. 예를 들어, 체돌연변이는 프레임워크 부위 1의 아미노 말단 부분과 프레임워크 부위 4의 카복시-말단 부분에서 상대적으로 덜 빈번하다. 더욱이, 많은 체돌연변이는 항체의 결합 성질을 현저하게 변화시키지 않는다. 이 이유로, 원래 항체의 것과 유사한 결합 성질을 갖는 완전한 재조합 항체를 재창제하기 위하여, 특정 항체의 전체 DNA 서열을 얻는 것이 필요하지 않다(WO 99/45962 참조). 전형적으로 CDR 부분에 걸친 부분적인 중쇄 및 경쇄 서열이 이 목적을 위해 충분하다. 부분 서열은 어느 배아계 가변 및 결합 유전자 조각이 재조합된 항체 가변 유전자에 기여하는지를 결정하는데 사용된다. 그 후 배아계 서열은 가변영역의 유실된 부분을 채우는데 사용된다. 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 단백질 성숙화 중 절단되고 최종 항체의 성질에 기여하지 않는다. 유실 서열을 첨가하기 위하여, 클로닝된 cDNA 서열을 라이게이션이나 PCR 증폭에 의해 합성 올리고뉴클레오티드와 결합시킬 수 있다. 다르게는, 전체 가변영역을 짧은 중첩되는 올리고뉴클레오티드의 세트로 합성하고, PCR 증폭에 의해 결합하여 전체적으로 합성된 가변영역 클론을 창제할 수 있다. 이 과정은 특정 제한위치의 제거나 포함, 또는 특정 코돈의 최적화와 같은 특정의 장점들을 갖는다.
하이브리도마로부터의 중쇄 및 경쇄 전사체의 뉴클레오티드 서열은, 합성 올리고뉴클레오티드의 중첩 세트를 설계하여 천연 서열과 동일한 아미노산 코딩 능력을 갖는 합성 V 서열을 창제하는데 사용된다. 합성 중쇄 및 카파쇄 서열은 세 가지 방식으로 천연 서열과 다를 수 있다: 반복된 뉴클레오티드 염기의 스트링을 방해하여 올리고뉴클레오티드 합성과 PCR 증폭을 용이하게 하고; Kozak의 규칙(Kozak(1991) J. Biol. Chem. 266: 19867-19870)에 따라 최적의 해독 개시 위치가 도입되고; 해독 개시 위치의 상류에 HindⅢ 위치가 조작된다.
중쇄 및 경쇄 가변영역을 위해, 최적화된 코딩 및 상응하는 비코딩 가닥 서열은 상응하는 비코딩 올리고뉴클레오티드의 중간점에서 약 30-50 뉴클레오티드로 나누어진다. 따라서, 각 쇄에 대해, 올리고뉴클레오티드를 150-400 뉴클레오티드에 걸치는 중첩 이중 가닥 세트로 조립할 수 있다. 그 후 풀은 150-400 뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물을 제조하는 주형으로 사용된다. 전형적으로는, 단일 가변영역 올리고뉴클레오티드 세트는 두 개의 중첩 PCR 산물을 생성하기 위해 별도로 증폭되는 두 개의 풀로 나뉜다. 그 후 이들 중첩 산물은 PCR 증폭에 의해 결합되어 완전한 가변영역을 형성한다. 그것은 또한 발현 벡터 제작물로 쉽게 클로닝될 수 있는 단편을 생성하기 위하여 PCR 증폭에서 중쇄 또는 경쇄 불변영역의 중첩 단편(카파 경쇄의 BbsⅠ 위치나, 감마 중쇄의 AgeⅠ 위치 포함)을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
그 후 재제작된 중쇄와 경쇄 가변영역은 클로닝된 프로모터, 리더 서열, 해독 개시, 불변영역, 3' 비해독, 폴리아데닐화 및 전사 종결서열과 결합되어 발현 벡터 제작물을 형성한다. 중쇄와 경쇄 발현 제작물은 단일 벡터로 결합되거나, 숙주 세포로 공동-형질감염되거나, 연속적으로 형질감염되거나, 별도로 형질감염된 후 두 쇄를 모두 발현하는 숙주 세포를 형성하도록 융합된다.
신규한 항원-특이성을 존재하는 성숙 항체로 이식하기 위하여 유사한 과정을 따를 수 있다. 바람직하게는, CDR 공여체 항체와 동일한 가변 배아계 유전자로부터 기원한 수용체 항체가 선택된다. 그 후 공여체 항체로부터의 하나 이상의 CDRs를 상기한 기술을 이용하여 전달한다.
인간 IgGκ를 위한 발현 벡터 제작에 사용하기 위한 예시적 플라스미드가 아래 기재된다. PCR 증폭된 V 중쇄 및 V 카파 경쇄 cDNA 서열을 완전한 중쇄 및 경쇄 미니유전자를 재제작하는데 사용할 수 있도록 플라스미드를 제작하였다. 이들 플라스미드를 완전한 인간 IgG1,κ 또는 IgG4,κ 항체를 발현하는데 사용할 수 있다. 유사한 플라스미드를 다른 중쇄 이소타입의 발현을 위해서나, 람다 경쇄를 포함하는 항체의 발현을 위해 제작할 수 있다.
따라서, 다른 구체예에서 본 발명은 인간 항-CD25 항체를 제조하는 다양한 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 그 방법은
(1) 인간 중쇄 프레임워크 부위와, 인간 중쇄 CDRs 중 적어도 하나가 도 1-10에 나타낸 CDRs의 아미노산 서열(또는 서열번호 17-19, 23-25, 29-31 또는 35-37의 상응하는 아미노산 잔기)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 CDRs; 및 (2) 인간 경쇄 프레임워크 부위와, 인간 경쇄 CDRs의 적어도 하나가 도 1-10에 나타낸 CDRs의 아미노산 서열(또는 서열번호 20-22, 26-28, 32-34 또는 38-40의 상응하는 아미노산 잔기)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 CDRs를 포함하고; CD25에 결합하는 능력을 보유하는 항체를 제조하는 것:
을 포함한다.
그 후 CD25에 결합하는 항체의 능력은 실시예에 기재된 것들(예를 들어, FACS 분석)과 같은 표준 결합 검정법을 이용하여 결정될 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화도에 특히 중요한 역할을 한다는 것이 당업계에 잘 알려져 있으므로, 상기한 바와 같이 제조된 본 발명의 재조합 항체는 바람직하게는 AB1, AB7, AB11 또는 AB12의 중쇄 및 경쇄 CDR3들을 포함한다. 항체는 추가로 AB1, AB7, AB11 또는 AB12의 CDR2들을 포함할 수 있다. 항체는 추가로 AB1, AB7, AB11 또는 AB12의 CDR1들을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 (1) 인간 중쇄 프레임워크 부위, 인간 중쇄 CDR1 부위, 인간 중쇄 CDR2 부위, 및 도 1-10에 나타낸 AB1, AB7, AB11 또는 AB12의 CDR3(또는 서열번호 19, 25, 31 또는 37의 상응하는 아미노산 잔기)인 인간 중쇄 CDR3 부위; 및 (2) 인간 경쇄 프레임워크 부위, 인간 경쇄 CDR1 부위, 인간 경쇄 CDR2 부위, 및 도 1-10에 나타낸 AB1, AB7, AB11 또는 AB12의 CDR3(또는 서열번호 22, 28, 34 또는 40의 상응하는 아미노산 잔기)인 인간 경쇄 CDR3 부위를 포함하고, CD25에 결합하는 항-CD25 항체를 제공한다. 항체는 추가로 AB1, AB7, AB11 또는 AB12의 중쇄 CDR2 및(또는) 경쇄 CDR2를 포함할 수 있다. 항체는 추가로 AB1, AB7, AB11 또는 AB12의 중쇄 CDR1 및(또는) 경쇄 CDR1을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 조작된 항체의 CDR1, 2 및(또는) 3는 여기에 개시된 AB1, AB7, AB11 또는 AB12의 CDR들과 정확한 아미노산 서열(들)을 포함한다. 그러나, CD25에 효과적으로 결합하는 항체의 능력은 여전히 보유하면서 AB1, AB7, AB11 또는 AB12의 정확한 CDR 서열들로부터 일부 오차(예를 들어, 보존적 치환)가 가능할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 다른 구체예에서, 조작된 항체는 AB1, AB7, AB11 또는 AB12의 하나 이상의 CDRs에 예를 들어 90%, 95%, 98% 또는 99.5%의 상동성을 갖는 하나 이상의 CDRs로 구성될 수 있다.
CD25에 단순히 결합하는 것에 부가하거나 대체하여, 상기한 것들과 같은 조작된 항체는
(1) CD25에 대한 고친화도 결합;
(2) IL-2에 대한 CD25 결합의 저해 또는 차단;
(3) CD25 발현 T 세포의 제거;
(4) T 세포의 내성화;
(5) CD25 발현 T 세포의 증식 저해;
(6) PBMCs의 항-CD3 항체-유도된 T 세포 증식의 저해;
(7) MLR의 저해; 및(또는)
(8) T 세포 상에 발현된 CD25의 내재화
와 같은, 본 발명의 항체의 다른 기능적 성질의 보유에 대해 선별될 수 있다.
CD25 에 대한 인간 모노클로날 항체 결합의 특성규명
본 발명의 인간 항-CD25 항체는 수많은 다른 방법으로 단리되고 특성규명될 수 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체를 정제하기 위해 선별된 하이브리도마를 적당한 플라스크에서 성장시킬 수 있다. 그 후 상등액을 단백질 A-세파로스(IgG1 이소타입 항체를 위해)(파마시아(Pharmacia), 뉴저지주 피스카타웨이)나 IgG3 이소타입 항체의 경우 항-인간 IgG 코팅된 세파로스 또는 단백질 G-세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피 전에 여과 및 농축할 수 있다. 용출된 IgG를 순도를 보장하기 위해 겔 전기영동과 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 조사할 수 있다. 완충용액을 PBS로 교환하고, 1.43 흡광계수를 이용하여 OD280으로 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분액하여 -80 ℃에서 저장할 수 있다.
선별된 인간 항-CD25 모노클로날 항체가 독특한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위하여, 부위-특이적 또는 다중-부위 특이적 돌연변이유발을 사용할 수 있다.
정제된 항체의 이소타입을 결정하기 위하여, 이소타입 ELISAs를 수행할 수 있다. 마이크로타이터 플레이트의 웰을 10 ㎍/㎖의 항-인간 Ig로 4 ℃에서 밤새 코팅할 수 있다. 5% BSA(소 혈청 알부민)로 블로킹한 후, 플레이트를 상온에서 2 시간 동안 10 ㎍/㎖의 모노클로날 항체 또는 정제된 이소타입 대조와 반응시킨다. 그 후 웰을 인간 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4, IgE, IgA1, IgA2, 또는 인간 IgM-특이적 알칼라인 포스파타제-콘쥬게이션된 프로브와 반응시킨다. 세척 후, 플레이트를 pNPP 기질(1 ㎎/㎖)로 현상하고 405 ㎚에서의 OD에 의해 분석한다.
면역화된 마우스의 혈청에서 항-CD25 항체의 존재나 CD25를 발현하는 살아있는 세포에 대한 모노클로날 항체의 결합을 입증하기 위하여, 플로우 사이토메트리를 이용할 수 있다. 간략하게는, CD25를 발현하는 세포주(표준 성장 조건 하에서 성장시킨)를 0.1% BSA와 0.02% 나트륨아지드를 함유하는 PBS 중의 다양한 농도의 모노클로날 항체와 혼합하고, 4 ℃에서 30 분간 인큐베이션한다. 세척 후, 세포를 일차 항체 염색과 동일한 조건 하에서 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG 항체와 반응시킨다. 샘플을 단일 생존 세포를 게이팅(gating)하기 위해 광산란 및 측산란성을 이용하는 플로우 사이토미터(예를 들어, 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson) FACS 장치)를 이용한 플로우 사이토메트리에 의해 분석할 수 있다. 플로우 사이토메트리에 (부가하거나 대신하여), 형광 현미경을 이용하는 대체 검정법을 사용할 수 있다. 상기한 바와 같이 세포를 정확하게 염색하고 형광 현미경에 의해 검사할 수 있다. 이 방법은 개개 세포의 가시화를 허용하지만, 항원 밀도에 따라 감도가 감소될 수 있다.
항-CD25 인간 IgGs는 웨스턴 블랏팅에 의해 CD25 항원과의 반응성에 대해 더 시험될 수 있다. 간략하게는, CD25 발현 세포로부터의 세포 추출물을 제조하고 소듐 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킬 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 20% 탈지유로 차단하여, 시험하고자 하는 모노클로날 항체로 프로빙할 수 있다. 인간 IgG 결합을 항-인간 IgG 알칼라인 포스파타제를 사용하여 검출하고 BCIP/NBT 기질 정제(시그마 케미칼 캄파니(시그마 케미칼 캄파니), 미주리주 세인트 루이스)로 현상할 수 있다.
CD25 발현 세포의 활성 저해
CD25에 대한 결합 특이성에 부가하여, CD25 발현 T 세포 및 기타 림프구와 같은 세포들의 다양한 활성을 저해하는 능력에 대해 인간 모노클로날 항-CD25 항체를 시험할 수 있다. 예를 들면, T 세포 증식 검정법을 공지의 기술을 이용하여 수행할 수 있다. 한 기술에서, T 세포 증식에 미치는 영향을 결정하기 위하여 인간 PBMCs를 적당한 배지에서 희석한 다음 예를 들어 항-CD3 항체로 자극한 후, 다양한 농도의 실험 항체를 첨가한다. 정제된 T 세포의 T 세포 증식을 또한, 항-CD3 및 항-CD28 모노클로날 항체의 존재 하에 측정할 수 있다.
MLR 검정법을 또한 공지 기술을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 제1 공여체로부터의 PBMCs를 조사하고(irradiated) 제2 공여체로부터의 PBMCs와 혼합한다. 그 후 변화하는 농도의 항체를 세포에 가한 후, MLR 반응을 측정한다.
Ⅱ. 인간 모노클로날 항- CD25 항체를 생성하는 형질전환 비인간 동물의 생산
또다른 측면에서, 본 발명은 CD25에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 발현할 수 있는 형질전환 또는 염색체도입 마우스와 같은, 형질전환 및 염색체도입 비인간 동물을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 마우스가 CD25 발현 세포로 면역화될 때 인간 항-CD25 항체를 생산하도록, 인간 중쇄 형질전환유전자를 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 또는 염색체도입 마우스를 제공한다. 여기에 상세히 기재되고 예시된 형질전환, 예를 들어 HuMAb 마우스의 경우와 같이, 인간 중쇄 형질전환유전자를 마우스의 염색체 DNA에 통합시킬 수 있다. 다르게는, WO 02/43478에 기재된 바와 같이 염색체도입(예를 들어, KM) 마우스의 경우처럼, 인간 중쇄 형질전환유전자를 염색체 외적으로 유지할 수 있다. 상기 형질전환 및 염색체도입 동물은 V-D-J/V-J 재조합 및 이소타입 스위칭을 거침으로써 CD25에 대한 다중 이소타입(예를 들어, IgG, IgA 및(또는) IgE)의 인간 모노클로날 항체를 생산할 수 있다. 이종 항체 레파토리에 의한 외래 항원 자극에 반응하는 형질전환 또는 염색체도입 비인간 동물의 설계는, 형질전환 동물 내에 함유된 이종 면역글로불린 형질전환유전자가 B 세포 발생 경로에 걸쳐 정확하게 기능할 것을 필요로 한다. 이것은 예를 들면, 이종 중쇄 형질전환유전자의 이소타입 스위칭을 포함한다. 따라서, 형질전환유전자는 이소타입 스위칭이 유도되고 항체 유전자의 하기 특성들 중 하나 이상을 갖도록 제작된다: (1) 고 수준 및 세포-유형 특이적 발현, (2) 기능적 유전자 재배열, (3) 대립형질 배제(allelic exclusion)의 활성화 및 그에 대한 반응, (4) 충분한 일차 레파토리의 발현, (5) 신호전달, (6) 체 과돌연변이, 및 (7) 면역 반응 동안 형질전환유전자 항체 좌위의 우성화.
상기 기준의 모두를 충족시킬 필요는 없다. 예를 들면, 형질전환 동물의 내생적 면역글로불린 위치가 기능적으로 파괴된 구체예에서, 형질전환유전자는 대립형질 배제를 활성화할 필요가 없다. 추가로, 형질전환유전자가 기능적으로 재배열된 중쇄 및(또는) 경쇄 면역글로불린 유전자를 포함하는 구체예에서, 기능적 유전자 재배열의 2번째 기준은 적어도 이미 재배열된 형질전환유전자에 대해서는 불필요하다. 분자면역학의 배경에 대해서는, Fundamental Immunology, 2판(1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y.를 참조.
특정 구체예에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생성하는데 사용되는 형질전환 또는 염색체도입 동물은 형질전환 동물의 배아계에서 재배열된, 비재배열된, 또는 재배열 및 비재배열된 이종 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 형질전환유전자의 결합을 함유한다. 각각의 중쇄 형질전환유전자는 하나 이상의 CH 유전자를 포함한다. 또한, 중쇄 형질전환유전자는 형질전환 동물의 B 세포에서 다중 CH 유전자를 코딩하는 이종 형질전환유전자의 이소타입 스위칭을 지원할 수 있는 기능적 이소타입 스위치 서열을 함유할 수 있다. 상기 스위치 서열들은 형질전환유전자 CH 유전자의 출처로서 역할하는 종으로부터의 배아계 면역글로불린 좌위에서 자연적으로 발생하는 것들이거나, 상기 스위치 서열들은 트랜스 유전자 제작물을 수여받는 종(형질전환 동물)에서 발생하는 것들로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 추측컨대 인간 스위치 서열이 그러하지 않는 반면, 마우스 스위치 서열은 마우스 스위치 재조합효소 시스템과 기능하도록 최적화되므로, 마우스 중쇄 위치에서 자연 발생하는 것들과 유사한 스위치 서열을 도입하면, 형질전환 마우스를 생산하는데 사용된 인간 형질전환유전자 제작물은 더 높은 빈도의 이소타입 스위칭을 생성할 수 있다. 스위치 서열을 단리하고 통상적인 클로닝 방법에 의해 클로닝하거나, 면역글로불린 스위치 부위 서열에 관하여 공개된 서열 정보(Mills 등, Nucl . Acids Res . 15: 7305-7316(1991); Sideras 등, Intl . Immunol . 1: 631-642(1989))를 기초로 하여 설계된 중첩된 합성 올리고뉴클레오티드로부터 새로이 합성될 수 있다. 각각의 상기 형질전환 동물에 대해, 기능적으로 재배열된 이종 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 형질전환유전자가 형질전환 동물의 상당한 부분(적어도 10%)의 B 세포에서 발견된다.
본 발명의 형질전환 비인간 동물을 생성하는데 사용되는 형질전환유전자는 하나 이상의 가변 유전자 조각, 하나의 다양성 유전자 조작, 하나의 연결 유전자 조각, 및 하나 이상의 불변영역 유전자 조각을 코딩하는 DNA를 포함하는 중쇄 형질전환유전자를 포함한다. 면역글로불린 경쇄 형질전환유전자는 하나 이상의 가변 유전자 조각, 하나의 연결 유전자 조각, 및 하나 이상의 불변영역 유전자 조각을 포함한다. 경쇄 및 중쇄 유전자 조각을 코딩하는 유전자 조각은 그들이 형질전환 비인간 동물을 이루는 종으로부터의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 조각을 코딩하는 DNA로부터 유래되거나 그에 상응한다는 점에서 형질전환 동물에 대해 이종적이다. 본 발명의 일 측면에서, 형질전환유전자는 개개 유전자 조각이 비재배열, 즉 기능적 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 코딩하도록 재배열되지 않도록 제작된다. 상기 비재배열된 형질전환유전자는 V, D 및 J 유전자 조각의 재조합(기능적 재배열)을 지원하고, 바람직하게는 CD25 항원에 노출될 때 형질전환 동물 내에서 생성된 재배열된 면역글로불린 중쇄에서 D 부위 유전자 조각의 모두 또는 일부의 도입을 지원한다.
