CN102250243B - 抗白细胞介素-15抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗白细胞介素-15抗体,包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为:GFTFSSYAM、AISGSGGTTYYADSVKG、AWAPFVNSIVVVTANDL,所述轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为:RASQGISTWLA、AASSLQS、QQANSFPI。本发明抗白细胞介素-15抗体特异性高,制备过程相对简单,成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗体,尤其涉及一种抗白细胞介素-15抗体。
背景技术
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见病,分布于所有的种族和民族,病人遍及全球,以温带、亚热带和寒带地区多见,热带地区少见。在气温和湿度变化大的北欧、美国、英国、瑞典、意大利、法国、俄罗斯、芬兰等国家和地区较多。据美国健康中心的调查,全美约有400-500万人患有类风湿关节炎。国外统计的发病率为0.5%-3%。现我国与国际风湿病学学会联盟合作进行了类风湿关节炎、强直性脊柱炎的流行病学调查,初步结果是,我国类风湿关节炎的患病率约为0.8-1.0%;汉族的患病率明显高于其他民族;女性患病多于男性。按此粗略计算,我国大约有1000-1400万类风湿关节炎病人。我国每年因RA就诊人数超过900万人次,住院患者超过25万次。RA造成的劳动能力丧失所导致的经济损失,并给家庭带来沉重的负担。
在病理上,类风湿关节炎是以慢性多关节滑膜炎、骨及软骨破坏为主要特征的全身性自身免疫性疾病,其主要标志是滑膜中白细胞浸润。表现为对称性的多关节的肿胀、疼痛、晨僵,体重减轻以及全身多***的受累。这种炎症过程能够刺激抗凋亡成纤维样滑膜细胞(FLS)的增殖。这样直接导致形成血管翳和关节损伤以及关节内致炎症细胞因子,如TNF-α(肿瘤坏死因子)的表达。类风湿关节炎的发病机理尚无定论。目前研究认为,许多细胞因子(如TNF-α、白细胞介素15(interleukin-15,IL-15)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)等)在RA的发病过程中起着重要的作用。
在我国,治疗RA的药物,主要有非甾体抗炎药(NSAIDS)、慢性抗风湿药(DMARDS)以及中药类。极少部分患者能使用昂贵的生物制剂类药物治疗类风湿关节炎。
甲氨蝶呤(MTX)作为治疗类风湿性关节炎的经典药物,能抑制二氢叶酸还原酶及甲酰基转移酶活性。来氟米特是一种具有抗增生活性的异唑类免疫抑制剂,其作用机制主要是抑制二氢乳清酸脱氢酶的活性阻断嘧啶的从头合成途径。此外,帕夫林对类风湿关节炎也有一定的疗效。但这类药物的问题在于患者会产生许多对药物的不良反应,同时大多数病人都要经历一个慢性的反复的病程,因而,如何更有效地控制类风湿关节炎患者的病情仍是一个大问题。而中药(如雷公藤、青风藤等)治疗类风湿性关节炎的有效性更是一个棘手问题。
在欧美国家,类风湿关节炎患者则能得到三种抗体类药物etanercept(商品名Enbrel),infliximab(商品名Remicade),adalimumab(商品名Humira)的有效治疗。此三种抗体类药物均作用在TNF-α这一靶标。对许多患者有着非常令人满意的疗效。许多患者经治疗后,症状完全消失。因此,抗体类药物治疗类风湿关节炎有其独到之处。
但上述三种药物对约50%的患者仍然不起作用,说明该部分患者的发病机理原因不是TNF-α。因此,研究开发不同靶标的抗体类药物有着很深远的意义。一方面打破欧美国家的技术封锁垄断、获得我们的自主知识产权,另一方面我们也可以藉此进入和瓜分欧美市场,再一方面我们可以降低成本生产和销售与我国患者消费水平相适应的治疗类风湿关节炎全人源抗体药物。
白细胞介素-15(interleukin-15,IL-15)是一种非常重要的致炎症细胞因子,由巨噬细胞、树突状细胞、角质化细胞与上皮细胞产生。它属于4-α-螺旋束细胞因子家族。IL-15能够活化多种免疫细胞、刺激它们增殖并延长其寿命:IL-15能够诱导T细胞增殖和细胞因子的产生,刺激正常T细胞的迁移与趋化,以及保护它们免除凋亡;能够增强NK细胞的细胞毒性和依赖抗体介导的细胞毒性作用,延长NK细胞的寿命并促进NK细胞分泌IFN-γ、GM-CSF和TNF-α;能够诱导B细胞的增殖和同族型转换(效应B细胞向浆细胞的转换);IL-15还能够促进CTL(细胞毒性T淋巴细胞)记忆细胞的产生。大量的实验表明,多种细胞中IL-15与IL-15R(即IL-15受体)之间的相互作用能够诱导产生级联信号转导。其中包括Janus激酶(Jak)和STA T途径转录激活子的活化。