대체 구체예에서, 형질전환유전자는 비재배열된 "미니-좌위"를 포함한다. 상기 형질전환유전자는 전형적으로 C, D 및 J 조각의 실질적인 부분과 V 유전자 조각의 서브세트를 포함한다. 상기 형질전환유전자 구조물에서 다양한 조절 서열들, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 클래스 스위치 부위, RNA 가공을 위한 스플라이스-공여체 및 스플라이스-수용체 서열, 재조합 신호 등은 이종 DNA로부터 유래된 상응하는 서열을 포함한다. 상기 조절 서열은 본 발명에서 사용된 비인간 동물과 동일하거나 관련된 종으로부터의 형질전환유전자 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자 조각들을 형질전환 마우스에서 사용하기 위해, 설치류 면역글로불린 인핸서 서열을 갖는 형질전환유전자에 결합될 수 있다. 다르게는, 합성 조절 서열들이 형질전환유전자로 도입될 수 있으며, 상기 합성 조절 서열들은 포유류의 게놈에서 자연적으로 발생하는 것으로 알려져 있는 기능적 DNA 서열과 상동적이지 않다. 합성 조절 서열들은 예를 들어, 스플라이스-수용체 위치나 프로모터/인핸서 모티프의 허용가능한 서열을 특정하는 것들과 같은 컨센서스(consensus) 규칙에 따라 설계된다. 예를 들면, 미니좌위는 자연적으로 발생하는 배아계 Ig 위치에 비해 비필수 DNA 부분(예를 들어, 중간 서열; 인트론이나 그의 일부)의 하나 이상의 내부적(즉, 부분의 말단에서가 아닌) 결실을 갖는 게놈 면역글로불린 좌위의 일부를 포함한다.
바람직한 형질전환 및 염색체도입 비인간 동물, 예를 들어 마우스는 부피를 조정한 후 이상적으로는 인간의 것과 실질적으로 유사한, 유의한 레파토리를 갖는 면역글로불린 생산을 나타낼 것이다.
이상적으로 레파토리는 부피가 조정될 때 인간에서 나타나는 것에 보통 적어도 약 10%, 바람직하게는 25 내지 50% 이상의 다양성을 가질 것이다. 일반적으로, 마우스 게놈으로 도입되고 V(-D-)J 유전자 조각 재배열과 연결 부위에서의 무작위 뉴클레오티드 부가에 의해 지시되는 상이한 V, J 및 D 부위의 수에 따라 적어도 약 천 개, 바람직하게는 104 내지 106 이상의 상이한 면역글로불린(이상적으로는 IgG)이 생산될 것이다. 전형적으로는, 면역글로불린은 미리 선택된 항원에 대해 10-9 M, 10-10M 또는 10-11 M 또는 심지어 그 미만과 같은 10-8 M 미만의 친화도(KD)를 나타낼 것이다. 상기한 바와 같은 형질전환 및 염색체도입 비인간 동물, 예를 들어 마우스는 예를 들면 CD25 발현 세포로 면역화될 수 있다. 다르게는, 형질전환 동물은 인간 CD25를 코딩하는 DNA로 면역화될 수 있다. 그러면 동물은 스위치 재조합(시스-스위칭)을 통해 클래스-스위치를 수행하고 CD25에 반응하는 면역글로불린을 발현하는 B 세포를 생산할 것이다. 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드가 체돌연변이와 V 부위 재조합적 결합, 및 배아계-코딩된 서열들에 의해 유래된 서열들을 포함할 수 있는, 인간 형질전환유전자 서열에 의해 코딩되는 인간 항체("인간 서열 항체"라고도 함)일 것이다; 체돌연변이와 차등적 V-J 및 V-D-J 재조합적 결합의 결과 다른 비-배아계 서열들이 존재할 수 있을지라도, 이들 인간 항체는 인간 VL 및 JL 또는 VH, DH 및 JH 유전자 조각에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일하다고 할 수 있다. 각각의 항체의 가변영역은 전형적으로는 인간 배아계 V 및 J 유전자 조각, 및 중쇄의 경우, 인간 배아계 V, D 및 J 유전자 조각과 적어도 80 퍼센트 유사하고; 형질전환유전자에 존재하는 인간 배아계 서열과 자주 90 또는 95 퍼센트 이상 유사하다. 그러나, 비배아계 서열들이 체돌연변이와 VJ 및 VDJ 결합에 의해 도입되므로, 인간 서열 항체는 빈번하게 마우스의 배아계에서의 인간 형질전환유전자(들)에서 발견되는 인간 V, D 또는 J 유전자 조각에 의해 코딩되지 않은 일부 가변영역 서열들을 가질 것이다. 전형적으로는, 상기 비배아계 서열들(또는 개개 뉴클레오티드 위치들)은 CDR 내 또는 부근, 또는 체돌연변이가 모여 있는 것으로 알려져 있는 부위에 모여 있다.
본 발명의 다른 측면은 여기에 기재된 바와 같은 형질전환 또는 염색체도입 비인간 동물로부터 유래된 B 세포를 포함한다. B 세포는 인간 CD25에 높은 친화도(예를 들어, 10-8 M 보다 낮은 해리 평형 상수(KD))로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마를 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 방사성 표지된 모노클로날 항체를 사용하는 CD25 발현 세포의 스캣차드 분석, FACS 분석을 이용하는 1/2-최대 결합 농도의 결정, 또는 바이아코어 장치에서 측정되는 표면 플라스몬 공명을 이용한 분석으로 결정될 때 10-9 M 미만, 10-10 M 또는 10-11 M, 또는 심지어 그 미만과 같은 10-8 M 미만의 친화도(KD)를 갖는 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다.
여기에서 모노클로날 항체는(1) 인간 VL 유전자 조각 및 인간 JL 조각에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변영역, 및 (2) 인간 CL 유전자 조각에 의해 코딩되는 경쇄 불변영역으로 구성되는 인간 서열 경쇄; 및 (1) 인간 VH 유전자 조각, D 부위 및 인간 JH 조각에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변영역, 및 (2) 인간 CH 유전자 조각에 의해 코딩되는 불변영역으로 구성되는 인간 서열 중쇄를 포함한다. 인간 D 유전자들은 원래 인간 배아계 서열이 쉽게 인식되지 않도록 재조합 및 체돌연변이에 의해 실질적으로 변형될 수 있음을 주목해야 한다.
CD25에 대한 고친화도 인간 모노클로날 항체의 개발은 통합된 인간 면역글로불린 형질전환유전자에 존재하지 않는 V 부위 유전자 조각을 포함하는 V 유전자 형질전환유전자를 게놈으로 도입하는 것을 포함하는, 통합된 인간 면역글로불린 형질전환유전자를 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물에서 인간 가변영역 유전자 조각들의 레파토리를 확장하는 방법에 의해 용이하게 될 수 있다. 흔히, V 부위 형질전환유전자는 인간 게놈에서 자연 발생하거나 재조합 방법에 의해 별도로 함께 스플라이싱될 수 있는, 순서가 바뀌거나(out-of-order) 생략된 V 유전자 조각들을 포함할 수 있는, 인간 VH 또는 VL(Vκ) 유전자 조각 어레이의 일부를 포함하는 효모 인공 염색체(YAC)이다. 흔히 5 개 이상의 기능적 V 유전자 조각들이 YAC 상에 포함되어 있다. 이 변이에서, V 부위 형질전환유전자에 존재하는 V 부위 유전자 조각에 의해 코딩되는 가변영역 서열 및 인간 Ig 형질전환유전자 상에서 코딩되는 C 부위를 포함하는 면역글로불린 쇄를 발현하는 형질전환 동물을, V 레파토리 확장 방법으로 생산할 수 있다. V 레파토리 확장 방법에 의해, 약 24 개 이상의 V 유전자들을 포함하는 동물들을 생성할 수 있듯이, 5 개의 상이한 V 유전자들을 갖는 형질전환 동물들을 생성할 수 있다. 일부 V 유전자 조각들은 비기능적일 수 있고(예를 들어, 슈도유전자 등), 이들 조각은 원하는 경우, 보유될 수 있거나 당업자에게 이용가능한 재조합 방법에 의해 선별적으로 결실될 수 있다.
일단 마우스 배아계를 J 및 C 유전자 조각들을 함유하는 인간 Ig 형질전환유전자에 실질적으로 존재하지 않는 확장된 V 조각 레파토리를 갖는 기능적 YAC를 포함하도록 조작되면, 그 유전형질(trait)은 확장된 V 조각 레파토리를 갖는 기능적 YAC가 상이한 인간 Ig 형질전환유전자를 갖는 비인간 동물 배아계로 교배되는 백그라운드를 포함한 다른 유전적 백그라운드로 전파되고 교배될 수 있다. 확장된 V 조각 레파토리를 갖는 다중 기능적 YACs는, 인간 Ig 형질전환유전자(또는 다중 인간 Ig 형질전환유전자들)와 작동하도록 배아계로 교배될 수 있다. 여기서 YAC 형질전환유전자들이라 하지만, 상기 형질전환유전자들은 게놈에 통합될 때 효모에서 자가 복제에 요구되는 서열들과 같은 효모 서열들을 실질적으로 갖지 않을 수 있고, 상기 서열들은 효모에서의 복제가 더 이상 필요하지 않게 된 다음(즉, 마우스 ES 세포 또는 마우스 전수정란(prozygote)으로의 도입 전에) 유전자 조작(예를 들어, 제한효소 분해 및 펄스-필드 겔 전기영동 또는 다른 적당한 방법)에 의해 임의로 제거될 수 있다. 인간 서열 면역글로불린 발현의 유전형질을 전파하는 방법은 인간 Ig 형질전환유전자(들) 발현, 및 임의로 확장된 V 조각 레파토리도 갖는 기능적 YAC를 갖는 형질전환 동물을 교배하는 것을 포함한다. VH 및 VL 유전자 조각들 모두가 YAC 상에 존재할 수 있다. 형질전환 동물은 인간 Ig 형질전환유전자 및(또는) 다른 인간 림프구 단백질을 코딩하는 형질전환유전자를 비롯한, 다른 인간 형질전환유전자를 갖는 백그라운드를 포함하는, 실험자가 원하는 어떠한 백그라운드로도 교배될 수 있다. 본 발명은 또한 확장된 V 부위 레파토리 YAC 형질전환유전자를 갖는 형질전환 마우스에 의해 생산된 고친화도 인간 서열 면역글로불린을 제공한다. 상기한 것이 본 발명의 형질전환 동물의 바람직한 구체예를 기재한 것이지만, 하기 3가지의 카테고리로 분류되는 다른 구체예들이 고려된다:
Ⅰ. 비재배열 중쇄 및 재배열 경쇄 면역글로불린 형질전환유전자를 포함하는 형질전환 동물;
Ⅱ. 비재배열 중쇄 및 비재배열 경쇄 면역글로불린 형질전환유전자를 포함하는 형질전환 동물; 및
Ⅲ. 재배열 중쇄 및 비재배열 경쇄 면역글로불린 형질전환유전자를 포함하는 형질전환 동물.
이들 카테고리의 형질전환 동물 중, 바람직한 순서는 아래와 같다: 내생적 경쇄 유전자들(또는 적어도 κ 유전자)이 상동적 재조합(또는 다른 방법)에 의해 녹아웃된 경우 Ⅱ > Ⅰ >Ⅲ, 그리고 내생적 경쇄 유전자들이 녹아웃되지 않고 대립형질 배제에 의해 우성화되어야만 하는 경우 Ⅰ > Ⅱ >Ⅲ.
Ⅲ. CD25 에 결합하는 이중특이적 /다중특이적 분자
본 발명의 또다른 구체예에서, CD25에 대한 인간 모노클로날 항체는 유도체화되거나 다른 기능적 분자, 예를 들어 다른 펩티드나 단백질(예를 들어, Fab' 단편)에 연결되어 다중 결합 위치나 표적 에피토프에 결합하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 다른 항체, 펩티드 또는 결합 모방체와 같은 하나 이상의 다른 결합 분자에 기능적으로 연결(예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 결합 또는 기타에 의해)될 수 있다.
따라서, 본 발명은 CD25에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이체와 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이체를 포함하는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 제2 표적 에피토프는 CD3, CD4, IL-15R, 막 결합 또는 수용체 결합 TNF-α, 막 결합 또는 수용체 결합 IL-15이다. 다른 구체예에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어, 인간 FcγRⅠ(CD64) 또는 인간 FcαRⅠ(CD89) 또는 T 세포 수용체이다. 따라서, 본 발명은 이펙터 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 다형핵 세포(PMNs))를 발현하는 FcγR, FcαR 또는 FcεR에 모두 결합할 수 있는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 이들 이중특이적 및 다중특이적 분자는 CD25 발현 세포를 이펙터 세포로 표적화하고, 본 발명의 인간 모노클로날 항체와 같이, CD25 발현 세포의 식균작용, ADCC, 사이토카인 방출 또는 슈퍼옥사이드 음이온의 생성과 같은 Fc 수용체-매개된 이펙터 세포 활성을 유발한다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 항-Fc 결합 특이체와 항-CD25 결합 특이체에 더하여, 추가로 제3 결합 특이체를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 제3 결합 특이체는 항-증진 인자(EF) 부분, 예를 들어 세포독성 활성에 관여하는 표면 단백질에 결합하여 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 분자이다. "항-증진 인자 부분"은 특정 분자, 예를 들어 항체나 수용체에 결합하여 Fc 수용체나 표적 세포 항원에 대한 결합 결정기의 효과를 증진시키는 항체, 기능적 항체 단편 또는 리간드일 수 있다. "항-증진 인자 부분"은 Fc 수용체나 표적 세포 항원과 결합할 수 있다. 다르게는, 항-증진 인자 부분은 제1 및 제2 결합 특이체가 결합하는 실체와 상이한 실체와 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-증진 인자 부분은 세포독성 T 세포(예를 들어, CD2, CD3,CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 다른 면역 세포를 통해)와 결합할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 결합 특이체로서 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv를 포함하는 하나 이상의 항체를 포함한다. 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 다이머, 또는 Fv나 Ladner 등의 US 4,946,778에 기재된 바와 같은 단일 쇄 구조물과 같은 그의 임의의 최소 단편일 수 있다. 항체는 또한 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 개시되어 있는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질일 수 있다.
일 구체예에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 결합이 인간 면역글로불린 G(IgG)에 의해 차단되지 않는 인간 모노클로날 항체에 의해 제공된다. 여기에 사용된 용어 "IgG 수용체"는 염색체 1에 위치한 8 개의 γ-쇄 유전자 중 임의의 것을 가리킨다. 이들 유전자는 FcγRⅠ(CD64), FcγRⅡ(CD32) 및 FcγRⅢ(CD16)의 3 개의 Fcγ 수용체 클래스로 그룹화되는 총 12 개의 막횡단 또는 가용성 수용체 이소폼을 코딩한다. 하나의 바람직한 구체예에서, Fcγ 수용체는 인간 고친화도 FcγRⅠ이다.
이들 바람직한 모노클로날 항체의 생산과 특성규명은 Fanger 등에 의해 WO 88/00052 및 US 4,954,617에 기재되어 있다. 이들 항체는 수용체의 Fcγ 결합 위치와 구별되는 위치에서 FcγRⅠ, FcγRⅡ 또는 FcγRⅢ의 에피토프와 결합하고, 따라서 그들 결합은 생리학적 수준의 IgG에 의해 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에서 유용한 특이적 항-FcγRⅠ 항체들은 MAb 22, MAb 32, MAb 44, MAb 62 및 MAb 197이다. 다른 구체예에서, 항-FcγRⅠ 항체는 인간화된 형태의 MAb 22(H22)이다. H22 항체의 생산과 특성규명은 Graziano, R. F. 등(1995) J. Immunol . 155(10): 4996-5002 및 WO 94/10332에 기재되어 있다. H22 항체 생산 세포주는 HA022CL1이라는 명칭으로 1992년 11월 4일에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁되었고 수탁번호 CRL 11177을 갖는다.
또 다른 바람직한 구체예에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 결합이 바람직하게는 인간 면역글로불린 A(IgA)에 의해 차단되지 않는 인간 IgA 수용체, 예를 들어 FcαRⅠ(CD89)에 결합하는 항체에 의해 제공된다. 용어 "IgA 수용체"는 염색체 19에 위치한 하나의 α-유전자(FcαRⅠ)의 유전자 산물을 포함하고자 하는 것이다. 이 유전자는 얼터네이티브 스플라이싱(alternative splicing)된 55 내지 110 kDa의 몇몇 막횡단 이소폼을 코딩하는 것으로 알려져 있다. FcαRⅠ(CD89)은 단핵구/대식세포, 호산성 및 호중성 과립구 상에서 항시적으로 발현되지만, 비-이펙터 세포 집단에서는 그렇지 않다. FcαRⅠ은 IgA1 및 IgA2 모두에 대해 중간 친화도를 갖는데, G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 사이토카인에 노출 시 증가된다(Morton, H. C. 등(1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). IgA 리간드 결합 도메인 밖의 FcαRⅠ에 결합하는 A3, A59, A62 및 A77로 동정된, 4 개의 FcαRⅠ-특이적 모노클로날 항체들이 기재된 바 있다(Monteiro, R. C. 등, 1992, J. Immunol. 148: 1764).
FcαRⅠ 및 FcγRⅠ은 (1) 면역 이펙터 세포, 예를 들어 단핵구, PMNs, 대식세포 및 수상세포 상에서 주로 발현되고; (2) 높은 수준(예를 들어, 세포 당 5,000-100,000)으로 발현되며; (3) 세포독성 활성(예를 들어, ADCC, 식균작용)의 매개자이고; (4) 그들에 표적화된 자가-항원을 포함하는 항원의 증진된 항원 제시를 매개하므로, 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 유발 수용체들이다.
여기서 사용되는 "이펙터 세포 특이적 항체"는 이펙터 세포의 Fc 수용체에 결합하는 항체나 기능적 항체 단편을 가리킨다. 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 항체는, 내생적 면역글로불린에 의해서는 결합되지 않는 위치에서 이펙터 세포의 Fc 수용체에 결합한다.
여기에 사용된 용어 "이펙터 세포"는 면역 반응의 인지 및 활성화 기에 반대되는, 면역 반응의 이펙터 기에 관여하는 면역 세포를 가리킨다. 예시적인 면역 세포는 척수나 림프 기원의 세포, 예를 들어, 림프구(예를 들어, B 세포와 세포독성 T 세포(CTLs)를 포함하는 T 세포), 살해자 세포, 천연 살해자 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 호중구, 다형핵 세포, 과립구, 비만세포 및 호염기구를 포함한다. 일부 이펙터 세포는 특이적 Fc 수용체를 발현하고 특이적 면역 기능을 수행한다. 바람직한 구체예에서, 이펙터 세포는 ADCC를 유발할 수 있고, 예를 들어, ADCC를 유도할 수 있는 호중구이다. 예를 들어, FcR을 발현하는 단핵구, 대식세포는 표적 세포의 특이적 살해와 면역 시스템의 다른 구성원에 대한 항원 제시나, 항원을 제시하는 세포에 대한 결합에 관여한다. 다른 구체예에서, 이펙터 세포는 표적 항원, 표적 세포, 또는 미생물을 식균할 수 있다. 이펙터 세포 상의 특정 FcR의 발현은 사이토카인과 같은 체액성 인자에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, FcγRⅠ의 발현은 인터페론 감마(IFN-γ)에 의해 상향-조절되는 것으로 밝혀져 있다. 이 증진된 발현은 표적에 대한 FcγRⅠ-함유 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 이펙터 세포는 표적 항원이나 표적 세포를 식균하거나 용균할 수 있다.