IL-15在许多疾病反应如超敏反应、移植排斥反应、自身免疫性疾病中具有重要的致炎症反应作用。英国McInnes研究组、Harada及同事、Bykovskaia等、以及Gonzalez-Alvaro等均报道类风湿关节炎患者在滑膜液、滑膜及血清中能显著检测到高水平的IL-15。IL-15导致RA的机理部分可能是通过TNF-α起作用,而Ziolkowska等报道IL-15可能是通过调节IL-17而导致类风湿关节炎。
丹麦Genmab生物医药公司与英国Glasgow大学关节炎中心的McInnes研究组、丹麦Rigs医院、丹麦Frederiksberg医院、英国伦敦Guy医院及瑞典Karolinska医院等密切合作,利用全人源IL-15的单克隆抗体进行了治疗类风湿关节炎的临床试验,结果取到令人比较满意的效果。
发明内容
本发明提供了一种特异性高的抗白细胞介素-15抗体。
一种抗白细胞介素-15抗体,包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为:GFTFSSYAM、AISGSGGTTYYADSVKG、AWAPFVNSIVVVTANDL,所述轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为:RASQGISTWLA、AASSLQS、QQANSFPI。
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述抗体可以是全抗体、抗体片段或单链抗体。
本发明还提供了编码上述抗体的基因。
本发明还提供了上述抗白细胞介素-15抗体在制备抑制IL-15诱导的T细胞增殖药物中的应用
本发明抗白细胞介素-15抗体特异性高,制备过程相对简单,成本低廉。
附图说明
图1为本发明抗白细胞介素-15单链抗体的结构示意图;
图2为实施例6诱导表达产物纯化前后的凝胶电泳图,第1道为纯化前,第2道为纯化后;
图3为实施例7本发明抗体浓度与OD450关系曲线图;
图4为实施例8中T细胞与各抗体混合培养后数量分布图,读数为CPMx103;#IL15-3为本发明的抗IL-15单链抗体;Ab16为非特异性单链抗体;mAb为鼠抗人IL-15抗体(购自R&D Systems公司)。
具体实施方式
本发明采用专利申请01813639.7公开的方法构建人单链抗体文库,并在人单链抗体文库中筛选IL-8抗体,具体实施过程如下:
实施例1 逆转录和扩增得到人抗体重链和轻链DNA
以来自人骨髓、人胎肝、人脾和人外周血白细胞的polyA+RNA(购自Clontech)为模板,并使用从Clontech购得的逆向转录酶试剂盒,以oligo(dT)和随机引物(random primers)为引物,根据Clontech试剂盒所提供的方法指南,将poly A+RNA逆向转录成cDNA。以上述cDNA为模板,使用一系列识别人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的引物,应用PCR法扩增人抗体中所有的重链和轻链的可变区。一系列识别人抗体重链和轻链可变区基因的引物序列如下:
第一组:人抗体重链可变区(VH)基因的5’-端引物
VH1b:5’CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTGCAG GAG TC(C/G)G
VH2b:5’-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTA CAG CTGCAG CAG TCA
VH3b:5’-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTACAG CAG TGG G
VH4b:5’-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GAG GTG CAG CTG(G/T)TG GAG(A/T)C(C/T)
VH5b:5’-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTC CAGCT(G/T)GT(A/G)CAG TCT GG
VH6b:5’-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG(A/G)TC ACCTTG AAG GAG TCT G
VH7b:5’-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTGGTG(C/G)A(A/G)TCT GG
第二组:人抗体重链可变区(VH)基因的3’-端引物
VH1f:5’-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGA GAC(A/G) GT GAC CAG GGT G
VH2f:5’-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGA GACGGT GAC CAG GGT T
VH3f:5’-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA AGA GAC GGTGAC CAT TGT
VH4f:5’-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGA GACGGT GAC CGT GGT CC
VH5f:5’-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC GGT TGG GGCGGA TGC ACT CC
VH6f:5’-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC (C/G) GA TGG GCCCTT GGT GGA (A/G) GC
第三组:人抗体λ-轻链可变区(Vλ)基因的5’-端引物
VL1b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG TCT GT(C/G)(C/G/T)TG ACG CAG CCG CC
VL2b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TAT G(A/T)GCTG AC(A/T) CAG CCA C
VL3b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TAT GAG CTGA(C/T)(A/G) CAG C(C/T)A CC
VL4b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG CCT GTGCTG ACT CA(A/G)(C/T)C
VL5b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG (A/G/T)CTGTG GTG AC(C/T) CAG GAG CC
VL6b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG CC(A/T)G(G/T)G CTG ACT CAG CC(A/C)CC
VL7b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TCT GAGCTG A(C/G)T CAG GA(C/G)CC
VL8b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG TCTG(C/T)(C/T)CTG A(C/T)T CAG CCT
VL9b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT AAT TTT ATG CTGACT CAG CCC C
第四组:人抗体λ-轻链可变区(Vλ)基因的3’-端引物
VL1f:5’-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TAG GAC GGT(C/G)A(C/G)CTT GGT CC
VL2f:5’-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA GAG GAC GGT CAGCTG GGT GC
第五组:人抗体k-轻链可变区(Vk)基因的5’-端引物
VK1b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAC ATC C(A/G)G (A/G/T)TG ACC CAG TCT CC
VK2b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAA ATT GT(A/G)(A/T)TG AC(A/G)CAG TCT CC
VK3b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAT ATT GTG(A/C)TG AC(C/G/T)CAG(A/T)CT CC
VK4b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAA ACG ACACTC ACG CAG TCT C
第六组:人抗体k-轻链可变区(Vk)基因的3’-端引物
VK1f:5’-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT TTC CACCTT GGT CC
VK2f:5’-GGG GTT TTT CAGTAT CTA CGA TTT GAT CTCCA(C/G)CTT GGT CC
VK3f:5’-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT ATC CACTTT GGT CC
VK4f:5’-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT AAT CTC CAGTCG TGT CC