"표적 세포"는 본 발명의 조성물(예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자)에 의해 표적화될 수 있는, 대상(예를 들어, 인간이나 동물)의 임의의 세포를 의미한다. 바람직한 구체예에서, 표적 세포는 CD25를 발현 또는 과잉발현하는 세포이다. CD25를 발현하는 세포는 전형적으로 활성화된 T 세포, 단핵구 및 B 세포를 포함한다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 화학적 기술(예를 들어, D. M. Kranz 등(1981) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78: 5807 참조), "폴리도마" 기술(Reading의 US 4,474, 893 참조), 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
특히, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 당업계에 알려지고 여기에 제공된 실시예에 기재된 방법을 이용하여, 성분 결합 특이체, 예를 들어, 항-FcR 및 항-CD25 결합 특이체를 콘쥬게이션화함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 및 다중특이적 분자의 각각의 결합 특이체는 별도로 생성된 후 서로 콘쥬게이션될 수 있다. 결합 특이체가 단백질이나 펩티드일 때, 다양한 커플링제 또는 가교결합제를 공유적 콘쥬게이션을 위해 사용할 수 있다. 가교결합제의 예들은 단백질 A, 카보디이미드, N-석신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 및 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC)(예를 들어, Karpovsky 등(1984) J. Exp . Med . 160: 1686; Liu, MA 등(1985) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82: 8648 참조)를 포함한다. 다른 방법은 Paulus, Behring Ins . Mitt .(1985) No. 78,118-132; Brennan 등, Science(1985) 229: 81-83, 및 Glennie 등, J. Immunol .(1987) 139: 2367-2375에 기재된 것들을 포함한다. 바람직한 콘쥬게이션화제는 둘 다 Pierce Chemical Co.(락포드, IL)로부터 입수가능한 SATA와 설포-SMCC이다.
결합 특이체가 항체일 때, 그들은 두 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 설프하이드릴 결합을 통해 콘쥬게이션될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 힌지 영역은 콘쥬게이션 전에 홀수의, 바람직하게는 하나의 설프하이드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
다르게는, 두 결합 특이체 모두를 동일한 벡터에 코딩하고 동일한 숙주 세포에서 발현하고 조립할 수 있다. 이 방법은 이중특이적 및 다중특이적 분자가 MAb×MAb, MAb×Fab, Fab×F(ab')2 또는 리간드×Fab 융합 단백질인 경우 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자, 예를 들어 이중특이적 분자는 단일 쇄 이중특이적 항체, 하나의 단일 쇄 항체와 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자, 또는 두 개의 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자와 같은 단일 쇄 분자일 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한 단일 쇄 분자일 수 있거나 적어도 두 개의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 상기 이중- 및 다중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 US 5,260,203; US 5,455,030; US 4,881,175; US 5,132,405; US 5,091,513; US 5,476,786; US 5,013,653; US 5,258,498; 및 US 5,482,858에 기재되어 있다.
이중특이적 및 다중특이적 분자의 특이적 표적에 대한 결합은 효소-결합 면역흡착 검정법(ELISA), 방사성면역검정법(RIA), FACS 분석, 생검(예를 들어, 성장 저해), 바이아코어 분석 또는 웨스턴 블랏 검정법에 의해 확인될 수 있다. 각각의 이들 검정법은 일반적으로 관심있는 복합체에 대해 특이적인 표지된 시약(예를 들어, 항체)을 사용하여 특별히 관심있는 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는 예를 들어, 항체-FcR 복합체를 인식하고 특이적으로 결합하는 효소-결합된 항체나 항체 단편을 이용하여 검출될 수 있다. 다르게는, 복합체는 다양한 다른 면역검정법 중 어느 것을 사용하여서도 검출될 수 있다. 예를 들어, 항체를 방사성 표지하고 방사성면역검정법(RIA)에 사용할 수 있다(예를 들어, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 참조). 방사성 동위원소는 γ 계수기나 섬광계수기의 사용과 같은 수단이나 오토래디오그래피에 의해 검출될 수 있다.
Ⅳ. 면역콘쥬게이트
본 발명의 다른 측면에서, 인간 항-CD25 항체는 세포독소, 약물(예를 들어, 면역억제제)이나 방사성 동위원소와 같은 치료 부위에 콘쥬게이션된다. 상기 콘쥬게이트는 여기서 "면역콘쥬게이트"라 한다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역콘쥬게이트를 "면역독소"라 한다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 치명적인(예를 들어, 죽이는) 임의의 시약을 포함한다. 예들은 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 마이토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 마이톡산트론, 마이트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신, 또는 그들의 유사체와 상동체를 포함한다.
본 발명의 면역콘쥬게이트를 형성하는데 적당한 치료제는 항대사물(예를 들어, 메쏘트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카뮤스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 마이토마이신 C 및 시스플라틴(시스-디클로로디아민 플래티넘(Ⅱ)(DDP)), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)), 및 항-유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 항체에 콘쥬게이션될 수 있는 치료 세포독소의 다른 예들은 칼리케아미신과 두오카마이신을 포함한다.
본 발명의 항체는 또한 방사성 동위원소, 예를 들어 요오드-131, 이트륨-90 또는 인듐-111에 콘쥬게이션되어 암과 같은 CD25-관련 장애를 치료하기 위한 세포독성 방사성의약품을 생성할 수 있다. 본 발명의 항체 콘쥬게이트는 특정 생물학적 반응을 변형하는데 사용될 수 있고, 약물 잔기는 고전적 화학적 치료제로 제한되는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 약물 잔기는 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들어, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 A 또는 디프테리아 독소와 같은 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 활성 단편, 또는 포스포리파제 효소, 예를 들어 포스포리파제 C와 같은 세포 표면에 활성인 물질을 포함할 수 있다.
이렇게 치료 부위를 항체에 콘쥬게이션하는 기술은 잘 알려져 있다. 예를 들어, Arnon 등, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 등(eds.), pp. 243-56(Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom 등, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.), Robinson 등(eds.), pp. 623-53(Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera 등(eds.), pp. 475-506(1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 등(eds.), pp. 303-16(Academic Press 1985); 및 Thorpe 등, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol Rev ., 62: 119-58(1982)를 참조.
추가 구체예에서, 본 발명에 따른 인간 모노클로날 항체는 항체가 방사성 동위원소에 콘쥬게이션될 수 있도록 하는 링커-킬레이터(예를 들어 티욱세탄)에 결합될 수 있다.
Ⅴ. 제약 조성물
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 인간 모노클로날 항체의 하나 또는 배합물을 함유하는, 제약 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, l9th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995에 개시된 것들과 같은 통상적인 기술에 따라 제약학적으로 허용되는 담체나 희석제, 및 기타 임의의 공지된 애쥬번트와 부형제로 제제화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 병용 요법에, 즉 치료하고자 하는 질환이나 이상에 관련된 다른 약제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 병용 요법은 하나 이상의 면역억제제, 하나 이상의 항염증제, 하나 이상의 건선 약제, 또는 하나 이상의 화학요법제와 함께 본 발명의 조성물을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 치료제는 사이클로스포린, 아자티오프린, 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸, 프리드니손과 같은 코르티코스테로이드, 메쏘트렉세이트, 황금 염, 설파살라진, 항말라리아제, 브레퀴나르, 레프루노미드, 미조리빈, 15-데옥시스페르구알린, 6-머캅토퓨린, 사이클로포스파미드, 라파마이신, 타크롤리무스(FK-506), OKT-3, 항-티모사이트 글로불린 등과 같은 하나 이상의 면역억제제를 포함한다.
추가 구체예에서, 본 발명의 조성물은 프레드니손과 사이클로스포린; 프레드니손, 사이클로스포린과 아자티오프린; 또는 프레드니손, 사이클로스포린과 마이코페놀레이트 모페틸과 같은 두 개 이상의 면역억제제와 배합하여 투여된다.
추가 구체예에서, 상기 치료제는 스테로이드성 약물 또는 NSAID(비스테로이드성 항-염증제)와 같은 하나 이상의 항-염증제를 포함한다. 바람직한 약제는 예를 들어, 아스피린과 다른 살리실레이트, 로페콕시브와 셀레콕시브와 같은 Cox-2 저해제, 이부프로펜, 페노프로펜, 나프록센, 설린닥, 디클로페낙, 피록시캄, 케토프로펜, 디플루니살, 나부메톤, 에토도락, 옥사프로진과 인도메타신과 같은 NSAIDs를 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 치료제는 메쏘트렉세이트, 하이드록시클로로퀴논, 설파살라진, 피리미딘 합성 저해제, 예를 들어 레프루노미드, IL-1 수용체 차단제, 예를 들어 아나킨라와, TNF-α 차단제, 예를 들어 에타네르셉트, 인플릭시마브 및 아달리무마브와 같은 하나 이상의 DMARDs를 포함한다. 추가의 적당한 DMARDs는 항-IL-6R 항체, CTLA4Ig 및 항-IL-15 항체이다.
다른 구체예에서, 상기 치료제는 콜타르, A 비타민, 안트랄린, 칼시포트리엔, 타라조텐 및 코르티코스테로이드를 포함하는 국부 약제, 코르티코스테로이드, 메쏘트렉세이트, 레티노이드, 예를 들어 아시크레틴, 사이클로스포린, 에타네르셉트, 알레파셉트, 에팔루지마브, 6-티오구아닌, 마이코페놀레이트 모페틸, 타크롤리무스(FK-506) 및 하이드록시우레아와 같은 경구 또는 주사 약제와 같은 염증성 또는 과증식성 피부 이상을 치료하기 위한 하나 이상의 약제를 포함한다. 다른 예들은 CTLA4Ig와 인플릭시마브이다. 다른 치료는 햇빛에 대한 노출이나 UVB(광-밴드 및 협-밴드 자외선 B), UVA(자외선 A) 및 PUVA(소랄렌 메톡살렌 + 자외선 A)를 포함한 광요법을 포함할 수 있다.
추가 구체예에서, 본 발명의 조성물은 메쏘트렉세이트 + 광요법(PUVA 또는 UVA); 메쏘트렉세이트 + 아시크레틴; 아시트레틴 + 광요법(PUVA 또는 UVA); 메쏘트렉세이트 + 아시크레틴 + 광요법(PWA 또는 UVB); 하이드록시우레아 + 광요법(PUVA 또는 UVB); 하이드록시우레아 + 아시크레틴; 사이클로스포린 + 메쏘트렉세이트; 또는 칼시포트리엔 + 광요법(UVB)과 같은, 2 이상의 상기 요법과 결합하여 투여된다.
또다른 구체예에서, 상기 치료제는 독소루비신, 시스플라틴, 블레오마이신, 카르무스틴, 사이클로포스파미드, 빈데신, 빈크리스틴과 클로람부실과 같은 하나 이상의 화학요법제를 포함한다.
또다른 구체예에서, 본 항체는 방사선요법 및(또는) 골수 이식과 결합하여 투여될 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 항체는 다른 항체, 예를 들어 IL-2 수용체의 p75에 결합하는 항체나, 예를 들어 MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL- 5, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-10, CD11a, CD20 또는 CD58에 결합하는 항체와 같은 다른 면역억제성 인간 모노클로날 항체나, 그들의 리간드에 결합하는 항체와 배합하거나; 다른 면역조절 화합물, 예를 들어, 가용성 IL-15R 또는 IL-10과 배합하여 투여될 수 있다.
여기에 사용된 "제약학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 상용가능한 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅, 항세균 및 항진균제, 등장화제 및 흡착 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥 내, 근육 내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합하다(예를 들어, 주사나 주입에 의해).
"제약학적으로 허용되는 염"은 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고 어떠한 원치않는 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 가리킨다(예를 들어, Berge, S. M., 등(1977) J. Pharm . Sci . 66: 1-19 참조). 상기 염의 예들은 산 부가염과 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬산, 요오드산, 인산 등과 같은 비독성 무기산, 및 지방족 모노- 및 디카복실산, 페닐-치환된 알칸산, 하이드록시알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산 등과 같은 비독성 유기산으로부터 유래된 것들을 포함한다. 염기 부가염은 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등과 같은 알칼리토금속, 및 N,N'-디벤질-에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등과 같은 비독성 유기 아민으로부터 유래된 것들을 포함한다.
제약학적(치료) 조성물을 포함하는, 본 발명의 조성물은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및(또는) 방식은 원하는 결과에 따라 달라진다. 활성 화합물은 임플란트, 경피 패취 및 미세캡슐화된 전달 시스템과 같은 제어 방출 제제와 같이 화합물을 신속한 방출로부터 보호하는 담체로 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머를 사용할 수 있다. 상기 제형의 제조방법은 당업자에 일반적으로 알려져 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조.
본 발명의 조성물을 특정 투여 경로로 투여하기 위하여, 불활성화를 방지하는 물질로 화합물을 코팅하거나 불활성화를 방지하는 물질과 공동-투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 대상에게 적절한 담체, 예를 들어 리포좀, 또는 희석제와 함께 투여될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 희석제는 염수와 완충 수용액을 포함한다. 리포좀은 통상적인 리포좀 뿐만 아니라 수-중-유-중-수 CGF 에멀젼을 포함한다(Strejan 등(1984) J. Neuroimmunol . 7: 27).
제약학적으로 허용되는 담체는 멸균 수용액이나 분산액 및 멸균 주사용액이나 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 제약학적으로 활성인 물질을 위한 상기 매질과 시약의 사용은 당업계에 알려져 있다. 어느 통상적인 매질이나 시약이 활성 화합물과 양립불가능하지 않는 한, 본 발명의 제약 조성물에서 그의 사용이 예상된다. 보조 활성 화합물도 조성물에 도입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로는 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정하여야 한다. 조성물은 액제, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 고 약물 농도에 적당한 기타 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매나 분산 매질일 수 있다. 레시틴과 같은 코팅을 사용하거나, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지하거나, 계면활성제를 사용하여 적당한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우, 조성물 내에 등장화제, 예를 들어 설탕, 글리세롤과 같은 폴리알콜, 만니톨, 솔비톨, 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 조성물 내에 흡수를 지연시키는 시약, 예를 들어 모노스테아레이트 염과 젤라틴을 포함시킴으로써 주사 조성물의 흡수를 지연시킬 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 피하 주사에 의해 결정 형태로 투여된다. Yang 등(2003) PNAS, 100(12): 6934-6939를 참조.
활성 화합물을 요구되는 바대로, 적절한 용매에 상기 열거한 성분 중 하나 또는 배합물을 요구되는 양으로 도입한 후, 멸균 미세여과함으로써 멸균 주사용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 활성 화합물을 염기성 분산 매질과 상기 열거된 것들 중 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클로 도입함으로써 분산액을 제조한다. 멸균 주사용액 제조를 위한 멸균 분말의 경우 바람직한 제조방법은, 진공건조와 동결건조로 미리 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 부가적인 원하는 성분의 분말을 생산하는 것이다.
용량 투여계획은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료적 반응)을 제공하기 위하여 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 몇몇 분할된 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 위급에 의해 표시된 바대로 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 투여 편이성과 용량 균일성을 위해 단위 복용형에서 비경구 조성물을 제제화하는 것이 특히 바람직하다. 여기에 사용된 단위 복용형은 치료하고자 하는 대상을 위한 단위 용량으로 적합화된 물리적으로 분리된 단위를 말한다; 각 단위는 요구되는 제약학적 담체와 함께 원하는 치료효과를 나타내기 의해 계산된 예정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 복용형의 세부사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성과 달성하고자 하는 특정 치료효과,및 (b) 개체의 민감성을 치료하기 위한 상기 활성 화합물을 배합하는 기술 본연의 제한들에 의해 지시되거나 직접 좌우된다.
제약학적으로 허용되는 항산화제의 예들은 (1) 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 이아황산나트륨, 메타이아황산나트륨, 아황산나트륨 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 지용성 항산화제; 및 (3) 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 솔비톨, 주석산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트화제:를 포함한다.
본 발명의 치료 조성물은 경구, 비강 내, 국소(구강과 설하 포함), 직장, 질 및(또는) 비경구 투여와 같은 특정 투여 경로를 위해 제제화될 수 있다. 제제는 편리하게는 단위 복용형(unit dosage form)으로 제공되며 약제학 분야에 알려진 어떠한 방법으로도 제조될 수 있다. 단일 복용형을 제조하기 위하여 담체 물질과 배합될 수 있는 활성성분의 양은 치료되는 대상과 특정 투여 양식에 따라 달라진다. 단일 복용형을 제조하기 위하여 담체 물질과 배합될 수 있는 활성성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 그 양일 것이다. 일반적으로, 100 퍼센트 중 이 양은 약 0.01% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30%의 활성성분일 것이다.
질내 투여에 적당한 본 발명의 제제는 당업계에 적당한 것으로 알려져 있는 담체를 함유하는 페써리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제제를 포함한다. 본 발명의 조성물의 국소 또는 경피 투여를 위한 제제는 산제, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패취 및 흡입제를 포함한다. 활성 화합물은 멸균 조건 하에서 제약학적으로 허용되는 담체와 요구될 수 있는 어떠한 보존제, 완충제, 또는 추진제와도 혼합될 수 있다.
여기에 사용된 어구 "비경구 투여"와 "비경구로 투여되는"은 보통 주사에 의한, 장내 및 국소 투여 이외의 투여 양식을 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관내, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 제한없이 포함한다.
본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적당한 수성 및 비수성 담체의 예들은 물, 에탄올, 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은) 및 그들의 적당한 혼합물, 올리브유와 같은 식물유와 에틸 올레이트와 같은 주사용 유기 에스테르를 포함한다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하고, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지하고, 계면활성제를 사용하여 적당한 유동성을 유지할 수 있다.
이들 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제와 분산제와 같은 애쥬번트를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 방지를 상기한 멸균 과정과, 다양한 항세균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등을 포함시켜 보장할 수 있다. 또한 설탕, 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 부가적으로, 알루미늄 모노스테아레이트와 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 물질을 포함시켜 주사 제약학적 형태의 지연된 흡수를 유발할 수 있다.
본 발명의 화합물을 인간과 동물에게 의약으로 투여할 때, 그들은 단독으로나 예를 들어, 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 0.01 내지 99.5%(보다 바람직하게는, 0.1 내지 90%)의 활성성분을 함유하는 제약 조성물로서 제공될 수 있다.
선택된 투여 경로와 무관하게, 적당한 수화물 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및(또는) 본 발명의 제약 조성물은 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제약학적으로 허용되는 제형으로 제제화된다.
본 발명의 제약 조성물 중의 활성성분의 실제 용량 수준은 환자에게 독성을 미치지 않으면서 특정 환자에 대한 원하는 치료 반응, 조성물 및 투여 양식을 을 달성하는데 효과적인 활성성분의 양을 얻도록 변화될 수 있다. 선택된 용량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배설율, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및(또는) 물질, 나이, 성별, 체중, 증상, 치료받는 환자의 일반적인 건강과 이전의 의학적 히스토리와 의학 분야에 잘 알려진 유사한 인자를 포함한 다양한 약동력학적 인자에 의해 좌우될 것이다.
당업계에서 통상적 지식을 갖는 의사나 수의사는 요구되는 제약 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 원하는 치료효과를 달성하고 원하는 효과가 달성될 때까지 용량을 점차적으로 증가시키기 위하여 의사나 수의사는 요구되는 것 보다 낮은 수준으로 제약 조성물에 사용되는 본 발명의 화합물의 투약을 시작할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적당한 일일 용량은 치료 효과를 나타내는데 효과적인 가장 낮은 용량인 화합물의 양일 것이다. 상기 유효용량은 일반적으로 상기한 인자들에 의존한다. 투여가 바람직하게는 표적 위치에 근접하여 투여되는 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하인 것이 바람직하다. 본 발명의 화합물을 단독으로 투여하는 것이 가능한 반면, 화합물을 제약학적 제제(조성물)로 투여하는 것이 바람직하다. 항-CD25 항체를 표적으로 하는 항-이디오타입 항체를 사용하여 생물학적 샘플에서 투여 후 상이한 시점에서 순환하는 모노클로날 항-CD25 항체의 양을 측정함으로써 용량을 결정하거나 조정할 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 이식 거부의 예방을 위해 유도 치료, 즉, 이식 전과 이식 후 매우 초기, 예를 들어 이식 직전과 이식 후 3 개월까지 단일 또는 다중 투여를 위한 예방적 단기 요법으로서 투여될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 예를 들어 이식편 거부의 예방을 위해 약 20 내지 100 ㎎의 총 용량으로 투여되며, 예를 들어 수술 전 제1 투약으로 15 또는 20 ㎎의 정맥내 주입과 수술 후 처음 10 일 내에 잇따른 투약으로 투여될 수 있다. 다르게는, 용량은 볼루스 주사에 위해 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 이식편 거부의 예방을 위해 0.5-1.5 ㎎/㎏ 용량으로 정맥내로, 수술 전 제공된 제1 투약과 함께 격주로 5회까지의 투약으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 면역억제 요법, 예를 들어 프레드니손 또는 메틸프레드니손과 같은 스테로이드와 사이클로스포린 및 아자티오프린; 또는 프레드니손 또는 메틸프레드니손과 같은 스테로이드, 사이클로스포린과 마이코페놀레이트 모페틸과 병용될 수 있다. 인간 항체의 투여는 바람직하게 스테로이드를 절약하며 신속한 스테로이드 투여중지를 야기한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 2-용량 정맥내 주입 투여계획(이식일에 용량 당 약 20 ㎎과 이식 후 4 일째 약 20 ㎎)에 의해 이식편 거부를 치료하거나 예방하기 위해 투여될 수 있다. 상기 투여는 예를 들어 상기한 바와 같은 면역억제 요법과 병용될 수 있다. 예를 들어, 수술 전 1 g의 마이코페놀레이트 모페틸과, 마취 유도 시 500 ㎎의 메틸프레드니손을 경구 투여할 수 있다. 사이클로스포린을 이식 후 2 일에 도입할 수 있으며 마이코페놀레이트 모페틸을 이식 후 1 g으로 계속할 수 있다. 스테로이드는 수술 후 4 일 째에 경구로 프레드니손 20 ㎎으로 감소될 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 이식 거부를 치료하거나 예방하기 위하여 2-용량 유도 요법, 수술 전 1 시간에 제공되는 제1 1 ㎎/㎏ 용량과 수술 후 4 일에 제2 용량에 의해 투여될 수 있다. 상기 투여는 예를 들어 상기한 바와 같은 면역억제 요법과 병용될 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 이식편 거부의 예방을 위해 장기 요법,예를 들어 주 단위나 월 단위, 예를 들어 임의로 1 이상의 월 투여가 따르는 3 내지 8 주 투여로, 20 내지 40 ㎎과 같은 10 내지 150 ㎎ 범위 용량의 투여에 의해 투여될 수 있다. 장기 요법에 의해 사이클로스포린 유지 요법을 감소시키거나 방지할 수 있다.
치료 항체 조성물은 당업계에 알려진 의학 장치로 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물은 US 5,399,163; US 5,383,851; US 5,312,335; US 5,064,413; US 4,941,880; US 4,790,824; 또는 US 4,596,556에 개시된 장치와 같은, 무바늘 피하 주사 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 알려진 임플라트와 모듈의 예들은 의약을 제어된 속도로 투여하기 위한 임플란트 가능한 미세-주입 펌프를 개시한 US 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료 장치를 개시한 US 4,486,194; 의약을 정확한 주입 속도로 전달하기 위한 의약 주입 펌프를 개시한 US 4,447,233; 연속적인 약물 전달을 위한 가변 흐름 임플란트 가능한 주입 장치를 개시한 US 4,447,224; 다중-챔버 구획을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 개시한 US 4,439,196; 및 삼투 약물 전달 시스템을 개시한 US 4,475,196을 포함한다. 기타 다수의 임플란트, 전달 시스템, 및 모듈이 당업자에게 알려져 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체내에서 적당한 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽(BBB)은 많은 고도로 친수성인 화합물들을 배제한다. 본 발명의 치료 화합물이 BBB를 횡단하는 것을 보장하기 위해(필요한 경우) 예를 들어, 리포좀에 제제화될 수 있다. 리포좀을 제조하는 방법에 대해서는, 예를 들어 US 4,522,811; US 5,374,548; 및 US 5,399,331를 참조. 리포좀은 특정 세포나 기관으로 선별적으로 수송되어 표적화된 약물 전달을 증진시키는 하나 이상의 부위를 포함할 수 있다(예를 들어, V. V. Ranade(1989) J. Clin. Pharmacol . 29: 685를 참조). 예시적 표적화 부위는 폴레이트나 바이오틴(예를 들어, Low 등의 US 5,416,016을 참조); 만노사이드(Umezawa 등(1988) Biochem. Biophys . Res . Commun . 153: 1038); 항체(P. G. Bloeman 등(1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais 등(1995) Antimicrob . Agents Chemother . 39: 180); 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe 등(1995) Am. J. Physiol. 1233: 134), 본 발명의 제제 및 발명된 분자의 성분을 포함할 수 있는 상이한 종; pl20(Schreier 등(1994) J. Biol . Chem . 269: 9090)을 포함한다; K. Keinanen; M. L. Laukkanen(1994) FEBS Lett . 346: 123; J. J. Killion; I. J. Fidler(1994) Immunomethods 4: 273도 참조. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 치료 화합물은 리포좀 내에 제제화되고, 보다 바람직한 구체예에서 리포좀은 표적화 부위를 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 리포좀 내의 치료 화합물은 원하는 부위, 예를 들어 염증 또는 감염 위치나, 종양 위치에 근접한 위치로 볼루스 주사에 의해 전달된다. 조성물은 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유체여야만 한다. 그것은 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야만 하고 세균과 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야만 한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체의 효율적인 용량과 용량 투여계획은 치료하고자 하는 질환이나 증상에 의해 좌우되며 당업자에 의해 결정될 수 있다.
이식편 거부를 예방하기 위한 "치료학적 유효 용량"은 바람직하게는 초기 이식편 거부 에피소드의 수와 중증도를 감소시킬 것이다.
류마티스성 관절염을 위한 "치료학적 유효 용량"은 바람직하게는 환자에서 ACR20 개선의 예비적 정의(Preliminary Definition of Improvement), 보다 바람직하게는 ACR50 개선의 예비적 정의, 보다 더 바람직하게는 ACR70 개선의 예비적 정의를 낳는다.
ACR20 개선의 예비적 정의는 압통 관절 계수(Tender Joint Count(TJC))와 부종 관절 계수(Swollen Joint Count(SJC))에서 ≥20% 개선과 아래 5 개의 평가 중 3 개에서 ≥20% 개선으로 정의된다: 환자 통증 평가(VAS), 환자 포괄적 평가(VAS), 의사 포괄적 평가(VAS), 환자 자가-평가 무력(HAQ), 및 급성 기 반응물(CRP 또는 ESR).
ACR50과 ACR70은 각각 ≥50%와 ≥70% 개선으로 동일한 방법으로 정의된다. 더 상세한 것은 Felson 등, American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism(1995) 38: 727-735를 참조.
다르게는, 류마티스성 관절염의 치료학적 유효용량은 EULAR에 의해 정의된 DAS28을 포함하는 DAS(질환 활성도 점수), 보다 바람직하게는 DAS56에 의해 측정될 수 있다.
건선을 위한 "치료학적 유효용량"은 환자에서 PASI50, 보다 바람직하게는 PASI75, 보다 더 바람직하게는 PASI90이나, 치료 전 증상과 비교할 때 약물 치료 후 개선의 인상을 비교한 전체 건선 평가에서 감소를 낳을 것이다. PASI(건선 면적 및 중증도 지수)는 그 질환의 면적과 중증도를 평가하기 위해 사용되는 점수 시스템이다. PASI50은 점수에서 ≥50% 개선이다. 동일한 방법으로, PASI75와 PASI90은 각각 점수의 ≥75%와 ≥90% 개선으로 정의된다.
종양 요법을 위한 "치료학적 유효용량"은 완전하거나 부분적일 수 있는 객관적 종양 반응에 의해 측정될 수 있다. 완전한 반응(CR)은 질환의 임상적, 방사선적 또는 다른 증거가 없음으로 정의된다. 부분적 반응(PR)은 50% 초과의 응집 종양 크기의 감소로부터 기인한다. 진행에 대한 중앙 시간은 객관적 종양 반응의 지속성을 특징지우는 척도이다.
종양 요법을 위한 "치료학적 유효용량"은 질환의 진행을 안정화화는 그의 능력에 의해 측정될 수도 있다. 암을 저해하는 화합물의 능력은 인간 종양에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 다르게는, 조성물의 이 성질은 당업자에게 알려져 있는 시험관내 검정법에 의해 세포 성장을 저해하거나 고사를 유도하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가될 수 있다. 치료 화합물의 치료학적 유효용량은 종양 크기를 감소시키거나, 대상에서 증상을 경감시킬 수 있다. 당업자는 대상의 크기, 대상 증상의 중증도와 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자에 기초하여 상기 양을 결정할 수 있을 것이다.
Ⅵ. 본 발명의 용도와 방법
본 발명의 인간 항체, 및 그의 유도체/콘쥬게이트 및 조성물은 CD25 매개된 장애나 CD25를 발현하는 T 세포가 관여하는 장애의 치료를 포함하는 수많은 용도를 갖는다.
일 구체예에서, 본 발명의 인간 항체는 CD25의 그의 리간드(IL-2)에 대한 결합을 차단하거나 저해하기 위하여 대상에게 생체내에서 투여될 수 있다. 이것은 차례로 CD25 함유 세포와 연관된 다양한 질환을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다.
치료(예를 들어 경감) 또는 예방 가능한 예시적 질환은 심장, 폐, 결합된 심장-폐, 기관지, 신장, 간, 췌장, 식도, 장, 피부, 사지 이식, 탯줄 이식, 줄기세포 이식, 섬 세포 이식 등과 같은 기관 또는 조직 이식을 수행하고 있거나 수행한 환자에서 동종이식편 및 이종이식편 거부를 포함한 이식편 거부를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 상기 환자는 성인을 포함하지만 소아 환자가 될 수도 있다.
따라서, 본 발명의 항체는 동종이식편 및 이종이식편 거부의 예방에 사용되거나, 급성 동종이식편 또는 이종이식편 거부 에피소드를 반전, 치료 또는 다르게는 경감하는데 사용될 수 있다.
치료 가능한 추가 질환은 이식편-대-숙주 질환, 예를 들어 혈액 수혈 이식편-대-숙주 질환 및 골수 이식편-대-숙주 질환; 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 1형 당뇨병, 인슐린-요구성 2형 당뇨병, 다중 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 중증근무력증, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 장염, 피부-다발성근염, 스조그렌 증후군, 거대세포 동맥염을 포함한 동맥염, 재생불량성 빈혈, 천식, 경피증 및 포도막염과 같은 염증성, 면역 또는 자가면역 질환; 염증성 또는 과증식성 피부 질환, 예를 들어, 플라크 건선을 포함한 건선, 수장족저농포증(PPP), 침식성 편평 태선, 천포창 수포증, 표피 수포증, 접촉성 피부염 및 아토피성 피부염; 및 다양한 림프 신생물, 예를 들어, T 세포 백혈병, 호지킨병, 모발세포 백혈병, 또는 균상식육종 및 세자리 증후군을 포함한 표피 T 세포 림프종을 포함한다.
치료 가능한 추가 질환은
위암, 식도암, 악성 흑색종, 결장직장암, 췌장암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 자궁경부암, 난소암, 및 신세포암과 같은, 침윤성 CD25+ 조절성 T 세포의 저해가 이로운 악성종양;
성인 T 세포 백혈병/림프종, 역형성대세포림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), 말초 T 세포 림프종, 및 이차성 유전분증과 같은 혈액학적 장애;
괴저성 농피증, 환상 육아종, 알러지성 접촉피부염, 반흔성 유천포창 및 임신성 포진과 같은 피부 장애;
콜라겐성 결장염, 경화성 담관염, 만성 활동성 간염, 루포이드 간염, 자가면역 간염, 알콜성 간염, 만성 췌장염, 및 급성 췌장염과 같은 간-위장 장애;
심근염 및 심낭염과 같은 심장 장애;
동맥경화증, 거대세포 동맥염/류마티스성 다발성 근육통, 다카야스 동맥염, 결절성 다발동맥염, 가와사키 증후군, 베게너 육아종증, 현미경적 다발혈관염, 척-스트라우스 증후군, 백혈구파괴 맥관염 및 이차성 백혈구파괴 혈관염과 같은 혈관 장애;
급성 사구체신염, 만성 사구체신염, 미세변화 신염 및 굳패스쳐 증후군과 같은 신장 장애;
폐포염, 폐쇄성 세기관지염, 규폐증 및 베릴륨증과 같은 폐 장애;
다중 경화증, 알츠하이머병, 증증근무력증, 만성 탈수초성 다발성 신경병증 및 길랑-바레 증후군을 포함한 다발성 신경근염과 같은 신경 장애;
재발성 다발연골염, 사르코이드증, 전신성 홍반성 낭창, CNS 루푸스, 원판상 루푸스, 루푸스 신염, 만성 피로 증후군 및 섬유근통과 같은 결합조직 장애;
그레이브스병, 하시모토 갑상선염 및 아급성 갑상선염과 같은 내분비 장애; 및
열대 연축성 대칭부전마비와 같은 바이러스 감염이다.
생체내 및 시험관내에서 본 발명의 항체 조성물(예를 들어, 인간 항체와 면역콘쥬게이트)를 투여하는 적당한 경로는 당업계에 잘 알려져 있으며 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 주사(예를 들어, 정맥내 또는 피하)에 의해 투여될 수 있다. 사용되는 분자의 적당한 용량은 대상의 나이와 체중과 항체 조성물의 농도 및(또는) 제제에 의존할 것이다.
항체는 CD25 발현 세포, 특히 활성화된 T 세포와 연관된 질환을 치료하거나 예방하기 위하여 단독으로 또는 항체 조성물과 함께 또는 상승적으로 작용하는 면역억제제, 항염증제, 염증성 또는 과증식성 피부 장애 치료제, 화학요법제 또는 세포독소와 같은 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 인간 항-CD25 항체는 하나 이상의 치료제, 예를 들어, 면역억제제나 본 발명의 전체 항염증 효과를 증가시키는 항염증제와 공동-투여될 수 있다. 항체는 약제와 결합되거나(면역복합체로서) 약제와 별도로 투여될 수 있다. 후자의 경우(별도 투여), 항체는 약제의 전, 후 또는 그와 동시에 투여된다.
또한 본 발명의 범위 내에 본 발명의 항체 조성물(예를 들어, 인간 항체와 면역콘쥬게이트)과 사용 지침을 포함하는 키트가 포함된다. 키트는 추가로 면역억제제 와 같은 하나 이상의 부가적인 약제나 하나 이상의 부가적인 본 발명의 인간 항체를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체 조성물로 치료되는 환자는 인간 항체의 치료 효과를 증진시키거나 강화시키는 면역억제제, 항염증제, 염증성 또는 과증식성 피부 장애 치료제, 화학요법제와 같은 다른 치료제로 부가적으로(본 발명의 인간 항체의 투여 전, 동시 또는 후) 투여된다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 면역콘쥬게이트는 화합물(예를 들어, 치료제, 표지, 세포독소, 면역억제제 등)을 항체에 결합시킴으로써 상기 화합물을 표면에 CD25가 결합된 CD25를 갖는 세포로 표적화하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 생체 외 또는 시험관내에서 (예를 들어, 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소, 효소 조인자와 같은 검출가능한 표지로) CD25 발현 세포를 배치하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 면역독소를 투여하여 표면에 CD25가 결합된 세포를 살해하는 방법을 제공한다.
추가 구체예에서, 본 발명의 항체는 CD25의 수준, 또는 막 표면에 CD25를 함유하는 세포의 수준을 검출하여 CD25를 발현하는 활성화된 세포가 병인에 능동적 역할을 하는 질환을 생체내 또는 시험관내에서 진단하는데 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어, 항체와 CD25 간의 복합체 형성을 허용하는 조건 하에서 시험하고자 하는 샘플을 임의로 대조 샘플과 함께 인간 항체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 그 후 복합체 형성이 검출된다(예를 들어, ELISA를 이용하여). 시험 샘플과 함께 대조 샘플을 이용할 때 복합체는 두 샘플 모두에서 검출되며, 샘플 간 복합체 형성의 임의의 통계학적으로 유의한 차이가 시험 샘플에서의 CD25 존재의 지표가 된다.
본 발명은 추가로 제한적인 것으로 해석되어서는 안되는 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다.
<실시예>
실시예 1 CD25 에 대한 인간 항체의 생산
항원: 세포 표면 CD25를 발현하는 형질감염체 세포주를 HuMAb 마우스를 면역화시키고 항-CD25 항체를 특성규명하기 위한 시약으로 사용하기 위하여 개발하였다. 이 세포주는 혈소판-유래된 성장 인자 수용체의 막횡단 영역에 커플링된 CD25의 세포외 영역을 발현하도록 조작된 CHO 세포주였다. CD25 서열을 HUT102 세포로부터 제조된 cDNA로부터 증폭하고 혈소판 유래된-성장 인자 수용체 서열을 pDISPLAY 벡터(인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation))로부터 얻었다. 융합 단백질을 코딩하는 발현 제작물을 발현 벡터에 조작하였다. CHO 형질감염체 세포주는 5 nM 및 50 nM 메쏘트렉세이트에서 2 라운드의 메쏘트렉세이트 증폭을 수행하여 CD25의 발현 수준을 증가시켰다.
CHO - CD25 트랜스펙토마 배양: CHO-CD25 트랜스펙토마 세포(메다렉스 인크(Medarex Inc.), NJ, USA)를 하이포크산틴을 갖지 않고, 티미딘을 갖지 않으며, 페니실린(5000 U/㎖), 스트렙토마이신(5000 ㎎/㎖; BioWhittaker, 벨기에) 및 메쏘트렉세이트(최종 농도 50 nM, 시그마)를 갖는 CHO-S-SFM Ⅱ 배지(Gibco BRL)에서 배양하였다. 세포를 2 내지 3 일 마다 교체하였다.