PCR法扩增人抗体中的重链可变区(VH)时应用上述第一组引物与第二组引物的组合,即有42个PCR反应。类似地,扩增人抗体中的λ-轻链可变区(Vλ)时应用上述第三组引物与第四组引物的组合,即有18个PCR反应。扩增人抗体中的k轻链可变区(Vk)时应用上述第五组引物与第六组引物的组合,即有20个PCR反应。
第1组引物中包含有酵母双杂交载体pACT2(Hua SB,Luo Y,Qiu M,Chan E,Zhou H,Zhu L.(1998)Gene.215:143-152.)(Hua SB,Qiu M,ChanE,Zhu L,Luo Y.(1997)Plasmid 38:91-96.)多克隆位点上游的同源序列(下划线部分);第4组和第6组引物中包含有与酵母双杂交载体pACT2多克隆位点下游的同源序列(下划线部分);而第2组、第3组和第5组引物中包含有连接肽(linker)的序列(下划线部分)。连接肽用于连接抗体的重链和轻链的可变区。
PCR法扩增人抗体中所有的重链和轻链可变区的反应条件如下:
5.0μl PCR缓冲液(10x)
1.0μl 3’-端引物(10μM)
1.0μl 5’-端引物(10μM)
5.0μl cDNA底物
1.0μl dNTP(10mM)
36μl 水
1.0单位Taq聚合酶(Clontech生产)
将上述各组分混合均匀后置于PCR仪(Applied BioSystems公司)中进行反应。PCR反应的参数为解链94℃,1分钟、退火50℃,1分钟、延伸72℃,2.5分钟、循环30次。
实施例2连接载体多克隆位点的同源序列和连接肽序列
以实施例1中PCR所得的人抗体重链可变区DNA为模板,以引物7和引物8为上游引物和下游引物,采用PCR法进行扩增,反应条件同上。引物7序列为载体pACT2多克隆位点的上游同源序列,引物8序列为连接肽反链序列。
引物7(pACT2上游同源序列)
5’-ACC CCA CCA AAC CCA AAA AAA GAG ATC TGT ATG GCTTAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC
引物8(连接肽序列反链)
5’-ACT GCC TCC ACC ACC GCT GCC ACC TCC GCC AGA TCCTCC GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC
以实施例1中PCR所得的人抗体轻链可变区DNA为模板,以引物9和引物10分别为下游引物和上游引物,采用PCR法进行扩增,反应条件同上。引物9为载体pACT2多克隆位点的下游同源序列,引物10为连接肽顺链序列。
引物9(pACT2下游同源序列)
5’-GAG ATG GTG CAC GAT GCA CAG TTG AAG TGA ACT TGCGGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA
引物10(连接肽序列顺链)
5’-GGC GGT GGT GGA TCA GGC GGC GGA GGA TCT GGC GGAGGT GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT
实施例3 将人抗体重链和轻链DNA通过连接肽序列连接成单链抗体
将实施例2中PCR扩增得到的含载体pACT2多克隆位点的同源序列和连接肽序列的人抗体重链可变区DNA和轻链可变区DNA混合。以该混合DNA为模板,以引物7和引物9分别为上游引物和下游引物,进行PCR扩增,得到包括人抗体重链DNA序列、轻链DNA序列、载体pACT2多克隆位点同源序列以及连接肽DNA序列的单链抗体(scFv)DNA,反应条件同实施例1。
实施例4 构建人单链抗体(scFv)基因文库
上述实施例3所述的单链抗体(scFv)DNA两侧接有酵母双杂交载体pACT2(Clontech公司生产)多克隆位点两侧的同源序列。将上述实施例3所述的单链抗体(scFv)DNA与经限制性内切酶(Bam HI和Eco RI)处理后的酵母双杂交载体pACT2按照Clontech公司提供的方法(YeastProtocol Handbook,PT3024-1)将其共同转化进入酵母菌株Y187(基因型MATα,ura3-52,his3-200,ade2-101,lys2-801,trp1-901,leu2-3,112,gal4Δ,gal80Δ,URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ)内,经细胞内同源重组后将单链抗体(scFv)DNA整合到pACT2载体上,从而得到酵母双杂交单链抗体(scFv)文库。单链抗体(scFv)DNA片段与pACT2载体上的Gal4激活区域(Activation Domain,AD)融合在一起。
为检查这个人单链抗体(scFv)文库的质量,随机挑出了21个克隆。对***片段测序分析表明所有克隆都包括与Gal4融合在一起的单链抗体(scFv)DNA片段(数据未显示),而且所有单链抗体(scFv)DNA序列都是独特的。