형질전환 마우스: HCo7 및 HCo12 마우스를 필터 케이지에 가두고 면역화, 출혈 및 융합 일에 양호한 신체적 조건에 있는지 평가하였다. 선별된 하이브리도마를 생산한 마우스는 모두 웅성이었다. 마우스 번호 23185, 23196, 23197 및 23198은 (CMD)++; (HCo7)11952+; (JKD)++; (KCo5)9272+ 유전형을 갖는다. 마우스 번호 23175는 (CMD)++; (HCol2)15087+; (JKD)++; (KCo5)9272+ 유전형이었다. 개개 형질전환유전자 표시는 무작위로 통합된 형질전환유전자의 줄 수가 뒤따르는 괄호 내에 있다. 표시 ++와 +는 동형접합체 또는 반접합체를 가리킨다; 그러나 마우스가 통상 PCR-기초 검정법을 사용하여 스크리닝되므로, 무작위 통합된 인간 Ig 형질전환유전자의 이형접합성과 동형접합성을 구별하는 것은 불가능하였다. + 표시는 이들 요소에 대해 실제로 동형접합체인 마우스에게 주어질 수 있다.
면역화 과정 및 계획: 마우스는 두 가지 형태의 항원으로 면역화되었다: 생 세포(상기한 CD25 형질감염된 CHO 세포)와 정제 단백질(재조합 인간 CD25(rhCD25), R&D 시스템즈(cat#; 223-2A/CF), 미네아폴리스, MN)의 NS/0-발현된 재조합 단백질). 가용성 rhCD25를 완전 프로인트 애쥬번트(CFA) 또는 불완전 프로인트 애쥬번트(IFA)와 혼합하였다. 프로인트 애쥬번트는 Gibco-BRL(메릴랜드주 록빌)로부터 얻었다. 마우스에게 복강내 강으로 0.2 ㎖의 준비된 항원을 주사하였다. 최종 꼬리 정맥 면역화를 멸균 PBS나 염수(0.9% NaCl) 중의 가용성 CD25로 수행하였다. 형질감염된 세포로의 면역화는 마우스 당 1.0-2.0×107 세포로 멸균 염수 중 0.2 ㎖로 복강 내(i.p.)로 투여되었다. 모든 면역화는 복강 내 강으로 주사되었다. 융합 전 3 일 및 2 일에, 정맥 내(i.v.) 추가접종을 수행하였다. 면역화 계획은 표 1에 기재되어 있다. 모든 마우스는 HCo7 및 HCo12 유전형으로부터의 12 마리 마우스의 코호트(cohort) 중에 포함되었다.
활성 일 면역화: 애쥬번트, 항원 출혈 및 역가*/융합
1 일 염수 중 1.5×107 생 CD25 형질감염 세포, IP
12 일 CFA, rhCD25(20 ㎍)
21 일 염수 중 1.5×107 생 CD25 형질감염 세포, IP
28 일 CFA, rhCD25(20 ㎍)
35 일 역가
42 일 융합
23175/23197
42 일 염수 중 1.5×107 생 CD25 형질감염 세포, IP
56 일 CFA, rhCD25(20 ㎍)
63 일 역가
68 일 염수 중 1.5×107 생 CD25 형질감염 세포, IP
71 일 융합
23196/23198
81 일 역가
85 일 융합 23185
* 역가에 대해서는 표 2를 참조.
마우스 역가: 마우스 # 23175, 23185, 23196, 23197 및 23198의 역가를 아래 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 역가는 CD25 특이적 시험에서 양성을 나타낸 혈청 희석물을 가리킨다. 반복된 면역화 후 항원에 대한 반응은 강력한 반응 수준을 나타냈고 융합을 위해 마우스를 준비하였다.
마우스 # 역가 35 일 역가 63 일 역가 81 일
23175 12800
23185 6400 12800 12800
마우스 # 역가 35 일 역가 63 일 역가 81 일
23196 6400 25600
23197 50000
23198 3200 25600
융합 과정: SP2/0-agl4 골수종 세포주(ATCC CRL 1581, 로트 F-15087)를 융합을 위해 사용하였다. 원래 ATCC 바이알을 해동시키고 배양물에서 확장하였다. 동결 바이알의 종자 스탁(stock)을 이 확장으로부터 제조하였다. 세포를 배양물에서 6-8 주간 유지시키고, 1 주에 2 회 계대하였다.
10% FBS(하이클론(Hyclone) cat#; SH30071), 항생제-항진균제(100×)(Gibco, #15240062) 및 0.1% L-글루타민을 함유하는 고 글루코스 DMEM(메디아테크 셀그로(메디아테크 Cellgro), #; 1001233)을 골수종 세포를 배양하는데 사용하였다. 5% 오리젠-하이브리도마 클로닝 인자(이젠(Igen)), 4.5×10-4 M 피루브산 나트륨, HAT(1.0×10-4 M 하이포크산틴, 4.0 ×10-4 M 아미노프테린, 1.6×10-5 M 티미딘; 시그마) 및 소 태아 혈청(하이클론, 유타주 로간)을 포함하는 부가적인 배지 보충물을 하이브리도마 성장 배지에 첨가하였다.
마우스 번호 #23197로부터의 지라는 정상 크기였고 4.0×108 생존 세포를 제공하였다. 마우스 번호 #23175로부터의 지라는 정상 크기였고 2.6×108 생존 세포를 제공하였다. 마우스 #23196과 #23198로부터의 지라는 정상 크기였고 각각 2.4×108 및 2.0×108 생존 세포를 제공하였다. 마우스 #23185로부터의 마지막 지라는 정상 크기였고 1.9×108 생존 세포를 제공하였다. 지라세포를 표준 과정에 따라 융합하였다.
하이브리도마 생성(융합)을 위해 사용된 배지: 10% 소 태아 혈청(FBS);(하이클론, 유타주 로간, SH30071 로트#AJE10321) 항생제-항진균제(GibcoBRL, 로트#15240062) 및 0.1% L-글루타민(Gibco, 로트#1013845)을 함유하는 고 글루코스 DMEM(메디아테크, 로트#10013264)을 골수종 세포를 배양하는데 사용하였다. 5% 오리젠-하이브리도마 클로닝 인자(Igen, 로트t#36600 및 36782 및 36684), 4.5×10-4 M 피루브산 나트륨, HAT(시그마, H0262): 1.0×10-4 M 하이포크산틴, 4.0×10-7 M 아미노프테린, 1.6×10-5 M 티미딘, 또는 HT(시그마, H0137): 1.0×10-4 하이포크산틴, 1.6×10-5 M 티미딘을 포함하는 부가적인 배지 보충물을 하이브리도마 성장 배지에 첨가하였다.
지라와 림프절을 면역화된 마우스로부터 제거하고 이들 기관을 DMEM + 10% FBS를 함유하는 튜브에 위치시켰다. 튜브를 조직 배양실로 옮기고 단일 세포 현탁액을 지라와 림프절로부터 제조하고 세포를 계수하였다. 적절한 부피의 SP2/0 세포(ATCC CRL 1581, 로트 F-15087; SP2/0 1 세포 당 6 개의 지라 또는 림프절 세포)를 옮기고 세포를 혼합하고 재현탁하였다. 약 1.2 ㎖의 PEG를 가하였다(튜브를 37 ℃ 물을 함유하는 비이커에서 부드럽게 휘저으면서 1 분). 튜브를 90 초간 방치하고, 15 ㎖의 DMEM을 가하고 배지로의 세척을 수행하였다. 세포를 회전시킨 후, 상등액을 제거하고 세포를 재현탁하였다. 10 ㎖의 HAT-함유 배지를 튜브에 가하였다. CO2 인큐베이터에서 30-60 분간 인큐베이션한 후, 세포를 96-웰 배양 플레이트에 200 ㎕/웰(96-웰 플레이트 당 약 1×107 세포)로 플레이팅하였다. 7 일에, 세포에 HT-함유 배지, 250 ㎕/웰을 공급하였다(HT 배지는 아미노프테린이 제거된 HAT 배지이다).
인간 IgG,κ 항체에 대한 최초 ELISA 스크린을 융합 후 7-10 일에 수행하였다. 그 후 인간 IgG,κ 양성 웰을 가용성 CD25 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 스크리닝하였다. 그 후 항원 양성 하이브리도마를 24-웰 플레이트와 최종적으로 조직 배양 플라스크로 옮겼다. 세포를 오리젠 DMSO 동결 배지(피셔 Cat#IG-50-0715)에서 동결시켜 항원 양성 하이브리도마를 발생 과정 중 몇몇 단계에서 보존하였다.
IgG /κ 검출을 위한 ELISA 프로토콜( 융합물을 스크리닝하기 위해 사용되는): ELISA 플레이트를 항-인간-κ, 1 ㎍/㎖(이뮤노테크, 로트#0173)나 항-인간-γ, 1 ㎍/㎖(잭슨, 로트#109-006-098), 50 ㎍/웰로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 비우고 남아있는 결합 위치를 트윈-20(0.05%)과 5% 닭 혈청을 함유하는 PBS(PBSTC)로 1 시간 동안 실온(RT)에서 차단하였다. 플레이트를 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS(PBST)로 3 회 세척하였다. 융합과 서브클론으로부터 유래된 상등액을 PBSTC에서 1:2로 희석하여 일반적으로 시험하였다. 양성 대조로서, 인간 IgG(칼바이오켐)를 사용하였다. 샘플을 약 2 시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 세척하고 PBSTC에 1:5000으로 희석된 이차 항체, 항-인간-IgG-Fc-HRP 콘쥬게이트(잭슨, 로트#109-036-098)를 웰에 가하였다(100 ㎕). RT에서 1 시간 인큐베이션한 후, ELISA를 제조자의 권고에 따라 ABTS(시그마)를 사용하여 전개하였다.
ELISA 에 의한 이소타입 결정: 96-웰 ELISA 플레이트(Greiner, 독일)를 마우스-항-인간 IgG1(CLB, 네덜란드, 스탁으로부터 1:5,000 희석물) 또는 마우스-항-인간 IgG3(CLB, 스탁으로부터 1:10,000 희석물)로 밤새 코팅하였다(100 ㎕/웰, 실온(RT)). 플레이트를 PBST(150 ㎕/웰)로 3× 세척한 후, 플레이트를 PBSTC로 1 시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 그후 인간 CD25 모노클로날 항체 클론의 상등액을 가하였다(100 ㎕/웰; RT에서 2 시간). 항-KLH IgG1(1 ㎍/㎖)과 항-KLH IgG3(1 ㎍/㎖) 상등액을 양성 대조로 사용하였다. 배양 배지와 PBSTC를 음성 대조로 사용하였다. PBST에서 세척한 후(3×), 염소-항-hIgG-HRP(Fc 특이적; 잭슨 Labs, 메인, USA)를 가하였다(RT에서 1 시간). IgG3의 검출을 위해 콘쥬게이트를 1:2000으로 희석하는 반면, IgG1의 검출을 위해, 콘쥬게이트를 1:500으로 희석하였다. PBST로 세척한 후(3×), 10 ㎖ ABTS 완충액(Roche) 당 10 ㎎ ABTS(Roche)를 제조하고 각 웰에 100 ㎕ 가하였다. 20 분후, ELISA 리더(EL 808, Bio-Tek Instruments, 버몬트, USA)로 흡광도를 405 ㎚에서 판독하였다.
면역화 과정에 기초하여 모두 HCo 마우스: AB1, AB7, AB11 및 AB12로부터 유래된 4 개의 항원 특이적 하이브리도마를 선별하였다. 이들 네 클론의 이소타입은 IgG1,κ인 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 항체는 다른 이소타입, 예를 들어 IgG2, IgG3, IgG4, IgM 및 IgA로 재조합적으로 발현될 수 있다.
선별 후 하이브리도마를 유지하기 위해 사용되는 배지: 모든 인간 CD25 모노클로날 항체 하이브리도마 세포주를 10% FCS(Wisent Multicell optimum C241), 2 mM L-글루타민(Glutamax-Ⅱ), 50 IU/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(pen/strep), 2 μM/β-ME(모두 Gibco BRL, Life Technologies, 스코틀랜드로부터 유래됨), 24% HCF(Origen, Igen International Inc., 게이스버그, USA)를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(Biowhittaker, 로트#BE12-709F)에서 배양하였다.
항체의 정제: 배양 상등액으로부터의 인간 CD25 특이적 항체의 정제나 농축 전에, 세포 잔류물이나 다른 불순물과 같은 조물질을 제거하기 위하여 세포 배양 상등액을 진공에 의한 일회용 병 상부 필터를 통해 여과해야만 한다. 샘플의 부피가 500 ㎖ 초과이면 샘플을 Prep/scale™ TFF, 1 ft2 캐트리지(Millipore, USA)로 500 ㎖ 미만의 부피로 농축할 수 있다.
CD25 특이적 항체의 단백질 A 정제를 친화성 크로마토그래피를 사용하여 수행하였다.
5 ㎖ 단백질 A 칼럼(ProtA 5 ㎖ SP, 버전 041201, Amersham 파마시아 Biotech AB, 스웨덴)을 PBS, pH 7.4로 평형화하고 샘플-펌프 A를 PBS, pH 7.4로 프라이밍한 후, CD25 특이적 항체를 함유하는 상등액을 칼럼으로 로딩하고, 비결합된 샘플을 세척해내고, 시스템-펌프 B를 0.1 M 시트르산, pH 5(용출 완충액 1)로 헹구었다. 그 후, 소 IgG(배양 상등액에 존재하는)를 시스템 펌프 B를 통해 용출 완충액 1로 용출하였다. 시스템-펌프 A를 0.1 M 시트르산, pH 3(용출 완충액 2)으로 헹군 후, 인간 CD25 특이적 항체를 용출 완충액 2로 시스템-펌프 A를 통해 용출하였다. 그 후 시스템-펌프 B를 0.1 M 시트르산, pH 2(용출 완충액 3)로 헹구고 칼럼에 결합된 모든 남아있는 IgG를 용출 완충액 3으로 시스템-펌프 B를 통해 용출하였다. 용출된 CD25 특이적 항체를 10%(v/v) 2 M 트리스-HCl(시그마), pH 9로 중화한 후, 피크-분획을 풀링하였다.
용출-단계 2로부터 풀링된 피크-분획을 4 ℃에서 18 시간 동안 PBS로 투석하였다(30 ㎖ 정제 물질을 5 ℓ PBS로). 정제 물질을 보존하고 저장하기 위하여, 샘플을 농축하였다. 인간 IgG의 농도를 폴리클로날 항-IgG 항체(CLB, 암스테르담, 네덜란드, 로트#M1090)를 이용하는 비탁 검정법(Dade-Behring, BNII)를 이용하여 결정하였다. 항체를 수적화하고, 스냅 동결하여 -80 ℃에서 저장하였다.
실시예 2 CD25 에 대한 인간 항체의 항체 서열분석
항체의 V L 및 V H 부위의 서열분석
서열분석: pGEMT-벡터 시스템 Ⅱ에서 클로닝한 후, VDJ-부위를 서열분석하였다. 서열분석을 Baseclear(라이덴, 네덜란드)에서 수행하였다.
서열을 Vbase(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/intro.htm)의 배아계 V-유전자 서열에 대해 정렬하였다.
RNA 제조: 총 RNA를 Rneasy 키트(Qiagen, 웨스트버그, 루스덴, 네덜란드)로 제조자의 프로토콜에 따라 5×106 세포의 네(4)가지 상이한 인간 CD25 하이브리도마 세포주(AB1, AB7, AB11, AB12)로부터 제조하였다.
cDNA 제조: 인간 CD25 하이브리도마 세포로부터의 RNA의 상보적 DNA(cDNA)를 3 ㎍의 총 RNA로부터 완충액을 갖는 AMV 역전사효소(Roche Diagnostics GmbH, 만하임, 독일), 올리고 d(T)15(Promega, 매디슨, WI, USA), dNTP(Roche Diagnostics GmbH, 만하임, 독일) 및 RNAsin(Promega)으로 제조자의 프로토콜(2000, 버전 3)에 따라 제조하였다.
VH와 VL 부위를 하기 PCR 프라이머를 이용하여 증폭하였다:
VH: FR1 5' 프라이머
AB62 CAg gTK CAg CTg gTg CAg TC(서열번호 41)
AB63 SAg gTg CAg CTg KTg gAg TC(서열번호 42)
AB65 gAg gTg CAg CTg gTg CAg TC(서열번호 43)
VH 리더 5' 프라이머
AB85 ATg gAC Tgg ACC Tgg AgC ATC(서열번호 44)
AB86 ATg gAA TTg ggg CTg AgC Tg(서열번호 45)
AB87 ATg gAg TTT ggR CTg AgC Tg(서열번호 46)
AB88 ATg AAA CAC CTg Tgg TTC TTC(서열번호 47)
AB89 ATg ggg TCA ACC gCC ATC CT(서열번호 48)
VH 3' 프라이머
AB90 TgC CAg ggg gAA gAC CgA Tgg(서열번호 49)
Vκ: FR1 5' 프라이머
AB8 RAC ATC CAg ATg AYC CAg TC(서열번호 50)
AB9 gYC ATC YRg ATg ACC CAg TC(서열번호 51)
AB10 gAT ATT gTg ATg ACC CAg AC(서열번호 52)
AB11 gAA ATT gTg TTg ACR CAg TC(서열번호 53)
AB12 gAA ATW gTR ATg ACA CAg TC(서열번호 54)
AB13 gAT gTT gTg ATg ACA CAG TC(서열번호 55)
AB14 gAA ATT gTg CTg ACT CAg TC(서열번호 56)
Vκ 리더 5' 프라이머:
AB123 CCC gCT Cag CTC CTg ggg CTC CTg(서열번호 57)
AB124 CCC TgC TCA gCT CCT ggg gCT gC(서열번호 58)
AB125 CCC AgC gCA gCT TCT CTT CCT CCT gC(서열번호 59)
AB126 ATg gAA CCA Tgg AAg CCC CAg CAC AgC(서열번호 60)
Vκ 3' 프라이머
AB16 Cgg gAA gAT gAA gAC AgA Tg(서열번호 61)
상기 프라이머 서열에서, K, S, R, Y 및 W는 아래 의미를 갖는다:
K = G 또는 T
S = C 또는 G
R = A 또는 G
Y = C 또는 T
W = A 또는 T
클로닝을 위해 V H 와 V L 부위를 증폭하는데 사용되는 PCR 조건: 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 T1 써모사이클러 96(Biometra, 웨스트버그, 루스덴, 네덜란드) 상의 AmpliTaq 폴리머라제(Perkin Elmer)로 수행하였다.
PCR 사이클링 프로토콜:
11 사이클 94 ℃ 2 분
94 ℃ 30 초
65 ℃ 30 초, 사이클 당 -1 °
72 ℃ 30 초
30 사이클 94 ℃ 30 초
55 ℃ 30 초
72 ℃ 30 초
72 ℃ 10 분
4 ℃로 냉각
pGEMT -벡터 시스템 Ⅱ 에서 V H 와 V L 의 클로닝: 아가로스 겔에서 PCR 산물을 분석한 후, 산물을 QIAEX Ⅱ 겔 추출 키트(Qiagen, 웨스트버그, 루스덴, 네덜란드)로 정제하였다. 각각의 VH 및 VL 부위의 FR1 또는 리더 프라이머를 사용한 항상 2 개의 독립적으로 증폭된 PCR 산물을 pGEMT-벡터 시스템 Ⅱ(Promega)에서 제조자의 프로토콜(1999, 버전 6)에 따라 클로닝하였다.
E. coli JM109로 형질전환한 후, 개개 콜로니를 T7 및 SP6 프라이머와 55 ℃에서의 30 어닐링 사이클을 이용하는 콜로니 PCR에 의해 스크리닝하였다. 콜로니로부터의 플라스미드 DNA를 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(Qiaprep Spin miniprep kit(Qiagen))를 이용하여 정제하였다. VH 및 VL 부위를 추가로 분석하기 위하여, Nco1/Not1(NE Biolabs, 웨스트버그, 루스덴, 네덜란드) 분해를 수행하고 아가로스 겔에서 분석하였다.
4 개의 선별된 하이브리도마 세포주는 하기 항체 서열을 발현하였다:
AB1: 아미노산 서열 서열번호 2 및 4를 갖는 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체;
AB7: 아미노산 서열 서열번호 6 및 8을 갖는 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체;
AB11: 아미노산 서열 서열번호 10 및 12를 갖는 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체; 및
AB12: 아미노산 서열 서열번호 14 및 16을 갖는 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체.
얻어진 서열을 도 1-10에 나타내었다.
실시예 3 CD25 에 대한 인간 항체의 결합 특성
CHO 세포 상에 항시적으로 발현되는 CD25 에 대한 인간 CD25 모노클로날 항체 상등액의 결합: 플로우 사이토메트리에 의해 결정하였을 때 AB1, AB7, AB11 및 AB12는 모두 형질감염된 CHO 세포 상에 발현된 CD25에 결합하였다(표 3 참조).
ELISA 검정법에서 hrCD25 에 대한 인간 CD25 모노클로날 항체 상등액의 결합: AB1, AB7, AB11 및 AB12는 모두 코팅 항원으로 hrCD25를 사용하는 ELISA에서 시험하였을 때 CD25에 결합하였다. 플레이트를 PBSTC로 1 시간 동안 RT에서 코팅함으로써 비특이적 결합을 차단하면서, 96-웰 플레이트(Greiner)를 밤새 RT에서 rhCD25(100 ng/㎖; R&D)로 코팅하였다. 플레이트를 PBST로 세척한 후(3×), 100 ㎕의 샘플 항체를 가하였다. 플레이트를 3× 세척한 후(PBST), 플레이트를 PBS 중의 스트렙타비딘-폴리-HRP(1:10,000)로 인큐베이션하고 100 ㎕를 각 웰에 가하였다(1 시간, RT). 플레이트를 세척한 후(PBST에서 3×), 10 ㎖ ABTS 완충액(Roche) 당 10 ㎎ ABTS(Roche)를 제조하고 100 ㎕를 각 웰에 가하였다. 20 분 후, 흡광도를 ELISA 리더(EL 808, Bio-Tek Instruments)로 405 ㎚에서 판독하였다.
클론 명칭, 이소타입 및 CD25에 대한 결합
클론 서브클래스 CD25 - 결합 1 CHO - CD25 2
AB1 IgG1 + +
AB7 IgG1 + +
AB11 IgG1 + +
AB12 IgG1 + +
1rhCD25 ELISA에 의해 결정된 클론 배양물 상등액의 결합
2형질감염된 CHO 세포 상에 발현되고 플로우 사이토메트리로 결정된 CD25에 대한 결합
인간 CD25 모노클로날 항체의 상등액에 의한 바이오틴화된 IL -2의 그의 수용체에 대한 결합의 저해: 인간 모노클로날 항체가 CD25에 대한 IL-2 결합을 차단하거나 저해하는 정도를 조사하기 위하여, 플레이트를 PBSTC로 1 시간 동안 RT에서 코팅하여 비특이적 결합을 차단하면서, 96-웰 플레이트(Greiner)를 밤새 RT에서 rhCD25(100 ng/㎖; R&D systems, MN, USA)로 코팅하였다. 플레이트를 PBST로 세척한 후(3×), 100 ㎕의 샘플 항체(농도 범위: 10, 33 및 100 ng/㎖)를 가하였다. 비교를 위해, Zenapax®도 가하였다. 10 분 후, rIL-2-바이오틴(50 ng/㎖)을 가하였다(1.5 시간, RT). 플레이트를 3× 세척한 후(PBST에서), 플레이트를 PBS 중의 스트렙타비딘-폴리-HRP(스탁으로부터의 1:10,000 희석물)로 인큐베이션하고, 100 ㎕를 각 웰에 가하였다(1 시간, RT). 플레이트를 세척한 후(PBST에서 3×), 10 ㎖ ABTS 완충액(Roche) 당 10 ㎎ ABTS(Roche)를 제조하고 100 ㎕를 각 웰에 가하였다. 20 분후, 흡광도를 ELISA 리더(EL808, Bio-Tek Instruments)로 405 ㎚에서 판독하였다. 데이터는 두 대표적 실험의 하나를 나타낸다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 인간 CD25 모노클로날 항체 AB1, AB7, AB11 및 AB12의 상등액은 Zenapax®에 비해 더 효율적으로 CD25에 대한 바이오틴화된 IL-2의 결합을 저해할 수 있었다.
인간 CD25 모노클로날 항체의 상등액에 의한 CD25 에 대한 Zenapax ® 결합의 저해: 인간 모노클로날 항체가 CD25에 대한 Zenapax® 결합을 차단하거나 저해하는 정도를 조사하기 위하여, 플레이트를 PBSTC로 1 시간 동안 RT에서 코팅하여 비특이적 결합을 차단하면서, 96-웰 플레이트(Greiner)를 밤새 RT에서 rhCD25(100 ng/㎖; R&D systems, MN, USA)로 코팅하였다. 플레이트를 PBST로 세척한 후(3×), 100 ㎕의 샘플(농도 범위: 10, 33 및 100 ng/㎖)을 가하였다. 10 분 후, 바이오틴화된 Zenapax®(5 ng/㎖)를 가하였다(1.5 시간, RT). 플레이트를 3× 세척한 후(PBST에서), 플레이트를 PBS 중의 스트렙타비딘-폴리-HRP(스탁으로부터의 1:10,000 희석물)로 인큐베이션하고, 100 ㎕를 각 웰에 가하였다(1 시간, RT). 플레이트를 세척한 후(PBST에서 3×), 10 ㎖ ABTS 완충액(Roche) 당 10 ㎎ ABTS(Roche)를 제조하고 100 ㎕를 각 웰에 가하였다. 20 분후, 흡광도를 ELISA 리더(EL808, Bio-Tek Instruments)로 405 ㎚에서 판독하였다. 데이터는 두 대표적 실험의 하나를 나타낸다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 인간 CD25 모노클로날 항체 AB1, AB7, AB11 및 AB12의 상등액은 CD25에 대한 Zenapax®의 결합을 차단하였다.
실시예 4 CD25 에 대한 인간 모노클로날 항체는 항- CD3 항체-유도된 T 세포 증식을 저해한다.
T 세포 증식 검정법을 이용하여 인간 항체를 T 세포 증식을 저해하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 비교를 위해, Zenapax®와 이소타입 대조 항체(hIgG1/κ)도 시험하였다.
PBMC 단리: 인간 혈액 세포(네덜란드 적십자 혈액 은행, 우트레크트, 네덜란드로부터의 백혈구 층에서 얻은) 피콜 구배(파마시아, 2500 rpm, 25 분) 상에 놓았다. 피펫으로, RPMI 1640(10% FCS(Wisent Multicell optimum C241), 2 mM L-글루타민, 50 IU/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 25 mM HEPES(모두 BioWhittaker, 유럽으로부터 유래됨)를 함유함)에서 PBMCs를 모았다.
T 세포 증식 검정법: 인간 PBMCs를 96-웰 평저 플레이트(Greiner)에서 RPMI 1640(10% FCS(Wisent Multicell optimum C241), 2 mM L-글루타민, 50 IU/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 25 mM HEPES(모두 BioWhittaker, 유럽으로부터 유래됨) 함유)에 1.5×105 세포/웰(삼중으로)로 희석하였다. 세포를 항-CD3 항체(CLB-T3/4.E, cat#M1654, 10 ng/㎖)로 자극하였다. 그 후, 50 ㎕의 증가하면서 희석된 실험 항체를 세포에 가하였다(500 ng/㎖ 내지 7.8 ng/㎖, 2-단계 희석으로). 5 일 후(37 ℃, 5% CO2), 증식을 BrdU(최종 농도: 10 μM, Roche)를 이용하여 하기 방법에 따라 정량하였다.
BrdU 표지화 검정법( Roche BrdU -염색 키트 , cat no 1 647 229): BrdU 표지화 용액(100 μM)을 웰에 가하고 세포를 밤새 인큐베이션하였다(37 ℃, 5% CO2). 세포를 웰에 재현탁하고 원심분리하였다(10 분, 300 g). 상등액을 제거하고 세포 펠렛을 건조하였다(1 시간, 60 ℃). 그 후 펠렛을 FixDenat(200 ㎕/웰; 30 분, RT)로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, FixDenat를 제거하고 100 ㎕/웰 항-BrdU-POD(100 ㎕ 항-BrdU 스탁 용액을 10 ㎖ Ab-희석 용액에 가한다)를 펠렛에 가하였다(1 시간, RT). 상등액을 제거한 후, 플레이트를 세척 용액(200 ㎕/웰)으로 세척하였다(3×). 마지막으로, 100 ㎖/웰 기질 용액을 펠렛에 가하였다(5 분, RT). 발색 반응을 H2S04(25 ㎕/웰, 1 M)로 정지시키고 광학 밀도를 ELISA 리더에 의해 450 ㎚에서 판독하였다(Bio-Tek Instruments).
도 13에 나타낸 바와 같이, 인간 모노클로날 항체 AB1, AB7 및 AB12는 항-CD3 항체-유도된 T 세포 증식을 용량-의존적 방식으로 저해하였다. 인간 항체에 의한 저해가 Zenapax®에 의한 것 보다 효율적이었다. 데이터는 세 대표적 실험 중 하나를 나타낸다.
실시예 5 CD25 에 대한 인간 모노클로날 항체는 MLR 을 저해한다
인간 항체를 MLR 검정법을 이용하여 MLR을 저해하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 비교를 위해 Zenapax®와 이소타입 대조 항체(hIgG1/κ)도 시험하였다. 두 비-MHC-매칭 공여자로부터의 인간 PBMCs(네덜란드 적십자사 혈액은행, 우트레크트, 네덜란드로부터의 백혈구 층으로부터 얻은)를 RPMI 1640(10% FCS(Wisent Multicell optimum C241), 2 mM L-글루타민, 50 IU/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(모두 Gibco BRL, Life Technologies, 패슬리, 스코틀랜드로부터 유래됨) 함유)에 2.0×106 세포/㎖로 희석하였다. 제1 공여자로부터의 PBMCs를 조사하고(2000 rads) 96-웰 평저 플레이트(Greiner)에서 삼중으로 제2 공여자로부터의 PBMCs(1.0×105 세포/웰)와 혼합하였다(1.0×105 세포/웰). 그 후, 50 ㎕의 증가하면서 희석된 실험 항체를 세포에 가하였다(50 ng/㎖ 내지 0.8 ng/㎖ 범위에서, 2-단계 희석으로). 6 일간 배양한 후(37 ℃, 5% CO2), 증식을 BrdU(최종 농도: 10 μM, Roche)를 이용하여 상기한 방법에 따라 정량하였다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 인간 모노클로날 항체 AB1, AB7 및 AB12는 MLR을 용량-의존적 방식으로 저해하였다. AB1, AB7 및 AB12에 의한 MLR의 저해(약 1 내지 3 ng/㎖의 용량에서)가 Zenapax®에 의한 것 보다 효율적이었다. 데이터는 세 대표적 실험 중 하나를 나타낸다.
실시예 6 바이아코어 3000 장치에서 AB12 의 역학적 분석
친화도 분석을 바이아코어 3000 장치를 이용하여 표면 플라스몬 공명의 변화를 모니터링함으로써 측정하였다. 바이아코어 3000 및 바이아코어 3000 소프트웨어 컨트롤(BIAcore, 웁살라, 스웨덴, 로트#BR-1100-43)을 사용하였다. 아민-커플링 화학을 이용하여 제조자의 권고에 따라 인간 CD25(R&D Systems, 로트#223-2A/CFO)를 CM-5 센서 칩(BIAcore, 로트#BR-1000-14)에 저밀도로 고정하였다. 에탄올-아민-HCl을 이용하여 활성화된 센서 칩의 잔존 결합 위치를 차단한 후, 인간 모노클로날 항체 AB12와 비교를 위해 Zenapax®를 이용하여 25 ℃에서 수행하였다(제조자의 권고에 따라). 각각 AB12와 Zenapax®를 함유하는 샘플을 코팅된 센서 칩의 표면에 걸쳐 흐르도록 하여 AB12와 Zenapax®가 rhCD25와 결합하도록 하였다. 각각 AB12와 Zenapax®의 결합과 해리를 센서 칩 상의 표면 플라스몬 공명(SPR)을 이용하여 모니터링하였다. 결과를 바이아코어 3000(Bio-tek Instruments)을 이용하여 가시화하고 BIAevaluation 소프트웨어 3.1(BIAcore, 웁살라, 스웨덴)을 이용하여 분석하고 랑귀르 결합 1:1을 예비-고정된 모델로 사용하였다.
바이아코어 분석에 의해 결정된 rhCD25에 대한 결합에 대한 AB12의 KD:
4.74×10-11±0.43×10-11
바이아코어 분석에 의해 결정된 rhCD25에 대한 결합에 대한 Zenapax®의 KD:
1.52×10-10±0.27×10-10
실시예 7 T 세포 블라스트의 AB12 -처리는 CD25 의 내재화를 야기했다
AB12를 CD25의 내재화를 유도하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 항-KLH(인간 IgG1/κ 이소타입 항체, 키홀 림펫 헤모시아닌에 대해 특이적)를 이소타입 대조 항체로서 포함하였다.
T 세포 블라스트의 유도: 림프구 분리 배지 구배를 이용하여 헤파린-혈액 샘플로부터 말초 혈액 단핵구 세포(PBMCs)를 단리한 후, PBMCs를 배양 배지(37 ℃, 5% CO2)에서 5 ㎍/㎖ 파이토헤마글루티닌(PHA; Difco, cat#211796)으로 3 일 내지 4 일간 자극하였다.
내재화를 조사하기 위한 T 세포 블라스트의 자극: 세포를 수획하고 PBS에서 세척한 후, 세포를 트립판 블루로 계수하였다. T 세포 블라스트의 일 부분(1×106 세포/㎖)를 FITC-표지된 AB12(2 ㎍/㎖ AB12-FITC), 또는 이소타입 대조로서 FITC-표지된 항-KLH(2 ㎍/㎖), 또는 항체를 첨가하지 않고 예비-인큐베이션하였다(4 ℃, 15 분간). 예비-인큐베이션 후, 세포를 PBS에서 세척하고, 1×106 세포(1 ㎖ 배양 배지 중)를 24-웰 플레이트에 가하고, 18 시간 인큐베이션하였다(37 ℃, 5% CO2). 나머지 T 세포 블라스트를 FITC-표지된 AB12(2 ㎍/㎖), 또는 FITC-표지된 항-KLH(2 ㎍/㎖) 존재 또는 부재 하에 18 시간 동안 인큐베이션하였다(37 ℃, 5% CO2).
인큐베이션 후, 세포를 수획하고, 로다민-표지된 밀-배아 어글루티닌(1 ㎍/㎖, 막 표지; Molecular Probes, cat No. W-849)으로 4 ℃에서 15 분간 표지하였다. 그 후, 세포를 PBS로 세척하고, 25 ㎕ 벡타쉴드(Vectashield) DAPI(Vector Laboratories, 벌링게임, CA, USA)에 재현탁하였다. 그 후, 10 ㎕의 세포 현탁액을 조직 슬라이드에 피펫팅하고, 덮은 후, 형광 현미경(Carl Zeiss)으로 분석하고, 로다민-염색에 대한 TRITC 필터나(필터 세트 15, Zeiss), FITC-염색에 대한 FITC 필터(필터 세트 09, Zeiss)로 사진을 찍었다. 로다민-표지된 밀-배아 어글루티닌으로 얻은 막 염색은 나타나 있지 않다.
도 15A와 15B에 나타낸 바와 같이, 18 시간 배양 후, AB12-FITC 신호를 세포 내부에서 발견할 수 있었다. 도 15A는 AB12-FITC 예비-인큐베이션(15 분)과 세척 후 세포를 18 시간 배양한 후 결과를 나타내고, 도 15B는 AB 12-FITC 존재 하에서 세포를 18 시간 배양한 후 결과를 나타낸다. 무관한 FITC-콘쥬게이션된 항-KLH 항체를 이용한 대조 실험(도 15C)은 FITC-표지된 항체의 내재화를 나타내지 않는다.
실시예 8 T 세포 블라스트의 AB12 -처리는 플로우 사이토메트리로 측정시 CD25 의 내재화를 야기했다
다른 실험에서 플로우 사이토메트리를 상이한 시간 간격으로 T 세포 블라스트에서 FITC-표지된 AB12의 내재화를 결정하는데 사용하였다.
림프구 분리 배지 구배(Ficoll)를 이용하여 헤파린-혈액 샘플로부터 말초 혈액 단핵구 세포(PBMCs)를 분리한 후, PBMCs를 배양 배지에서 5 ㎍/㎖ 파이토헤마글루티닌(PHA; Difco, cat#211796)으로 3 일 내지 4 일간 자극하였다(37 ℃, 5% CO2).
배양 3 일 후 T 세포 블라스트를 수획하고 PBS로 세척한 후, 트립판 블루로 계수하였다. T 세포 블라스트(2 ㎖ 배양 배지 중 2.5×106 세포)에 2 ㎍/㎖의 FITC-표지된 AB12, 또는 FITC-표지된 항-KLH(이소타입 대조 항체)를 가하였다. 세포의 예비-인큐베이션 후(4 ℃, 1 시간), 세포를 두 부분으로 나누었다. 일 부분을 배양 배지에서 세척하고, 다른 부분을 세척하지 않았다. 세척 후, 예비-인큐베이션 샘플을 배양 배지에 재현탁하였다. 두 부분을 모두 4 ℃ 또는 37 ℃에서 인큐베이션하였다.
0, 0.5, 1 또는 4.5 시간 인큐베이션한 후(4 ℃ 또는 37 ℃), 3 ㎖의 FACS 완충액(0.05% BSA와 0.01 ㎍/㎖ 나트륨 아지드를 함유하는 PBS)을 세포에 가하고, 세포를 300 g에서 회전시켰다(4 ℃). 일 부분에서, 세포를 200 ㎕ FACS 완충액에 재현탁하는 한편, 다른 부분에서, 세포를 200 ㎕ FACS 완충액과 1 ㎎/㎖ 에티디움 브로마이드(시그마, cat No. E8751)에 재현탁하였다. 에티디움 브로마이드를 플로우 사이토메트리에 의해 세포를 얻기 직전에 가하였다.
에티디움 브로마이드를 세포 표면 상의 형광 신호를 소광하는데 사용하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 에티디움 브로마이드가 있거나 없이 측정된 4 ℃에서 인큐베이션된 샘플의 형광 비율은 약 1이었다. 이것은 내재화가 일어나지 않았음을 의미한다. 37 ℃에서 배양된 세포는 시간에 걸쳐 이 형광 비율의 증가를 나타내었다. 이것은 AB12-FITC의 내재화가 일어났음을 가리킨다. 예상된 바와 같이, FITC-표지된 AB12의 계속된 존재 하에서의 세포의 인큐베이션(도 16B)은 FITC-표지된 AB12로 예비-인큐베이션만 한 세포(도 16A)와 비교하여 더 높은 수준의 내재화를 일으켰다. 도 16A는 1 시간 동안 예비-인큐베이션되고 과량의 FITC-표지된 AB12가 세척된 세포의 평균 형광 강도(MFI)의 비율을 나타낸다. 도 16B는 FITC-표지된 AB12의 존재 하에 세포를 배양한 후 결과를 나타낸다. MFI의 비율은 시험 샘플의 MFI를 0 시간의 샘플의 MFI로 나누어 결정한다. 이소타입 대조 항체(항-KLH-FITC, 데이터는 나타내지 않음)에서는 염색이 관찰되지 않았다.