上述经同源重组而得到酵母双杂交单链抗体(scFv)基因文库中抗体DNA拷贝数大约有1×108个,可应用于酵母双杂交技术筛选特定的抗体。
实施例5 筛选抗体
使用人白细胞介素-15(IL15)作为抗原对酵母双杂交单链抗体scFv文库进行筛选。将编码人IL-15的DNA克隆进入载体pGBKT7(Clontech公司)构建出pGBK-IL15。pGBK-IL15编码Gal4 DNA结合区域(BindingDomain,即BD)并融合人IL-15在其C端。
在编码人IL-15的DNA序列得到验证后,pGBK-IL15质粒DNA转化进酵母菌株AH109(基因型MATa,ura3-52,his3-200,ade2-101,trp1-901,leu2-3,112,gal4Δ,gal80Δ,LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3,GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2,URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ)(Clontech公司)。带有pGBK-IL15质粒的AH109酵母可在不含色氨酸的合成培养基(SD/-W)上生长。
将等量的含有pGBK-IL15的MATa型酵母细胞(AH109菌株)与包含单链抗体scFv文库的MATα型酵母细胞(Y187菌株)进行共同培养时,此二型细胞即可交配结合。载有scFv文库的pACT2载体含有LEU2基因,pGBK-IL15包含TRP1基因。包含两种质粒的酵母细胞可以生长在不含亮氨酸和丝氨酸的酵母合成培养基(SD/-LW)。存在scFv/IL-15相互作用的细胞会激活整合在菌株基因组中的报告基因ADE2和HIS3,从而使得酵母细胞可以生长在缺乏腺嘌呤,组氨酸,亮氨酸和色氨酸的培养基(SD/-AHLW)上,并在该平板培养基上形成菌落。
我们在上述筛选培养基(SD/-AHLW)上总共挑选出23个菌落。然后,对这些菌落进行进一步的分析。
首先,按Clontech公司的方法使用β半乳糖苷酶检测法检测lacZ表达。存在scFv/IL-15相互作用的细胞也会激活整合在菌株基因组中的另一报告基因lacZ,从而能测得酵母细胞内表达的β半乳糖苷酶。检测酵母细胞β半乳糖苷酶的方法如下:
(1)上述酵母在筛选培养基(SD/-AHLW)平板上生长。
(2)将酵母菌落转移到Whatman五号滤纸上。
(3)将带有酵母细胞菌落的滤纸浸入液氮之中,使细胞破裂。
(4)将滤纸从液氮中取出,并置于30℃的烘箱内。重复步骤3和4二次。
(5)将滤纸铺于适量的X-gal溶液中,并置于37℃的温箱内约15分钟。若带有菌落处显示蓝色,表明为β半乳糖苷酶阳性。
X-gal溶液配方如下:
16.1g/L Na2HPO4·7H2O
5.50g/L NaH2PO4·H2O
0.75g/L KCl
0.246g/L MgSO4·7H2O
35mg/L X-gal
(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)
5mM β-巯基乙醇
pH7.0
检测结果:上述挑选出的23个菌落中有11个是β半乳糖苷酶阳性的,表明在这些菌落的细胞内另一报告基因lacZ也被激活了。
其次,对上述11个β半乳糖苷酶阳性菌落的scFv进行特异性分析,以确定单链抗体scFv是特异性地与IL-15部分结合,而不是与其它部分。将含有scFv的pACT2质粒DNA从上述11个β半乳糖苷酶阳性的酵母中提取出来。并分别与pGBKT空载体DNA,或与含有编码融合Gal4-DNA结合区(BD)和人核纤层蛋白C编码序列的质粒pGBKT-Lam(Clontech公司)的DNA,共同转化到AH109酵母细胞内。转化后的酵母细胞先铺于SD/-LW平板培养基上生长,然后转移到SD/-AHLW平板培养基上。并进一步使用β半乳糖苷酶分析。
经上述方法对scFv进行特异性分析后,我们得到5个对人IL-15具有特异性的单链抗体scFv。
然后,对上述5个对人IL-15具有特异性的单链抗体scFv进行测序分析。使用ABI自动测序仪测定scFv的DNA序列。分析这些单链抗体scFv克隆的序列表明有二个不同的抗人白细胞介素-15的单链抗体。其中与克隆号#IL15-3相同的有2个,而与克隆号#IL15-7相同的则有3个。
克隆号#IL15-3的单链抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,DNA序列如SEQ ID NO.3所示;VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.1)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNNLRVEDTAVYYCAKAWAPFVNSIVVVTANDLWGQGTLVTVSS