본 발명의 항체의 이 내재화 특성은 그들이 예를 들어 성인 T 세포 백혈병/림프종, 재생불량성 대세포 림프종, 피부 T 세포 림프종(균상식육종과 세자리 증후군 포함), 말초 T 세포 림프종, 호지킨병, 모발 세포 백혈병, 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소 림프구성 림프종(SLL)을 치료하기 위하여 독소와 콘쥬게이션하기에 적당하게 할 것이다.
다른 셋팅에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 성인 T 세포 백혈병/림프종, 재생불량성 대세포 림프종, 피부 T 세포 림프종(균상식육종과 세자리 증후군 포함), 말초 T 세포 림프종, 호지킨병, 모발 세포 백혈병, 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소 림프구성 림프종(SLL)을 치료하기 위하여 적당한 방사성 동위원소로 방사성표지화할 수 있다.
더욱이, 항체는 종양 존재량을 결정하기 위해 111In으로 표지하여 투여되는 방사성표지된 항체의 용량을 조정할 수 있다.
균등물
당업자는 단지 통상적인 실험을 이용하여, 여기에 기재된 본 발명의 특정 구체예의 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 균등물은 하기 청구의 범위에 의해 포함되도록 하고자 한다. 종속항에 개시된 구체예의 어떠한 조합도 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 생각될 것이다.
참조에 의한 도입
여기에 인용된 모든 특허, 계류 중인 특허출원과 다른 출판물은 이로써 그들 전체로 참조로서 도입된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (51)

  1. (a) 각각 서열번호 35, 36 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 각각 서열번호 38, 39 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
    (b) 각각 서열번호 14 및 16에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 및 인간 카파 경쇄 가변영역을 가지고,
    인간 CD25에 결합하고 CD25에 대한 IL-2의 결합을 저해하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, 가변영역이 각각 서열번호 13 및 15에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간 중쇄 및 인간 카파 경쇄 핵산에 의해 코딩되고, 인간 CD25에 결합하고 CD25에 대한 IL-2의 결합을 저해하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  3. 제1항 또는 제2항의 항체에 의해 정의되는, 인간 CD25 상의 에피토프에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (i) IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, 분비성 IgA, IgD 및 IgE 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것;
    (ii) IgG1 항체인 것;
    (iii) IgG4 항체인 것;
    (iv) 리간드로서 인간 재조합 CD25 및 분석물로서 항체를 사용하여 바이아코어(BIAcore) 3000 장치에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술로 측정했을 때, 10-8 M 이하의 해리 평형 상수(KD)로 인간 CD25로부터 해리되는 것;
    (v) 인간 CD25에 대한 특이성;
    (vi) CD25에 대한 IL-2 결합의 저해;
    (vii) CD25를 발현하는 T 세포의 제거;
    (viii) T 세포의 내성화(tolerize);
    (ix) CD25를 발현하는 T 세포의 증식 저해;
    (x) 말초혈액 단핵구 세포(PBMCs)의 항-CD3 항체-유도된 T 세포 증식의 저해;
    (xi) 혼합 림프구 반응(MLR)의 저해; 및
    (xii) T 세포 상에 발현된 CD25의 내재화
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 VH1-69/JH4b 또는 VH1-69/JH5b 배아계(germline) 서열로부터 유래된 중쇄 가변영역 아미노산 서열, 및 인간 A27/Jκ4 또는 A27/Jκ5 배아계 서열로부터 유래된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD25에 결합하는 단리된 인간 항체.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 VH1-69/D7-27/JH4b 또는 VH1-69/D7-27/JH5b 배아계 서열로부터 유래된 중쇄 가변영역 아미노산 서열, 및 인간 A27/Jκ4 또는 A27/Jκ5 배아계 서열로부터 유래된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD25에 결합하는 단리된 인간 항체.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, IgM 항체, IgA1 항체, IgA2 항체, 분비성 IgA 항체, IgD 항체 및 IgE 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 항체로서, 진핵세포 내에서 글리코실화되는 항체.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, IgG1,κ 항체, IgG1,λ 항체, IgG4,κ 항체 및 IgG4,λ 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 항체로서, 진핵세포 내에서 글리코실화되는 항체.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 단편 또는 단일쇄 항체인 항체.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, (ⅰ) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합된 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역, (ⅱ) 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변영역, 및 (ⅲ) CH2 불변영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변영역을 포함하는, 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질인 항체.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, V-(D)-J 유전자 조각(segment) 재배열로 기능적 인간 중쇄 형질전환유전자(transgene) 및 기능적 인간 경쇄 형질전환유전자가 형성된 형질전환(transgenic) 비인간 동물로부터 수득되어 불멸화 세포에 융합된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체.
  12. V-(D)-J 유전자 조각 재배열로 기능적 인간 중쇄 형질전환유전자 및 기능적 경쇄 형질전환유전자가 형성된 형질전환 비인간 동물로부터 수득되어 불멸화 세포에 융합된 B 세포를 포함하고, 제1항 또는 제2항의 모노클로날 항체를 검출가능한 양으로 생산하는 하이브리도마.
  13. 제1항 또는 제2항에 따른 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 중쇄 및 인간 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스펙토마에 의해 생산되는 항체.
  15. 인간 중쇄 및 인간 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하고, 제1항 또는 제2항의 항체를 검출가능한 양으로 생산하는 트랜스펙토마.
  16. 인간 중쇄 및 인간 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하고, 제1항 또는 제2항의 항체를 검출가능한 양으로 생산하는 진핵 또는 원핵 숙주 세포.
  17. 인간 중쇄 및 인간 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하고, 제1항 또는 제2항의 항체를 검출가능한 양으로 생산하는 형질전환 비인간 동물 또는 식물.
  18. 인간 중쇄 형질전환유전자 및 인간 경쇄 형질전환유전자를 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물을 인간 CD25 또는 인간 CD25를 발현하는 세포로 면역화하여, 동물의 B 세포에 의해 항체가 생산되도록 하고;
    동물의 B 세포를 단리하고;
    상기 B 세포를 골수종 세포와 융합하여, 인간 CD25에 특이적인 인간 모노클로날 항체를 분비하는 불멸화된 하이브리도마 세포를 형성하고;
    하이브리도마의 배양 상등액이나 상기 하이브리도마로부터 유래된 트랜스펙토마로부터 CD25에 특이적인 인간 모노클로날 항체를 단리하는 것
    을 포함하는, 인간 CD25에 결합하는, 제1항 또는 제2항에 따른 인간 모노클로날 항체의 생산 방법.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 방사성동위원소를 결합시키기 위하여 킬레이터 링커를 추가로 포함하는 항체.
  20. 세포독성제, 방사성동위원소 또는 약물에 결합된 제1항 또는 제2항에 따른 항체를 포함하는 면역콘쥬게이트.
  21. 제1항 또는 제2항에 따른 항체, 및 CD3, CD4, IL-15R, 막 결합 또는 수용체 결합된 TNF-α, 또는 막 결합 또는 수용체 결합된 IL-15에 대한 결합 특이체를 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자.
  22. 제1항의 항체를 투여하여 CD25 발현 세포의 성장 및/또는 증식이 저해되거나 또는 CD25 발현 세포가 사멸되도록 하는 것을 포함하는, CD25 발현 세포의 성장 및/또는 증식의 저해, 또는 CD25 발현 세포의 제거를 위한 시험관내 방법.
  23. 세포독성제, 방사성동위원소 또는 약물에 결합된 제1항의 항체를 포함하는 면역콘쥬게이트를 투여하여 CD25 발현 세포의 성장 및/또는 증식이 저해되거나 또는 CD25 발현 세포가 사멸되도록 하는 것을 포함하는, CD25 발현 세포의 성장 및/또는 증식의 저해, 또는 CD25 발현 세포의 제거를 위한 시험관내 방법.
  24. 제1항의 항체, 및 CD3, CD4, IL-15R, 막 결합 또는 수용체 결합된 TNF-α, 또는 막 결합 또는 수용체 결합된 IL-15에 대한 결합 특이체를 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 투여하여 CD25 발현 세포의 성장 및/또는 증식이 저해되거나 또는 CD25 발현 세포가 사멸되도록 하는 것을 포함하는, CD25 발현 세포의 성장 및/또는 증식의 저해, 또는 CD25 발현 세포의 제거를 위한 시험관내 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD25 발현 세포가 활성화된 T 세포인 방법.
  26. 제1항 또는 제2항의 항체와 CD25 간의 복합체 형성을 허용하는 조건 하에서 샘플을 상기 항체와 접촉시키고;
    복합체의 형성을 검출하는 것을 포함하는,
    샘플에서 CD25 항원, 또는 CD25 발현 세포의 존재를 검출하는 방법.
  27. 검출가능한 표지에 임의로 결합되어 있는 제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는, 샘플에서 CD25 항원 또는 CD25 발현 세포의 존재를 검출하는 진단 키트.
  28. 인간 CD25에 결합하는 제1항 또는 제2항에 따른 인간 항체의 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄와 중쇄 모두의 가변영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 인간 CD25에 결합하는 인간 항체의 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄와 중쇄 모두의 불변영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터.
  30. 서열번호 13에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 15에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  31. 서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 16에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  32. 제1항 또는 제2항에 따른 인간 모노클로날 항체를 코딩하는 발현 벡터.
  33. 제1항의 항체를 장애의 치료 또는 예방에 유효한 양으로 포함하는, 이식 거부, 이식편-대-숙주 질환, 면역, 자가면역 또는 염증성 질환, 염증성 또는 과증식성 피부 장애, 림프 신생물, 악성 종양 및 혈액학적 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 장애의 치료 또는 예방용 제약 조성물.
  34. 세포독성제, 방사성동위원소 또는 약물에 결합된 제1항의 항체를 포함하는 면역콘쥬게이트를 장애의 치료 또는 예방에 유효한 양으로 포함하는, 이식 거부, 이식편-대-숙주 질환, 면역, 자가면역 또는 염증성 질환, 염증성 또는 과증식성 피부 장애, 림프 신생물, 악성 종양 및 혈액학적 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 장애의 치료 또는 예방용 제약 조성물.
  35. 제1항의 항체, 및 CD3, CD4, IL-15R, 막 결합 또는 수용체 결합된 TNF-α, 또는 막 결합 또는 수용체 결합된 IL-15에 대한 결합 특이체를 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 장애의 치료 또는 예방에 유효한 양으로 포함하는, 이식 거부, 이식편-대-숙주 질환, 면역, 자가면역 또는 염증성 질환, 염증성 또는 과증식성 피부 장애, 림프 신생물, 악성 종양 및 혈액학적 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 장애의 치료 또는 예방용 제약 조성물.
  36. 인간 CD25에 결합하는 제1항의 항체의 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄와 중쇄 모두의 가변영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 장애의 치료 또는 예방에 유효한 양으로 포함하는, 이식 거부, 이식편-대-숙주 질환, 면역, 자가면역 또는 염증성 질환, 염증성 또는 과증식성 피부 장애, 림프 신생물, 악성 종양 및 혈액학적 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 장애의 치료 또는 예방용 제약 조성물.
  37. 제30항의 발현 벡터를 장애의 치료 또는 예방에 유효한 양으로 포함하는, 이식 거부, 이식편-대-숙주 질환, 면역, 자가면역 또는 염증성 질환, 염증성 또는 과증식성 피부 장애, 림프 신생물, 악성 종양 및 혈액학적 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 장애의 치료 또는 예방용 제약 조성물.
  38. 제31항의 발현 벡터를 장애의 치료 또는 예방에 유효한 양으로 포함하는, 이식 거부, 이식편-대-숙주 질환, 면역, 자가면역 또는 염증성 질환, 염증성 또는 과증식성 피부 장애, 림프 신생물, 악성 종양 및 혈액학적 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 장애의 치료 또는 예방용 제약 조성물.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식 거부가 심장, 폐, 결합된 심장-폐, 기관지, 신장, 간, 췌장, 식도, 장, 피부, 사지, 탯줄, 줄기세포, 또는 섬 세포 이식과 같은 기관 또는 조직 이식을 받은 환자의 동종이식편 또는 이종이식편 거부인 제약 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 예방적 치료에 의한 이식 거부의 예방에 사용될 수 있는 제약 조성물.
  41. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식편-대-숙주 질환이 혈액 수혈 이식편-대-숙주 질환 및 골수 이식편-대-숙주 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  42. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역, 자가면역 또는 염증성 질환이 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 1형 당뇨병, 인슐린-요구성 2형 당뇨병, 다중 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 중증근무력증, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 장염, 피부-다발성 근염, 스조그렌(Sjoegren) 증후군, 거대세포 동맥염을 포함하는 동맥염, 재생불량성 빈혈, 천식, 경피증 및 포도막염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  43. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 또는 과증식성 피부 장애가 플라크 건선을 포함하는 건선, 수장족저농포증(PPP), 침식성 편평 태선, 천포창 수포증, 표피 수포증, 접촉성 피부염 및 아토피성 피부염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  44. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 림프 신생물이 T 세포 백혈병, 호지킨병, 모세포(hairy cell) 백혈병, 또는 균상식육종 및 세자리(Sezary) 증후군을 포함하는 피부 T 세포 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  45. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장애가 침윤성 CD25+ 조절성 T 세포의 저해가 이롭고, 위암, 식도암, 악성 흑색종, 결장직장암, 췌장암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 자궁경부암, 난소암 및 신세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 악성종양인 제약 조성물.
  46. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장애가 성인 T 세포 백혈병/림프종, 역형성대세포림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), 말초 T 세포 림프종 및 이차성 유전분증으로 구성된 군으로부터 선택되는 혈액학적 장애인 제약 조성물.
  47. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 다른 치료제를 추가로 포함하거나 또는 다른 요법과 사용될 수 있는 제약 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 치료제가 사이클로스포린, 아자티오프린, 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸, 프레드니손과 같은 코르티코스테로이드, 메쏘트렉세이트, 황금 염, 설파살라진, 항말라리아제, 브레퀴나르, 레프루노마이드, 미조리빈, 15-데옥시스페르구알린(15-deoxyspergualine), 6-머캅토퓨린, 사이클로포스파미드, 라파마이신, 타크롤리무스(FK-506), OKT3 및 항-티모사이트 글로불린으로 구성된 군으로부터 선택되는 면역억제제인 제약 조성물.
  49. 제47항에 있어서, 상기 치료제가 스테로이드 약물, NSAID(비스테로이드성 항염증제), 및 메쏘트렉세이트와 같은 DMARD, 하이드록시클로로퀸, 설파살라진, 레프루노마이드, IL-1 수용체 차단제, 예를 들어 아나키나라, TNF-α 차단제, 예를 들어 에타네르셉트, 인플릭시마브 및 아다리무마브, 항-IL-6R 항체, CTLA4Ig 및 항-IL-15 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 항염증제인 제약 조성물.
  50. 제47항에 있어서, 상기 치료제가 콜타르, A 비타민, 안트랄린, 칼시포트리엔, 타라조텐, 코르티코스테로이드, 메쏘트렉세이트, 레티노이드, 예를 들어 아시크레틴, 사이클로스포린, 에타네르셉트, 알레파셉트, 에팔루지마브, 6-티오구아닌, 마이코페놀레이트 모페틸, 타크롤리무스(FK-506), 하이드록시우레아 및 UVB(광-밴드 및 협-밴드 자외선 B), UVA(자외선 A) 및 PUVA(소랄렌 메톡살렌 + 자외선 A)와 같은 광요법으로 구성된 군으로부터 선택되는 염증성 또는 과증식성 피부 장애를 치료하는 약제 또는 요법인 제약 조성물.
  51. 제47항에 있어서, 상기 치료제가 독소루비신, 시스플라틴, 블레오마이신, 카르무스틴, 클로람부실 및 사이클로포스파미드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
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Families Citing this family (147)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030091574A1 (en) 2001-03-23 2003-05-15 Gevas Philip C. Combination treatment of pancreatic cancer
US20090191232A1 (en) 2001-05-04 2009-07-30 Gevas Philip C Combination therapy for the treatment of tumors
US20040009172A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-15 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
US20090280065A1 (en) * 2006-04-10 2009-11-12 Willian Mary K Uses and Compositions for Treatment of Psoriasis
TWI430810B (zh) * 2002-07-19 2014-03-21 Abbott Lab S A ＴＮＦα相關病症之治療
JP4966497B2 (ja) 2002-11-15 2012-07-04 ゲンマブ エー／エス Ｃｄ２５に対するヒトモノクローナル抗体
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
BRPI0414688A (pt) * 2003-09-23 2006-11-28 Pdl Biopharma Inc tratamento de doença respiratória com anti-receptor de il-2
JP2008513536A (ja) 2004-09-22 2008-05-01 レセプター バイオロジックス インコーポレイテッド プロガストリンに対するモノクローナル抗体
JP2008515819A (ja) * 2004-10-07 2008-05-15 ウニベルジテート・チューリッヒ 乾癬の予防及び治療用ｉ型インターフェロンブロッキング剤
US20060165687A1 (en) * 2004-10-19 2006-07-27 Duke University Vaccine adjuvant
AU2005313971B2 (en) * 2004-12-08 2011-10-13 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for immunotherapy and detection of inflammatory and immune-dysregulatory disease, infectious disease, pathologic angiogenesis and cancer
BRPI0607740A2 (pt) * 2005-02-08 2009-09-29 Novartis Ag indução de anticorpos antilinfócitos
JP5837730B2 (ja) * 2005-02-10 2015-12-24 ベイラー リサーチ インスティテュートＢａｙｌｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 抗インターフェロンアルファモノクローナル抗体及び使用方法
EP3312196B1 (en) * 2005-03-23 2019-07-17 Genmab A/S Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
GB0507696D0 (en) * 2005-04-15 2005-05-25 Novartis Ag Organic compounds
CA2606081C (en) 2005-04-26 2013-09-17 Markus M. Heiss Combination of the application of antibodies for immunostimulation together with glucocorticoids
NZ591701A (en) 2005-05-16 2012-11-30 Abbott Biotech Ltd Use of tnf inhibitor for treatment of erosive polyarthritis
EP1888644A1 (en) * 2005-06-01 2008-02-20 Micromet AG Anti-il2 antibodies
RU2446826C2 (ru) * 2005-10-14 2012-04-10 Фукуока Юниверсити Агенты для подавления повреждения трансплантированных островков после трансплантации островков
AR058135A1 (es) 2005-10-21 2008-01-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes para el tratamiento de cardiopatias
AR057582A1 (es) * 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
AR057941A1 (es) * 2005-11-25 2007-12-26 Univ Keio Agentes terapeuticos para el cancer de prostata
KR101866623B1 (ko) 2005-11-28 2018-07-04 젠맵 에이/에스 재조합 １가 항체 및 그의 제조 방법
JP5033643B2 (ja) * 2006-01-27 2012-09-26 学校法人慶應義塾 脈絡膜血管新生を伴う疾患の治療剤
CA2648644C (en) 2006-04-07 2016-01-05 Osaka University Muscle regeneration promoter
US9605064B2 (en) * 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
US9399061B2 (en) 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis
US9624295B2 (en) 2006-04-10 2017-04-18 Abbvie Biotechnology Ltd. Uses and compositions for treatment of psoriatic arthritis
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
US20130004480A1 (en) 2006-07-04 2013-01-03 Paul Parren CD20 Binding Molecules for the Treatment of Copd
TR201910145T4 (tr) 2006-09-26 2019-08-21 Genmab As Tümörlerin tedavi edilmesine yönelik anti-CD38 artı kortikosteroidler artı bir kortikosteroid-olmayan kemoterapötik.