下划线部分依次为重链可变区中的三个高变区CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列。
轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.2)
DIQLTQSPS SVSASVGDRVTITCRASQGISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPITFGQGTRLEIK
下划线部分依次为轻链可变区中的三个高变区CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列。
实施例6 抗体表达与纯化
将抗人IL-15的单链抗体scFv的DNA克隆到蛋白质表达载体中pET27b(+)(Novagen公司)而得到pET27b-IL15。克隆后的pET27b-IL15,在scFv的N端是pelB序列(可将表达后的scFv蛋白质分泌到表达细菌E.coli的周质腔periplasmic space中),而C端含有一段编码HSV标记物和一个6x His标记物(可用于蛋白质的纯化)的序列。将pET27b-IL15转化入蛋白质表达细菌E.coli菌株BL21 DE3(Novagen公司)。并按照该公司提供的方法用IPTG(浓度0.5mM)诱导表达和分离抗人IL-15的单链抗体scFv蛋白质。
因为scFv蛋白质的C端含有一个6x His标记物,可以应用Qiagen公司所提供的方法方便地用Ni-NTA柱(Qiagen公司)来纯化scFv蛋白质。纯化前后蛋白质用SDS-PAGE凝胶电泳的分析,结果如图2所示。
实施例7 酶标免疫法(ELISA)测试抗IL15的scFv特性
重组人IL-15的蛋白质购自美国R&D Systems公司。用于酶标免疫法(ELISA)的96-孔板(MaxiSorp板)购自Nunc公司。方法如下:
(1)上述96-孔板首先用IL-15包被。
(2)包被后的96-孔板再用SuperBlock(购自Pierce公司)作封闭处理。
(3)纯化了的抗IL-15单链抗体在0.02% BSA中作系列稀释后加入已包被有IL-15的96-孔中,与IL-15结合。
(4)将96-孔板清洗后,在96-孔中再加入稀释了5000倍的鼠抗HSV标记物的抗体(购自Novagen公司)用来检测结合了的单链抗体(注:在scFv的C端含有一个HSV标记物)。
(5)将96-孔板清洗后,在96-孔中再加入稀释了10000倍的山羊抗鼠IgG抗体并偶联有HRP(辣根过氧化物酶)的偶联物(购自Sigma公司)。
(6)将96-孔板最终清洗后,应用购自Sigma公司的HRP底物TMB试剂作显色处理。
(7)最后,反应用0.5M的硫酸终止,并检测450nm的吸收光谱。
结果如图3所示,结果说明克隆号#IL15-3单链抗体能有效地结合IL-15。
实施例8 测试scFv抑制IL-15诱导的T细胞增殖
测试纯化后的抗IL-15单链抗体的对IL-15诱导CD8+T细胞增殖的抑制作用。实验步骤如下:
(1)每孔2.5×104个分离后的CD8+T细胞培养在96孔细胞培养板中。培养基为RPMI-1640+10% FCS(胎牛血清)。重组人IL-15的蛋白质(浓度为10pM)与上述纯化后的抗IL-15单链抗体(1nM)或鼠抗人IL-15抗体(购自R&D Systems公司)(1nM)混合在培养基中。
(2)在37℃的CO2培养箱内培养72小时。
(3)每孔中加入0.5μCi的[3H]-胸腺嘧啶。在37℃的CO2培养箱内继续培养6小时。
(4)用RPMI-1640培养基洗三遍后,将细胞收集,再用液体闪烁仪计数,重复三次,取平均。
结果如图4所示,所获得的抗IL-15单链抗体#IL15-3能有效抑制IL-15诱导CD8+T细胞增殖作用。
Claims (6)
1.一种抗白细胞介素-15抗体,包括重链可变区和轻链可变区,其特征在于,所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为:GFTFSSYAM、AISGSGGTTYYADSVKG、AWAPFVNSIVVVTANDL,所述轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为:RASQGISTWLA、AASSLQS、QQANSFPI。
2.根据权利要求1所述的抗白细胞介素-15抗体,其特征在于,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的抗白细胞介素-15抗体,其特征在于,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的抗白细胞介素-15抗体,其特征在于,所述抗体为单链抗体。
5.编码权利要求1~4任一所述抗白细胞介素-15抗体的基因。
6.权利要求1~4任一所述抗白细胞介素-15抗体在制备抑制IL-15诱导的T细胞增殖药物中的应用。
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