WO2008084402A2 (en) * 2007-01-11 2008-07-17 Philipps-Universitaet Marburg Diagnosis and treatment of alzheimer's and other neurodementing diseases
WO2008088902A2 (en) * 2007-01-17 2008-07-24 Yale University Attenuation of the adaptive immune response
RU2450829C2 (ru) 2007-01-23 2012-05-20 Синсу Юниверсити Ингибитор хронического отторжения
NZ577858A (en) * 2007-01-29 2012-02-24 Valtion Teknillinen Method for producing novel ige based reagents
AU2008255350B2 (en) * 2007-05-31 2014-07-10 Genmab A/S Transgenic animals producing monovalent human antibodies and antibodies obtainable from these animals
WO2009081395A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-02 Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority A method of treating neurodegenerative diseases
US9669057B2 (en) 2008-04-25 2017-06-06 Duke University Regulatory B cells and their uses
RU2532832C2 (ru) 2008-05-07 2014-11-10 Аргос Терапьютикс, Инк. Гуманизированные антитела против альфа-интерферона человека
CN102256623A (zh) 2008-06-05 2011-11-23 独立行政法人国立癌症研究中心 神经浸润抑制剂
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
JP5774595B2 (ja) 2009-10-28 2015-09-09 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｇｌｐ−１ｒ抗体及びそれらの使用
US8906374B2 (en) * 2010-04-20 2014-12-09 Cedars-Sinai Medical Center Combination therapy with CD4 lymphocyte depletion and mTOR inhibitors
PL2578231T3 (pl) 2010-05-28 2023-01-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Środek wzmacniający przeciwnowotworową odpowiedź limfocytów t
SI2580243T1 (sl) 2010-06-09 2020-02-28 Genmab A/S Protitelesa proti humanemu CD38
AU2011267106B2 (en) 2010-06-15 2015-05-14 Genmab A/S Human antibody drug conjugates against tissue factor
WO2012016227A2 (en) 2010-07-29 2012-02-02 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
EP2600878A4 (en) 2010-08-04 2014-06-11 Univ Duke REGULATORY B-CELLS AND ITS USES
WO2012088272A1 (en) * 2010-12-21 2012-06-28 Duke University Methods and compositions combining immunotherapy with monocyte activation
CN106432506A (zh) 2011-05-24 2017-02-22 泽恩格尼亚股份有限公司 多价和单价多特异性复合物及其用途
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
CN103374074A (zh) * 2012-04-28 2013-10-30 中国科学院上海生命科学研究院 一种抗cd25单链抗体
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
BR112015000167B1 (pt) 2012-07-06 2021-11-23 Genmab B.V. Proteína dimérica, proteína, composição, kit de partes e seus usos, bem como método para aumentar a oligomerização em solução de uma proteína dimérica compreendendo um primeiro e segundo polipeptídeo, cada um compreendendo pelo menos as regiões ch2 e ch3 de uma cadeia pesada de igg1 humana e proteína dimérica variante
EP2882776B1 (en) 2012-08-13 2018-05-02 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-jagged anitbodies and methods of use
US10017739B2 (en) 2012-09-06 2018-07-10 Duke University Methods of expanding and assessing B cells and using expanded B cells to treat disease
HUE039329T2 (hu) 2012-10-12 2018-12-28 Adc Therapeutics Sa Pirrolobenzodiazepin-antitest konjugátumok
AU2013372331A1 (en) 2013-01-10 2015-07-23 Genmab B.V. Human IgG1 Fc region variants and uses thereof
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
EP3620473A1 (en) 2013-01-14 2020-03-11 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
AU2014207549B2 (en) 2013-01-15 2018-12-06 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
US10519242B2 (en) * 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
CN105451767B (zh) 2013-03-15 2019-10-18 泽恩格尼亚股份有限公司 多价和单价多特异性复合物及其用途
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US20140302037A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CA2906927C (en) * 2013-03-15 2021-07-13 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
WO2015112842A1 (en) * 2014-01-24 2015-07-30 Ntercept, Llc Methods and compositions for immune dis-inhibition
CA2937035A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for treating cancer and infectious diseases
ME03666B (me) 2014-03-28 2020-10-20 Xencor Inc Bispecifična antitela koja se vezuju za cd38 i cd3
WO2015199534A1 (en) * 2014-06-26 2015-12-30 Erasmus University Medical Center Rotterdam Determining encapsulating peritoneal sclerosis
WO2016054522A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Ntercept, Llc Compositions and methods for inhibiting the biological activity of soluble biomolecules
MX2017006770A (es) 2014-11-25 2018-02-09 Adc Therapeutics Sa Conjugados de pirrolobenzodiazepina y anticuerpo.
EP3223845B1 (en) 2014-11-26 2021-05-19 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd20
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
KR20170084327A (ko) 2014-11-26 2017-07-19 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 cd38에 결합하는 이형이량체 항체
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
CN104483493B (zh) * 2014-12-30 2016-09-28 青岛市市立医院 一种筛选咪唑立宾于免疫t细胞中药物作用靶位的方法
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
GB201507827D0 (en) * 2015-05-07 2015-06-17 Adc Therapeutics Sarl Diagnostic test
US11371066B2 (en) 2015-07-13 2022-06-28 Modular Genetics, Inc. Generation of acyl alcohols
CN114146056A (zh) 2015-07-29 2022-03-08 纳米提克斯有限责任公司 用于清除可溶性生物分子的模块化组合物及其相关方法
WO2017096262A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Jomoco, Corp. Compositions and methods to mitigate or prevent an immune response to an immunogenic therapeutic molecule in non-human primates
JP7058219B2 (ja) 2015-12-07 2022-04-21 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｐｓｍａに結合するヘテロ二量体抗体
EP3407916B1 (en) 2016-01-29 2023-12-20 Merck Sharp & Dohme LLC Phosphonate linkers and their use to facilitate cellular retention of compounds
JP7325959B2 (ja) * 2016-04-07 2023-08-15 キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッド 腫瘍特異的細胞の枯渇のための抗ＣＤ２５ ＦＣγ受容体二重特異性抗体
RU2022104399A (ru) 2016-06-14 2022-05-05 Ксенкор, Инк. Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек
US10316088B2 (en) 2016-06-28 2019-06-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR102562519B1 (ko) 2016-10-14 2023-08-02 젠코어 인코포레이티드 IL-15/IL-15Rα FC-융합 단백질 및 PD-1 항체 단편을 포함하는 이중특이성 이종이량체 융합 단백질
WO2018106959A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
CN110248668B (zh) 2016-12-15 2023-05-30 杜克大学 用于消耗调节性b10细胞的抗体和方法以及与免疫检查点抑制剂的联用
EP3565604A4 (en) 2017-01-04 2020-09-09 Nanotics, LLC ELIMINATING PARTICLE ASSEMBLY PROCESSES
US11879014B2 (en) 2017-03-17 2024-01-23 Tusk Therapeutics Ltd. Method of treating cancer or depleting regulatory T cells in a subject by administering a human IGG1 anti-CD25 antibody
US20210138213A1 (en) 2017-03-30 2021-05-13 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
KR20190137847A (ko) 2017-04-20 2019-12-11 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 항-cd25 항체-약물 접합체와의 병용 요법
CN108795858A (zh) * 2017-04-28 2018-11-13 深圳宾德生物技术有限公司 高抗癌活性t细胞的筛选方法和应用
JP7185884B2 (ja) 2017-05-02 2022-12-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
RU2745451C1 (ru) * 2017-05-25 2021-03-25 Инститьют Фор Бейсик Сайенс Антитела к человеческому интерлейкину-2 и их применение
CA3064681A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-cd25 adc
AU2018283284B2 (en) 2017-06-15 2024-05-16 Cancer Advances Inc. Compositions and methods for inducing humoral and cellular immunities against tumors and cancer
MA49517A (fr) 2017-06-30 2020-05-06 Xencor Inc Protéines de fusion fc hétérodimères ciblées contenant il-15/il-15ra et domaines de liaison à l'antigène
US20200283535A1 (en) * 2017-07-06 2020-09-10 Tusk Therapeutics Ltd. Compounds and methods for tumour-specific cell depletion
US11692037B2 (en) 2017-10-20 2023-07-04 Hyogo College Of Medicine Anti-IL-6 receptor antibody-containing medicinal composition for preventing post-surgical adhesion
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR20200085828A (ko) 2017-11-08 2020-07-15 젠코어 인코포레이티드 신규의 항-pd-1 서열을 사용한 이중특이적 및 단일특이적 항체
MX2020006322A (es) 2017-12-19 2020-09-18 Xencor Inc Proteinas de fusion il-2 fc modificadas.
KR102083884B1 (ko) * 2018-02-19 2020-03-03 가톨릭대학교 산학협력단 이식 거부 질환 치료용 미니서클 벡터
AU2019233581A1 (en) 2018-03-13 2020-09-03 Cancer Research Technology Limited Anti-CD25 for tumour specific cell depletion
AU2019247415A1 (en) 2018-04-04 2020-10-22 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
CN112437777A (zh) 2018-04-18 2021-03-02 Xencor股份有限公司 包含IL-15/IL-15RA Fc融合蛋白和TIM-3抗原结合结构域的靶向TIM-3的异源二聚体融合蛋白
WO2019204665A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
JP2021524449A (ja) 2018-05-23 2021-09-13 アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム 分子アジュバント
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
US20230009902A1 (en) 2018-06-20 2023-01-12 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue orginating from the endoderm
GB201811364D0 (en) 2018-07-11 2018-08-29 Adc Therapeutics Sa Combination therapy
CA3115096A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
CN113677359A (zh) * 2018-11-14 2021-11-19 鲁比克治疗股份有限公司 Cd25抗体
KR20210095165A (ko) 2018-11-19 2021-07-30 프로제너티, 인크. 바이오의약품으로 질환을 치료하기 위한 방법 및 디바이스
US11472890B2 (en) 2019-03-01 2022-10-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind ENPP3 and CD3
KR102503349B1 (ko) 2019-05-14 2023-02-23 프로벤션 바이오, 인코포레이티드 제1형 당뇨병을 예방하기 위한 방법 및 조성물
JP7245358B2 (ja) * 2019-06-10 2023-03-23 山東博安生物技術股▲ふん▼有限公司 抗ｃｄ２５抗体及びその適用
KR20220020331A (ko) 2019-06-10 2022-02-18 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 항-cd25 항체 약물 접합체 및 추가 제제를 포함하는 조합 요법
GB201917254D0 (en) 2019-11-27 2020-01-08 Adc Therapeutics Sa Combination therapy
EP4309722A2 (en) 2019-12-13 2024-01-24 Biora Therapeutics, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
US20230174670A1 (en) 2020-05-14 2023-06-08 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-cd25 antibodies, antigen-binding fragments thereof, and medical uses thereof
US11124568B1 (en) * 2020-08-19 2021-09-21 Vitruviae LLC CD3/CD25 antibodies for neuro-immune diseases
GB202015916D0 (en) 2020-10-07 2020-11-18 Adc Therapeutics Sa Combination therapy
AU2022220616A1 (en) * 2021-02-12 2023-08-31 Merck Sharp & Dohme Llc Antibodies that bind metapneumovirus, antigenic metapneumovirus proteins, and uses thereof
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
CA3212665A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
WO2022192586A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
KR102604849B1 (ko) * 2021-05-11 2023-11-22 가톨릭대학교 산학협력단 항-cd25 항체, il-10 및 cxcr3를 발현하는 미니서클 벡터
AU2022302769A1 (en) 2021-06-29 2024-02-08 Adc Therapeutics Sa Combination therapy using antibody-drug conjugates
CA3228178A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
WO2023034569A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cmet antibodies and their uses
AU2022339819A1 (en) 2021-09-03 2024-04-11 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-lamp1 antibodies and their uses
CN115197321B (zh) * 2022-06-02 2023-08-18 四川大学 靶向cd25的抗体及其用途
WO2024006961A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Neoleukin Therapeutics, Inc. Neo-2/15 variants and uses thereof for preferentially stimulating t-regulatory cells
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6383487B1 (en) * 1990-03-16 2002-05-07 Novartis Ag Methods of treatment using CD25 binding molecules

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE272471C (ko)
US4578335A (en) 1984-05-21 1986-03-25 Immunex Corporation Interleukin 2 receptor
US4845198A (en) 1984-05-21 1989-07-04 Immunex Corporation Hybridoma antibody which binds IL-2 receptor
US5356795A (en) 1984-07-25 1994-10-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Cloning cDNAs for the human interleukin-2 receptor (55 RD protein)
US5317087A (en) 1984-11-13 1994-05-31 Immunex Corporation Purification of the IL-2 receptor
US4816565A (en) 1985-08-13 1989-03-28 Tasuku Honjo Interleukin 2 receptor and a method for production thereof
US5011684A (en) 1985-09-05 1991-04-30 Beth Israel Hospital Association Lysing or blocking unwanted cells with IL-2 receptor-specific binding substance
US5336489A (en) 1985-09-05 1994-08-09 The Beth Israel Hospital Association Treatment of allograft rejection with IL-2 receptor-specific cytotoxins
FR2616330B1 (fr) 1987-06-12 1990-12-21 Immunotech Sa Agent actif et medicament en contenant destines a prevenir ou a combattre le rejet de greffe d'organe chez l'homme
WO1989001340A1 (en) 1987-08-17 1989-02-23 The United States Of America, As Represented By Th Method for treating malignancy and autoimmune disorders in humans
EP0414816B1 (en) 1988-05-19 1994-07-27 The Beth Israel Hospital Association Induction of tolerance to a foreign antigen
US5152980A (en) 1988-05-19 1992-10-06 The Beth Israel Hospital Association Induction of tolerance to a foreign antigen IL-2 receptor-binding substances
DD272471A1 (de) 1988-06-13 1989-10-11 Univ Leipzig Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen den il-2-rezeptor humaner t-lymphozyten
IL162181A (en) * 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
FR2649488A1 (fr) 1989-07-07 1991-01-11 Inst Nat Sante Rech Med Fragments d'anticorps monoclonaux specifiques de la presence de leucocytes actives - leur procede d'obtention et leur application dans le cas de rejet de greffe
FR2652746A1 (fr) 1989-10-06 1991-04-12 Merieux Inst Application d'agents actifs pour la preparation d'un medicament destine au traitement de lymphomes ou assimiles.
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE4028955A1 (de) 1990-09-12 1992-03-19 Boehringer Mannheim Gmbh Monoklonale antikoerper gegen den interleukin 2-rezeptor
FR2672291A1 (fr) 1991-01-31 1992-08-07 Inst Nat Sante Rech Med Composition d'anticorps diriges contre le recepteur de l'interleukine-2 humaine ou animale.
WO1992015318A1 (en) 1991-03-07 1992-09-17 Seragen, Inc. Use of cell surface receptor targeted molecules for the treatment of viral diseases
JP3105629B2 (ja) 1991-04-23 2000-11-06 サングスタット メディカル コーポレイション 特異的結合ペアのメンバーの細胞活性調節接合体
US5326559A (en) 1991-05-16 1994-07-05 Miller D Douglas Treatment of accelerated atheosclerosis with interleukin-2 receptor targeted molecules
WO1992020364A1 (en) 1991-05-17 1992-11-26 Seragen, Inc. Cytokine receptor targeted molecules for treatment of meoplastic cell growth
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
JPH08140528A (ja) * 1993-12-03 1996-06-04 Genpharm Internatl Inc 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
AU2226799A (en) 1998-01-15 1999-08-02 Center For Molecular Medicine And Immunology Antibody/receptor targeting moiety for enhanced delivery of armed ligand
WO1999043798A1 (en) 1998-02-27 1999-09-02 Cli Oncology, Inc. Methods and compositions using tumor specific soluble interleukin-2 receptor alpha molecules
JP2000022337A (ja) * 1998-06-30 2000-01-21 Matsushita Electric Works Ltd 多層配線板及びその製造方法
US6620189B1 (en) 2000-02-28 2003-09-16 Radiant Medical, Inc. Method and system for control of a patient's body temperature by way of a transluminally insertable heat exchange catheter
US6472179B2 (en) 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
WO2000025816A1 (en) 1998-10-30 2000-05-11 The University Of Miami Treatment of hepatitis c by administration of anti-il-2 receptor monoclonal antibody and an antiviral compound
GB9825632D0 (en) 1998-11-23 1999-01-13 Novartis Ag Organic compounds
FR2793691B1 (fr) 1999-05-21 2003-10-03 Hippocampe Utilisation d'anticorps reconnaissant le recepteur de l'interleukine-2 dans la prevention et/ou le traitement des infections par les virus du sida
US20020048550A1 (en) 2000-07-20 2002-04-25 Vallera Daniel A. Radiolabeled immunotoxins
CA2438652A1 (en) * 2001-02-19 2002-09-06 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity
ATE484522T1 (de) * 2001-04-24 2010-10-15 Bayer Corp Menschliche antikörper gegen timp-1
JP2006512895A (ja) * 2002-06-28 2006-04-20 ドマンティス リミテッド リガンド
JP4966497B2 (ja) 2002-11-15 2012-07-04 ゲンマブ エー／エス Ｃｄ２５に対するヒトモノクローナル抗体
US20090117584A1 (en) * 2005-06-29 2009-05-07 Genmab A/S Non-Human mammalian Arthritis Model Featuring Human Antibodies Against Citrul-Linated Proteins
ES2530265T3 (es) * 2005-07-21 2015-02-27 Genmab A/S Ensayos de potencia de unión de una sustancia medicamentosa de anticuerpo a un receptor FC
JP4316600B2 (ja) 2006-11-06 2009-08-19 本田技研工業株式会社 吸気装置のレゾネータ
AU2008206923A1 (en) * 2007-01-17 2008-07-24 Merck Serono S.A. Process for the purification of Fc-containing proteins
EP2234641B1 (en) * 2008-01-03 2015-08-19 Genmab A/S Monoclonal antibodies against cd32b
UA109633C2 (uk) * 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
AU2011267106B2 (en) * 2010-06-15 2015-05-14 Genmab A/S Human antibody drug conjugates against tissue factor
CN105859889B (zh) * 2010-11-17 2020-01-07 中外制药株式会社 具有代替凝血因子viii的功能的功能的多特异性抗原结合分子
AU2012213437B2 (en) * 2011-02-01 2016-08-18 Genmab A/S Human antibodies and antibody-drug conjugates against CD74
US8790651B2 (en) * 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
CN109022465B (zh) * 2011-10-28 2022-04-29 特瓦制药澳大利亚私人有限公司 多肽构建体及其用途
WO2014028502A1 (en) * 2012-08-13 2014-02-20 ImmunGene Inc. Engineered antibody-interferon fusion molecules for treatment of autoimmune diseases
HUE039329T2 (hu) * 2012-10-12 2018-12-28 Adc Therapeutics Sa Pirrolobenzodiazepin-antitest konjugátumok
MX2017006770A (es) * 2014-11-25 2018-02-09 Adc Therapeutics Sa Conjugados de pirrolobenzodiazepina y anticuerpo.
GB201507827D0 (en) * 2015-05-07 2015-06-17 Adc Therapeutics Sarl Diagnostic test
GB201513607D0 (en) * 2015-07-31 2015-09-16 Feingold Jay M Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6383487B1 (en) * 1990-03-16 2002-05-07 Novartis Ag Methods of treatment using CD25 binding molecules

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